JP2006068401A

JP2006068401A - 人工血管

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Publication number: JP2006068401A
Application number: JP2004257768A
Authority: JP
Inventors: Akira Kodama; 亮児玉; Takashi Kitajima; 隆北嶋
Original assignee: Terumo Corp; Kyushu Institute of Technology NUC
Current assignee: Terumo Corp; Kyushu Institute of Technology NUC
Priority date: 2004-09-03
Filing date: 2004-09-03
Publication date: 2006-03-16
Also published as: WO2006025297A1; US20080281408A1

Abstract

【課題】本発明の課題は、内皮細胞増殖促進剤、例えば、血管新生因子であるＨＧＦを、その活性を損なわずに、人工血管材料に安定に保持させ、それによって内皮化を促進する機能をもつ人工血管を提供することにある。
【解決手段】多孔質管状構造体の少なくとも内表面に、（１）ポリアミノ酸ウレタン共重合体、（２）コラーゲン又はゼラチン、（３）コラーゲン結合活性を有する内皮細胞増殖促進剤を、順次積層し固定化して成る人工血管が提供される。内皮細胞増殖促進剤としては、コラーゲン結合活性を有するポリペプチドと血管新生因子、特にＨＧＦとの融合蛋白質が好ましい例である。
【選択図】図１

Description

本発明は、内皮細胞増殖促進活性を有する生体適合性に優れた人工血管に関する。

閉塞あるいは損傷して機能不全となった血管を置換するための人工血管として、これまで、中、大口径の人工血管は実用化されているが、内径4mm以下の小口径人工血管は、移植後血栓付着のために閉塞しやすく、実用化が遅れている。冠状動脈や下肢血管（膝下動脈）のような、小口径の部位に適用できる人工血管は未だ実用化されておらず、現状では、他の部位の生体血管を転用して移植することが行われている。しかしながら、このような動脈に障害をもつ患者は、他の部位の血管も脆弱なことが多く、代用可能な血管が得られにくい。また、血管拡張術（ステント挿入あるいは、バルーンカテーテル処置など）は、脆弱な血管には適用が難しい。従って、小口径の人工血管の実用化は、強く望まれているものである。

小口径人工血管が閉塞する原因となる初期の現象として、血栓付着がある。小口径では、血流量が少なく一旦付着した血栓は、脱落せずさらに血栓形成が進行してその厚みを増し、閉塞に至る。そのため、血漿蛋白や血小板が全く付着しない、抗血栓性の高分子素材が求められてきた。これまでのところ、延伸ポリテトラフロオロエチレン（ePTFE）が、抗血栓性としてはもっとも良好な素材であるとして、小口径用に利用が検討されてきたが、ePTFEも初期の血栓付着は抑止するものの、長期にわたると血栓が付着し、閉塞することが避けられなかった。実用化されている中・大口径のePTFE人工血管であっても、血栓付着のため、移植後２年ごとに交換する必要があるとも言われている。

従って、更なる抗血栓性の材料の探求や改良も検討されているが、生体に移植して効果を検討したものは少なく、また、長期にわたる抗血栓性の点では未だ不十分であると言われている。例えば、Uchidaらは、ポリウレタンとポリアミノ酸の新規共重合体（ＰＡＵ）を報告している（非特許文献１と２参照）。ポリアミノ酸の部位は親水性で、細胞親和性を持ち、またポリウレタン部分は抗血栓性を示す。特開２００１−１３６９６０（特許文献１）は、このポリマーをコートした材料が長期間血小板付着を抑止し、優れた抗血栓性を示したことを開示している。更に、内皮化の効果も報告されている（非特許文献３参照）。しかしながらこの結果は、ラット腹部大動脈の、５mm程度の短い血管部位を置換した結果であり、ラットの高い修復能力によるものと推定される。イヌでの移植実験では、内皮化は確認されなかった。このほか種々の抗血栓性材料の開示例があるが、in
vitroでの評価が多く、生体での効果としては、いずれも不十分な段階にある。親水性ポリマー、例えば、親水性のポリウレタンで処理した人工血管等も提案されているが（特許文献２参照）、生体での効果としては、未だ十分なものではない。
特開２００１−１３６９６０号公報特表平１１−５０２７３４号公報 J. Polym Sci. A: Polym Chem 37, 383-389, 1999年 Polymer 41, 473-480, 2000年 Wangら、J. Biomed Mater. Res. 62, 315-322, 2002年

こうしたことから、人工血管素材自体の改良には限界があり、内皮細胞の抗血栓性を利用しようとする試みが行われてきている。生体の血管では、内皮細胞が剥離した部分には血栓が付着するが、内皮が存在している部分は通常血栓が付着しない。即ち、生体血管で実際に抗血栓性機能を担っているのは内皮細胞層（内膜）であり、究極的な抗血栓性材料とは、血管内皮細胞であると考えられるためである。
この考え方に基づく方法論の一つは、人工血管基材の内面に、予め内皮細胞を播種して内膜を形成させた後に移植することである。しかしながら、この方法では、細胞の採取、培養などの工程が必要なことから即時的に使えるものではない。また細胞の採取は患者に負担を強いる方法であるという望ましくない点がある。

もう一つの方法論は、移植後早期に、その表面が内皮細胞に覆われるように誘導する物質を、人工血管材料と複合化させることであり、内皮細胞の接着を促進する、接着性のペプチドやコラーゲン、フィブロネクチン（Fn）などのマトリックス蛋白質、そして内皮細胞の増殖を促進する成長因子などの蛋白質が検討されている。細胞接着を高める工夫としては、細胞接着に関わるペプチド配列（ＲＧＤ）を、ポリウレタンに共有結合で固定化する方法が開示されている（非特許文献４、５、６参照）。但し、ＲＧＤ配列自体には、細胞の増殖効果がないことから、更に内皮細胞を増殖させるような仕組みがあることが望ましい。
Linら、J．Biomater. Sci. Polymer Edn, 3, 217-227; 1992年 Linら、J. Biomed．Mater．Res 28, 329-342;1994年 Tiwariら、FASB J. 16,791-796; 2002年

細胞外マトリックスの成分（コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカンなど）を固定化することも、細胞接着を高めるうえで効果があるとされている。例えば、Vohraらは、ePTFEにフィブロネクチン(Fn)を吸着させることが可能であると報告している（非特許文献７参照）。この場合、共有結合のような固定法は取られておらず、吸着する量は、1cm²あたり約０．３μｇ程度だが、細胞は接着できるという。また、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が毎分200mlの流速で流れる条件下で、２時間後には、吸着したFnの約７０％が保持されたとしている。ただし、実用的な人工血管を考える上で、２時間という評価時間は短すぎると考えられる。またFn吸着面に接着した内皮細胞が、この流速下で、その接着を維持できるのかは明らかにされておらず、吸着させるだけでは不十分と推定される。また、生体内では、培養実験のような大量の内皮細胞（あるいはその前駆細胞）が存在する環境ではあり得ないので、これらの結果が生体内の環境にも適用できるとは考えがたい。
Artif. Organ 14,41-45; 1990年

より確実に蛋白質を固定化する方法として、グルタールアルデヒドで架橋固定化する方法が、従来、良く行われてきたが（例えば、特許文献３参照）、蛋白が変性するため活性を持つ蛋白には望ましくなく、また、コラーゲンを固定した場合には石灰化が起こるとされている。
特開平８−２８３６６７号公報蛋白質の変性剤を用いず、共有結合で固定化する方法も多数開示されている。例えば、濱口ら（非特許文献８参照）は、ePTFEのチューブを、アルカリ金属化合物（メチルリチウム）で処理してフッ素原子を引き抜き、メタクリル酸をグラフト重合した。ここにカルボジイミドで、ゼラチン化したコラーゲンを共有結合で固定化した。このようにして作られた人工血管は、開存率に影響はなかったが、４週後の、内皮による表面の内皮化率は優れていたと述べている。但し、１２週後ではゼラチン固定していないePTFEも同様に内皮化した。Nishibeらは、同様の方法でフィブロネクチンを共有結合させた。この場合も内皮の被覆率が向上したと報告されている（非特許文献９参照）。人工臓器24,168-173;１９９５年 Surg. Today, 30,426-431;２０００年

これらの方法は、要約すると材料方面を化学的にあるいは物理的に改変し、そこにグラフト重合などでメタクリル酸などを結合させ、反応性の強い官能基（水酸基、エポキシ基、カルボキシル基など）を表面に形成する。次いで、この官能基に蛋白分子を直接接触させ、あるいは架橋剤を用いて共有結合させる、というものであり、この方法に基づく人工血管の特許も多数公表されている（例えば、特許文献４、５、６参照）。固定化するものとしては、Ｆｎやコラーゲンなどのマトリックス蛋白質、ＴＧＦα,インスリン、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）などの成長因子、さらに抗血栓剤としてヘパリンを固定化できるとする。トランスフェリンも可能である。またこれらを組み合わせて固定化することも可能であるとしている。これらの方法においては、グルタールアルデヒドのような蛋白質の変性をきたすことはないが、何らの構造変化も起こさずに蛋白質が共有結合されることはあり得ない。そしてそれは、蛋白質としての活性に影響する可能性がある。注意すべき点は、上記の一連の特許において開示されていることは、種々の蛋白を結合させることは可能であるということであって、どのような蛋白質、成長因子も活性に影響なく固定できる方法を開示しているわけではないということである。実際に、これらの特許明細書には、活性に影響せずに共有結合できるものを、共有結合で固定化すると記載されている。
特開平９−２６２２８２号公報特開平９−２７６３９３号公報特開平５−２６９１９８号公報

蛋白を材料表面に固定化する方法としては、このほかに光反応を利用したものも開示されている。固定化する蛋白質に、光反応性の活性基を生じさせた後、材料にコートして紫外線照射で固定化する（特許文献７参照）。この方法は、コラーゲンなどには適用できるが、成長因子などに適用するためには条件検討の必要がある。
特表２００１−５０２１８７号公報

これまでに内皮化を促進する機能を与える方法として、以上のような方法が提案されてきているが、細胞の接着性を高める工夫だけでなく、細胞増殖効果をもたらす物質を固定化することも合わせて行う必要がある。特に、血管新生因子を固定化することが、より望ましいと考えられる。そして、更に活性に影響を与えない固定化方法が望ましい。代表的な血管新生因子は、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦであるが、人工血管基材にこれらを固定化する試みは、これまでに少ない。特にＨＧＦを固定化した例は、本発明者の知る限り見あたらない。ＶＥＧＦについては、特開平１０−１３７３３４号公報（特許文献８）において、ＶＥＧＦとFnをともに固定化したフィルム（ポリエチレン）が開示されている。これらの蛋白質は、コロナ放電で表面処理されたポリエチレンフィルム上にアクリル酸をグラフト重合後、カルボジイミドで活性化されたカルボキシル基に共有結合で固定化されている。このフィルム上では、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の増殖と運動性が亢進した。但し、生体内での内皮再生効果は検討されていない。また増田ら（非特許文献１０参照）は、先に引用した特許文献６と類似の方法であるが、ベンゾフェノン基を導入して光反応性としたゼラチンとヘパリンの混合液に、ＶＥＧＦとｂＦＧＦを加え、ポリウレタンチューブからなる人工血管基材にコーティングした。これに紫外線照射を行い、光固定化した人工血管を作製している。このような人工血管をラット腹部大動脈に移植したところ、内皮化に有効であったことが示された。４週後において、固定化していない対照血管で３０％が内皮化されたのに対し、固定化血管では50-60%であった。以上のようにＶＥＧＦとｂＦＧＦを固定化した方法は見いだされるが、いずれも共有結合で固定化されている。一方、ＨＧＦを固定化した例は見いだせない。
特開平１０−１３７３３４号公報人工臓器、27,287-292、1998年

血管新生因子のうちＨＧＦは当初、肝細胞増殖因子として発見されたものであるが、その後血管新生作用を持つことが見いだされ注目されている（非特許文献１１、１２、特許文献９参照）。特に、その内皮増殖活性はＶＥＧＦより強く、血管においては内皮特異的な増殖因子である（非特許文献１３参照）。ＶＥＧＦは、血管新生効果という点では、ＨＧＦに比べて即効性で、虚血（低酸素状態）に直ちに反応して血管内皮細胞の増殖を促すが、血管透過性も示す。また、ＶＥＧＦで誘導される微小血管は、成熟せず短期に退縮するとも言われている（非特許文献１４参照）。また、ｂＦＧＦは、活性は強力であるが、様々な細胞にも増殖効果を示し、副作用も懸念される。
特開平６−９６９１号公報 Bussolinoら、 J. Cell Biol. 119, 629-641, 1992年 Grantら、Proc．Natl. Acaad．Sci．USA、90, 1937-1941, 1993年 Nakamuraら、Hypertension, 28, 409-413, J. Hypertens. 14, 1067-72, 1996 年 Carmeliet、Nature Medicine 10, 1102-1103、２０００年

これらのことから、ＨＧＦの人工血管材料への応用が期待されるが、そのような開示例は見あたらない。ＨＧＦを抗血栓性の材料に固定化するには、何らかの方法の考案が必要である。たとえばePTFEは撥水が強く、蛋白質の水溶液は通常はじかれてしまう。また、その上で溶液を乾固させても、容易に剥がれてしまうので、蛋白を高分子材料に固定化させるためには工夫が必要である。共有結合ではその活性が失われる可能性が大きい。

本発明者らはこれまでに、共有結合などの化学処理によらずに、成長因子を安定に固相に固定化する方法を報告してきた。即ち、成長因子をコラーゲン結合性に改変するのである。Fn分子内のコラーゲ結合性ドメイン部分と、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＢＭＰ、ＶＥＧＦなど種々の成長因子を連結する事が可能であった（特許文献１０〜１３、非特許文献１５参照）。これによってなる融合蛋白質は、コラーゲンに強固に結合でき、しかも成長因子の活性は天然型のそれと同等であった。即ち、この融合蛋白質は、成長因子をコラーゲンコートされた固相に固定化する方法として優れていた。しかしながらこの方法は、コラーゲンコートできる固相に限定される方法であった。つまり、ＨＧＦなどの血管新生因子をコラーゲン結合型に改変しても、例えば、ePTFEのような蛋白吸着が起こりにくい人工血管材料上に、固定化することはできないと考えられた。
特開２００１−１９０２８０号公報特開２００２−５８４８５号公報特開２００２−６０４００号公報ＷＯ０２／０１４５０５号公報 Ishikawaら、J Biochem, 129, 627-633, 2001年

本発明の課題は、内皮細胞増殖促進剤、例えば、血管新生因子であるＨＧＦを、その活性を損なわずに、人工血管材料に安定に保持させる方法を見いだすことにあり、それによって内皮化を促進する機能を持つ人工血管を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、先ず、人工血管素材へコラーゲンを固着させる新規の方法を見出した。即ち、例えば、ePTFEチューブにポリウレタンとポリアミノ酸の共重合体（ＰＡＵ）をコートすることが、コラーゲンをチューブ表面に長期間維持させる上で有効であることを発見した。次に、血管新生因子、例えば、ＨＧＦにコラーゲン結合性を付与した、ＨＧＦ融合蛋白質を設計することに成功した。そして、この融合蛋白を、ＰＡＵとコラーゲンが積層しコートされた人工血管基材に固定化することによって、内皮化を促進する機能を持った人工血管が実現可能であることを知見し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明の課題は、多孔質管状構造体の少なくとも内表面に、（１）ポリアミノ酸ウレタン共重合体、（２）コラーゲン又はゼラチン、（３）コラーゲン結合活性を有する内皮細胞増殖促進剤を、順次積層し固定化して成る人工血管によって達成される。図１には、本発明の人工血管の内部構造が模式的に示されており、１は人工血管の外観を、２は多孔質管状構造体を、３はポリアミノ酸ウレタン共重合体層を、４はコラーゲン又はゼラチン層を、５は内皮細胞増殖促進剤を示している。

本発明の人工血管は、基材と蛋白質を共有結合で固定化するような化学処理を施さず、蛋白質の活性に影響を与えずに、固定化できる方法によって作成される。その作成法は簡便であり、また、移植された人工血管の早期内皮化が可能であるため、小口径であっても長期に開存させることが可能な人工血管が得られる。

本発明は、多孔質管状構造体の少なくとも内表面に、（１）ポリアミノ酸ウレタン共重合体、（２）コラーゲン又はゼラチン、（３）コラーゲン結合活性を有する内皮細胞増殖促進剤を、順次積層し固定化して成る人工血管である。多孔質管状構造体としては、人工血管素材として使用される従来公知の材料、形態のものを使用できる。例えば、多孔質の高分子材料である延伸ポリテトラフルオロエチレン(ePTFE)、ポリウレタン、ポリエチレン（ダクロン）、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリブチレンテレフタレート(PBT)などの繊維、織布、不織布が挙げられる。多孔質のフィルム状の基材で形成されても良い。小口径の血管素材として望ましいのは、ePTFEおよびポリウレタンであるが、抗血栓性の点では、ePTFE
が特に望ましい。

本発明においては、これらの基材からなる、多孔質管状構造体の内外の表面、少なくとも内表面に、先ず、疎水性と親水性の領域を併せ持つ両親媒性ポリマーであるポリアミノ酸ウレタン共重合体（ＰＡＵ）をコートする。ＰＡＵはUchidaら（J. Polymer Science,
Polymer Chemistry 37, 383-389 (1999年; Polymer41,473-480 (2000年))によって開示された方法、あるいは、本発明者らの一人が公表している方法（特開２００１−１３６９６０号公報）で合成することができる。このポリマーのジメチルホルムアミド(DMF)の懸濁液を、適当な濃度（樹脂濃度として、１〜３％）に、ジクロロ酢酸で希釈し、得られた溶液にePTFEチューブを浸漬する。ＰＡＵのコートに要する時間は１５時間程度で十分であるが、ＰＡＵ濃度により適宜変更することが可能である。ＰＡＵに浸漬したチューブは、大量の蒸留水で十分に洗浄、風乾し、ついで、１２０度で５分間加熱し、ＰＡＵを乾固する。これによってＰＡＵコートチューブ(PAU(+)チューブ)が作製される。ＰＡＵのコート量は、多孔質管状構造体に対して０．１〜３％の範囲が適当である。

本発明において用いられるＰＡＵとしては、疎水性と親水性の領域を併せ持つものであれば、特に制限はないが、好ましいのは、アミノ酸ユニット平均４以上が連続して結合されたポリアミリ酸とウレタンとの共重合体が（ａ）α−アミノ酸−Ｎ−カルボン酸無水物、（ｂ）イソシアネート基を有するウレタンプレポリマー、（ｃ）水、ヒドラジン及び有機アミンから選ばれる少なくとも１種、を反応させて得られるものである（特開２００１−１３６９６０号公報参照）。

次に、PAU(+)チューブに、コラーゲン又はゼラチンを積層・コートする。そのためには、例えば、コラーゲン溶液にチューブを浸漬する。コラーゲン溶液は中性では繊維化するため、均一にコートするには酸性溶液が望ましい。濃度は0.01〜0.3％が適当である。あるいは、ｐＨが中性付近の溶液で有れば、液温を４℃以上にしないことで繊維化が抑制される。これらの溶液に３７℃で２時間、あるいは４℃１昼夜、浸漬したのち、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で素早く繰り返し洗浄する。ＰＢＳで洗浄することにより、繊維化したコラーゲンが、ＰＡＵ上に薄い層として固定化されると推定される。コラーゲン又はゼラチンのコート量は特に制限はないが、コラーゲン又はゼラチンの溶液濃度が０．００１〜０．２％の範囲のものに、チューブを浸漬するのが適当である。かかる方法で、チューブの壁表面積当たり、０．０１〜５μｇ／ｍｍ^２程度のコラーゲン又はゼラチンがコートされる。

コラーゲン又はゼラチンが安定に固定化されていることは、ＰＡＵとコラーゲンがコートされたチューブ（コラーゲン(+)チューブ）を、流液中におき残存量を調べることで、検証できる。例えば、ＰＢＳを生体の血流速度の範囲で流し、この条件下で１週間以上おき、その後、残っているコラーゲン量を、抗体を用いた染色などで調べれば良い。感度の良いコラーゲン抗体が得られない場合は、コラーゲンに結合性の高い蛋白を結合させ、その蛋白質に対する抗体を反応させる方法が考えられる。発明者らは、これまでにフィブロネクチンのコラーゲン結合性ドメイン(FNCBD)を組み換え蛋白質として、生産できることを報告している（Ishikawaら、J.
Biochem, 129, 627-633, 2001年）。このFNCBDをプローブとしてコラーゲンコート表面に結合させ、次いで、抗FNCBD抗体で検出し、長期間コラーゲンが残存していることが確認できる。以上のように、ＰＡＵをコートした表面は、コラーゲンを強固に結合された状態を維持できるので、更に、コラーゲン結合性活性を持つ内皮細胞増殖促進剤、例えば、血管新生因子を固定化することが可能となる。

本発明においては、次いで、ＰＡＵとコラーゲン又はゼラチンが積層・コートされたコラーゲン(+)チューブに、コラーゲン結合活性を持つ内皮細胞増殖促進剤が積層・コートされ固定化される。コラーゲン結合活性を持つ内皮細胞増殖促進剤とは、コラーゲン結合活性と内皮細胞増殖促進活性を併せ持つ蛋白質を意味する。好ましいのは、コラーゲン結合活性を持つように改変された血管新生因子である。血管新生因子としては、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞増殖因子）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）等が挙げられるが、特に、ＨＧＦが望ましい。ｂＦＧＦは、血管の細胞以外にも増殖効果を示すため余り好ましくはない。ＶＥＧＦについては、迅速で、強力な血管新生効果が知られているが、同時に血管透過性を示す因子でもあり、血管の成熟という点ではやや懸念がある。但し、ＨＧＦと併用することは有効と考えられる。

前記のごとく本発明において用いることが望ましいのは、コラーゲン結合活性を持つように改変された血管新生因子、特に、コラーゲン結合活性が強化されたＨＧＦの融合蛋白質である。天然型ＨＧＦが、コラーゲン親和性を持つことは報告されているが（Schuppanら、Gastroenterology139-152, １９９８年）、その程度は微弱であり、生理的塩濃度において、結合したＨＧＦの大半は遊離する。従って、人工血管に固定化する因子として、活性の持続は期待できない。そこで、より強固なコラーゲン結合性を発揮させるために、融合蛋白質を設計する必要がある。

本発明者らは、これまでに成長因子に強固なコラーゲン結合性を付与する方法を提案している（特開２００１−１９０２８０号公報、特開２００２−５８４８５号公報、特開２００２−６０４００号公報、ＷＯ０２／０１４５０５号公報参照）が、この方法をＨＧＦにも適用することが可能である。即ち、フィブロネクチンのコラーゲン結合性ドメイン(FNCBD)のアミノ酸配列から選ばれる配列と、ＨＧＦのアミノ酸配列を融合させた蛋白質を設計した。上記FNCBD配列は、例えば、Fnの成熟型蛋白質のアミノ酸２６０番目から４８４番目までの配列、あるいは２６０番目から５９９番目までの配列などを選択すると良いことが分かっている。これらのフィブロネクチンのコラーゲン結合性ドメインからなるポリペプチドは、本発明においても、融合蛋白質を生成するために好ましく用いられる。

本発明者らが特開２００２−６０４００号公報で提案した、血管新生調節因子のＤＤＳとして有用なハイブリッドポリペプチドは、フィブロネクチンのコラーゲン結合性ドメインと、血管新生調節因子とを連結することにより、血管新生調節活性が維持され、且つコラーゲンに対する結合活性が付与されたコラーゲン結合性血管新生調節因子であるが、かかるポリペプチドも、本発明の内皮細胞増殖促進剤あるいは融合蛋白質の一つとして用いることができる。

本発明者らが先に提案した方法は、融合蛋白質を大腸菌で生産させる方式であった。この方式でもＨＧＦ融合蛋白質は生産できるが、ＨＧＦとしての活性は殆ど示さなかった。大腸菌で生産した場合には、複雑な立体構造は再現できないためと考えられる。そこで、本発明では、ＨＧＦの融合蛋白質は、大腸菌以外の方法、例えば、昆虫細胞を宿主とするバキュロウイルス発現系(Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin
no.1555、１９８７年)を採用した。融合蛋白の設計においては、そのアミノ酸末端側に、昆虫細胞から分泌されやすいようにするため、シグナルペプチド配列を付加したものとする。例えば、蜂毒素メリチンなどの、昆虫の分泌蛋白質のシグナルペプチドが挙げられる。これにより、「シグナルペプチド−FNCBD-HGF成熟蛋白質配列」という構造の融合蛋白質をコードする遺伝子が設計され、これを組み込んだベクターのＤＮＡと、野生型バキュロウイルスのＤＮＡとをco-transfectionすることにより、昆虫細胞内に、組み換えウイルスが生成される。組み換えウイルスに組み込まれたＨＧＦ融合蛋白質をコードする融合遺伝子から、ＨＧＦ融合蛋白質（Fn-HGF）が翻訳され、昆虫細胞の培養上清に分泌され回収することが可能である。この融合蛋白質の配列の例は、配列表配列番号２及び４に示されている。

従って、本発明において特に好ましいのは、コラーゲン結合活性を有する融合蛋白質として、配列表配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列、あるいはこれと相同なアミノ酸配列を持つ、ＨＧＦ融合蛋白質を用いた人工血管である。なお、本発明において相同アミノ酸配列はと、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加された、実質的に同様のコラーゲン結合活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を意味する。

本発明において好ましく用いられる、配列表配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列、あるいはこれと相同なアミノ酸配列を持ち、且つコラーゲン結合活性を有するＨＧＦ融合蛋白質は、配列表配列番号１又は３に示される塩基配列、あるいはこれと相同な塩基配列からなる遺伝子を用いて発現される。そして、本発明においては、かかる遺伝子を用いたＨＧＦ融合蛋白質の発現に、昆虫細胞を用いる方法が好ましい。なお、相同な塩基配列とは、対応する塩基配列によってコードされたアミノ酸配列と、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を意味する。

以下、ＨＧＦ融合蛋白質を例として、融合蛋白質を生産する方法について詳しく説明する。生産する方法としては、上記の昆虫細胞を宿主とするバキュロウイルス発現系に限らず、哺乳動物の培養細胞、例えば、COS細胞などを用いる方法も可能である。その場合は、適切なベクタが多数知られており、それらの中から選択することができる。シグナルペプチドとしてはＨＧＦのシグナルペプチドなどを利用することができる。宿主細胞から分泌されたＨＧＦ融合蛋白質は、その培養上清をヘパリンアフィニティーカラムにかけて精製することが可能である。また、この蛋白質はコラーゲン結合性のFNCBD部分を有していることから、ゼラチンアフィニティーカラムで精製することもできるが、カラムから吸着した蛋白を溶出させるには８M尿素が必要であり、活性を失うので、立体構造を再生させる方法が必要となる。精製を容易にするために、無血清培地で宿主昆虫細胞（Sf9など）を培養するが、この場合、生産されたＨＧＦ融合蛋白質は１本鎖のままである。天然型のＨＧＦは１本鎖で合成された後、切断されてα鎖とβ鎖に分かれそれらが会合し、活性型のヘテロダイマーとなると言われている（Nakaら、J．Biol.
Chem, 267, 20114-20119、１９９２年）。本発明のＨＧＦ融合蛋白質も、血清（２〜１０％）と混合して保温することにより、ヘテロダイマーとすることができる（図２）。ヘテロダイマーとしたＨＧＦ融合蛋白質は、天然型のＨＧＦと同等の内皮増殖活性を持ち（図３）、また、強固なコラーゲン結合性を持つこと（図４）が確認される。しかも結合性と増殖活性は長期に安定であることから、ＰＡＵとコラーゲン又はゼラチンがコートされた人工血管基材上に固定化するには好適な特性を備えている。

ＨＧＦとしての活性は、内皮細胞（HUVEC、HCAECなど）の培養液に添加することで、調べることができる。この検討の際には、血管新生因子であるｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ等を含まない培地で培養することでより明瞭にその活性を知ることができる。コラーゲン結合性を有することは、例えば、コラーゲンコートした表面にその蛋白溶液を添加して結合させ、PBS等で洗浄し、次いで抗HGF抗体を反応させて、結合量を調べることで示される。天然型ＨＧＦを同様の方法で検討すると、ＨＧＦ融合蛋白質に比べ遙かに低い濃度でその結合が飽和している（図４）。従って天然型ＨＧＦを人工血管基材に固定化することは困難である。

結合の安定性については、コラーゲンへ結合させた後、一定期間、例えば、３７℃で保温しておき、その後結合量を測定する。これにより、一旦結合したＨＧＦ融合蛋白質の残存性（結合安定性）を明らかにすることができる。あるいは一定期間後に、細胞を播種して、活性の残存性（安定性）を見ることも可能である。例えば、１週間後でもほぼ50%の活性が保たれていることが確認される（図５）。

以上のような特性を持つため、本発明のＨＧＦ融合蛋白質は、ＰＡＵとコラーゲンが順次積層・コートされた表面に、容易に固定化することが可能であり、かつ安定に結合が維持される。固定化において結合に与るのは、Fnのコラーゲン結合性ドメイン（FNCBD）であるため、共有結合のような分子構造に影響を与える方法ではないという利点を持ち、融合蛋白質の溶液に上記のコートされたチューブを浸漬するだけで良い。これによって本発明の人工血管（ＨＧＦ固定化人工血管）の作成が完了する（図１）。内皮細胞増殖促進剤、例えば、ＨＧＦ融合蛋白質のコート量は特に制限はないが、チューブの壁表面積当たり、２〜２００ｎｇ／ｍｍ^２程度のコート量が適当である。

この人工血管に、実際にＨＧＦ融合蛋白質が固定化されていることは、ＨＧＦに対する抗体を反応させ、抗体に連結した酵素の発色反応を見ることで、明らかにできる。同様の検出法を、コラーゲンコートまでの人工血管、及び、天然型ＨＧＦを添加した人工血管に適用した場合には、抗体が結合せず、発色は認められないということを確認することができる。結合した量については、ＨＧＦ融合蛋白質溶液の添加前の濃度と、添加後回収された溶液の濃度の差から推定することができる。あるいは、人工血管を入れた容器と入れていない容器それぞれに、ＨＧＦ融合蛋白質の溶液を添加して、回収される溶液のＨＧＦ濃度をELISA法で測定し、その差から求めることができる。ＰＡＵとコラーゲンがコートされた基材上には、少なくとも添加濃度が64μg/mlまで、濃度依存的に結合量が増加することが確認される（図６）。

本発明のＨＧＦ融合蛋白質を固定化した人工血管（図１）の効果については、その血管を動物の血管に置換移植することで確認できる。内径３mm程度の血管をもつ動物が望ましいが、ラットやウサギは血管修復能力が高いとされているので、イヌの頸動脈や、下肢大腿動脈が適切である。ＰＡＵコートあるいは、コラーゲンコートだけのePTFEチューブを対照として、移植結果を比較することにより、内皮化の促進が起きていることを確認することができる。
確認の手段としては、移植後一定期間の後に摘出された人工血管を、フォルマリンなどで固定し、パラフィン切片を作成して染色する。通常のヘマトキシリン・エオシン染色で、扁平な内皮細胞が、人工血管の表面に接着しているのが確認される（図７）。このような細胞が、更にシート状に連なって内皮層が形成される。内皮細胞であることは、特異的な抗体である抗ＣＤ３１抗体や、抗von Willebrand Factor抗体で染色することにより検証できる。あるいは、摘出した血管を、そのまま銀染色に供するか、グルタールアルデヒドで固定して、走査型電子顕微鏡で表面観察をしても良い。これらの方法を用いることで、ＨＧＦ融合蛋白質が固定化された人工血管では、ほぼ全域にわたって内皮細胞の存在が確認されたが、対照の人工血管では、中央部では内皮細胞が認められず、血管の吻合部付近だけに内皮細胞があることが確認される。即ち、内皮細胞の進展がＨＧＦ融合蛋白質によって促進されることが示される（図８）。この様にして、ＨＧＦ融合蛋白を固定化した人工血管は、内皮化促進機能をもつ人工血管であることを明らかにすることができる。以下、実施例を示して、具体的に説明する。

[ＨＧＦ融合蛋白質の製造]
Ａ）ＨＧＦ融合蛋白質の設計
１）ＨＧＦ遺伝子配列
ＨＧＦ遺伝子の配列は、特開平６−９６９１号公報に開示されているものを用いた。この配列は、ヒト卵巣腫瘍より樹立された細胞株(HUOCA-２型及び３型)が生産する、血管新生活性を示す蛋白質をコードする遺伝子としてクローニングされたもので、その塩基配列を決定したところ、Miyazawaら（BBRC.
169, 967-973 (1989)）が報告したＨＧＦの配列と同一であった。この配列を鋳型として、ＰＣＲ法によりＨＧＦ成熟ポリペプチドをコードする配列を取得した。PCRプライマーには、エンテロキナーゼが認識するアミノ酸配列DDDK（Ｄ＝アスパラギン酸、Ｋ＝リジン）をコードする配列を付加してあり、これによって、ＨＧＦ成熟配列のアミノ末端側に、エンテロキナーゼ認識配列が連結した蛋白質をコードする遺伝子が取得された。得られた遺伝子配列は、制限酵素SalIとBamHIで消化し、同じ２つの酵素で切断されたpBlueScript
II SK(-)（Stratagene社）に連結してプラスミドpHH２を得た。

２）フィブロネクチンとＨＧＦの融合遺伝子
ヒトフィブロネクチン（Fn）のｃDNA配列は既に報告されている（Kornblihttら、EMBO J. 4, 1755 (1985)、データベースではGenbank
X02761, Swiss P02751）。この配列をもとにPCR用プライマーを作成し、Fnの部分配列を増幅した。即ち、Ishikawaら（J．Biochem.,129,627-633）に基づき、先ずヒト腎臓由来のRNAを抽出し、逆転写によってcDNAに変換した後、ＰＣＲで２種類の配列範囲のＤＮＡを増幅した。１つは、Fnの成熟蛋白質としてのアミノ酸番号２６０番から４８４番目までの配列であり、もう一つは、２６０番から５９９番目までの配列である。それぞれを制限酵素で切断、回収し、上記のプラスミドｐＨＨ２に、Fnの配列がＨＧＦのアミノ末端側に連結されるように挿入した。これによりプラスミドｐHH3SとｐHH3Lを得た。前者にはFnの２６０から４８４番目までのアミノ酸配列をコードするDNAが挿入されており、後者は２６０から５９９番目に対応するDNAが挿入された。

３）トランスファーベクターの作成
pHH3Sを制限酵素MstIとBamHIで消化し、２．８５KbのBamHI消化断片を単離した。この断片を、ｐAcYM1-Mel（Tomitaら、Biochem.
J. 312, 847-853 (1995)）のBamHI部位に挿入して、トランスファーベクターｐHH7を得た。このベクターにおいては、蜂毒素蛋白質メリチンのシグナル配列、ヒトFnの配列（Ala260からArg484）、エンテロキナーゼ認識配列DDDDK（D=アスパラギン酸、K=リジン）、そしてＨＧＦの成熟配列のそれぞれをコードする、DNA配列が読みとり枠のずれがないように順次連結されている。この融合遺伝子の配列は、配列表配列番号１に示されている。なお、メリチンのシグナル配列は、この融合蛋白質を細胞外に分泌するために付加されものであり、分泌に際して切断除去されるものである。分泌された後の融合蛋白質、即ち、ＨＧＦ融合蛋白質(Fn-HGF)のアミノ酸配列は、配列表配列番号２に示されている。

上記と同様の手順で、ｐHH3Lから単離された３．２Kb BamHI消化断片を、ｐAcYM1-Melに挿入してトランスファーベクターｐHH７Lを得た。融合蛋白質の遺伝子配列は、配列表配列番号３に示され、分泌されるＨＧＦ融合蛋白質のアミノ酸配列は、配列表配列番号４に示されている。

Ｂ）ＨＧＦ融合蛋白質の生産と精製
１）組み換えウイルスの作成
（１）先ず昆虫細胞Ｓｆ９の1ｘ10⁶ 個を10% 牛胎児血清(FCS)を添加したGrace's Medium(Gibco、Invitrogen社)に懸濁し、径35mm
の培養皿に入れた。３０分静置した後、培地を除去し、無血清培地Sf-900II（Gibco、Invitrogen社）で培養皿を更に３回洗浄した。
（２）トランスファーベクターpHH7のＤＮＡ2μgをエタノール沈殿し、乾燥後3.５μlのTE(10mM Tris・HCl,PH8/1mM EDTA) に溶かした。これにBaculovirus
linear DNA(Baculogold, Pharmingen社)の0.１μg（１μl）を混合し、さらに滅菌蒸留水(DW)を加えて全量で８μlとした。この混合液に、２倍希釈したlipofectin(Gibco、Invitrogen社）)の8μlを加えて１６μlとした。混合１５分後に、その５μl（あるいは11μl）を1mlのSf-900IIと共に、培地を除去した上記１）の培養皿に添加した。
（３）２８℃で終夜培養した後、液を除き、1mlのGrace培地(10%血清添加)を加えて更に３日培養した。この培養上清をウイルス液として回収保存した。

（４）組み換えウイルスの単離
あらかじめ、1ｘ10⁶ 個をのSf9細胞をφ35mm 培養皿に播種し、３０分間静置後、培地を200μl程度残して、吸引除去した。上記（３）の保存培養上清（ウイルス液）を、Grace培地で１００，１０００，１００００倍に希釈したものを100μl培養皿に加え、細胞に感染させた。１５分ごとに液を攪拌し、これを４回行った後（１時間後）、液を吸引除去した。あらかじめオートクレーブしておいた３％低融点アガロースを、Grace培地（10%血清含む）で３倍希釈し３７℃に加温しておき、その2mlをウイルス液を除去した上記の培養皿の細胞上に添加した。３０分間室温で静置し固化させた後、1mlのGrace培地（１０％血清を含む）を添加し、これを２８℃で５日培養した。培養後1mlのNeutral
red(0.1mg/ml)を添加し、４時間以上静置した。これにより、感染した部位の細胞が溶解してできるプラークを判別することができる。単一のプラーク部分のアガロースを、パスツールピペットで打ち抜いて、５００μlのGrace培地（１０％血清含む）に懸濁してウイルスを遊離させ、４℃で保存した。得られたウイルス液を用いて上記の操作を繰り返し、単一のウイルスクローン（AcHH7）となるまで純化した。また回収液量あたりの感染性ウイルスの数（力価）も、上記のようなプラーク形成法により計測することができる。純化されウイルスが得られた所で、徐々に培養スケールを大きくしながら感染を繰り返して、多量のウイルス液を得た。

２）ＨＧＦ融合蛋白質発現の確認
Sf9細胞1ｘ10⁶
個をφ35mm dishに播種した後、AcHH7ウイルスをm.o.i５ないし１０で感染させた。感染後４日間培養し、培養上清を回収した。ＨＧＦ融合蛋白質が、AcHH7感染細胞から培養上清中に分泌されていることを、以下のようにイムノブロット（ウェスタンブロット）法によって確認した。即ち、先ず培養上清を、Laemmliの方法に準じてSDSポリアクリルアミド（7.5%）電気泳動（SDS-PAGE）を行った。その際、サンプルバッファーにはmercaptoethanolを添加しない非還元条件で泳動した。泳動後、Tris-glycine緩衝液を用い、セミドライ法にてPVDF膜に転写した(2mA/cm²の電流で９０分)。転写されたPVDF膜をPBSで２回洗浄し、25％
Block Ace（大日本製薬社) / PBSで60分間ブロッキングした。洗浄液（0.05% Tween-20/PBS）で1回洗浄後、抗ヒトHGF抗体（T-7701、特殊免疫研究所、1：1000
に5% Block Aceで希釈）で60分反応させた。洗浄液で３回洗浄後、ビオチン標識抗マウス抗体（DAKO E0464、1：500希釈）で30分反応した。洗浄液で３回洗浄した後POD標識ストレプトアビジン（DAKO
P0397、1：700希釈）で30分反応した。洗浄液で３回洗浄した後、ＨＧＦのバンドをＥＣＬ Western blotting detection
reagent（Amersham Bioscience）にて検出したところ、培養上清中に、抗体反応性のバンドが認められた。このバンドはまた、抗フィブロネクチン抗体とも反応したことから、ＨＧＦ融合蛋白質（Fn-HGF）が、細胞上清中に分泌されていることが確認された。

３）大量培養
始めに、10%血清（FCS）を含むSf-900II 培地に、Ｓｆ９細胞を3-5ｘ10⁶ 個/ ml で三角フラスコ（ポリカーボン製三角フラスコヘ゛ントタイプ：コーニング）を用いて培養開始した。２８℃で旋回培養器にのせ、120
rpm旋回で培養した。初めの培養サイズは250ｍｌフラスコに50ml培養液で、2-3日間培養し、継代した。継代後は、1000mlフラスコに250ｍｌの培養液とした。更にこれを継代していく過程で、血清濃度を10,
5, 2, 1,％と順次低下させて培養し、最終的に無血清の培地(Sf-900II)で培養した。以上の無血清状態に馴化した細胞を、細胞密度＝2ｘ10⁶cells/mlに調整して培養（Sf-900II
, 無血清、旋回培養）した。これを遠心分離して回収し、m.o.i=５から１０で組み換えウイルスAcHH7を感染させた（室温で１時間）。この間適宜攪拌した後、再び、遠心前の液量になるよう無血清培地を加えて旋回培養に戻した。3日間培養した後、培養上清を回収した。回収された上清を保存する場合は−８０℃の凍結保存とした。

４）精製
（１）上記実施例において取得された培養上清に、最終濃度0.03 %となるようCHAPS溶液を添加し、0.45μmフィルターでろ過した。
（２）FPLCを使用して以下のように精製した。ヘパリンカラム（Hitrap Heparin HP, 1ml 、Amersham Bioscience：17-0406-01）を、あらかじめ、10ml以上のbufferを用いて流速0.5ml/minで流し平衡化した。緩衝液の組成は10mM
リン酸緩衝液(PB)、 0.15M NaCl, 0.03% CHAPS (pH7.2)であった。
（３）上記（１）で処理されたサンプル溶液を、流速0.5ml/minにてカラムに添加した。次いで、20ml以上の緩衝液を流速0.5ml/minで流してカラムを洗浄した。
（４）溶出は、以下の緩衝液を流速0.5ml/minで流すことによって行った。
溶出緩衝液：Ａ液 0.15M Nacl, 10mM PB, 0.03% CHAPS (pH7.2)

：Ｂ液 2M NaCl, 10mM PB, 0.03% CHAPS (pH7.2)
以下のNaCl濃度となる様にＡ液とＢ液を混合して使用した。
0.15ＭＮａＣｌにて5分間洗浄。
0.4ＭＮａＣｌにて40分間溶出。
0.7ＭＮａＣｌにて40分間溶出。
フラクションサイズ＝2min
2ＭＮａＣｌにて20分間洗浄。

（５）0.７ＭＮａＣｌ溶出フラクション2番目のピークを、SDS-PAGEにて精製度を確認した。
（６）Fn-HGFを含むことが確認されたフラクションをプールして、10mM PB, 0.15M NaCl, 0.03% CHAPS
(pH7.2)に対して一昼夜透析した。これをＨＧＦ融合蛋白質の精製標品とした。分注後、−80℃に保存した。
（７）定量
ＥＬＩＳＡ法により、精製標品の濃度を、イムニス
ＨＧＦＥＬＩＳＡ（特殊免疫研究所：CODE 1EH1）にて定量した。即ち、標品の濃度はＨＧＦ量として表される。
（８）ヘテロダイマー化
生産されたFn-HGFは、無血清条件下で培養・回収・精製したものであるため、1本鎖の状態と考えられる。ここに、牛胎児血清（FCS）を１０％となるように加えて、37℃で１５分間インキュベートした。上記２)の方法に従い、ヒトＨＧＦ（ｈＨＧＦ、天然型）（レーン１）、血清処理前の融合蛋白質（レーン２）、処理後の蛋白質（レーン３）、及び、組み換えウイルス非感染のSf９細胞培養上清（レーン４）を、それぞれ電気泳動後、ウエスタンブロットを行った（図２）。血清処理により、移動度が変化することより、Fn-HGFがヘテロダイマーに変変換されたことが示された。

Ｃ）ＨＧＦ融合蛋白質の活性
１）コラーゲン結合活性
始めに１型コラーゲン（ウシ）10μg/ml PBS溶液（高研、CELLGEN）を氷冷下、100μlづつELISA用96 wellフ゜レート（Nunc
Polysorp 96well immuno module）に分注し、4℃で一昼夜インキュベートした。ウェルを洗浄液（0.05% Tween-20/PBS）で3回洗浄後、50％ Block Ace/PBS液
250μlを分注し、室温で60分間インキュベートした。3回洗浄後、各種濃度のFn-HGF溶液を100μl分注し、37℃で120分間インキュベートした。ウェルを5回洗浄後、抗ヒトＨＧＦ抗体（1:1000
希釈）を120分間インキュベートした。5回洗浄後、POD標識抗マウス抗体（DAKO P0260、1:1000 希釈）で60分間インキュベートした。5回洗浄後、酵素基質(OPD、Sigma)溶液100μlを分注し、室温で30分間インキュベートした。各ウェルに2N硫酸
50μlを添加して反応を停止し、吸光度（492nm-620nm）を測定した。

図４に示すように、Fn-HGFはウシ１型アテロコラーゲンに対して濃度依存的に強く結合したが、ＨＧＦ（TOYOBO HGF-101、CHO細胞発現リコンヒ゛ナント蛋白質）はわずかな結合が見られるのみであった。添加濃度0.5nM（蛋白質濃度で約50ng/ml）までは、結合量が微量ながらも増加したが、それ以上濃度での結合の増加は見られなかった。このような結果はSchuppanら（Gasteroenterology、114,139-152(1998)）が報告したように、コラーゲンがＨＧＦに弱い結合性を持つためと考えられる。この濃度での結合量は彼らの結果によれば約1.5ngであり、添加量の4%程度である。ＨＧＦそのものの結合は、この段階で既に飽和しているといえる。これに対してFn-HGFは、いずれの濃度においてもＨＧＦより高い結合性を示しかつ、添加濃度に対応して結合量が増大した。しかも、添加溶液の濃度がＨＧＦの場合の２０倍であっても、結合が飽和することは無く、より強固なコラーゲン結合性が付与されていることが示された。
同様の検討を行ったところ、１型以外にも２型、３型、４型いずれにも高い結合活性を示した。

２）血管内皮細胞に対する細胞増殖活性
（１）溶液中でのＨＧＦ融合蛋白質の活性
ヒト冠状動脈血管内皮細胞（ACBRI、大日本製薬社）を、培養液(基本培地＝EBM-2、 Clonetics社、添加試薬＝IGF-I、 2% FCS）に浮遊させ、24穴培養プレート（Falcon
24well plate）に1穴あたり1x10⁴個/500μlを播種した。細胞接着確認後、Fn-HGF溶液5μlを添加し、37℃、 5%
CO₂、 100%湿度で培養した。3日後、WST-1試験液(Dojindo)を50μl/well分注し、４時間後の吸光度（450-620nm）を測定した。その結果、ＨＧＦ濃度換算で0〜100
ng/mlの範囲内で、濃度依存的な血管内皮細胞増殖効果を示した。しかも、ＨＧＦそのものが示す活性を上回る値であった。従って、本発明のＨＧＦ融合蛋白質においては、融合蛋白質としての設計によって、その本来の増殖活性が失われていないばかりでなく、むしろ、効果の安定性も実現されている可能性が考えられる（図３）。

（２）コラーゲン結合後の細胞増殖活性
24穴培養プレートに、ウシ１型コラーゲン
10μg/ml PBS溶液（氷冷）500μlを分注し、4℃で一昼夜インキュベートした。ＰＢＳで5回洗浄後、Fn-HGF溶液500μlを分注し、37℃で2時間インキュベートした。ＰＢＳで5回洗浄後、37℃でPBS中に保管した。保管直後、１日後、３日後、７日後に、それぞれ別のウェルに、ヒト冠状動脈血管内皮細胞（HCAEC）1x10⁴個/500μlを培養液（基本培地＝EBM-2,
添加試薬＝IGF-I, 2% FCS、Clonetics社）を用いて播種した。以下、上記（１）と同様にWST-1法にて細胞増殖活性を検討した。その結果、１日後では約６０％の活性に低下するが、以後は、１週後まで安定に活性を維持した（図５）。

[ＰＡＵの製造]
特開２００１−１３６９６０の実施例１に記載された方法に準じて、ＰＡＵを合成した。即ち、ポリテトラメチレンエーテルグリコール（ＯＨ価５７．３５）９８０ｇと、トリレンジイソシアネート（２，４−トリレンジイソシアネートと、２，６−トリレンジイソシアネートとの混合物、２，４−トリレンジイソシアネート８０重量％）１７４ｇを７０℃で５時間反応させ、末端にイソシアネート基を有するウレタンプレポリマー（ＮＣＯ当量、１１６５）を得た。このウレタンプレポリマー５８．２ｇとγ−メチル−Ｌ−グルタメート−Ｎ−カルボン酸無水物５８．２ｇとをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３９４．３ｇに溶解し、これにヒドラジンヒドラート１．３７５ｇをＤＭＦ２０ｇに溶解した溶液を滴下、反応させ、粘度１８５００ｃｐ／２５℃のポリアミノ酸ウレタン共重合体（ＰＡＵ）溶液（濃度２０重量％DMF溶液）を得た。アミノ酸鎖の平均重合度について、１級アミンとイソシアネートの反応性および１級アミンによるＮ−カルボン酸無水物の重合機構（Ｍｕｒｒａｙ
ＧｏｏｄｍａｎａｎｄＪｏｈｎＨｕｔｃｈｉｓｏｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８８，３６２７（１９６６））に基づいて算出すると約６２であった。

[ＰＡＵコート人工血管の作製]
上記で得られたＰＡＵを用いて、人工血管基材のコーティングを次のように行った。初めに、ＰＡＵの溶液をジクロロ酢酸で希釈して、ＰＡＵ濃度を２％とした。人工血管用ePTFEチューブ（内径３mmのものを、長さ約３５mm）は予め、エタノールに漬けて、気泡を除いておき、上記のＰＡＵ液に、直ちに浸漬した。４℃で１５時間おいた後、５００mlの蒸留水に投じ、更に蒸留水を三回交換した後、２４時間、蒸留水中に室温で保持した（常時攪拌）。その後、５００mlの蒸留水で３回洗浄した。洗浄されたチューブは風乾後、１２０℃のオーブンに移し、５分間加熱し、ＰＡＵコートチューブ（PAU(+)チューブ）とした。コート前後の重量の差から、ePTFEの重量に対して0.5%に相当する重量のＰＡＵがコートされていた。

[コラーゲンコート人工血管の作製]
上記PAU(+)チューブを、メタノールで洗浄し、次いで７０％メタノールで３回洗浄した後、蒸留水で洗浄を３回行った。次に０．２％の酸性溶液（高研製、I-PCコラーゲン0.5%を蒸留水で希釈）に入れ、４℃で１５時間処理した。処理後、PBSで洗浄を３回行い、ＰＡＵの上にコラーゲンが積層・コートされたコラーゲンコートチューブ（コラーゲン(+)チューブ）が作製された。

[コラーゲンコートの確認]
コラーゲン(+)チューブを、PBSで洗浄した後、40μg/ml（１μM）のFNCBD溶液に漬けた。FNCBDの製造法は、特開２００１−１９０２８０号公報の記載に従った。３７℃で２時間反応させた後、PBSで３回洗浄した。洗浄されたチューブは、長さ４ｃｍのポリプロピレンチューブにいれ、PBSが流れる環境下に置いた。このチューブは上流端が内径5mmで、下流端内径が２．５mmと徐々に細くなった形状をしているものである。これにより、挿入されるePTFEチューブがPBSで流されない様になっている。このポリプロピレンチューブを、ロータリポンプにセットされたシリコンチューブに連結して、PBSを流速100ml/minで循環させた。時間をおいて、コラーゲン(+)チューブを、PBS循環路にいれ、１２日後に全てを取り出した。即ち、流路に１、２、６、１２日間さらされたコラーゲン(+)チューブを回収した。これらを同時に、抗ＦＮＣＢＤ抗体による染色性で検討した。抗FNCBDモノクローナル抗体（TaKaRa、FC4-4）を１：１０００で希釈し、１時間室温で反応させた。次にPBSで３回洗浄し、結合した抗体をABC法で検出した（Vectorstain、マウスABC-POキット、Vector社）。即ち、ビオチン化抗マウスIgG抗体、及びABC-complexを、Vector社マニュアルに倣って、順次反応させた。反応後、PBSで６回洗浄した後、クロロナフトール・H₂O₂で発色反応を行った。その結果、コラーゲンコート後、１２日まで、ほぼ変化無くコラーゲンが残存していることが確認された。このことから、ＰＡＵはコラーゲンを固着する上で非常に有効な材料であることが示された。

[ＨＧＦ融合蛋白質の固定化人工血管の作製]
初めに、コラーゲン(+)チューブに、どの程度のＨＧＦ融合蛋白質が結合可能かを見るため、以下のように検討した。コラーゲン(+)チューブから、4mm径のディスクに打ち抜いたものを複数作成した。９６ウェルプレートのウェルに、種々の濃度のＨＧＦ融合蛋白質溶液あるいは、PBSを添加した。同一濃度のウェルを４ウェルづつ用意し、そのうち２つに、上記のディスクを入れ、残り２つのウェルはディスクを入れずにおいた。３７℃で２時間後、それぞれの溶液をウェルから回収し、ＨＧＦ濃度をHGF
ELISAキット（Quantikine
HGF,R&D社）を用いて測定した。ディスクを入れなかったウェルのＨＧＦ濃度から、ディスクを入れたウェルのＨＧＦを減じて、結合されたＨＧＦ融合蛋白質の濃度とした。その結果を図６に示した。図６から明らかなように、ＨＧＦ融合蛋白質は、ヘテロダイマーとした場合、添加量に依存して結合が増加した。最大濃度６４μg/mlでは、添加量の約半分が結合していた。一方、一本鎖の分子は、低い濃度で結合が飽和した。

次に、最大可能な添加濃度６４μg/ml（ＨＧＦ濃度として）、及び、１６μg/mlのＨＧＦ融合蛋白質溶液を用いて、上記のコラーゲン(+)チューブに添加した。結合したＨＧＦ融合蛋白質の量を、前記と同様に測定したところ、次の結果が得られた（チューブ本数各３本、液量は各１mlでテスト）。即ち、結合量と固定化ＨＧＦ密度は、６４μg/mlの場合は、１本当たり、それぞれ11.7μgと21ng/mm²で、１６μg/mlの場合は、１本当たり、それぞれ4.5μgと8ng/ mm²であった。

[ＨＧＦ融合蛋白質固定化人工血管の移植]
実施例２で作成されたＨＧＦ融合蛋白を固定化した人工血管（添加濃度６４μg/ml）を、ビーグル犬の下肢大腿動脈に置換移植した。動脈の長さ３ｃｍを切除した後、３ｃｍの長さの人工血管を縫合移植した。移植後１，２，４週で摘出し、フォルマリン固定し、パラフィンに包埋した。パラフィンブロックを、人工血管の長軸に沿って１０等分し、そのそれぞれからパラフィン切片を作成し、ヘマトキシリン＆エオシンで染色した結果、１週後では、人工血管の内面には、内皮細胞は認められなかった。２週経過後のものでは、生体血管との吻合部（上流側）から約3mmの部位まで、内皮細胞を認めることができたが、それより下流には内皮細胞は認められなかった。

一方、４週後に摘出したものは、全体にわたり、内皮様細胞が認められた。即ち、１０等分した、それぞれの部位で、人工血管内面上に内皮様細胞の核を見ることができた。図７には、血管の中央部付近（両端からもっとも遠い部位）での、切片の像を示す。これらの内皮様細胞は、抗CD31抗体で染色した結果、陽性であった。また１０箇所の内６箇所について、内側表面上の内皮細胞の核の数を数えた。図８は、その値を、周の長さ1mm当たりに存する内皮細胞の数として表したものである。この結果から明らかな様に、ＨＧＦを固定化した人工血管は、全長にわたって内皮化が起きていた。

[ＶＥＧＦ固定化人工血管の移植]
実施例２において作製されたコラーゲン(+)チューブに、コラーゲン結合性ＶＥＧＦを添加して固定化した。添加濃度は、ＨＧＦ融合蛋白と同じく０．８μM（８０μg/m）とした。このコラーゲン結合性ＶＥＧＦとは、本発明者らが既に開示したＶＥＧＦの融合蛋白質である（特開２００２−６０４００号公報参照）。

このようにして作成されたＶＥＧＦ固定化血管を、前記実施例３と同様に移植した。

[比較例１]ＰＡＵコート人工血管の移植
実施例２で作成されたPAU(+)チューブを、上記実施例３と同様に移植した。、

[比較例２]コラーゲンコート人工血管の移植
実施例２で作成されたコラーゲン(+)チューブを、上記実施例３と同様に移植した。

実施例４と比較例１と２で移植したチューブを、前記実施例３のＨＧＦ融合蛋白質固定化人工血管と同様に、パラフィン切片を作成し染色した。図８から明らかなように、ＶＥＧＦを固定化した人工血管は、ＨＧＦ固定化人工血管に比べ、内皮細胞の数では劣るが、全長にわたって内皮細胞の存在が認められた。これに対し、ＰＡＵコートだけの人工血管では、ごくわずかな数の内皮細胞を認めるのみであった。特に中央部から下流端までは、内皮細胞が皆無に近い状態であった。また、コラーゲンコート人工血管は、全体にわたって内皮細胞は認められるが、その数はＨＧＦ固定化人工血管に比べて遙かに少なかった。
以上のことから、ＨＧＦあるいはＶＥＧＦを固定化したことで、人工血管の内皮化が早まったと考えられる。その効果は、ＶＥＧＦよりもＨＧＦの方がより優れていた。

本発明の人工血管は、蛋白質の活性に影響を与えずに、積層・固定化という簡便な方法で作成される。そして、移植された人工血管の早期内皮化が可能であるため、小口径であっても長期に開存させることが可能な人工血管が得られる。本発明の人工血管は、冠状動脈や下肢血管（膝下動脈）のような、小口径の部位に適用できる人工血管として利用されることが期待される。

本発明の人工血管の構造と機能を説明するための模式図である。本発明のＨＧＦ融合蛋白質のウェスタンブロットの結果を示す図である。レーン１は、市販の組み換えＨＧＦ蛋白質（天然型）。レーン２、３は、AcHH7細胞から分泌された培養上清の蛋白質で、２が血清処理前、３が処理したもの。レーン４は、野生型ウイルスを感染させたSf9細胞の培養上清。本発明のＨＧＦ融合蛋白質の内皮細胞増殖活性を、天然型ＨＧＦと比較した図である。本発明のＨＧＦ融合蛋白質のコラーゲン結合活性を、天然型ＨＧＦと比較した図である。本発明のＨＧＦ融合蛋白質のコラーゲン結合後の活性の経時変化を示す図である。コラーゲンコートチューブへのＨＧＦ融合蛋白質の結合量を示す図である。移植された本発明の人工血管中央部付近の内表面上に、内皮細胞が生着していることを示す図である。移植された本発明の人工血管の、全長にわたる内皮化の程度を示す図である。縦軸は周1mm当りに存在する内皮細胞核の数を、横軸は上流側吻合部からの長さ(mm)を示す。

符号の説明

１本発明の人工血管
２多孔質管状構造体
３ポリアミノ酸ウレタン共重合体層
４コラーゲン又はゼラチン層
５内皮細胞増殖促進剤

配列番号１
人工配列の説明：HGF融合蛋白質をコードするDNA配列。
塩基番号１から６２はメリチンシグナル配列をコードする塩基配列(pAcYM1-Melに由来)、
塩基番号７０から７４４はFnのアミノ酸番号２６０から４８４をコードする配列、
塩基番号７４８から７６２はエンテロキナーゼの認識配列をコードする配列、
塩基番号７６３から２８５６は、ＨＧＦの成熟ポリペプチドをコードする配列、
である。

配列番号２
人工配列の説明：HGF融合蛋白質
アミノ酸番号３から２２７はFnのアミノ酸番号２６０から４８４までのアミノ酸配列、
アミノ酸番号２２９から２３３はエンテロキナーゼ認識配列、
アミノ酸番号２３４から９３０はＨＧＦ成熟ポリペプチドのアミノ酸配列、
である。

配列番号３
人工配列の説明：HGF融合蛋白質をコードするDNA配列。
塩基番号１から６２はメリチンシグナル配列をコードする塩基配列(pAcYM1-Melに由来)、
塩基番号７０から１０８９はFnのアミノ酸番号２６０から５９９をコードする配列、
塩基番号１０９３から１１０７はエンテロキナーゼの認識配列をコードする配列、
塩基番号１１０８７から３２０１は、ＨＧＦの成熟ポリペプチドをコードする配列、
である。

配列番号４
人工配列の説明：HGF融合蛋白質
アミノ酸番号３から３４２はFnのアミノ酸番号２６０から５９９までのアミノ酸配列、
アミノ酸番号３４４から３４８はエンテロキナーゼ認識配列、
アミノ酸番号３４９から１０４５はＨＧＦ成熟ポリペプチドのアミノ酸配列、
である。

Claims

多孔質管状構造体の少なくとも内表面に、（１）ポリアミノ酸ウレタン共重合体、（２）コラーゲン又はゼラチン、（３）コラーゲン結合活性を有する内皮細胞増殖促進剤を、順次積層し固定化して成る人工血管。
多孔質管状構造体が、延伸ポリテトラフルオロエチレンからなるものである請求項１記載の人工血管。
ポリアミノ酸ウレタン共重合体が、アミノ酸ユニット平均４以上が連続して結合されたポリアミノ酸とウレタンとの共重合体であって、（ａ）α−アミノ酸−Ｎ−カルボン酸無水物、（ｂ）イソシアネート基を有するウレタンプレポリマー、（ｃ）水、ヒドラジン及び有機アミンから選ばれる少なくとも１種、を反応させて得られるものである請求項１又は２記載の人工血管。
内皮細胞増殖促進剤が、コラーゲン結合活性を有するポリペプチドと血管新生因子との融合蛋白質である請求項１〜３記載の人工血管。
融合蛋白質が、コラーゲン結合活性を有するポリペプチドとHGFとの融合蛋白質である請求項４記載の人工血管。
融合蛋白質が、配列表配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列、あるいはこれと相同なアミノ酸配列を持つHGF融合蛋白質である請求項５記載の人工血管。
コラーゲン結合活性を有するポリペプチドが、フィブロネクチン由来のポリペプチドである請求項４〜６記載の人工血管。