CN107840973A - 一种丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用,所述方法通过由特定家蚕丝素缺失型突变品种的蚕茧提取获得的丝胶蛋白水溶液同时与两种交联剂交联,获得具有新特性的丝胶蛋白水凝胶。由本发明所述方法制得的丝胶蛋白水凝胶具有新的荧光特性,即超强的绿色和红色荧光特性;具有与传统水凝胶不同的微观结构,水凝胶拥有两类微孔的复合孔结构;同时具有形变记忆性,可注射性及原位成胶特性;所述丝胶蛋白水凝胶具有良好的生物相容性和细胞粘附性,对药物具有良好的控释作用;丝胶蛋白水凝胶及其经过冻干得到的三维多孔丝胶蛋白生物支架,可作为细胞外基质支持细胞生长和促进营养物质交换,可应用于多种组织损伤的修复和疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明属于组织工程学领域,涉及一种生物医用材料,具体为一种丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
丝胶蛋白是包裹在蚕丝表面的一种粘性蛋白,约占蚕丝蛋白总质量的20~30%,其由分子量为24~400kDa的多肽组成,含有18种氨基酸。长期以来由于人们对丝胶蛋白研究和认识的不足,主要将其当作废物处理,造成资源的严重浪费和环境的污染。直到近年来随着研究的深入,人们发现丝胶蛋白不但具有诸多优良特性,如,可降解、抗菌、抗癌、抗氧化、抗凝血、亲水、保湿、增白、无免疫原性以及促进细胞粘附和增殖等;而且拥有大量便于人们进行交联和修饰的活性基团,如氨基、羟基、羧基。如今,丝胶蛋白已成为一种备受人们青睐的新兴生物医用材料。
水凝胶作为一类重要的组织工程材料,具有一定的柔韧性且富含水,与天然组织非常接近,已被广泛地应用于生物医药和组织工程与再生医学的各个领域。例如,被用于模拟细胞外基质,为细胞、组织提供结构支撑和形态引导;作为药物或细胞的递送载体或仓库;用于生物粘附剂和组织隔离材料等。其中一类水凝胶由天然生物材料(如胶原、海藻酸盐、壳聚糖和透明质酸等)制备,这类水凝胶因为拥有与机体高度相似的理化特性和优越的生物学性能而备受青睐。丝胶蛋白具有良好的生物活性和无免疫原性,基于丝胶开发新型水凝胶是当前蚕丝蛋白应用研究的重要课题。
由于当前丝胶蛋白分离方法的局限性,直到2014年我们采用未降解性丝胶在国际上首次通过交联的方式制备了具有优良特性的三维纯丝胶蛋白水凝胶,但在机械强度低、透明度差、荧光特性较弱、交联剂毒性大等方面存在一些问题;另一方面当前报道的丝胶蛋白水凝胶及其孔结构是均一的,具有复合孔结构(同一材料具有不同类型的孔)的丝蛋白水凝胶的研究仍处于空白。
另外多重交联有望提高材料的交联度,交联度的提高与材料的机械性能,膨胀等特性息息相关。因此采用多重交联是开发新型特性的丝胶蛋白水凝胶的潜在途径。由于存在不同的交联剂之间会发生相互作用或反应,以及交联剂与丝胶蛋白发生反应的强度和成胶时间不同等问题导致多重交联的困难。为此我们筛选了交联剂组合,优化体系配比方案(含加样顺序),成功实现了多重交交并开发出了新型丝胶蛋白水凝胶及支架。
发明内容
解决的技术问题:为了克服现有技术的缺陷,获得一种具有优良荧光特性、复合孔结构、形变记忆性、可注射性、生物相容性和细胞粘附性的丝胶蛋白水凝胶,本发明提供了一种通过多重交联的手段制备丝胶蛋白水凝胶的方法,以及所述丝胶蛋白水凝胶在荧光标记探针、生物医用材料及药物和/或生长因子载体中的应用。
技术方案:一种丝胶蛋白水凝胶的制备方法,包含以下步骤:
第1步、制备丝胶蛋白水溶液
称取丝素缺失型突变品种的家蚕蚕茧,采用LiBr或LiCl水溶液提取,经纯化、浓缩得到非降解性的质量百分浓度为1.0~10%的丝胶蛋白水溶液;
第2步、制备丝胶蛋白水凝胶
将HRP加入丝胶蛋白水溶液中,混合均匀后加入戊二醛并混匀,最后加入H2O2混匀,制得丝胶蛋白水凝胶;
其中,HRP为催化剂,戊二醛和H2O2为交联剂;戊二醛的浓度为0.1~50wt%,且每毫升丝胶蛋白水溶液中加入1~500μL戊二醛;HRP的质量百分浓度为1×10-5~50%,每毫升丝胶蛋白水溶液中加入1~1000μLHRP;H2O2的质量百分浓度为1×10-6~30%,每毫升丝胶蛋白水溶液中加入1~1000μL H2O2。
所述家蚕丝素缺失型突变品种为185Nd-s,140Nd-s,139Nd-s,均由中国农业科学院蚕业研究所保存和提供。
优选的,第1步中所述丝胶蛋白水溶液的具体制备方法如下:
(1)称取丝素缺失型突变品种家蚕蚕茧并剪成碎片,清洗后去除水分;
(2)将蚕茧碎片浸泡于浓度为6~8mol/L的LiBr或LiCl水溶液中,25~50℃浸泡5~24 小时,LiBr或LiCl水溶液的用量为每克蚕茧碎片加入20~100mL;
(3)取步骤(2)的溶液离心、去除不溶物,收集澄清溶液;
(4)向步骤(3)获得的澄清溶液中加入1/4体积的1mol/L、pH8.0~11.0的Tris-HCl缓冲液,并在超纯水中透析;
(5)将步骤(4)纯化后溶液离心去除沉淀,浓缩得到质量百分浓度为1.0~10%的丝胶蛋白水溶液。
进一步的,第1步中所述丝胶蛋白水溶液的具体制备方法如下:
(1)称取家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧,并将其剪成1cm2碎片,清洗3次,去除水分,备用;
(2)将蚕茧碎片浸泡于浓度为6mol/L的LiBr水溶液中,35℃浸泡24小时,LiBr或LiCl 水溶液的用量为每克蚕茧碎片加入40mL;
(3)取步骤(2)的溶液3500rpm离心、去除不溶物,收集澄清溶液;
(4)向步骤(3)获得的澄清溶液中加入1/4体积的1mol/L、pH9.0的Tris-HCl缓冲液,并在超纯水中透析;
(5)将步骤(4)纯化后溶液离心去除沉淀,透析得到浓度为0.1~4wt%的丝胶蛋白水溶液,再浓缩至1.0~10wt%,置于4℃冰箱保存。
由所述方法制备获得的丝胶蛋白水凝胶。
所述丝胶蛋白水凝胶在制备荧光标记探针中的应用。
所述丝胶蛋白水凝胶在制备生物医用材料中的应用。
所述丝胶蛋白水凝胶在制备药物和/或生长因子载体中的应用。
有益效果:(1)本发明首次采用多交联剂同时交联丝胶蛋白,采用非降解丝胶蛋白制备多重交联的丝胶蛋白水凝胶;(2)由本发明所述方法制得的丝胶蛋白水凝胶具有新的荧光特性,即超强的绿色和红色荧光特性;(3)所述丝胶蛋白水凝胶具有新型的复合孔微观结构;同时具有形变记忆性,可注射性及原位成胶特性;(4)所述丝胶蛋白水凝胶具有良好的生物相容性和细胞粘附性,对药物具有良好的控释作用;(5)丝胶蛋白水凝胶及其经过冻干得到的三维多孔丝胶蛋白生物支架,可作为细胞外基质支持细胞生长和促进营养物质交换,可应用于多种组织损伤的修复和疾病的治疗。
附图说明
图1是本发明所述的丝胶蛋白水凝胶示意图;
其中A为戊二醛和H2O2同时交联制得,B为戊二醛交联制得;C为H2O2交联制得;
图2是实施例1中制得丝胶蛋白水凝胶的微观结构图;
其中A为戊二醛和H2O2同时交联制得,B为戊二醛交联制得;C为H2O2交联制得;
图3是实施例1中不同交联方式制备获得的丝胶蛋白水凝胶的孔隙率统计图;
图4是实施例1中丝胶蛋白水凝胶在不同pH条件下的降解曲线图;
图5是实施例1中丝胶蛋白水凝胶在不同pH条件下的吸水膨胀率(37℃)曲线图;
图6是实施例1中丝胶蛋白水凝胶的红外光谱图;
图7是实施例1中丝胶蛋白水凝胶冻干支架的荧光图;
图8是实施例1中丝胶蛋白水凝胶冻干支架的绿色荧光强度统计图;
图9是实施例1中丝胶蛋白水凝胶冻干支架的红色荧光强度统计图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换,均属于本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一种丝胶蛋白水凝胶的制备方法,包含以下步骤:
一、蚕茧选择
选用丝素缺失型突变品种家蚕蚕茧(由中国农业科学院蚕业研究所保存并向外商业化提供) 为原材料,主要的化学成分为:家蚕丝胶蛋白。
二、丝胶的提取与分离
(1)称取家蚕突变品种蚕茧0.5g并剪成0.2cm2的碎片,然后置于洁净的蓝盖瓶中,用超纯水清洗5次,5000rpm离心5分钟去除水分;
(2)向步骤(1)中得到的蚕茧碎片中加入25mL的摩尔浓度为6mol/L的LiBr溶液,将该蓝盖瓶置于恒温水浴锅内35℃水浴24小时,溶解丝胶蛋白;
(3)将步骤(2)得到的溶液转入离心管内6000rpm离心10分钟,去除不溶性物质,得到澄清的溶液;
(4)向步骤(3)得到的澄清溶液中加入其1/4体积的Tris-HCl缓冲液(1mol/L,pH9.0);
(5)将步骤(4)中的溶液转入到预处理好的透析袋(MWCO 3500)中,然后将透析袋两端用麻线扎紧,放置于含有超纯水的烧杯中;将该烧杯置于搅拌器上慢速搅拌透析,每隔3 小时换一次水,共透析48小时;
(6)将(5)中透析后的丝胶蛋白水溶液转到离心管中,6000rpm离心5分钟,去除沉淀;
(7)将丝胶蛋白水溶液再装入到透析袋中并将透析袋两端用夹子夹紧,再将透析袋置于质量百分浓度为10-40%(w/v)的PEG6000溶液中浓缩;将丝胶蛋白水溶液浓缩到需要的浓度为止(质量百分浓度为2.0%以上);
(8)蛋白浓度检测采用丝胶蛋白水溶液干燥法;取1mL的丝胶蛋白水溶液转入洁净的小玻璃培养皿中。然后将培养皿置于烘箱中100℃烘干12小时。接下来用摄子将烘干的丝胶蛋白膜取下。则丝胶蛋白溶液的浓度即为:丝胶蛋白膜的质量/1mL。
(9)蛋白质分子量检测采用SDS-PAGE方法。取20μL用于分子量检测,其余置于4℃冰箱保存备用。
三、水凝胶的制备
(1)将浓缩后的丝胶蛋白水溶液用超纯水调整到2.0%(丝蛋白水溶液浓度为质量百分浓度);
(2)每1mL丝胶蛋白水溶液中加入20μL浓度为5mg/mL的辣根过氧化物酶;
(3)充分混匀后加入20μL质量百分浓度为25%的戊二醛并迅速混匀。
(4)向步骤3中加入20μL质量百分浓度为0.003%的过氧化氢并迅速混匀。
(5)静置2分钟便可获得水凝胶如图1所示。
四、结果分析
1、丝胶蛋白的颜色
该丝胶蛋白水凝胶由丝胶蛋白同时与两种交联剂(过氧化氢和戊二醛)同时交联获得,如图1所示水凝胶的颜色呈淡红色。
2、丝胶水凝胶具有新型的复合孔结构(含大小两类孔)
将丝胶蛋白水凝胶在-196℃过夜冷冻后再经真空低温冻干,并在扫描电子显微镜下观察。如图2所示:多重交联获得的丝胶蛋白水凝胶经-196℃冷冻温度处理后再冻干获得的丝胶蛋白三维多孔生物支架孔径大小和孔的分布与形态,单一交联剂(仅采用过氧化氢或戊二醛一种交联剂与丝胶蛋白交联)获得的丝胶蛋白水凝胶经-196℃冷冻温度处理后再冻干获得的丝胶蛋白三维多孔生物支架孔径大小和孔的分布与形态。从图2可以看出单一交联的丝胶蛋白水凝胶 (支架)均为单一的孔结构(同一水凝胶微观结构比较均一,所有的孔大小相近,结构相似),而多重交联获得的丝胶蛋白水凝胶具有两类孔结构,孔为大小两类复合存在。表明本发明获得了具有新结构的新型丝胶蛋白水凝胶。
3、丝胶蛋白水凝胶的孔隙率对比分析
将水凝胶在-196℃下冻干后称重得质量为w1,置于超纯水中1小时后取出并去除样品表面多余的水后称得样品的重量为w2,则样品的孔隙率即为(w2-w1)/w2×100%。由图3我们可以看出,不同交联方式获得的丝胶蛋白水凝胶的孔隙率是不同的。本发明中采用的多重交联方式获得的丝胶蛋白水凝胶的孔隙率相对于单交联的水凝胶的孔隙率低。
4、丝胶蛋白水凝胶在不同pH环境下的降解速率
对于测试pH环境对降解的影响,将丝胶蛋白水凝胶浸泡于不同pH值(pH 3.0、pH7.4、 pH 11.0)的PBS溶液中,每日更换一次PBS溶液,在预设的时间点,取出、干燥、称重,结果见图4。
如图4所示:丝胶蛋白水凝胶在前7天内降解速率较快,7天后丝胶蛋白水凝胶的降解速率变缓慢。水凝胶降解具有pH响应性,其中在pH 11.0的碱性条件下降解速率最快,3周接近完全降解;在pH 3.0的酸性条件下降解速率最慢,3周降解率不到10%,结果表明本发明获得的丝胶蛋白水凝胶不仅具有降解性且降解具有PH影响应。
5、pH值对丝胶蛋白水凝胶的膨胀率的影响
将丝胶蛋白水凝胶冻干、称重、浸泡于三种不同pH值(pH 3.0、pH 7.4、pH 11.0)的PBS 溶液中,在不同时间点取出称重并按以下公式测定其吸水膨胀率。(其中Ws为膨胀状态下的重量,Wd为干重)
如图5所示:丝胶蛋白水凝胶在前1天内,膨胀率迅速上升,在3天后基本稳定。在pH7.4 和pH 11.0的环境下,最大的膨胀率可达到23倍。在pH 3.0的条件下,最大的膨胀率为17倍。
6、丝胶蛋白水凝胶和丝胶蛋白的红外光谱分析
利用傅里叶变换红外光谱仪(Nexus,Thermal Nicolet,USA)测定丝胶蛋白水凝胶在4000– 400cm-1的特征峰。
如图6所示:采用多重交联的丝胶蛋白水凝胶中的丝胶蛋白二级结构无明显变化,丝胶蛋白水凝胶能很好地保持天然丝胶的构象。
7、丝胶蛋白水凝胶冻干架的荧光观察
将经-80℃冻干后的水凝胶样品切成厚度为3毫米的薄片,将样品置于荧光显微镜(leica DMI3000)下观察并拍照,对于观察同一种荧光不同的水凝胶样品均采用同样的曝光参数。然后对拍照的样品荧光强度进行分析(所用软件为Image-Pro Plus,版本为Version 6.0.0.260)
如图7所示,多重交联获得的丝胶蛋白水胶和单一交联获得的丝胶蛋白水凝胶在荧光强度上存在明显的不同。让人意想不到的是其中多重交联丝胶蛋白水凝胶(同时采用H2O2和戊二醛交联获得的水凝胶)的绿色荧光和红色荧光均显著强于单一交联的丝胶蛋白水凝胶(H2O2或戊二醛交联的水凝胶)。具有强红色荧光和/或绿色荧光材料便于体外进行跟踪,在医学领域具有广阔的应用领域。
Claims (6)
1.一种丝胶蛋白水凝胶的制备方法,其特征在于,包含以下步骤:
第1步、制备丝胶蛋白水溶液
称取丝素缺失型突变品种的家蚕蚕茧,采用LiBr或LiCl水溶液提取,经纯化、浓缩得到非降解性的质量百分浓度为1.0~10%的丝胶蛋白水溶液;
第2步、制备丝胶蛋白水凝胶
将HRP加入丝胶蛋白水溶液中,混合均匀后加入戊二醛并混匀,最后加入H2O2混匀,制得丝胶蛋白水凝胶;
其中,HRP为催化剂,戊二醛和H2O2为交联剂;戊二醛的浓度为0.1~50wt%,且每毫升丝胶蛋白水溶液中加入1~500μL戊二醛;HRP的质量百分浓度为1×10-5~50%,每毫升丝胶蛋白水溶液中加入1~1000μLHRP;H2O2的质量百分浓度为1×10-6~30%,每毫升丝胶蛋白水溶液中加入1~1000μL H2O2。
2.根据权利要求1所述的一种丝胶蛋白水凝胶的制备方法,其特征在于,第1步中所述丝胶蛋白水溶液的具体制备方法如下:
(1)称取丝素缺失型突变品种家蚕蚕茧并剪成碎片,清洗后去除水分;
(2)将蚕茧碎片浸泡于浓度为6~8mol/L的LiBr或LiCl水溶液中,25~50℃浸泡5~24小时,LiBr或LiCl水溶液的用量为每克蚕茧碎片加入20~100mL;
(3)取步骤(2)的溶液离心、去除不溶物,收集澄清溶液;
(4)向步骤(3)获得的澄清溶液中加入1/4体积的1mol/L、pH8.0~11.0的Tris-HCl缓冲液,并在超纯水中透析;
(5)将步骤(4)纯化后溶液离心去除沉淀,浓缩得到质量百分浓度为1.0~10%的丝胶蛋白水溶液。
3.一种由权利要求1或2所述方法制备获得的丝胶蛋白水凝胶。
4.权利要求3所述丝胶蛋白水凝胶在制备荧光标记探针中的应用。
5.权利要求3所述丝胶蛋白水凝胶在制备生物医用材料中的应用。
6.权利要求3所述丝胶蛋白水凝胶在制备药物和/或生长因子载体中的应用。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110041536A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-07-23 | 江苏科技大学 | 功能性丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用 |
CN110665055A (zh) * | 2019-07-10 | 2020-01-10 | 赣南医学院第一附属医院 | 丝胶蛋白/纳米羟基磷灰石组织工程骨移植物及其制备方法和应用 |
CN110698694A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-01-17 | 江苏科技大学 | 高机械强度丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用 |
CN112646204A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-04-13 | 江苏科技大学 | 一种丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用 |
CN113402733A (zh) * | 2021-05-24 | 2021-09-17 | 重庆医科大学 | 复合水凝胶及其制备方法和应用 |
CN114404568A (zh) * | 2022-01-16 | 2022-04-29 | 重庆理工大学 | 一种丝胶蛋白多肽注射制剂及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103951831A (zh) * | 2014-02-28 | 2014-07-30 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 丝胶蛋白水凝胶的制备方法及其应用 |
CN106700099A (zh) * | 2016-11-23 | 2017-05-24 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种无色透明的丝胶蛋白水凝胶及其制备的支架及应用 |
CN106750395A (zh) * | 2016-11-23 | 2017-05-31 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种制备无色透明的丝胶蛋白水凝胶的方法 |
-
2017
- 2017-10-20 CN CN201710981720.4A patent/CN107840973B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103951831A (zh) * | 2014-02-28 | 2014-07-30 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 丝胶蛋白水凝胶的制备方法及其应用 |
CN106700099A (zh) * | 2016-11-23 | 2017-05-24 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种无色透明的丝胶蛋白水凝胶及其制备的支架及应用 |
CN106750395A (zh) * | 2016-11-23 | 2017-05-31 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种制备无色透明的丝胶蛋白水凝胶的方法 |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110041536A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-07-23 | 江苏科技大学 | 功能性丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用 |
CN110041536B (zh) * | 2019-03-14 | 2022-04-15 | 江苏科技大学 | 功能性丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用 |
CN110665055A (zh) * | 2019-07-10 | 2020-01-10 | 赣南医学院第一附属医院 | 丝胶蛋白/纳米羟基磷灰石组织工程骨移植物及其制备方法和应用 |
CN110665055B (zh) * | 2019-07-10 | 2022-08-26 | 赣南医学院第一附属医院 | 丝胶蛋白/纳米羟基磷灰石组织工程骨移植物及其制备方法和应用 |
CN110698694A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-01-17 | 江苏科技大学 | 高机械强度丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用 |
CN112646204A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-04-13 | 江苏科技大学 | 一种丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用 |
CN113402733A (zh) * | 2021-05-24 | 2021-09-17 | 重庆医科大学 | 复合水凝胶及其制备方法和应用 |
CN114404568A (zh) * | 2022-01-16 | 2022-04-29 | 重庆理工大学 | 一种丝胶蛋白多肽注射制剂及其应用 |
CN114404568B (zh) * | 2022-01-16 | 2023-12-26 | 重庆理工大学 | 一种丝胶蛋白多肽注射制剂及其应用 |
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Publication number | Publication date |
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