CN105695409B - 一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法 - Google Patents

一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105695409B
CN105695409B CN201610164348.3A CN201610164348A CN105695409B CN 105695409 B CN105695409 B CN 105695409B CN 201610164348 A CN201610164348 A CN 201610164348A CN 105695409 B CN105695409 B CN 105695409B
Authority
CN
China
Prior art keywords
precursor cells
culture
oligodendrocyte precursor
cell
naked mole
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610164348.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105695409A (zh
Inventor
崔淑芳
杨文静
孙伟
汤球
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second Military Medical University SMMU
Original Assignee
Second Military Medical University SMMU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Military Medical University SMMU filed Critical Second Military Medical University SMMU
Priority to CN201610164348.3A priority Critical patent/CN105695409B/zh
Publication of CN105695409A publication Critical patent/CN105695409A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105695409B publication Critical patent/CN105695409B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides, bases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞的分离纯化和培养方法。本发明综合使用多种培养基从裸鼹鼠胎鼠大脑皮层分离并纯化培养少突胶质前体细胞，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠少突胶质前体细胞的合理培养方法。本发明方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠少突胶质前体细胞，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠少突胶质前体细胞的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。

Description

一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法
技术领域：
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种细胞的分离纯化及培养方法，特别涉及一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞的分离纯化和培养方法。
背景技术：
少突胶质细胞(Oligodendrocyte)是中枢神经系统的成髓鞘细胞，其包绕有髓神经元轴突形成的髓鞘结构对神经元有营养、支持和保护作用，并且髓鞘的存在是神经元轴突动作电位高效传导的结构基础，能够保证神经元之间信息传递的速率。少突胶质细胞是由少突胶质前体细胞分化而来，在病理情况下，少突胶质前体细胞可以受到微环境的刺激而再次启动分化。在中风、脑白质营养不良以及新生儿缺血缺氧性脑病等多种与脑缺血缺氧相关的疾病中一般会伴随有髓鞘的损伤(Billiards SS,Haynes RL,Folkerth RD,Borenstein NS,Trachtenberg FL,Rowitch DH,Ligon KL,Volpe JJ,KinneyHC.2008.Myelin abnormalities without oligodendrocyte loss in periventricularleukomalacia.Brain Pathol 18:153–163.)。
裸鼹鼠是一种变温哺乳动物，在氧气浓度仅有6％左右的不通风洞穴中能够保持脑结构和功能的完整无损并进行正常的生命活动，尤其是耗氧量较高的少突胶质细胞。因此，研究裸鼹鼠少突胶质细胞特殊的低氧耐受能力对于脑缺血缺氧性疾病中少突胶质细胞损伤的治疗具有重要的指导意义。由于在体微环境非常复杂，无法在体直接观察少突胶质细胞在低氧环境中的功能改变情况及其适应机制，并且在体的结果可能容易受到微环境中其他细胞组分和结构的影响。因此需要建立离体的裸鼹鼠少突胶质细胞模型以弥补在体观察的缺陷。
而少突胶质细胞是由少突胶质前体细胞分化而来，虽然前者增殖能力较差，但是少突胶质前体细胞具有较强的分裂增殖能力，易于体外培养，并通过诱导其分化的方法得到少突胶质细胞。目前，研究人员已经摸索出诱导小鼠神经干细胞球分化为少突胶质前体细胞并进一步使其分化为少突胶质细胞，以及大鼠少突胶质前体细胞的培养方法(WenjingYang,Lin Xiao,Cui Li,Xiuyun Liu,Mingdong Liu,Qi Shao,Dan Wang,Aijun Huang andCheng He.TIP30 inhibits oligodendrocyte precursor cell differentiation viacytoplasmic sequestration of Olig1.Glia.2015；63(4):684-98.)。另外，中国专利CN200910251053.X，申请公布号为CN101735983A，公开了一种大鼠的少突胶质前体细胞的分离纯化方法，包括以下步骤：①获取混合细胞，混合细胞培养基由DMEM/F12培养基和体积分数为10％的胎牛血清组成；②培养混合细胞：混合神经细胞培养基由DMEM/F12培养基、体积分数为1％的N2添加剂和体积分数为15～20％的B104条件培养基组成；③消化分离少突胶质前体细胞；④纯化少突胶质前体细胞：少突胶质前体细胞纯化培养基由无糖DMEM培养基、浓度为5～10mmol/L的乳酸、体积分数为1％的N2添加剂和体积分数为15～20％的B104条件培养基组成。
但是现有技术中无论小鼠还是大鼠的少突胶质前体细胞分离纯化和培养方法均不适用于裸鼹鼠，目前国内外文献尚无有关裸鼹鼠少突胶质前体细胞分离纯化和培养方法的相关报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞的分离纯化和培养方法，以方便、高效的获得纯度高、状态好的裸鼹鼠少突胶质前体细胞，为体外建立裸鼹鼠少突胶质前体细胞提供技术支持，同时为体外研究裸鼹鼠少突胶质前体细胞的分化、迁移以及低氧耐受能力、以及裸鼹鼠少突胶质细胞低氧耐受机制的阐述和相应治疗药物或靶分子的筛选提供强大的保障。
我们试用了目前小鼠、大鼠的少突胶质前体细胞分离纯化和培养方法，结果发现均无法培养获得纯度高、状态好的裸鼹鼠少突胶质前体细胞，而且裸鼹鼠少突胶质前体细胞增殖的数量也较少。
关于裸鼹鼠少突胶质前体细胞的培养尚没有建立出可行的实验方法，我们分析其原因，主要是：1)裸鼹鼠是一种变温动物，其体细胞离体培养的温度有待摸索，并且其不恒定的机体代谢速率导致其体细胞体外培养基区别于普通的大鼠或小鼠；2)裸鼹鼠生存在较为阴暗潮湿的环境中，其体细胞的培养对湿度有较高的要求；3)裸鼹鼠已经适应了外界低氧的环境，所以其体细胞离体培养环境中的氧气浓度区别于常氧环境中生活的动物，并且需要摸索。
因此，裸鼹鼠少突胶质前体细胞的培养中最重要的摸索到合适的温度、湿度和氧气浓度，以及摸索到适合的培养基。
为达到此目的，本发明的裸鼹鼠少突胶质前体细胞的分离纯化方法包括以下步骤：
A、收集裸鼹鼠大脑皮层混合胶质细胞：
分离出生1-7天裸鼹鼠大脑皮层组织，将组织剪碎，加入消化液混匀之后，将其放入三气培养箱中消化；用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将细胞沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；将单细胞悬液种于包被有左旋多聚赖氨酸的培养瓶中；
所述的组织消化液，可以为常规的蛋白水解酶类消化液，例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，辅以DNA酶以解除DNA片段粘连所致的细胞聚集。
优选的消化液：质量浓度为0.125％的胰酶和/或终浓度为0.2mg/ml的DNA酶。
所述的混合神经细胞培养基，可以为常规的含血清混合神经细胞培养液，例如低糖DMEM等。优选的混合神经细胞培养基为含有15％体积百分比胎牛血清的低糖DMEM。
B、裸鼹鼠大脑皮层混合胶质细胞的培养：
将步骤A得到的混合胶质细胞，用混合神经细胞培养基中培养于三气培养箱中25--30天；自混合胶质细胞接种之后，每7天采取半量换液的方法更换胶质细胞混合培养基；
所述的混合神经细胞培养基，可以为常规的混合神经细胞培养液，例如含体积分数15％胎牛血清的低糖DMEM等。
C、裸鼹鼠少突胶质前体细胞的分离及纯化培养：
将步骤B培养的混合神经细胞于恒温震荡摇床培养，恒温35±2℃，将震荡培养的细胞悬液置于未包被有左旋多聚赖氨酸的培养皿中使细胞贴壁，使极易贴壁及贴壁能力强的其他胶质细胞贴于平皿底部，而少突胶质前体细胞由于仅在有左旋多聚赖氨酸包被的平皿商贴壁能力较强而悬浮在液体中，因此小心吸取上清，并将上清中的细胞种于包被有左旋多聚赖氨酸的培养皿中；待其贴壁后，用添加促分裂增殖因子的少突胶质前体细胞增殖培养基进行纯化培养；
所述的增殖培养基为Neurobasal/B27和促分裂增殖因子等，优选的增殖培养基为Neurobasal和B27以体积比为50:1的组合(添加体积百分数为2％B27的Neurobasal)。
添加促分裂增殖因子指的是添加B104条件上清。
所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5±1％，湿度为96±2％。
进一步，步骤A中，取出生1-7天裸鼹鼠大脑，剥除脑膜后分离皮层组织，用显微剪将组织剪碎至1mm3，加入消化液混匀之后，将其放入三气培养箱中消化；消化条件为：胰酶浓度为0.125％，DNA酶浓度为0.2mg/ml，时间为30分钟；然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将细胞沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；随后将单细胞悬液种于包被有左旋多聚赖氨酸的T25培养瓶中。
进一步，步骤A中，所述左旋多聚赖氨酸浓度为0.01mg/ml。
进一步，步骤A中，所述离心参数设置为室温下，800rpm，5分钟。
进一步，步骤B中，用混合神经细胞培养基中培养于三气培养箱中28天。
进一步，步骤C中，所述震荡培养时间为20小时。
进一步，步骤C中，所述恒温震荡摇床转速为200rpm。
进一步，步骤C中，恒温震荡培养过程中保持培养瓶口旋紧以减少瓶内外空气交换。
进一步，步骤C中，所述细胞贴壁时间为1小时。
进一步，步骤C中，所述B104条件上清的收集是利用神经母细胞瘤B104细胞培养于二气培养箱中，利用增殖培养基进行培养，待细胞生长至80％融合度时，换为Neurobasal/B27培养基培养48小时，随后收集上清并用0.22μm滤器过滤后置于-70℃保存备用。
进一步，所述二气培养箱参数设置为：37℃，21％氧气浓度，5％二氧化碳浓度，以及96％湿度。
进一步，所述少突胶质前体细胞增殖培养基为含有体积分数为30％B104条件上清的低糖DMEM。
本发明的有益效果在于：A、综合使用多种培养基从裸鼹鼠新生鼠大脑皮层分离并纯化培养少突胶质前体细胞，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠少突胶质前体细胞的合理培养方法。我们发现5％氧浓度条件下，细胞状态能够得到较好的保持，并能够保持增长；B、操作方法简单，具有较高的可重复性。利用摇床将所需的少突胶质前体细胞按一定的转速摇下，再进行第二次差速贴壁纯化，不仅能够得到纯度为98％以上的少突胶质前体细胞，而且能够最大程度的保持细胞活力和功能；C、通过使用少突胶质前体细胞增殖培养基，有效的保证了少突胶质前体细胞的增殖并保证纯度能够达到98％以上(针对少突胶质前体细胞特异性标记物NG2进行的免疫细胞化学染色结果)；④增殖培养基中无需额外添加生长因子，只需要利用B104细胞系的上清即可达到促进少突胶质前体细胞增殖的效果。
综上所述，本发明方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠少突胶质前体细胞，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠少突胶质前体细胞的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。
附图说明：
图1为体外培养的混合神经细胞，其中A为40倍镜下混合神经细胞，B为200倍镜下混合神经细胞。
图2为体外培养的少突胶质前体细胞(100倍光镜)。
图3为体外纯化培养的少突胶质前体细胞免疫细胞化学染色鉴定，其中A为NG2，B为Hoechst，C为NG2/Hoechst。
具体实施方式：
以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1：裸鼹鼠少突胶质前体细胞分离纯化及培养
1、实验材料
出生1-7的清洁级裸鼹鼠由中国人民解放军第二军医大学实验动物中心提供。将新生裸鼹鼠置于-20℃冰板进行麻醉后置于75％乙醇中浸泡10min，然后断头，并用青霉素100U/ml和0.1mg/ml链霉素混合液擦拭裸鼹鼠头部表面，然后剪开头部皮肤及颅骨，将大脑剥离并置于预冷的解剖液中。
DNA酶I购自Solarbio生物科技有限公司，胰蛋白酶、左旋多聚赖氨酸、青链霉素混合液等购自Sigma公司，DMEM、低糖DMEM、澳洲来源胎牛血清、Neurobasal培养基、B27无血清添加因子等购自Thermo Fisher Scientific公司，培养皿、T25和T75培养瓶购自Corning公司。
混合神经细胞培养基成分为低糖DMEM培养基含有体积分数为10％的胎牛血清，少突胶质前体细胞纯化培养基为Neurobasal+2％B27和体积分数为30％的B104条件上清。
B104条件上清的收集方法为：种于未包被有左旋多聚赖氨酸基质层的T75培养瓶中的B104细胞系，待细胞生长至80％满时，弃掉含有10％胎牛血清的DMEM培养基，同时用PBS润洗3遍，并将培养基更换为含有体积分数2％B27的Neurobasal培养基，于37℃，5％CO2，96％湿度的培养箱中继续培养48小时，然后将上清于1000rpm下离心5min，经0.22μm的滤器过滤后保存于-80℃备用。
2、裸鼹鼠少突胶质前体细胞分离纯化及培养方法
A、收集裸鼹鼠大脑皮层混合胶质细胞：取出生1-7天裸鼹鼠大脑2个，剥除脑膜后获得皮层组织并置于1ml解剖液中，用显微剪将组织剪碎至1mm3，加入消化液(0.25％质量体积分数的胰酶1ml和终浓度为0.2mg/ml的DNA酶I)混匀之后，将其放入三气培养箱中消化30min。然后用混合神经细胞培养基终止消化，800rpm条件下离心5分钟以去除上清，然后添加5ml混合神经细胞培养基中将细胞沉淀重悬并小心吹打成单细胞悬液(尽量避免气泡产生)。随后将单细胞悬液按照1×106密度种于包被有左旋多聚赖氨酸的T25培养瓶中，每瓶培养液体积为5ml。
B、裸鼹鼠大脑皮层混合胶质细胞的培养：将A、中得到的细胞，用混合神经细胞培养基于三气培养箱中培养28天。自细胞接种之后，每7天采取半量换液法更换培养基。
C、裸鼹鼠少突胶质前体细胞的分离及纯化培养：将B、中培养的混合胶质细胞(如图1所示，圆形有光晕的为少突胶质前体细胞)于35℃恒温震荡摇床中进行震荡培养20小时，震荡培养过程中保持培养瓶口旋紧以减少瓶内外空气交换。然后，将震荡培养的细胞悬液置于未包被有左旋多聚赖氨酸基质层的培养皿中使细胞贴壁，使极易贴壁及贴壁能力强的其他胶质细胞贴于平皿底部，而少突胶质前体细胞由于仅在有左旋多聚赖氨酸包被的平皿上贴壁能力较强而悬浮在液体中，因此小心吸取上清，并将上清中的细胞种于包被有左旋多聚赖氨酸的培养皿中。待其贴壁后，用含有体积分数为30％B104条件上清的Neurobasal/B27培养基进行培养(Neurobasal：B27＝50：1)24小时，即可得到纯化的少突胶质前体细胞，培养于35℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％的三气培养箱中。
实施例2：裸鼹鼠少突胶质前体细胞的鉴定
采用实施例1所得的裸鼹鼠少突胶质前体细胞的鉴定：利用4％多聚甲醛对处于增殖培养基中的少突胶质前体细胞进行固定，并结合形态学鉴定、免疫细化化学等方法进行鉴定。
1、细胞形态学鉴定：
鉴定方法参考文献中所述(Wenjing Yang,Lin Xiao,Cui Li,Xiuyun Liu,Mingdong Liu,Qi Shao,Dan Wang,Aijun Huang and Cheng He.TIP30 inhibitsoligodendrocyte precursor cell differentiation via cytoplasmic sequestrationof Olig1.Glia.2015；63(4):684-98.)。
结果如图2所示，光镜下，少突胶质前体细胞胞体呈圆形或椭圆形，胞体折光度较强，胞体周围有一圈明显的光晕，从胞体向周围伸出二极或三极突起。在增殖培养基中培养24小时后，细胞依然能够保持二极或三极突起的前体状态。
2、免疫细胞化学鉴定：
鉴定方法参考文献中所述(Wenjing Yang,Lin Xiao,Cui Li,Xiuyun Liu,Mingdong Liu,Qi Shao,Dan Wang,Aijun Huang and Cheng He.TIP30 inhibitsoligodendrocyte precursor cell differentiation via cytoplasmic sequestrationof Olig1.Glia.2015；63(4):684-98.)。
结果如图3所示，将差速贴壁纯化的少突胶质前体细胞进行爬片实验，在增殖培养基中培养24小时后，利用4％多聚甲醛将细胞固定，然后利用抗少突胶质前体细胞表面特异抗原NG2的抗体进行免疫细胞化学染色。结果显示，在增殖培养基中，细胞能够保持NG2阳性(红色荧光)的前体状态。
根据上述实验结果，本发明分离纯化的裸鼹鼠少突胶质前体细胞具备典型的少突胶质前体细胞形态，呈NG2阳性，并且具有典型的双极或三极突起，并在增殖培养基中能够保持良好的增殖状态。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (7)

1.一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法，包括以下步骤：
A、收集裸鼹鼠大脑皮层混合胶质细胞：
分离出生1-7天裸鼹鼠大脑皮层组织，将组织剪碎，加入消化液混匀之后，将其放入三气培养箱中消化；用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将细胞沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；将单细胞悬液种于包被有左旋多聚赖氨酸的培养瓶中；
B、裸鼹鼠大脑皮层混合神经细胞的培养：
将步骤A得到的混合神经细胞，用混合神经细胞培养基中培养于三气培养箱中25--30天；自混合神经细胞接种之后，每7天采取半量换液的方法更换混合神经细胞培养基；
C、裸鼹鼠少突胶质前体细胞的分离及纯化培养：
将步骤B培养的混合神经细胞恒温震荡摇床中培养，恒温35±2℃，将震荡培养的细胞悬液置于未包被有左旋多聚赖氨酸的培养皿中使细胞贴壁，小心吸取上清，并将上清中的细胞种于包被有左旋多聚赖氨酸的培养皿中；待其贴壁后，用添加B104条件上清的少突胶质前体细胞增殖培养基进行纯化培养；
所述的少突胶质前体细胞增殖培养基为Neurobasal和B27；
所述的混合神经细胞培养基为含体积分数为15％胎牛血清的低糖DMEM；
所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5±1％，湿度为96±2％；
步骤C中，所述震荡培养时间为20小时；所述恒温震荡摇床转速为200rpm；恒温震荡培养过程中保持培养瓶口旋紧以减少瓶内外空气交换；
步骤C中，所述B104条件上清的收集是利用神经母细胞瘤B104细胞培养于二气培养箱中，利用混合神经细胞增殖培养基进行培养，待细胞生长至80％融合度时，换为Neurobasal/B27培养基培养48小时，随后收集上清并用0.22μm滤器过滤后置于-70℃保存备用；所述二气培养箱参数设置为：37℃，21％氧气浓度，5％二氧化碳浓度，以及96％湿度；所述混合神经细胞增殖培养基为含有体积分数为15％胎牛血清的低糖DMEM。
2.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法，其特征在于，所述的消化液含有质量浓度为0.125％的胰酶和/或终浓度为0.2mg/ml的DNA酶I。
3.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法，其特征在于，所述的少突胶质前体细胞增殖培养基为Neurobasal和B27以体积比为50:1的组合。
4.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法，其特征在于，步骤A中，取出生1-7天裸鼹鼠大脑，剥除脑膜后分离皮层组织，用显微剪将组织剪碎至1mm3，加入消化液混匀之后，将其放入37℃培养箱中消化；消化条件为：胰酶质量浓度为0.125％，DNA酶I终浓度为0.2mg/ml，时间为30分钟；然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将细胞沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；随后将单细胞悬液种于包被有左旋多聚赖氨酸的T25培养瓶中。
5.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法，其特征在于，步骤A中，所述左旋多聚赖氨酸浓度为0.01mg/ml。
6.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法，其特征在于，步骤A中，所述离心参数设置为室温下，800rpm，5分钟。
7.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法，其特征在于，步骤B中，用混合神经细胞培养基中培养于三气培养箱中28天。
CN201610164348.3A 2016-03-22 2016-03-22 一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法 Active CN105695409B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610164348.3A CN105695409B (zh) 2016-03-22 2016-03-22 一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610164348.3A CN105695409B (zh) 2016-03-22 2016-03-22 一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105695409A CN105695409A (zh) 2016-06-22
CN105695409B true CN105695409B (zh) 2019-09-27

Family

ID=56232430

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610164348.3A Active CN105695409B (zh) 2016-03-22 2016-03-22 一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105695409B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109722416B (zh) * 2017-10-29 2023-12-01 复旦大学 一种纯化培养大鼠少突胶质前体细胞的培养基及使用方法
CN109722419B (zh) * 2017-10-29 2023-12-01 复旦大学 一种利用微量神经组织获取和培养少突胶质前体细胞的方法
CN109722418B (zh) * 2017-10-29 2023-01-03 复旦大学 一种获取和纯化新生小鼠少突胶质前体细胞的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1833021A (zh) * 2003-07-18 2006-09-13 大冢制药株式会社 少突胶质祖细胞和获得及培养它们的方法
CN101735983A (zh) * 2009-12-29 2010-06-16 中国人民解放军第三军医大学 少突胶质前体细胞的分离纯化方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1833021A (zh) * 2003-07-18 2006-09-13 大冢制药株式会社 少突胶质祖细胞和获得及培养它们的方法
CN101735983A (zh) * 2009-12-29 2010-06-16 中国人民解放军第三军医大学 少突胶质前体细胞的分离纯化方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells";Ying Chen et al.;《NATURE PROTOCOLS》;20070426;第2卷(第5期);第1045-1048页 *
"PREPARATION OF SEPARATE ASTROGLIAL AND OLIGODENDROGLIAL CELL CULTURES FROMRAT CEREBRAL TISSUE";KEN D.McCARTHY et al.;《THE JOURNAL OF CELL BIOLOGY》;19800601;第85卷;第890-902页 *
"SD大鼠少突胶质前体细胞系的分离、培养及鉴定";唐军 等;《实用儿科临床杂志》;20061231;第21卷(第23期);第1657-1659页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105695409A (zh) 2016-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7897388B2 (en) Growth of neural precursor cells using umbilical cord blood serum and a process for the preparation for therapeutic purposes
CN104726406B (zh) 一种诱导牙髓间充质干细胞分化为神经细胞的方法
US20110217385A1 (en) Method for extracting mesenchymal stem cell from human or animal embryo and for extracting the secretion product thereof
CN106367389A (zh) 一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法及应用
CN101735983B (zh) 少突胶质前体细胞的分离纯化方法
CN105695409B (zh) 一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法
CN105695410B (zh) 一种裸鼹鼠小胶质细胞培养方法
CN108865997B (zh) 一种用于体外培养星形胶质细胞的培养基及培养方法
CN105754943B (zh) 一种裸鼹鼠海马神经元培养方法
CN106754716B (zh) 一种裸鼹鼠雪旺细胞培养方法
CN102703387A (zh) 一种星形胶质细胞分离和培养方法
CN108070558B (zh) 一种临床级神经干细胞的制备方法
CN105695408B (zh) 一种裸鼹鼠星形胶质细胞培养方法
CN103060265A (zh) 老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法
CN113249316A (zh) 脐带/胎盘间充质干细胞源性外泌体的制备方法及应用
CN102206611A (zh) 一种羊水源性神经干细胞的分离培养方法
CN107513519A (zh) 一种雪旺细胞的培养方法
CN109722416B (zh) 一种纯化培养大鼠少突胶质前体细胞的培养基及使用方法
CN114507635B (zh) 一种动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法
CN109666642B (zh) 一种树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法
CN106635990A (zh) 一种原代培养背根神经节卫星胶质细胞的方法
CN105695411B (zh) 一种裸鼹鼠皮层神经元培养方法
CN109439614B (zh) 一种维持和恢复毛乳头细胞干性的外泌体制剂
CN106676063A (zh) 一种人羊膜间充质干细胞的分离培养方法
CN106906177A (zh) 一种裸鼹鼠睾丸间质细胞分离纯化及培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant