CN107952113A - 一种人羊膜神经管的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人羊膜神经管的制备方法，及其在修复周围神经腓总神经损伤中的应用，采用机械剥离与生物胶粘合，制备周围神经损伤修复用羊膜神经管，包被于完全离断的腓总神经，依据实验观察的羊膜吸收情况和缝合腓总神经的功能恢复时间，确定构成羊膜神经管的羊膜层叠数，羊膜神经管应用于5mm较长的腓总神经缺损缝合后的促再生修复，取得满意疗效，受损神经支配区域趾展功能、神经传导速度、腓总神经大体解剖和胫骨前肌肌肉组织病理学均在较短时间恢复，同时羊膜也在一定的时间内被完全吸收，有利于外周刺激信号上传，受损神经信号上传的轴浆运输也得到恢复，且促进神经轴突再生的神经生长因子明显表达上调，而抑制轴突再生的因子明显下调。

Description

一种人羊膜神经管的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术与医学领域，具体涉及一种人羊膜神经管的制备方法及应用。

背景技术

临床常见的周围神经损伤多为创伤所致，可单独发生，或与其他组织损伤合并发生，也可由于压迫、感染、缺血、肿瘤或营养障碍等引起。周围神经损伤后，受该神经支配区的运动，感觉和营养均将发生障碍。临床上表现为疼痛、肌肉瘫痪，皮肤粗糙、无汗、萎缩、破溃，感觉减退或消失，血运障碍等。故而需要及时恢复神经连续性和完整性，并保证神经和髓鞘在适宜的微环境下再生，才能使损伤的神经得以修复，保障受损神经支配区域功能的康复，减轻神经支配区的肌肉萎缩和感觉障碍。

近年来，越来越多的研究运用组织工程技术制备多种神经管，桥接神经断端，建立神经再生通道，明显促进了神经损伤的再生与修复；给予神经营养因子，促进轴突再生，施万氏细胞增殖；损伤神经周围包裹生物材料，防止粘连；移植间充质干细胞，抗炎、改善神经再生微环境与血供等，在周围神经损伤的修复中都产生了较好的修复作用，展示了良好的生物技术临床应用前景。然而，如何构建更加仿真的神经管或具有多种生物活性的神经管，使用生物特性更优的生物材料或赋予生物材料新的活性等，一直是周围神经损伤修复学领域积极探索的重要研究课题。所需生物材料生物相容性、降解情况、可塑性和赋予的生物学功能及合理使用等，都决定着神经再生、修复的质量。常用的生物材料有壳聚糖、聚乳酸和聚羟基乙酸共聚物复合膜、几丁糖-胶原-二丙酸、纤维蛋白凝胶等，这些生物材料均具有良好的生物相容性，能防止神经粘连，并为神经提供了相对较好的再生微环境。

人羊膜(human amniotic membrane，HAM)作为一种生物材料已有悠久的历史，近30年来，才逐渐成为关注与研究的重点，目前已较为广泛地应用于眼表损伤、角膜重建、阴道修补、皮肤烧伤、组织填充、支架材料及神经管制作等。研究表明羊膜具有非致瘤性和低免疫原性，其抗菌、抗病毒、抗炎作用与分泌多种活性因子等功能特性，如分泌转化生长因子-β、表皮生长因子、基质细胞衍生因子、血管内皮细胞生长因子、多型胶原等，使其成为了医用生物材料开发的良好来源；作为废弃物，使用中存在的伦理争议非常小，来源十分丰富，也促成了羊膜产品的研发。近年多篇文献报道，鉴于羊膜的分泌功能等，将新鲜或冻干的羊膜作为周围神经修复的材料可明显促进损伤神经功能的恢复，但其具体修复神经作用报道不尽一致，修复的作用机制更是了解甚少。

发明内容

本发明意在提供一种利用新鲜的人羊膜制作的神经管，以促进损伤神经功能的恢复，并进一步研究其修复的作用机制。

本发明的一种人羊膜神经管的制备方法，取2～4层新鲜的人羊膜片，边缘用临床体内应用的粘合剂粘合封闭制成人羊膜神经管。

进一步，所述粘合剂为医用OB胶或医用组织胶水。医用OB胶为外科封堵瘘口用的氰基烯酸酯胶，医用组织胶水为外科伤口闭合、止血所用的α-氰基丙烯酸正丁酯。

进一步的，所述新鲜的人羊膜片为无菌获取的胎儿娩出后、去除表面粘液及血渍的胎盘附属物后获得。

进一步的，所述人羊膜片为3层。

本发明的工作原理及有益效果在于：(1)应用市售医用OB胶或医用组织胶水粘合新鲜羊膜片，可灵活调整制备神经管的大小；(2)利用HAM分泌多种活性物质，发挥抗炎作用等生物学功能，为神经再生提供合适的微环境，HAM也可能为施万氏细胞增生，形成施万氏管提供生物材料支架，从而促进了轴突的再生；(3)活性HAM的应用，可能减轻神经元变性，较快地恢复神经的连续性，恢复了神经功能和逆向轴浆运输，改善了神经损伤及Wallerian变性所导致的多种神经再生与再生抑制因子的分子变化。总之，本发明的效果验证实验中，不但很好地证明了这种HAM神经管良好的促周围神经损伤修复作用，还明确了可能涉及的多种作用机制，为HAM神经管的进一步开发利用奠定了关键技术基础和重要的实验研究证据。

人羊膜神经管在修复周围神经腓总神经损伤的应用。具体为将长2.0～4.0cm×宽1.0～2.0cm大小的人羊膜片环绕包裹于缝合的腓总神经断端周围，神经管侧面、人羊膜片边缘用医用OB胶或医用组织胶水封闭。人羊膜神经管包裹与腓总神经断端缝合处，14和28天检测大鼠趾展指数提高，腓总神经断端缝合处上下端神经传导速度，胫骨前肌肌肉恢复率和组织病理学变化、轴突运输明显改善，腓总神经损伤恢复良好。

与腓总神经损伤模型动物不同，人羊膜片神经管应用后，脊髓(L4～L5)组织中BDNF、脑衰蛋白反应调节蛋白-2(collapsin response mediator protein-2，CRMP-2)、生长相关蛋白-43(growth associated protein,GAP-43)和NGF mRNA表达已明显降低至正常水平。

本发明利用医用OB胶或医用组织胶水粘合羊膜，并经过实验观察羊膜吸收情况和缝合腓总神经功能恢复时间，确定了羊膜层叠层数，制备了新鲜羊膜神经管，充分利用了羊膜的多种生物学功能，将这种羊膜神经管应用于5mm较长的腓总神经缺损缝合后的促再生修复，取得了满意疗效，受损神经支配区域趾展功能、神经传导速度、腓总神经大体解剖和胫骨前肌肌肉组织病理学均在较短时间恢复，同时羊膜也在一定的时间内被完全吸收，有利于外周刺激信号上传，受损神经信号上传的轴浆运输也得到恢复，且促进神经轴突再生的明显表达上调，而抑制轴突再生的明显下调。本发明所采用的羊膜神经管制备方法不但国内外尚未见相关报道，研究结果从腓总神经支配区域功能、神经传导速度、神经离断区域腓总神经大体解剖和支配区胫前肌肌肉组织病理学、快蓝逆行荧光示踪及神经轴突再生正负调节基因表达多个层面明确的修复效果和机制也未见报道。

附图说明

图1动物分组及建立腓总神经损伤模型图；

图2术后28天术区腓总神经局部肉眼观察图；

图3术后3、14和28天羊膜神经管对腓总神经损伤大鼠趾展功能变化的影响图；

图4术后28天腓总神经损伤测胫骨前肌肌肉HE染色图(100×)；

图5术后28天腰骶部脊髓组织快蓝逆行荧光示踪图(50×)。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细的说明：

一、实验过程

1.人羊膜获取：经产妇及家属知情同意后，从遵义市妇幼保健院获取，无菌条件机械剥离羊膜，4oC保存，2h内制备新鲜羊膜，产前血清学检测排除乙肝、梅毒与获得性免疫缺陷综合症。

2实验动物：成年健康SD大鼠，72只，体重180～220g，雌雄不限。由第三军医大学实验动物中心提供(许可证号：SCXK(渝)2007-0003)，清洁动物室适应性饲养1周后用于实验。实验过程符合《实验动物管理条例》。

3方法

3.1HAM神经管的制备

无菌剥离新鲜胎盘羊膜，D-Hank’s液(含双抗,终浓度为青霉素:100IU/ml,链霉素:0.1mg/ml，临用前新鲜配制)反复冲洗，刮除羊膜表面黏液及残留血渍，将羊膜剪成1.5-3×1-2.5cm2大小的羊膜片，置入LG-DMEM(Gibco，New York，USA))基础培养基中，4℃保存，12h内使用，用前D-PBS冲洗干净。

将剪好的羊膜片，置于缝合好的腓总神经下方，将一端轻轻贴合于缝合神经表面，顺时针将羊膜片松紧适度地包裹神经干两层，神经管侧预留羊膜片边缘采用医用OB胶(广州白云医用胶有限公司)或医用组织胶水(北京康派特医疗器械有限公司)粘合、封闭，剪去多余的羊膜。

3.2分组及制备腓总神经损伤模型

SD大鼠随机分组(n＝12)，7％水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠，消毒右侧股后部，沿坐骨神经体表走行作斜行约25mm长切口，用玻璃分针暴露、游离腓总神经，切除腓总神经干5mm。使其自然回缩，形成一定间隙。各组大鼠作如下处理。

空白组：分离、暴露、不损伤腓总神经干；

模型组：用10-0非吸收性外科缝线将腓总神经干近心断端包埋于邻近肌肉内，远心侧断端游离；

缝合组：10-0非吸收性外科缝线将腓总神经干近心侧和远心侧断端行神经外膜端端缝合3针；

HAM神经管组：无菌羊膜片环绕包裹于缝合的腓总神经断端周围2层，边缘用医用OB胶或医用组织胶水封闭。

3.3术后观察与检测

(1)一般情况分别于术后3、14和28天观察各组大鼠步态、足迹、脚部皮肤组织溃疡及伤口愈合情况。

(2)术区剖检 分别于术后14天每组处死2只大鼠，检测羊膜吸收情况及缝合神经情况；术后28天剖检术区，观察周围组织炎症、粘连及瘢痕情况，HAM神经管形态与吸收情况。

(3)趾展功能检测 自制大鼠行走箱，宽约10cm，高约20cm，长约70cm的通道，分别在术后3、14和28天，大鼠双侧后足醮印油后即放入通道的一端,待其自行走向另一端,选取术侧及正常侧足印合适清晰脚印测量第1至第5足趾宽度(Toe spread,TS)，如果脚出现爪形或者足印有拖尾不能检测，可以提住大鼠颈背部皮肤，让其站立于白纸，用手测量足趾之间宽度。计算趾展功能(Toe spread function,TSF)。TSF＝(ETS/NTS)×100％。式中E代表手术侧，N代表正常侧。

(4)神经传导速度检测

术后28天，检测神经传导速度。麻醉大鼠，连接好导线，启动BL-420E系统，将刺激电极刺入大鼠右侧坐骨神经传出部位，距刺激电极下行约1.5cm，将引导电极1刺入坐骨神经体表投影区。距引导电极1约2cm，引导电极2插入胫骨前肌，准确测量引导电极1、2之间距离d，公共地线连接在刮净皮毛处。BL-420E启动步骤：试验项目—肌肉神经实验—神经干动作电位引导，参数：输入引导电极1、2之间距离，刺激波宽0.1ms，强度5～10V，按下50HZ滤除50HZ干扰系统。实验中需要反复调试刺激电极，引导电极，直至电脑显示屏出现引导电极1和引导电极2的复合肌动作电位为止。并可以适当增加刺激电极电压强度，记录两引导电极动作电位的潜伏期，BL-NewCentury软件自动计算神经传导速度。

(5)微量进样器制作 抽出玻璃微电极内导丝，用P-97型微电极拉制仪拉制玻璃微电极形成尖端有微孔玻璃管，将玻璃管与微量进样器密闭连接，作为腓总神经干注射FB进样器。

(6)FB逆行荧光示踪 为验证神经干连续性，利用轴浆逆行运输原理，术后28天，在空白组腓总神经干远心侧，在缝合组腓总神经干断端缝合处远心侧以远5mm，在羊膜管组腓总神经干断端远心侧和羊膜管连接处以远5mm处，在模型组腓总神经干断端远心侧以远5mm，分别用微量进样器在神经干内注射2.5％FB 5μL，24h后处死大鼠，取脊髓(L4～L5)和脊髓腰骶膨大标本，连续冰冻做脊髓纵行切片，片厚8μm，倒置荧光显微镜下(紫外激发340～380nm)，观察并照相。

(7)组织病理学检查 术后28天，处死大鼠，分别取手术侧及对侧胫骨前肌固定4％多聚甲醛中，石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下对比观察肌肉病理学变化。

(8)胫骨前肌肌肉恢复率 自大鼠胫骨前肌起止点完整取术侧及正常侧小腿胫骨前肌，滤纸蘸干血液，天平准确称量湿重，胫骨前肌肌肉恢复率＝(术侧肌重/正常侧肌重)×100％。

(9)脊髓组织总RNA提取 留取新鲜L4～L5的脊髓组织约50mg，加入宝生物工程(大连)有限公司公司RNAzol提取试剂，按照RNAzol试剂说明书要求，依次加入氯仿、异丙醇提出总RNA，弃上清液，控干，加入DEPC配置的75％乙醇1mL，清洗RNA沉淀，振荡混匀，4℃，12000rpm离心10min。去除乙醇溶液，控干RNA沉淀5～10min，加入适量0.1％DEPC。

(10)RNA含量测定与完整性检测 总RNA样品稀释50倍后用紫外分光光度计同时测定OD260和OD280值。OD260/OD280值在1.8～2.0之间者用于后续实验。RNA样品进行1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定RNA的完整性。

(11)定量PCR检测 检测上述各组留取脊髓组织中神经再生相关基因BDNF、CNTF、CRMP-2、GAP-43、GDNF、Lingo-1、NGF和β-actin mRNA表达情况，目的基因和内参基因的引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成，所测基因引物序列如表1所示。

表1检测基因引物序列

注：β-actin是内参基因。

按照宝生物工程(大连)有限公司公司逆转录试剂盒要求，进行逆转录，反应体系如下，反应条件：37℃ 15min，85℃ 5sec。

注：各组Total RNA浓度统一稀释至50ng/μL。

实时聚合酶链反应(Real time polymerase chain reaction，RT-PCR)如下：

a.反应体系如下：

b.反应条件：预变性：95℃ 30sec，一个循环；PCR反应：95℃ 5sec，55-60℃,30sec，共40个循环。

c.结果计算(相对定量法)

以Ct值为统计参数计算下列数据：

Ct average＝(Ct1+Ct2)/2(重复管)

dCt＝Ct average-中间值

目的基因的表达＝2^(-dCt)

目的基因的相对表达＝目的基因的表达/内参基因的表达

4.统计学处理采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析LDS检验，P<0.05认为差异是有统计学意义统计学处理

二、实验结果

1.行走与足印 术后3天，空白组跛行最轻外，其余各组大鼠右后肢出现跛行或者足不触地，第3天的行走足迹可见，各组大鼠左侧(L，健侧)足迹清晰，足印较右侧(手术侧)大，健侧第1足趾至第5足趾的距离即趾展距离，明显较手术侧宽，空白组足印与趾展距离均明显较其他腓总神经离断处理组大而宽。术后14天，模型组出现足内翻，足蜷缩，跛行更明显，而空白组、羊膜组与缝合组足印与趾展距离明显较模型组大而宽。术后28天，模型组足内翻，足背拱起，跛行及胫骨前肌肌肉萎缩严重，因足趾过于蜷缩，可导致足趾间距离难以辨认，并发现1只大鼠术侧足肿胀明显，并出现皮肤破溃与存在散在出血、坏死。羊膜片组手术测后肢同健侧足印大小和趾展距离比较明显恢复，肌肉萎缩也不明显。

2.术区剖检观察 术后14和28天，解剖肉眼观察可见，术区各组均有不同程度的组织粘连，空白组最轻，缝合组与羊膜组次之，模型组神经与周围组织粘连较多。术后28天，分离损伤腓总神经周围及粘连组织，可见模型组神经缺损明显存在。而空白组、缝合组和羊膜片组神经缝合处均可见较好的神经干连续，未见处及其外膜连续性存在，未见脓肿和神经瘤形成。羊膜组绝大部分羊膜以被吸收，且神经与周围的粘连较模型组、缝合组轻，较易分离缝合的腓总神经(图3)。

3.趾展功能 一定范围内，大鼠术侧后足TSF值越高，说明腓总神经功能越接近正常，即表明损伤的腓总神经功能恢复更好。术后第3天，与模型组比较，缝合组和羊膜组TSF比较均无明显差异(P>0.05)，3组TSF均明显低手术前及空白组(P<0.05或P<0.01)，说明腓总神经损伤造模成功。术后14天，尽管羊膜组TSF略小于空白组(P<0.05)，但羊膜组TSF明显高于模型组和缝合组。术后28天，与模型组比较，羊膜组、缝合组TSF明显增高(P<0.01)，但均小于空白组，即各组腓总神经功能都有明显恢复，但未完全达到正常，羊膜组优于缝合组(表2)。

表2手术前后大鼠TSF变化(n＝8)。

与模型组比，▲▲P<0.01；与空白组比，△P<0.05,△△P<0.01；与羊膜组比，*P<0.05，**P<0.01.

4.神经传导速度改变 术后28天检测电生理检测结果显示，模型组未出现动作电位，其他各组均出现动作电位，与模型组比较，各组神经传导速度明显提高(P<0.01，表3)，说明缝合及羊膜神经管包被神经的连续性均得到良好恢复，神经功能也得到明显恢复，神经冲动下传速度已达空白组水平。

表3术后28天大鼠术侧神经传导速度的变化(n＝5-6)

与模型组比，▲▲P<0.01.

5.胫骨前肌肌肉恢复率 术后28天各组动物均有不同蹭到肌肉萎缩，其中空白组肌肉萎缩恢复率最高，模型组恢复率最低。缝合组与羊膜组肌肉萎缩恢复率明显高于模型组(P<0.01)，两组间无明显差异，但均低于空白组(P<0.05)。

表4术后28d胫骨前肌湿重肌肉恢复百分率(n＝7-8)

与模型组比，▲P<0.05,▲▲P<0.01；与空白组比，△△P<0.01.

6.胫骨前肌组织病理学变化 术后28天，空白组未见明显肌肉萎缩，肌纤维大小、形态一致，排列规则，肌间隙正常，未见肌纤维变性、坏死。模型组出现严重肌肉萎缩，肌纤维大小、形态不一致，排列杂乱，肌间隙宽窄不一，肌纤维断裂，严重变性，并有大量炎细胞浸润。缝合组和羊膜组中，均可见一定程度的肌肉萎缩、肌纤维变性。羊膜组肌间隙增宽较轻，肌纤维排列、形态较一致，组织形态结构与空白组相似，炎细胞浸润最少(图4)。

7.快蓝逆行荧光示踪 腰骶部脊髓冰冻切片缝合组、羊膜组、空白组均可见快蓝蓝色荧光，说明损伤的腓总神经与空白组一样，存在逆向轴浆运输，表明神经连续性较好，周围组织刺激，也可较好地上传至脊髓(图5)；视野可见空白组中荧光多于缝合组和羊膜组，提示后两组腓总神经未完全恢复，逆向轴浆运输相对较差。模型组脊髓组织中缺未见荧光，也进一步确证了模型的制备成功及腓总神经离断损伤不能自行恢复的结果。

8.脊髓中轴突再生相关基因的表达 被用于扩增目的基因的总mRNA电泳后，出现清晰的28S和18S两条泳带，且28S条带宽度大于1818S，所提取RNA完整性良好。腓总神经损伤采用不同处理干预28天后，定量PCR检测脊髓组织中轴突再生相关基因表达，结果显示：模型组BDNF、CRMP-2、GAP-43、NGF和Lingo-1mRNA表达水平明显高于空白组，而GDNF mRNA表达水平低于模型组；与模型组比较，缝合组、羊膜组BDNF、CRMP-2mRNA表达均明显降低，羊膜组NGF mRNA水平也明显降低，而缝合组与羊膜组GDNF mRNA有所增高，但明显统计学差异。与空白组比较，缝合组除GDNF mRNA外，上述其他5种基因表达水平均明显较高(P<0.05，P<0.01)；羊膜组除Lingo-1、NGF mRNA表达水平仍高于空白组外(P<0.01)，其他5种基因表达水平已达空白组水平(见表5)。

表5术后28天大鼠脊髓6种轴突再生相关基因mRNA相对表达量变化(n＝4)。

与空白组比，△P<0.05,△△P<0.01；与模型组比，▲P<0.05,▲▲P<0.01；与缝合组比，#P<0.05.

三、结论

上述研究发现，腓总神经损伤模型大鼠，均表现出跛行，损伤侧足印小、趾展距离缩小，TSF下降，神经传导速度减慢，1个月后腓总神经仍处于离断状态，并已出现胫前肌肌肉恢复下降和明显肌肉萎缩，不能经逆行轴浆运输将快蓝送到腰骶部脊髓。这些结果与文献报道腓总神经损伤的行为学、组织病理学和功能学改变一致，表明模型制备成功。实验发现，与模型组不同的是，随着时间的推移，羊膜神经管包裹处理与缝合组大鼠，分别于手术后第3-14天、14-28天出现明显的跛行减轻、足印增大，趾展距离增宽与TSF提高，且羊膜神经管组神经传导速度明显较高，胫前肌肌肉恢复率提高，损伤神经周围组织粘连也较轻，没有明显的肌肉萎缩，缝合组上存在较轻的肌肉萎缩，在脊髓也可见到经逆行轴浆运输抵达腰骶部的快蓝蓝色荧光。表明羊膜神经管包裹缝合的离断腓总神经，具有明显的促进腓总神经功能恢复的作用，羊膜神经管的使用不但使神经功能恢复明显较缝合组提前，还进一步减轻了腓总神经支配的胫前肌肉萎缩，且作用明显优于缝合组，这也提示，羊膜神经管的应用可能加速了轴突的再生，从而更好得维持了支配区的肌肉功能。术区剖检中发现羊膜神经管处理组神经与周围组织粘连明显较轻，表明羊膜神经管在肌腱修复等中的相似，具有明显的抑制周围组织粘连作用。这些作用可能与羊膜所具有的分泌多种生长因子及抗炎作用等有关。此外，1-4层羊膜使用，于28d内已基本降解、吸收，与文献所述羊膜具有良好的生物相容性和低免疫原性相一致。以往的研究还表明，间充质干细胞能促进施旺细胞增殖，羊膜自身的生物活性及所含的干细胞可能也通过促进施旺细胞增殖，或促进髓鞘形成，而加速轴突沿施旺氏管延伸，在重建中断的腓总神经连续性中发挥重要作用。

神经传导速度是观察神经功能恢复及其连续性的重要方法之一，而快蓝逆行荧光示踪则主要反映逆向轴浆运输情况。实验中，羊膜组不但神经传导速度较快，神经连续性恢复较好，且逆向轴浆运输功能虽不及空白组，但明显优于缝合组，表明损伤的腓总神经的逆向轴浆运输功能也得到了较好恢复，提示羊膜神经管的应用还促进了神经血管重建、腓总神经非运动功能恢复，如感觉神经功能恢复等。

周围神经损伤后轴突的再生，其神经元胞体所在的脊髓组织中促神经再生的营养因子和抑制神经再生蛋白的作用起着重要作用。胶质细胞分泌的BDNF是神经营养因子家族的重要一员，不仅刺激胶质细胞产生反应，还具有神经保护作用。在周围神经系统中，BDNF促进轴突再生和近端轴芽向远端生长，并使施万细胞向损伤处迁移并分泌BDNF。超短波和BMSCs联合修复周围神经损伤时，BDNF mRNA表达在脊髓和肌肉中均有增高。CRMP-2在生长中的轴突、树突和分化中的神经元内相对较高表达，在神经元的极性和轴突延伸方面作用明显，促进微管蛋白组装，参与骨架蛋白重建，可将微管蛋白运输至轴突生长锥，促进轴突延伸。GAP-43主要存在于再生神经轴芽末端，也可表达于神经系统多个部位，对轴突再生和轴突导向、神经元生长和发育均发挥作用。成熟运动神经元轴索的生长和突触的可塑性均受抑制，正常成年大鼠脊髓虽有一定数量的GAP-43mRNA阳性细胞，但不被翻译成蛋白质。研究报道，大鼠坐骨神经损伤再生时，术后7天，脊髓前角运动神经元胞体中GAP-43mRNA表达达高峰，30天时降至较低水平，GAP-43的不同时间段高低表达可能是神经功能损伤和恢复的表现。NGF广泛分布于神经组织和非神经组织，参与调节中枢神经系统神经元的发育和分化，作为信使分子参与神经突触功能调节，可保护脊髓前角运动神经元，支持神经元存活；在周围神经系统中促进轴突再生和髓鞘形成；药物修复周围神经损伤后，NGF在脊髓中表达会低于模型组，有利于减少疼痛和减少形成神经瘤风险，NGF的表达上调可促发痛、触觉过敏。实验初步检测了上述神经营养因子表达情况，结果模型大鼠脊髓组织中BDNF、CRMP-2、NGF和GAP-43mRNA表达水平明显高于空白组，前三者也高于羊膜组，进一步印证了羊膜组腓总神经几近完全修复后，上述促神经、轴突再生因子基因表达恢复近正常水平的分子证据，进一步证明羊膜组疗效优于单纯缝合组；而其他两组的相关基因表达水平也从动态变化的分子水平，吻合了腓总神经损伤尚处于修复过程中。

Lingo-1作为髓鞘形成的负性调控蛋白，是神经元和少突胶质细胞表达的跨膜信号蛋白，不表达于非神经组织和星形胶质细胞，大脑皮质内含量最多，脊髓中最少，作用是阴性调节髓鞘形成，抑制其表达可促进神经功能恢复和神经轴突生长。BDNF可降低Lingo-1mRNA的表达水平,减轻轴突生长的抑制。与空白组比较，制备了周围神经损伤的各组大鼠脊髓组织Lingo-1mRNA表达明显上调，提示尽管离断的腓总神经功能在给予不同处理后，神经功能得到了一定恢复。神经元、靶组织及胶质细胞合成的GDNF，具有神经元保护和促神经损伤修复作用，臂丛神经损伤后，近端神经元的保护作用与GDNF与其受体增多及其信号通路激活有关。如果损伤周围神经不处理，脊髓由于失去靶组织转运GDNF mRNA，就会导致脊髓中GDNF表达逐渐降低。模型组GDNF mRNA表达的降低，再一次印证了靶组织至脊髓逆向转运中断，脊髓中表达GDNF mRNA的减少，而其他修复组GDNF mRNA表达与空白组无显著差异的结果，可能与各组神经得到一定修复有关。

综上，新鲜HAM神经管可及早促进离断后缝合的腓总神经功能恢复；羊膜神经管对大鼠腓总神经损伤的修复作用，不但表现为神经功能及其支配效应肌肉功能及组织病理学的改善，还可能与调节BDNF、CRMP-2、GAP-43、Lingo-1、NGF和GDVF mRNA表达有关。羊膜神经管对腓总神经损伤的修复效果总体疗效评价优于缝合术，尤其是神经功能恢复时间提前、组织病理学与逆行轴浆运输方面更为突出。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (6)

1.一种人羊膜神经管的制备方法，其特征在于，取2～4层新鲜的人羊膜片，边缘用临床体内应用的粘合剂粘合封闭制成人羊膜神经管。

2.根据权利要求1所述的人羊膜神经管的制备方法，其特征在于：所述粘合剂为医用OB胶或医用组织胶水。

3.根据权利要求2所述的人羊膜神经管的制备方法，其特征在于：所述新鲜的人羊膜片为无菌获取的胎儿娩出后、去除表面粘液及血渍的胎盘附属物后获得。

4.根据权利要求3所述的人羊膜神经管的制备方法，其特征在于：所述人羊膜片为3层。

5.根据权利要求1～4任一所述的人羊膜神经管在修复周围神经腓总神经损伤的应用。

6.根据权利要求5所述的人羊膜神经管在修复周围神经腓总神经损伤的应用，其特征在于：将长2.0～4.0cm×宽1.0～2.0cm大小的人羊膜片环绕包裹于缝合的腓总神经断端周围，神经管侧面、人羊膜片边缘用医用OB胶或医用组织胶水封闭。