CN105327399B - 一种人造血管的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人造血管的构建方法，具体为在涤纶编织物管的内外均匀涂覆一种引入两种功能多肽的再生丝素蛋白。这两种多肽，一种是链侧基含有大量的亲水性基团，主要是酸性氨基酸、分子呈负电性的多肽，另一种是含有8个RGD的、促进细胞粘附的多肽。这两种多肽来自于生物体表达，序列是来自于天然蛋白质的类似物，无毒无刺激性，分子量单一，能与丝素蛋白共价结合涂覆于涤纶管，持续稳定地赋予人造血管亲水性能和负电性，促内皮化，降低对细胞的伤害，阻止蛋白沉积和血细胞聚集而造成血栓堵塞。本发明构建的人造血管具有良好的生物相容性，具有类似于天然血管的负电性膜层和促进内皮细胞粘附生长的微环境，这样有利于保护血液细胞和防止血栓形成。

Description

一种人造血管的构建方法
技术领域
本发明涉及应用于血管病变置换的涤纶人造血管领域，具体涉及一种表面引入带有亲水性和负电荷多肽和促进细胞粘附多肽的涤纶人造血管的构建方法。
背景技术
我国每年因心脑血管疾病死亡的人数有数百万，约以30％的比例逐年增加，因此，血管移植已成为关注的热点。人造血管是目前临床上最为紧缺的医疗器械，其中小口径人造血管的移植还是临床空白，即便是中、大口径人造血管，在我国产品也非常稀少，国产产品每年的使用比例非常小，只有20％左右。保守估计，全球每年超过200万(约60万人小口径)，我国每年约百万患者需要进行血管移植，所以研制具有自主知识产权的新功能人造血管材料尤其重要。
目前临床上人造血管使用的原料主要是涤纶和聚四氟乙烯的合成高分子材料，由涤纶纤维织成的管状人造血管(Dacron)已成功用于治疗主动脉瘤、主动脉狭窄等等大血管置换。由合成高分子聚四氟乙烯为原料经注塑而成的人造血管(Core-Tex)，也被成功用于大血管置换。但这两种材料疏水性都很强，不利于管内壁内皮化，组织相容性较差，有排异现象，易诱发血栓、表面沉积及炎症。为了能够较长时间的防止血栓，患者须终身服药，即便如此，5年后的通畅率也只有一半左右，所以上述这两种材料并不是最理想的人工血管材料，尤其不适用于临床小口径人造血管的研制。
涤纶纤维是应用较早的一种(大口径)人造血管材料，为了提高其生物相容性，一些研究报导了用丝素蛋白溶液浸渍涂层多孔针织涤纶血管来减轻对异物的反应和促进内皮细胞粘附，同时可以降低织物的渗水率(如中国协和医科大学博士学位论文：丝素蛋白涂层人造血管的研制)。
对于聚四氟乙烯材料人造血管，为了提高其内皮化，有将骨髓CD34+细胞种植于人造血管进行内皮化后，再进行移植来改善通畅率(如中华外壳杂志，2004)；也有将血管内皮生长因子(VEGF)基因装载于聚四氟乙烯材料中来促进内皮细胞的生长(如浙江大学学报，2007)。在抗凝血性能方面，主要报导了一些采用肝素固化和共价水蛭素以提高人造血管材料的抗凝和通畅性。
丝素蛋白或者胶原蛋白涂层可以改善涤纶和聚四氟乙烯材料的细胞相容性，但从天然血管组织结构来看，内壁为一层内皮细胞层，是防止血栓形成的关键，加之为带负电荷的内膜，能够阻止血浆蛋白沉积、减少血栓形成。所以，对于血管移植物而言，要有效阻止血栓，表面亲水性、电负性和促进内皮化是得以快速修复并保持通畅的重要内因，也就是说，人造血管，尤其是小口径人造血管应该具有类似于天然血管的负电性膜层和促进内皮细胞粘附生长的微环境。
发明内容
针对目前涤纶人造血管临床应用的一些问题，及不能应用于小口径人造血管制备的根本问题，本发明旨在提供一种表面引入带有亲水性和负电荷多肽和促进细胞粘附多肽的涤纶人造血管的构建方法，构建出的人造血管属于血液相容性材料，具有优异的表面亲水性和负电荷性和内皮化潜力，有利于组织愈合和抗凝固。
为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：
一种人造血管的构建方法，包括如下步骤：
步骤1)设计并构建携带有具有亲水性和负电荷多肽和促进细胞粘附多肽的基因的原核系统表达载体(Journal of Donghua University(English Edition),2012,29:26-29；Bio-Medical Materials and Engineering,2014,24:2057–2064)；所述具有亲水性和负电荷多肽为第一功能多肽，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1；所述促进细胞粘附多肽为第二功能多肽，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2；
步骤2)将已经设计构建好的携带有具有亲水性和负电荷多肽基因和促进细胞粘附多肽基因的原核系统表达载体转染大肠杆菌(BL21)细胞诱导培养数小时；
步骤3)收集并破碎上述大肠杆菌细胞，再经过纯化，获得具有亲水性/强负电性的多肽和促进细胞粘附的多肽，使用时配制成功能多肽水溶液；
步骤4)利用家蚕生丝制备再生丝素蛋白水溶液；
步骤5)将涤纶丝采用编织机纺成内径为1～6mm的管状编织物；
步骤6)将制得的再生丝素蛋白-功能多肽水溶液注入上述涤纶管状编织物，并添加一定含量的交联剂，冷冻干燥后摘下管状样品；或将制得的再生丝素蛋白水溶液注入上述涤纶管状编织物，并添加一定含量的交联剂，冷冻干燥后浸入功能多肽水溶液中，再次加入交联剂，在4℃温度下过夜反应，最后用去离子水浸泡风干。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种涤纶小口径(<6mm)人造血管构建新技术，将涤纶纤维编织物作为中层，由内而外涂覆再生丝素蛋白，同时引入功能多肽。本发明引入的多肽中，其中之一是链侧基含有大量的亲水性基团，而且主要是酸性氨基酸，分子呈负电性的多肽；另一种是含有8个RGD的促进细胞粘附的多肽。这两种多肽来自于生物体表达，序列是来自于天然蛋白质的类似物，无毒无刺激性，分子量单一，能与丝素蛋白共价结合，持续稳定地赋予涤纶亲水性能和负电性，促内皮化，降低对细胞的伤害，阻止蛋白沉积和血细胞聚集而造成血栓堵塞。通过本发明的方法构建的小口径人造血管具有类似于天然血管的负电性膜层和促进内皮细胞粘附生长的微环境，这样有利于保护血液细胞和防止血栓形成。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。
一种上述人造血管的构建方法，可以通过如下实施例实施。在制备所述人造血管之前，应先设计并构建携带有具有亲水性和负电荷多肽基因和促进细胞粘附多肽基因的原核系统表达载体(Journal of Donghua University(English Edition),2012,29:26-29；Bio-Medical Materials and Engineering,2014,24:2057–2064)；所述具有亲水性和负电荷多肽为第一功能多肽，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1；所述促进细胞粘附多肽为第二功能多肽，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2。所述两类多肽来自于生物体表达，其多肽序列均来自于天然丝蛋白中的一段类似物及其重复。
实施例一
1、分别将携带有第一功能多肽基因和第二功能多肽基因的原核系统表达载体转染大肠杆菌(BL21)细胞，涂覆于含氨苄青霉素的Luria-Bertani固体培养基，倒置放入37℃的生化培养箱培养14-16小时；挑取单一菌落放入新鲜含氨苄青霉素的4mL的Luria-Bertani液体培养基中，插入振荡速度200r/min的空气摇床37℃振荡培养8-10小时；将培养的菌液按1:100的比例于1L含氨苄青霉素的新鲜Luria-Bertani液体培养基中扩增培养；当菌液密度达OD600＝0.3～1.8时加入0～1.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导培养0～8小时，4℃离心收集菌细胞。
2、将收集的菌细胞用谷胱甘肽转移酶(GST)的亲和层析的结合缓冲液重悬混匀，置于冰上超声波破碎细胞，释放蛋白质；破碎完成后12000r/min、4℃离心10min收集含有第一功能多肽或第二功能多肽的上清液；表达的含有第一功能多肽或第二功能多肽序列的蛋白是含有GST标签的融合蛋白；将含有融合蛋白的上清液灌注GST亲和层析柱，洗脱非特异性蛋白，加入谷胱甘肽洗脱并收集单一的第一功能多肽或第二功能多肽的融合蛋白，然后灌入G50的Sephadex分子筛层析柱去除谷胱甘肽。
3、采用凝血酶酶切融合蛋白标签GST，切除标签GST释放第一功能多肽或第二功能多肽，酶切后的混合溶液分别进一步灌注GST亲和层析柱，收集流出液即获得第一功能多肽或第二功能多肽溶液；将第一功能多肽或第二功能多肽溶液加入脱盐柱脱净溶液中的所有盐成分，收集的第一功能多肽或第二功能多肽水溶液立即用液氮冻结，然后置于冷冻干燥机干燥成第一功能多肽或第二功能多肽粉末。
4、家蚕生丝在浓度为0.06％的Na2CO3溶液里煮沸脱胶，将一定量的脱胶干净的家蚕丝素以1:10的浴比放入到三元溶液氯化钙·乙醇·水(摩尔比为1:2:8),72℃水浴锅中充分搅拌至丝素充分溶解，将丝素溶液装入到透析袋中，4℃去离子水中透析3天，每2小时更换一次去离子水，即可得到家蚕丝素蛋白水溶液；将透析后的丝素溶液置于风扇下，蒸发去除一定的水分，调整透析后的丝素蛋白溶液浓度为2.5～6.0％。
5、将30～50D涤纶长丝通过组合编织成内径为1～6mm的小口径管状编织物；将织成的管状编织物装在设计的特定规格的模具上，再把上述丝素蛋白溶液脱气泡后注入管状模具中，由内而外渗透管状编织物，然后置于-80℃～-20℃冷冻1.0～24小时，取出小口径管状编织物浸渍于70％的乙醇2小时后，用去离子水冲洗去除乙醇。
6、管状编织物浸渍于适量的MES溶液中处理1小时，然后加入过量的EDC和NHS的混合液，冰浴条件处理1小时，再用去离子水冲洗干净；浸入0.01～0.015μM第一功能多肽的水溶液中(调节pH＝7.5)，4℃过夜反应；取出用去离子冲洗、风干；重复浸渍于适量的MES溶液中处理1小时，然后加入过量的EDC和NHS的混合液，冰浴条件处理1小时，再用去离子水冲洗干净；浸入0.01～0.015μM第二功能多肽的水溶液中，4℃下过夜反应，最后取出置于盛有去离子水的容器内浸渍2～4天，每隔3～4小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水。
7、取出并在标准环境中风干，得到具有一定孔结构的管状编织物。
本实施例获得的管状编织物细胞毒性0级(方法按照中华人民共和国国家标准GB/T 16886.5-2003/ISO 10993-5:1999，医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性实验中的浸提液试验方法)，无渗漏；细胞在本实施例获得的管状编织物内表面上1小时的粘附率达82.5％以上，细胞增殖率比丝素溶液涂层的涤纶管状编织物提高达65％以上；本实施例获得的管状编织物内表面的水接触角为纯涤纶材料的50％左右。
实施例二
1、分别将携带有第一功能多肽基因和第二功能多肽基因的原核系统表达载体转染大肠杆菌(BL21)细胞，涂覆于含氨苄青霉素的Luria-Bertani固体培养基，倒置放入37℃的生化培养箱培养14～16小时；挑取单一菌落放入新鲜含氨苄青霉素的4mL的Luria-Bertani液体培养基中，插入振荡速度200r/min的空气摇床37℃振荡培养8～10小时；将培养的菌液按1:100的比例于1L含氨苄青霉素的新鲜Luria-Bertani液体培养基中扩增培养；当菌液密度达OD600＝0.3～1.8时加入0～1.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导培养0～8小时，4℃离心收集菌细胞。
2、将收集的菌细胞用谷胱甘肽转移酶(GST)的亲和层析的结合缓冲液重悬混匀，置于冰上超声波破碎细胞，释放蛋白质；破碎完成后12000r/min、4℃离心10min收集含有第一功能多肽或第二功能多肽的上清液。表达的含有第一功能多肽或第二功能多肽序列的蛋白是含有GST标签的融合蛋白；将含有融合蛋白的上清液灌注GST亲和层析柱，洗脱非特异性蛋白，加入谷胱甘肽洗脱并收集单一的第一功能多肽或第二功能多肽的融合蛋白，然后灌入G50的Sephadex分子筛层析柱去除谷胱甘肽。
3、采用凝血酶酶切融合蛋白标签GST，切除标签GST释放第一功能多肽或第二功能多肽，酶切后的混合溶液分别进一步灌注GST亲和层析柱，收集流出液即获得第一功能多肽或第二功能多肽溶液；将第一功能多肽或第二功能多肽溶液加入脱盐柱脱净溶液中的所有盐成分，收集的第一功能多肽或第二功能多肽水溶液立即用液氮冻结，然后置于冷冻干燥机干燥成第一功能多肽或第二功能多肽粉末。
4、家蚕生丝在浓度为0.06％的Na2CO3溶液里煮沸脱胶，将一定量的脱胶干净的家蚕丝素以1:10的浴比放入到三元溶液氯化钙·乙醇·水(摩尔比为1:2:8),72℃水浴锅中充分搅拌至丝素充分溶解，将丝素溶液装入到透析袋中，4℃去离子水中透析3天，每2小时更换一次去离子水，即可得到家蚕丝素蛋白水溶液；将透析后的丝素溶液置于风扇下，蒸发去除一定的水分，调整透析后的丝素蛋白溶液浓度为2.5～6.0％。
5、将30～50D涤纶长丝通过组合编织成内径为1～6mm的小口径管状编织物；将织成的管状织物装在设计的特定规格的模具上，再把上述丝素蛋白溶液脱气泡后注入管状模具中、由内而外渗透编织物，然后置于-80℃～-20℃冷冻1.0～24小时，取出小口径管状编织物浸渍于70％的乙醇2小时后，用去离子水冲洗去除乙醇；
6、管状编织物浸渍于适量的MES溶液中处理1小时，然后加入过量的EDC和NHS的混合液，冰浴条件处理1小时，再用去离子水冲洗干净；浸入含有0.01～0.015μM第一功能多肽和0.01～0.015μM第二功能多肽的混合水溶液(调节pH＝7.5)中，4℃下过夜反应，最后取出置于盛有去离子水的容器内浸渍2～4天，每隔3～4小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水；
7、取出在标准环境中风干，得到具有一定孔结构的管状编织物。
本实施例获得的的管状编织物细胞毒性0级(方法按照中华人民共和国国家标准GB/T 16886.5-2003/ISO 10993-5:1999，医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性实验中的浸提液试验方法)，无渗漏；细胞在本实施例获得的管状编织物内表面上1小时的粘附率达80％以上，细胞增殖率比丝素溶液涂层的涤纶管状编织物提高55～60％；本实施例获得的管状编织物内表面的水接触角为纯涤纶材料的50％左右。
实施例三
1、分别将携带有第一功能多肽基因和第二功能多肽基因的原核系统表达载体转染大肠杆菌(BL21)细胞，涂覆于含氨苄青霉素的Luria-Bertani固体培养基，倒置放入37℃的生化培养箱培养14-16小时；挑取单一菌落放入新鲜含氨苄青霉素的4mL的Luria-Bertani液体培养基中，插入振荡速度200r/min的空气摇床37℃振荡培养8～10小时；将培养的菌液按1:100的比例于1L含氨苄青霉素的新鲜Luria-Bertani液体培养基中扩增培养；当菌液密度达OD600＝0.3～1.8时加入0～1.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导培养0-8小时，4℃离心收集菌细胞。
2、将收集的菌细胞用谷胱甘肽转移酶(GST)的亲和层析的结合缓冲液重悬混匀，置于冰上超声波破碎细胞，释放蛋白质；破碎完成后12000r/min、4℃离心10min收集含有第一功能多肽或第二功能多肽的上清液；表达的含有第一功能多肽或第二功能多肽序列的蛋白是含有GST标签的融合蛋白；将含有融合蛋白的上清液灌注GST亲和层析柱，洗脱非特异性蛋白，加入谷胱甘肽洗脱并收集单一的第一功能多肽或第二功能多肽的融合蛋白，然后灌入G50的Sephadex分子筛层析柱去除谷胱甘肽。
3、采用凝血酶酶切融合蛋白标签GST，切除标签GST释放第一功能多肽或第二功能多肽，酶切后的混合溶液分别进一步灌注GST亲和层析柱，收集流出液即获得第一功能多肽或第二功能多肽溶液；将第一功能多肽或第二功能多肽溶液加入脱盐柱脱净溶液中的所有盐成分，收集的第一功能多肽或第二功能多肽水溶液立即用液氮冻结，然后置于冷冻干燥机干燥成第一功能多肽或第二功能多肽粉末。
4、家蚕生丝在浓度为0.06％的Na2CO3溶液里煮沸脱胶，将一定量的脱胶干净的家蚕丝素以1:10的浴比放入到三元溶液氯化钙·乙醇·水(摩尔比为1:2:8),72℃水浴锅中充分搅拌至丝素充分溶解，将丝素溶液装入到透析袋中，4℃去离子水中透析3天，每2小时更换一次去离子水，即可得到家蚕丝素蛋白水溶液。将透析后的丝素溶液置于风扇下，蒸发去除一定的水分，调整透析后的丝素蛋白溶液浓度为2.5～6.0％。
5、向丝素蛋白水溶液中加入适量的MES溶液冰浴1小时，加入终浓度为0.01～0.015μM的第一功能多肽和0.01～0.015μM的第二功能多肽，同时加入过量的EDC和NHS的混合液，搅拌均匀、脱除气泡；将30～50D涤纶长丝通过组合编织成内径为1～6mm的小口径管状编织物，织成的管状织物装在设计的特定规格的模具上，缓慢注入上述混合溶液、由内而外渗透编织物，然后于-80℃～-20℃冷冻1.0～24小时，最后取出置于盛有去离子水的容器内浸渍2～4天，每隔3～4小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水。
6、取出在标准环境中风干，得到具有一定孔结构的管状编织物。
本实施例获得的的管状编织物细胞毒性0级(方法按照中华人民共和国国家标准GB/T 16886.5-2003/ISO 10993-5:1999，医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性实验中的浸提液试验方法)，无渗漏；细胞在本实施例获得的管状编织物内表面上1小时的粘附率为76％左右，细胞增殖率比丝素溶液涂层的涤纶管状编织物提高50％以上；本实施例获得的管状编织物内表面的水接触角为纯涤纶材料的55％左右。
实施例四
1、将家蚕生丝在浓度为0.06％的Na2CO3溶液里煮沸脱胶，将一定量的脱胶干净的家蚕丝素以1:10的浴比放入到三元溶液氯化钙·乙醇·水(摩尔比为1:2:8),72℃水浴锅中充分搅拌至丝素充分溶解，将丝素溶液装入到透析袋中，4℃去离子水中透析3天，每2小时更换一次去离子水，即可得到家蚕丝素蛋白水溶液；将透析后的丝素溶液置于风扇下，蒸发去除一定的水分，调整透析后的丝素蛋白溶液浓度为2.5～6.0％。
2、将30～50D涤纶长丝通过组合编织成内径为1～6mm的小口径管状编织物；将织成的管状织物装在设计的特定规格的模具上，再把上述丝素蛋白溶液脱气泡后注入管状模具中，由内而外渗透编织物，然后置于-80℃～-20℃冷冻1.0～24小时，取出小口径管状编织物浸渍于70％的乙醇2小时；最后取出置于盛有去离子水的容器内浸渍2～4天，每隔3～4小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水。
3、取出在标准环境中风干，得到具有一定孔结构的管状编织物。
本实施例获得的的管状编织物细胞毒性0级(方法按照中华人民共和国国家标准GB/T 16886.5-2003/ISO 10993-5:1999，医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性实验中的浸提液试验方法)，无渗漏；细胞在本实施例获得的管状编织物内表面上1小时的粘附率不到70％。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种人造血管的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1)设计并构建携带有具有亲水性和负电荷多肽和促进细胞粘附多肽的基因的原核系统表达载体；所述具有亲水性和负电荷多肽为第一功能多肽，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1；所述促进细胞粘附多肽为第二功能多肽，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2；
步骤2)将已经设计构建好的携带第一功能多肽基因和第二功能多肽基因的原核系统表达载体转染大肠杆菌细胞诱导培养数小时；
步骤3)收集并破碎上述大肠杆菌细胞，再经过纯化，获得具有第一功能多肽和第二功能多肽，使用时配制成功能多肽水溶液；
步骤4)利用家蚕生丝制备再生丝素蛋白水溶液；
步骤5)将涤纶丝采用编织机纺成内径为1～6mm的管状编织物；
步骤6)将制得的再生丝素蛋白水溶液及功能多肽水溶液注入上述涤纶管状编织物，并添加一定含量的交联剂，冷冻干燥后摘下管状样品；或将制得的再生丝素蛋白水溶液注入上述涤纶管状编织物，并添加一定含量的交联剂，冷冻干燥后浸入功能多肽水溶液中，再次加入交联剂，在4℃温度下过夜反应，最后用去离子水浸泡，风干。
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