CN106750395A - 一种制备无色透明的丝胶蛋白水凝胶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备无色透明的丝胶蛋白水凝胶的方法，其使用HRP和H2O2催化丝胶蛋白交联得到。通过使用本发明的方法，可制备无色透明的丝胶蛋白水凝胶，并可将该丝胶蛋白水凝胶制备成无色透明的支架，其可用于搭载细胞，特别是肿瘤细胞，建立三维肿瘤模型，并由于其无色透明的特性，有利于对所构建的三维肿瘤模型进行观察和示踪，从而更好地研究肿瘤细胞及其发展的肿瘤组织的生物学行为，进行肿瘤致病机制和肿瘤治疗的研究。

Description

一种制备无色透明的丝胶蛋白水凝胶的方法
技术领域
本发明涉及组织工程材料领域，更特别的，涉及一种制备无色透明的丝胶蛋白水凝胶的方法。
背景技术
水凝胶(Hydrogel)是以水为分散介质的凝胶，具有网状交联结构的水溶性高分子中存在疏水基团和亲水基团，亲水基团与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水基团遇水膨胀的交联聚合物。
丝胶蛋白(Silk Sericin)是包裹在丝素纤维表层的一种天然大分子粘性蛋白，约占蚕茧含量的20-30％，由分子量为24-400kDa的多肽组成，其分子由丝氨酸、天门冬氨酸和甘氨酸等18种氨基酸组成。近年来，由于丝胶蛋白良好的生物相容性、对细胞具有粘附和保护作用等生物学性能，成为生物医学领域新兴的材料。
蛋白质的交联主要分为两类方法，化学交联和酶交联。常用的化学交联剂有戊二醛和京尼平。常用于蛋白质交联的酶有转谷氨酰胺酶(TG)和多酚氧化酶(PPO)。
目前，主要使用化学交联剂戊二醛和天然生物交联剂京尼平将丝胶蛋白交联成水凝胶支架，未见使用酶催化交联的方法来制备水凝胶支架。
在中国，癌症已成为疾病死因之首，发病率和死亡率在持续上升，癌症已成为非常重要的公共健康问题。2015年中国预计有429.2万例新发肿瘤病例和281.4万例死亡病例。研究肿瘤细胞的生长增殖、侵袭、转移和耐药，是找到肿瘤治疗靶点和药物的重要手段。
传统的针对肿瘤致病机制和肿瘤治疗的研究所采用的二维(2D)研究模型是基于二维平面，难以模拟体内真实肿瘤的立体结构和内部环境。如果能建立体外三维(3D)肿瘤模型，并用于研究肿瘤细胞行为和对外界刺激及药物的响应，则能更精确地反映真实体内肿瘤的情况。然而，目前没有一种能够构建体外3D肿瘤模型，并且适用于对这样的肿瘤模型进行观察、示踪和研究的支载材料。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种制备无色透明的丝胶蛋白水凝胶的方法，其特征在于，使用HRP和H2O2催化丝胶蛋白交联得到。
优选地，所述HRP的工作浓度为0.625-25U/mL。
优选地，所述H2O2的工作浓度为0.00075％-0.03％。
优选地，所述丝胶蛋白的浓度为2.5-40mg/mL。
优选地，所述方法包括以下步骤：
1)使用不含家蚕丝素的蚕丝制备成丝胶蛋白水溶液；
2)向所述丝胶蛋白水溶液中添加H2O2和HRP，得到预成胶液；
3)将所述预成胶液于37℃成胶，得到所述丝胶蛋白水凝胶。
优选地，所述蚕丝为由家蚕丝素缺失型蚕所生产的蚕丝。
本发明的丝胶蛋白水凝胶以及由其制备的支架，是一种全新的生物复合材料，不同于其他交联剂形成的丝胶蛋白水凝胶，本发明采用全新的交联剂和交联方式形成的丝胶蛋白水凝胶为无色透明。基于此优良特性其可用于以下用途：
1.建立3D肿瘤模型，更真实而贴切地模拟体内真实肿瘤的结构，应用于肿瘤致病机制和肿瘤治疗的研究；
2.作为细胞培养模型，其无色透明的特性能应用于细胞的直接观察和示踪；
3.作为肿瘤耐药模型，更好地模拟肿瘤耐药；
4.作为药物和新合成化合物的筛选和研究平台，其无色透明特性能够更好地直接示踪相应的药物、新合成化合物。
本发明的丝胶蛋白水凝胶及其所制备的支架能够更好地模拟体内真实肿瘤的立体结构和肿瘤微环境，为肿瘤致病机制、肿瘤耐药、肿瘤治疗的研究提供更贴近真实肿瘤情况的研究模型，此外还能够用于3D细胞培养，也能够应用于药物和新合成化合物的筛选和示踪。
附图说明
图1为丝胶浓度对丝胶蛋白水凝胶成胶时间影响的示意图；
图2为HRP浓度对丝胶蛋白水凝胶成胶时间影响的示意图；
图3为H2O2浓度对丝胶蛋白水凝胶成胶时间影响的示意图；
图4为丝胶蛋白水凝胶支架不同pH条件下的吸水膨胀率；
图5为不同pH条件下丝胶蛋白水凝胶支架的降解情况示意图；
图6为不同温度冻干的丝胶蛋白水凝胶支架的扫描电镜微观结构示意图；
图7为不同温度冻干的丝胶蛋白水凝胶支架的孔径统计柱状图；
图8为不同交联剂制备的丝胶蛋白水凝胶的外观示意图；
图9为丝胶蛋白和丝胶蛋白水凝胶的红外光谱分析结果；
图10为丝胶蛋白和丝胶蛋白水凝胶的荧光光谱；
图11为丝胶蛋白水凝胶搭载细胞的光镜照片；
图12为丝胶蛋白水凝胶的粘附细胞数目统计柱状图；
图13为丝胶蛋白水凝胶上搭载细胞活力统计柱状图；
图14为鬼笔环肽对丝胶蛋白水凝胶搭载细胞上的β-actin进行染色的免疫荧光照片；
图15为丝胶蛋白水凝胶搭载的细胞体面积的柱状统计图；
图16为丝胶蛋白水凝胶搭载的细胞体周长的柱状统计图；
图17为丝胶蛋白水凝胶支架上种植细胞的共聚焦显微镜拍照示意图；
图18搭载HT-29细胞的3D丝胶蛋白水凝胶支架超微结构的电镜照片、HE染色照片和结直肠癌组织的HE染色照片；
图19为搭载HT-29细胞的3D丝胶蛋白水凝胶支架培养的第1天、第5天、第10天的光镜照片和HE染色照片；
图20为3D肿瘤模型的立体结构示意图；
图21为搭载HT-29细胞的3D丝胶蛋白水凝胶支架和结直肠癌组织的示意图；
图22为2D平面培养的细胞和3D丝胶蛋白水凝胶支架培养的细胞在裸鼠皮下成瘤实验的示意图；。
图23为2D平面和3D丝胶蛋白水凝胶支架培养HT-29细胞对5-氟尿嘧啶耐药情况示意图；
图24为2D平面和3D丝胶蛋白水凝胶支架培养HT-29细胞对塞来昔布耐药情况的示意图。
具体实施方式
以下结合实例和附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
丝胶蛋白水凝胶和水凝胶支架的制备
本发明的丝胶蛋白水凝胶和水凝胶支架通过以下方法来制备：
1.制备丝胶水溶液
蚕丝来自家蚕丝素缺失突变品种的蚕茧(购于中国农业科学院蚕业研究所)。通过以下方法从该蚕茧制备丝胶水溶液：
1)称取家蚕突变品种蚕茧1g并剪成1cm2的碎片，后置于洁净的烧杯中，用超纯水清洗3次，3500rpm离心5分钟去除水份；
2)向步骤1)中得到的蚕茧碎片中加入55mL的浓度为6mol/L的LiBr水溶液，将该烧杯放入恒温水浴锅内35℃水浴24小时，溶解丝胶蛋白；
3)将步骤2)得到溶液转入离心管内3500rpm离心5分钟，用滤器去除不溶性物质，得到澄清的溶液；
4)向步骤3)得到的澄清溶液中加入1/4体积的Tris-HCl缓冲液(1mol/L，pH 9.0)；
5)将步骤4)中的溶液转入到预处理好的透析袋(MWCO 3500)中，然后将透析袋两端用夹子夹紧，放置于含有pH 9.0的0.001mol/L Tris-HCl缓冲液的烧杯中；将该烧杯置于搅拌器上慢速搅拌透析，每隔3小时换一次水，共透析48小时，其中最后一次使用超纯水透析；
6)将5)中透析后的丝胶蛋白水溶液转到离心管中，4000rpm离心5分钟，去除沉淀；
7)将丝胶蛋白水溶液再装入到透析袋中并将透析袋两端用夹子夹紧，再将透析袋置于质量百分浓度为20％的PEG6000溶液中浓缩；将丝胶蛋白水溶液浓缩到浓度约为2％为止；
8)置于4℃冰箱保存备用。
2.制备H2O2工作液：将30％(v/v)的H2O2储存液用超纯水按1:100的比例稀释为0.3％(v/v)的H2O2工作液。
3.制备浓度为1.25U/μL的HRP(避光)，1mg HRP相当于250U。
4.制备丝胶蛋白水凝胶
将H2O2工作液，1.25U/μL的HRP和丝胶水溶液(2％，w/v)按1:1:100的比例混匀后置于37℃成胶，置于37℃温箱至少30分钟以上，等待其交联形成水凝胶。
5.将上述丝胶蛋白水凝胶放入模具中，制成厚度1cm直径1cm的圆柱体形，成胶后置于-80℃，冷冻24h后取出；将样品置于冷冻真空干燥机中干燥(根据样品大小确定适宜的干燥时间)，得到丝胶蛋白水凝胶支架。
不同丝胶浓度，不同浓度HRP，不同H2O2浓度对成胶时间的影响
按照上述方法和参数，分别使用不同的丝胶工作浓度(2.5、5、10、20、28和40mg/mL)，不同的HRP工作浓度(0.625、1.25、1.875、2.5、3.125、6.25、12.5和25U/mL)以及不同的H2O2工作浓度(0.00075％、0.0015％、0.00225％、0.00375％、0.0075％、0.015％和0.03％)，最终按照上述方法制备不同的丝胶蛋白水凝胶，测定其成胶时间。结果如图1-3所示，在所测量丝胶的浓度内成胶时间随着丝胶蛋白的浓度升高而缩短，约为6-80s，在所测量HRP的浓度内成胶时间随着HRP的浓度升高而缩短，约为6-130s，在所测量H2O2的浓度内成胶时间随着H2O2的浓度升高而延长，约为44-120s。
支架的37℃吸水膨胀率
将以上制备的支架称重，并分别浸泡于pH 3，pH 7.4，pH 11的PBS中，置于37℃浸泡24h后取出，按以下公式测定：
其中，Ws为膨胀状态下的重量，Wd为干重。
结果如图4所示，支架的吸水性能适中。
支架的降解
将支架置于pH3，pH7.4，pH11的PBS缓冲液中，每天更换pH缓冲液，在所示的时间点将样品取出，干燥，称重和初始重量相比，计算降解率。结果如图5所示，在pH7.4和pH11的缓冲液中，在前30天左右降解较快，在第100天左右完全降解。
支架的超微结构
将丝胶蛋白水凝胶分别在-20℃，-80℃，-196℃冷冻后再冻干得到支架，采用扫描电子显微镜观察其超微结构，结果如图6所示，丝胶蛋白水凝胶支架存在大量微观孔洞结构，这些孔洞结构能作为细胞外基质，提供细胞生长的微环境、促进营养物质的交换。
不同温度冻干对孔洞大小的影响
通过扫描电镜观察在-20℃，-80℃，-196℃冷冻后冻干的支架的孔洞，测量并统计其孔洞大小。结果如图6和7所示，随着冻干温度降低，支架孔洞的孔径越小。支架的孔洞结构是作为药物载体和细胞载体进行营养和气体交换的条件。
丝胶蛋白水凝胶的外观
采用前述方法合成的丝胶蛋白水凝胶的外观如图8所示，采用HRP/H2O2交联的丝胶蛋白水凝胶外观无色透明，能够作为细胞培养模型直接观察细胞，也能够应用于荧光或标记物质的直接观察和示踪，而采用戊二醛交联的丝胶蛋白水凝胶有一定颜色会影响细胞培养的直接观察和示踪，采用京尼平交联的丝胶蛋白水凝胶呈黑蓝色无法进行细胞的直接观察和示踪，不适用于肿瘤培养模型。
丝胶蛋白和丝胶蛋白水凝胶的红外光谱分析
利用傅里叶变换红外光谱仪(Nexus,Thermal Nicolet,USA)测定丝胶蛋白和丝胶蛋白水凝胶的特征峰。
如图9所示：用HRP/H2O2交联的丝胶蛋白水凝胶中的丝胶蛋白二级结构无明显变化，丝胶蛋白水凝胶能很好地保持天然丝胶的构象。从特征峰AmideⅠ,Amide Ⅱ,AmideIII，Amide IV可以看出，丝胶蛋白和丝胶蛋白水凝胶的图谱基本相同，上述特征峰没有明显改变，表明丝胶蛋白水凝胶中的多肽二级结构与纯丝胶蛋白中的相似，表明丝胶蛋白水凝胶能很好的维持丝胶蛋白的天然构象。
丝胶蛋白和丝胶蛋白水凝胶的荧光光谱测试
采用不同波长的激发光，分别测定丝胶蛋白和丝胶蛋白水凝胶的全光谱的发射光强度，结果如图10所示，丝胶蛋白形成丝胶蛋白水凝胶后荧光强度减弱，而且其荧光波谱稍微红移。
丝胶蛋白水凝胶搭载C2C12细胞(小鼠成肌细胞)
采用前述的方法制备丝胶蛋白水凝胶，将其均匀地铺在细胞培养皿中，待其成胶后用无菌PBS缓冲液轻柔地洗三次，再用75％的乙醇浸泡数小时，然后再用无菌PBS缓冲液洗三次，将培养的细胞收集、重悬，以1×106的细胞数目种植于上述已经预包被丝胶蛋白水凝胶的培养皿中，以无丝胶蛋白水凝胶的培养皿为对照，置于37℃，CO2浓度为5％的细胞培养箱中培养，在0，1，2天采用显微镜在普光下对细胞进行拍照并计数统计，结果如图11所示，丝胶蛋白水凝胶能很好地支持细胞粘附和增殖。
分别在第4小时，第8小时统计对照组和丝胶蛋白水凝胶组的粘附细胞数目，结果如图12所示，丝胶蛋白水凝胶有良好的生物相容性且能够支持细胞粘附。
分别在第2天，第3天采用MTT方法测定细胞活力，结果如图13所示，与对照组相比，丝胶蛋白水凝胶生物相容性良好与正常培养皿相比无统计学差异。
种植细胞在丝胶蛋白水凝胶上粘附和存活
采用以上方法将细胞种植于已经预包被丝胶蛋白水凝胶的培养皿中，以未包被丝胶蛋白水凝胶的培养皿作为对照，置于37℃，CO2浓度为5％的细胞培养箱中培养10天后，采用4％多聚甲醛固定，进行鬼笔环肽染色显示β-actin，并用DAPI标记细胞核，采用激光共聚焦显微镜观察拍照，结果如图14所示，统计所有拍照视野的细胞体积并用Photoshop测量细胞大小，统计结果如图15和图16所示。与对照组相比，丝胶蛋白水凝胶能很好地支持细胞粘附和存活。
种植细胞在丝胶蛋白水凝胶支架上的增殖
采用前述的方法制备冻干支架，将冻干支架切成厚度为1mm，直径为4.8mm的形状，收集培养的细胞，用10μL培养基重悬细胞，按2×104的细胞数目种植于支架中央。种植的稳转GFP的SHY5Y细胞用激光共聚焦显微镜分别在第1天、第5天和第10天拍照后显示细胞种植情况。结果如图17所示细胞在支架中能够立体分布生长。
在水凝胶支架上构建肿瘤模型
将HT-29细胞按照前述的方法种植到上述丝胶蛋白水凝胶支架中，培养10天后，采用4％的多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，进行HE染色，对照组是将HT-29细胞以1×106/只的细胞数目接种于裸鼠(6-8周的雄鼠)背部皮下，结果如图18显示采用丝胶蛋白水凝胶支架种植的肿瘤细胞与肿瘤组织的结构相似，与肿瘤组织一样具有细胞外基质，能够贴切地模拟肿瘤组织的立体结构和肿瘤微环境。分别在第1天、第5天和第10天进行拍照，结果如图19所示。
以上构建的肿瘤模型的结构
将以上建立的肿瘤模型与肿瘤组织的立体结构相比较，如图20的模式图所示，在丝胶蛋白水凝胶支架建立的3D肿瘤模型中(图21)，内部为坏死区，外部为增殖区，此结果与肿瘤组织的结构完全一致。
肿瘤模型的生长速度
分别采用前述的方法在普通细胞培养皿(2D)和3D丝胶蛋白水凝胶支架上培养细胞，在第5天和第10天采用MTT法测定细胞活力。将HT-29细胞以1×106/只的细胞数目接种于裸鼠背部皮下，所采用的裸鼠为6-8周的雄鼠，待成瘤后计为第0天，此后每天测量肿瘤的大小，以每天的肿瘤大小与第0天的肿瘤大小作比值，计算肿瘤的体内增殖作为体内组(invivo)如图22所示，结果显示3D丝胶蛋白水凝胶支架建立的肿瘤模型反映的肿瘤增殖情况更接近于体内真实肿瘤的生长情况。
肿瘤细胞的耐药性实验
分别采用前述的普通细胞培养皿(2D平面)和3D丝胶蛋白水凝胶支架培养HT-29细胞，并分别用剂量为图18所示的5-氟尿嘧啶(5-FU)和塞来昔布处理细胞，采用MTT法测定细胞活力来反映细胞耐药情况，结果如图23和24所示，相同剂量的5-氟尿嘧啶(5-FU)和塞来昔布作用于细胞后3D模型培养的细胞比2D培养的细胞存活率更高，说明3D丝胶蛋白水凝胶支架培养的细胞更加耐药，更贴近真实肿瘤细胞耐药的情况。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种制备无色透明的丝胶蛋白水凝胶的方法，其特征在于，使用HRP和H2O2催化丝胶蛋白交联得到所述丝胶蛋白水凝胶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HRP的工作浓度为0.625-25U/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述H2O2的工作浓度为0.00075％-0.03％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，丝胶蛋白的浓度为2.5-40mg/mL。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)使用不含家蚕丝素的蚕丝制备成丝胶蛋白水溶液；
2)向所述丝胶蛋白水溶液中添加H2O2和HRP，得到预成胶液；
3)将所述预成胶液于37℃成胶，得到所述丝胶蛋白水凝胶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蚕丝为由家蚕丝素缺失型蚕所生产的蚕丝。
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