CN109722419B - 一种利用微量神经组织获取和培养少突胶质前体细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学领域，涉及少突胶质前体细胞的获取方法，具体涉及一种从新生大鼠微量神经组织获取少突胶质前体细胞并纯化培养的方法。本方法通过将微量神经组织用消化酶Accusase进行适度消化并结合机械吹打，离解成单细胞悬液，种植在多聚赖氨酸包被的培养底面上，添加无血清培养基进行贴壁培养，促使少突胶质前体细胞大量增殖，同时抑制非少突胶质前体细胞过快增殖。培养10天后，撤除培养基中B27添加剂2～3天，使少突胶质前体细胞粘附力暂时降低，通过机械吹打方式进行选择性分离，获得进一步纯化的大鼠少突胶质前体细胞。获得的少突胶质前体细胞具有连续增殖能力，能够连续传代，并具有分化为成熟少突胶质细胞的能力。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及少突胶质前体细胞的获取方法，具体涉及一种从新生大鼠微量神经组织获取少突胶质前体细胞进行大量增殖并纯化培养的方法。
背景技术
少突胶质前体细胞在中枢神经系统内发挥着多种重要功能，它们不仅能够分化为成熟的少突胶质细胞，维持神经纤维电冲动的正常传导，而且能够与神经元形成突触联系，并且可以产生多种营养因子以支持和保护神经元(Lin SC,Bergles DE.Synapticsignaling between GABAergic interneurons and oligodendrocyte precursor cellsin the hippocampus.Nat Neurosci 2004；7:24-32.)(Lee Y,Morrison BM,Li Y,Lengacher S,Farah MH,Hoffman PN,et al.Oligodendroglia metabolically supportaxons and contribute to neurodegeneration.Nature 2012；487:443-8.)。在体外获取并纯化少突胶质前体细胞进行研究，不仅有助于进一步明确它们在发育和成熟阶段的生物学功能与特性，而且也为相关神经疾病如脊髓损伤、多发性硬化等的细胞移植治疗研究，提供重要的前提条件和基础。
目前分离及纯化培养少突胶质前体细胞的方法，主要包括混合胶质细胞培养后振摇分离法(McCarthyKD,de Vellis J.Preparation of separate astroglial andoligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.J Cell Biol 1980；85:890-902)，免疫吸附纯化法(Shi J,MarinovichA,Barres BA.Purification andcharacterization of adult oligodendrocyte precursor cells from the rat opticnerve.J Neurosci 1998；18:4627-36.)，神经干细胞定向诱导法(ChenY,Balasubramaniyan V,Peng J,Hurlock EC,Tallquist M,Li J,et al.Isolation andculture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.Nat Protoc 2007；2:1044-51.)。此外，还有少量文献报道采用神经母细胞瘤B104的条件培养基来促使原代少突胶质前体细胞增殖并形成克隆球。
混合胶质细胞培养后振摇分离法是获取大鼠少突胶质前体细胞最常用的方法之一，是通过将新生鼠大脑皮质等处的原代混合细胞在含10～20％胎牛血清的培养基中培养大约7～12天，待胶质细胞分层后，通过恒温摇床过夜振摇，来促使上层的少突胶质前体细胞脱落；免疫吸附纯化法，主要是通过针对少突胶质前体细胞胞膜上的抗原，利用特异性抗体包被的培养皿等来特异性吸附细胞悬液中的少突胶质前体细胞，或通过免疫磁珠、流式细胞仪等筛选分离特异性标记的细胞；神经干细胞定向诱导法，是首先将胚胎或新生期的神经组织解离后进行悬浮培养产生神经干细胞克隆，再通过定向诱导的方法如添加血小板源生长因子(Platelet-derived growth factor PDGF)等，使一部分神经干细胞球转变为少突胶质前体细胞球。
但是迄今为止，上述技术方法尚存以下缺陷：1)混合胶质细胞培养方法中，少突胶质前体细胞需要在含有高浓度血清(10～20％)的培养基中长期培养增殖，这与少突胶质前体细胞自身体内的生长环境之间存在明显差异，已知血清尤其是较高浓度血清对于少突胶质前体细胞的生物学特性存在明显而复杂的影响，能够在体外促使少突胶质前体细胞分化为2型星形胶质细胞，甚至可在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor bFGF)的共同作用下，诱使少突胶质前体细胞去分化成为神经干细胞(Kondo T,RaffM.Oligodendrocyte precursor cells reprogrammed to become multipotentialCNS stem cells.Science 2000；289:1754-7.)。2)免疫吸附纯化法，虽然在细胞分离过程中不需要接触血清，并且获取细胞的纯度较高，但实验过程需要的抗体数量及种类较多，价格较昂贵；同时此方法分离操作步骤复杂，对操作人员实践经验或仪器设备要求条件较高，并且较长的操作时间、吸附于细胞表面的抗体，都有可能对细胞的活性以及细胞生物学性状产生不利影响。3)神经干细胞定向诱导，实际上包括获取并培养神经干细胞和定向诱导两个步骤。实验需要处死怀孕母鼠，培养过程费时，成本昂贵，而且在定向诱导过程中可能会因为诱导的特异选择作用而出现细胞永生化等变异，使获取细胞与正常发育的少突胶质前体细胞存在差异。同时，这种永生化等变异也同样存在于使用B104条件培养基来诱导少突胶质前体细胞增殖和形成克隆球的过程中，除此之外，B104条件培养基中促使少突胶质前体细胞增殖的成分目前还没有完全清楚，其中机理尚未完全明确。4)上述实验取材方法需要动物数量多，材料准备及处理过程劳动量大，对于某些特定区域及核团的少突胶质前体细胞研究，如视神经等，取材甚至需要处死数十只动物(Watkins TA,Emery B,MulinyaweS,Barres BA.Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase andastrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.Neuron.2008；60:555-69.)，这对于一些特殊品系或转基因动物实验研究而言，成本与难度相对更大。
总之，以上方法存在取材数量多，培养时间跨度长，操作步骤复杂，抗体试剂昂贵，获取细胞生物学性状改变等缺陷。近年来，利用细胞黏附强度的差异来分离纯化特定类型的细胞，已有较多实验报道(Liang X,Osman TA,Sapkota D,Neppelberg E,Lybak S,Liavaag PG,et al.Rapid adherence to collagen IV enriches for tumourinitiating cells in oral cancer.Eur J Cancer 2014；50:3262-70.)(Singh A,SuriS,Lee T,Chilton JM,Cooke MT,Chen W,et al.Adhesion strength-based,label-freeisolation ofhuman pluripotent stem cells.Nat Methods 2013；10:438-44.)。这为我们发展一种更加简单、稳定、经济的少突胶质前体细胞获取和纯化方法提供了新的思路。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种从新生大鼠微量神经组织获取少突胶质前体细胞的方法；进一步提供一种不需要血清刺激和抗体吸附标记的大鼠少突胶质前体细胞。
本发明方法通过将微量神经组织如视神经及海马等用消化酶Accusase进行适度消化并结合机械吹打，离解成单细胞悬液，种植在多聚赖氨酸包被的培养底面上，添加含有PDGF的无血清培养基进行贴壁培养，特异性地促使少突胶质前体细胞大量增殖，相对抑制非少突胶质前体细胞的增殖速度。培养10天后获得富含少突胶质前体细胞克隆的原代细胞。随后暂时撤除培养基中B27添加剂2～3天，利用贴壁少突胶质前体细胞突起暂时回缩、粘附力明显降低的时机，结合机械分离方法，获得高纯度的少突胶质前体细胞。获得的大鼠少突胶质前体细胞能够维持连续增殖能力，持续保持前体状态和较高纯度，并具有分化为成熟少突胶质细胞的能力。
上述制备方法中，所述的新生大鼠是指出生1～3天的SD大鼠。
所述的微量神经组织，是指总体积少于2mm3的神经组织，如一只新生SD大鼠的一至两条眶内段视神经，或一只新生SD大鼠的单侧海马的1/4部分。
所述的多聚赖氨酸是指右旋多聚赖氨酸或左旋多聚赖氨酸，分子量大于70000。
具体而言，本发明从新生大鼠微量神经组织获取少突胶质前体细胞并纯化培养少突胶质前体细胞，其特征在于，包括以下步骤：
(1)新生大鼠微量神经组织的获取、消化和机械解离
无菌条件下获取新生SD大鼠眶内段视神经及海马等微量神经组织，于消化酶Accusase内消化30～90分钟，经机械吹打解离成细胞悬液，种植在多聚赖氨酸涂布的培养板内，用含有2％B27添加剂、1％N2添加剂和血小板源生长因子(PDGF-AA)的无血清培养基进行培养。
(2)原代细胞培养与少突胶质前体细胞克隆形成
细胞贴壁培养4天后，出现少突胶质前体细胞增殖克隆；与此同时，贴壁的其它非少突胶质前体细胞如星形胶质细胞等，增殖速度相对缓慢，培养过程中中少突胶质前体细胞的总体比例明显提高。
(3)利用特定成分短暂撤除方法降低少突胶质前体细胞粘附性
原代细胞培养约10天后，更换为不含B27添加剂的培养基。培养2～3天后，贴壁的少突胶质前体细胞出现明显突起回缩，胞体发亮变圆，与培养底面的接触面积明显变少，易于脱壁。与此同时，其它非少突胶质前体细胞如星形胶质细胞形态无明显改变。
(4)利用机械分离方法纯化少突胶质前体细胞
将上述培养细胞在无菌操作台内轻轻震荡或吹打，使大部分少突胶质前体细胞脱壁，而绝大部分非少突胶质前体细胞仍牢固贴壁。收集脱壁少突胶质前体细胞进行培养，重新加入2％B27添加剂，并添加碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor，bFGF)。
(5)少突胶质前体细胞的传代培养以及诱导分化
机械分离纯化的少突胶质前体细胞在加入2％B27添加剂以及bFGF后，快速贴壁并增殖，细胞呈典型的双极或三极形态，纯度达98％以上。
细胞传代：培养细胞5～6天传代一次。用Accusase消化2～3分钟后用D-PBS清洗，加入完全培养基(含bFGF)吹打使细胞脱壁，收集细胞按1:2或1:3比例传代。
细胞分化：将细胞培养基中的PDGF及bFGF撤除，添加15nm的三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine，T3)，继续培养5-10天，每3天更换培养基一次。
本发明提供了一种从新生大鼠微量神经组织中获取并大量纯化培养的少突胶质前体细胞。
本发明对获取的的大鼠少突胶质前体细胞及其分化而来的少突胶质细胞进行体外特征鉴定，鉴定步骤为：
(1)大鼠少突胶质前体细胞及其分化产生的少突胶质细胞的体外特征鉴定：
在体外对大鼠少突胶质前体细胞及其分化产生的少突胶质细胞进行细胞形态观测和细胞免疫荧光染色等指标检测，鉴定大鼠少突胶质前体细胞及其分化产生的少突胶质细胞的体外特征；
本发明对获取的的大鼠少突胶质前体细胞及其分化而来的少突胶质细胞进行体外特征鉴定，鉴定结果为：
(1)大鼠少突胶质前体细胞及其分化产生的少突胶质细胞在体外：
大鼠少突胶质前体细胞呈现双极及三级突起，符合少突胶质前体细胞的典型形态特征；表达少突胶质前体细胞特异性标志物，包括：细胞表面神经节苷脂A2B5、硫酸软骨素蛋白多糖NG2。
分化产生的少突胶质细胞呈现密集分支突起，部分呈蜘蛛网状，符合少突胶质细胞的典型形态特征；表达少突胶质细胞特异性标志蛋白，包括：半乳糖脑苷脂酶(galactocerebroside GC)和髓鞘碱性蛋白(myelinbasic protein MBP)。
本发明从新生大鼠微量神经组织中获取并纯化培养少突胶质前体细胞，方法具有如下优点：
该方法取材需要动物数量少。前述其它方法一次实验使用材料往往需要数只甚至数十只新生大鼠。而本方法可一次只需一只新生大鼠即可，这对于某些特殊品系或转基因动物实验研究而言，尤显重要。
该方法操作方便，步骤简单，成本低廉。通过培养基中特定成分(B27添加剂)增减来调节少突胶质前体细胞的粘附性，并结合简单机械分离，可以方便地分离、纯化少突胶质前体细胞。前述的振摇分离法、免疫吸附纯化法、神经干细胞定向诱导法等，对于实验人员的操作技术及实践经验要求较高，需要专门的相关仪器设备如恒温摇床、流式细胞仪，以及纯化和标记细胞所必需的多种昂贵抗体。
该方法在获取过程中避免了血清的刺激，在原代培养阶段避免了bFGF的影响，从而能够更好维持少突胶质前体细胞本身的生物学性状，同时也不存在定向诱导引起的细胞永生化等变异情况
获取的大鼠少突胶质前体细胞纯度较高，活性较好，可在体外连续传代，并可以分化为成熟的大鼠少突胶质细胞，有助于在相关生物学和医学研究中的广泛应用。
附图说明
图1显示了新生SD大鼠视神经组织经Accusase消化后，在添加PDGF的无血清培养基中机械解离并在多聚赖氨酸包被的培养底面上培养4、6、8天时在倒置显微镜下的检测结果(同一视野连续观察)。培养4天后，可见成簇的少突胶质前体细胞出现(白色箭头所示)，细胞呈典型的双极或三极形态。伴随培养时间延长，克隆内细胞数目快速增多。黑色箭头所示为粘附的其它非少突胶质前体细胞如星形胶质细胞等，增殖速度相对缓慢。
图2显示了视神经原代取材细胞培养10天后，更换为不含B27添加剂的培养基并继续培养2天时，在倒置显微镜下的检测结果。可见少突胶质前体细胞已增殖形成较大克隆，右侧放大图片可见克隆内大量少突胶质前体细胞出现明显突起回缩，胞体发亮变圆，与培养底面的接触面积变少。黑色箭头所示为粘附的其它非少突胶质前体细胞如星形胶质细胞等，扁平多突起，形态无明显改变。
图3显示了突起回缩的视神经少突胶质前体细胞经震荡、吹打脱壁后传代接种，并重新加入B27添加剂进行培养时，在倒置显微镜下的检测结果。可见多数细胞呈典型的双极或三极形态。右图显示了首次传代的少突胶质前体细胞呈NG2免疫细胞化学荧光检测阳性。
图4显示了传代后，较高密度状态下的的视神经少突胶质前体细胞在倒置显微镜下以及进行A2B5/GC/DAPI和NG2/GFAP/DAPI免疫细胞化学荧光检测的结果。可见绝大部分细胞呈A2B5或GC阳性(>98％)，而呈GFAP阳性的星形胶质细胞数目极少(白色箭头所示)。
图5显示了视神经少突胶质前体细胞在撤除PDGF并添加T3的培养基中分化6天后，在倒置显微镜下以及进行MBP/DAPI免疫细胞化学荧光检测的结果。可见较多细胞突起密集分支，并呈MBP阳性，提示为分化成熟的少突胶质细胞。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中，未具体注明实施条件和方法处，均为按照常规实验方案，如《分子克隆实验指南(第三版)》([美]J.萨姆布鲁克，D.W拉塞尔著，2003)中所述方法或试剂生产商建议方案来开展。
实施例1：多聚赖氨酸预涂培养板
将溶于无菌蒸馏水(10mg/ml)的右旋多聚赖氨酸(PDL,Sigma公司P6407)或左旋多聚赖氨酸(PLL,Sigma公司P6282)溶液，用滤膜过滤除菌(0.22μm)后，吸入25ml培养瓶(Nunc公司)及6孔培养板(Corning公司)以及12孔培养板(内置经过泡酸及高温消毒处理后的盖玻片)。置于4℃过夜后，吸除多聚赖氨酸溶液，将培养瓶及培养板置于无菌37℃细胞箱或无菌超净台内，彻底晾干。收藏于4℃或室温保存(保存至少3周)。使用之前，用消毒蒸馏水至少清洗2遍。
实施例2：新生大鼠微量神经组织的获取、消化和机械解离
取新生1～3天的新生SD大鼠，经低温麻醉后断头，无菌条件下剪除眼睑皮肤后，在体视显微镜下剪取双侧眶内段视神经，每条长约2mm，置于D-PBS中清洗，随后用精细镊转移至含有至少0.5ml消化酶Accusase(Sigma公司A6964)的1.5ml EP管内，并将视神经置于管底，防止飘浮在消化酶表面。密封后置于37℃细胞培养箱内消化90分钟。消化过程中每隔30分钟轻轻摇晃EP管一次。消化结束，取出EP管，轻轻吸除Accusase，用D-PBS反复清洗视神经3～5次，将视神经连同D-PBS一起转移至15ml离心管内，彻底吸除D-PBS后，按照每条视神经约2ml的比例加入完全培养基。
无菌条件下获取的新生SD大鼠的单侧海马等微量神经组织，参照上述操作方法进行消化及处理(但消化时间较视神经缩短，海马消化30～60分钟)。
用经火焰抛光管口的1ml巴斯德玻璃吸管，轻轻插入离心管培养基内，轻轻连续吹打培养基中的消化后组织，约15～30次，使组织大部分或全部被吹散分离成细胞悬液，吹打分离过程尽量避免产生气泡。收集细胞悬液，经40μm尼龙细胞筛(Corning公司)进行过滤并收集，轻柔吹打混匀后，将细胞悬液种植在前述多聚赖氨酸涂布的6孔培养板(1.5ml/孔)或12孔培养板内(1ml/孔)内。
完全培养基的组成为：少突胶质前体细胞培养基的成分包括DMEM/F12基础培养液(Gibco公司)，2％B27无血清培养基添加剂(17504044 Invitrogen公司)、1％N2神经细胞生长添加剂(17502048Invitrogen公司)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma公司)、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素(Gibco公司)，并添加10ng/ml血小板源生长因子(Platelet-derived growthfactor-AA，PDGF-AA,PeproTech公司)。
实施例3：原代细胞培养与少突胶质前体细胞克隆形成
将细胞置于37℃、5％CO2条件下静置培养。培养基每2天完全换液一次，换液前，轻轻摇晃震荡培养板，促使部分死亡细胞及细胞碎片脱壁。
细胞培养4天后，可见小簇状增殖的少突胶质前体细胞，呈双极或三级突起，胞体圆形或椭圆形，与周围粘附的星形胶质细胞等区别明显。伴随培养时间延长，细胞克隆扩大，克隆内细胞数量快速增长；与此同时，粘附的其它非少突胶质前体细胞如星形胶质细胞等，增殖速度相对缓慢，培养细胞中少突胶质前体细胞的总体比例明显提高。
实施例4：利用特定成分短暂撤除方法降低少突胶质前体细胞粘附性
原代细胞培养约10天后，将培养基中B27添加剂暂时撤除，但仍继续加入N2添加剂以及PDGF。细胞继续培养2～3天，每2天换液一次。少突胶质前体细胞出现明显突起回缩，胞体发亮变圆，与培养底面的接触面积明显变少，易于脱壁。培养液中仍含有正常浓度N2添加剂及PDGF，可以维持少突胶质前体细胞的存活及处于未分化状态。与此同时，其它非少突胶质前体细胞如星形胶质细胞形态无明显改变。
实施例5：利用机械分离方法纯化少突胶质前体细胞
将上述培养细胞更换新培养液后(不含B27添加剂)，在超净台内操作台面上，轻轻震敲培养板10～20次，或用一支经火焰抛光管口的1ml巴斯德玻璃吸管，吸取培养液，轻轻吹打贴壁细胞，逐步遍及培养板底面，吹打过程中尽量避免产生气泡。大部分少突胶质前体细胞将在此震荡或吹打过程中脱壁，而绝大部分非少突胶质前体细胞仍然牢固贴壁。将培养液连同脱落细胞收集入一只新离心管，轻柔吹打混匀后进行细胞计数并调整细胞密度，加入2％B27添加剂，以及10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor，bFGF,PeproTech公司)，按照2×104cells/ml传代接种在新的培养瓶及培养板内。
实施例6：少突胶质前体细胞的传代培养以及诱导分化
上述机械分离纯化的少突胶质前体细胞在加入2％B27添加剂以及bFGF后，可以快速贴壁，重新伸出突起并快速增殖。细胞呈典型的双极或三极形态，纯度达98％以上。
细胞在培养5～6天后接近融合时进行传代：首先用D-PBS清洗细胞2次，加入Accusase消化2～3分钟，待细胞出现突起回缩现象后，快速彻底吸除Accusase，用D-PBS清洗2次后，加入完全培养基(含bFGF)轻轻吹打，使细胞脱壁，收集细胞悬液进行细胞计数及密度调整，按1:2或1:3比例传代。
细胞分化：将细胞培养基中的PDGF及bFGF撤除，添加15nM的三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine，T3，Sigma公司)，继续培养5～10天，每3天更换培养基一次。
实施例7：免疫细胞化学反应鉴定少突胶质前体细胞及少突胶质细胞
细胞用4％多聚甲醛室温固定20分钟。随后在室温用PBS清洗3次(15分钟)，并用含0.1％BSA的PBS继续清洗两次。随后在封闭液中(含10％正常驴血清及0.2％Triton X-100的PBS)室温封闭45分钟。加入一抗后4℃过夜，用PBS清洗3次后，加入对应二抗在室温避光反应孵育45分钟，PBS清洗3次后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司)染核，继续PBS清洗3次后，封闭观察。在荧光显微镜及共聚焦显微镜下观察拍照，并用相关软件进行分析。
一抗包括A2B5(MAB1416R&D)、NG2(D262413 BBILife)、GC(G9152 Sigma)、MBP(M3821 Sigma)、GFAP(Z0334 Dako)等，使用浓度按说明书及试剂盒提供的使用浓度进行。
Claims (3)
1.一种从新生大鼠微量神经组织获取少突胶质前体细胞并纯化培养的方法，其特征在于，将微量神经组织用消化酶Accusase进行适度消化并结合机械吹打，离解成单细胞悬液后，种植在多聚赖氨酸包被的培养底面上，并在添加血小板源生长因子即PDGF、B27无血清添加剂、N2无血清添加剂、L-谷氨酰胺的DMEM/F12基础培养液中进行贴壁培养，特异性地促使少突胶质前体细胞大量增殖，相对抑制非少突胶质前体细胞的增殖，培养10天后获得富含少突胶质前体细胞克隆的原代细胞；随后暂时撤除培养基中B27无血清添加剂2～3天，利用贴壁少突胶质前体细胞突起暂时回缩、粘附力明显降低的时机，结合人工机械分离方法，获得高纯度的少突胶质前体细胞；获得的大鼠少突胶质前体细胞具有连续增殖能力，能够连续传代，并具有有分化为成熟少突胶质细胞的能力；
包括步骤：
（1）新生大鼠微量神经组织的获取、消化和机械解离
无菌条件下获取新生SD大鼠微量神经组织，于消化酶Accusase内消化60～90分钟后，经机械吹打解离成细胞悬液，过滤后种植在多聚赖氨酸涂布的培养板内，用含有2% B27无血清添加剂、1% N2无血清添加剂和血小板源生长因子和L-谷氨酰胺的DMEM/F12基础培养基进行培养；
（2）原代细胞培养与少突胶质前体细胞克隆形成
细胞贴壁培养4天后，出现少突胶质前体细胞增殖克隆；与此同时，贴壁的其它非少突胶质前体细胞增殖速度相对缓慢，培养细胞中少突胶质前体细胞的总体比例明显提高；
（3）利用特定成分短暂撤除方法降低少突胶质前体细胞粘附性
原代细胞培养10天后，更换为不含B27添加剂的培养基，培养2～3天后，少突胶质前体细胞出现明显突起回缩，胞体发亮变圆，与培养底面的接触面积明显变少，易于脱壁；与此同时，其它非少突胶质前体细胞形态无明显改变；
（4）利用机械分离方法纯化少突胶质前体细胞
将上述培养细胞在无菌操作台内轻轻震荡或吹打，使大部分少突胶质前体细胞脱壁，而绝大部分非少突胶质前体细胞仍牢固贴壁；收集脱壁少突胶质前体细胞进行培养，重新加入2% B27无血清添加剂，并添加碱性成纤维细胞生长因子，即bFGF；
（5）少突胶质前体细胞的传代培养以及诱导分化
机械分离纯化的少突胶质前体细胞在加入2% B27无血清添加剂以及bFGF后，快速贴壁并增殖，细胞呈典型的双极或三极形态，纯度达98%以上；
细胞传代：Accusase消化2～3分钟后用D-PBS清洗，加入细胞培养基吹打使细胞脱壁，收集细胞按1:2或1:3比例传代；
细胞分化：将细胞培养基中的PDGF及bFGF撤除，添加15nm的三碘甲状腺原氨酸，继续培养5-10天，每3天更换培养基一次。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）的消化方法指将微量神经组织置于消化酶Accusase内消化30～90分钟，不再使用其它类型消化酶。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）特定成分短暂撤除是指撤除B27无血清添加剂2～3天。
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|---|
| 大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞的生物学特性;吴斌等;《华中科技大学学报(医学版)》;20121215(第06期);第723-726页 * |
| 大鼠视网膜内髓鞘形成模型的建立与研究;郑华等;《解剖学报》;20060406(第02期);第125-129页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109722419A (zh) | 2019-05-07 |
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