CN110025828B - 一种功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜及其制备方法，先制备脱胶后的家蚕丝素纤维，然后制备家蚕丝素溶解液，接着制备纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液，再制备丝素蛋白多孔材料或丝素蛋白膜，最后制备功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜。所制备的功能丝素蛋白多孔材料和功能丝素蛋白膜属于非溶血性材料，溶血率<0.4％，功能丝素蛋白多孔材料和功能丝素蛋白膜稳定载有一种活性肽，这种活性肽能够调控血管内皮细胞与平滑肌细胞的竞争性生长及活化血管的舒张功能。本发明获得的功能丝素蛋白多孔材料和功能丝素蛋白膜用于组装人工血管、造瘘等血管组织工程具有广阔的应用前景。

Description

一种功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及载药的丝素蛋白材料的制备技术领域，具体涉及一种功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜及其制备方法。
背景技术
家蚕蚕丝是由家蚕合成与分泌的天然动物蛋白，来源广泛，其丝素蛋白具有良好的生物相容性，由20种人体可吸收的氨基酸组成，最终降解产物为氨基酸或小肽，易被细胞吸收或吞噬，不会引起明显的免疫反应。大量的研究表明丝素蛋白材料能够支持多种细胞的生长，在组织工程支架中越来越多地被研究与应用。
本发明旨在开发一种载有降钙素基因相关肽(CGRP)的丝素蛋白功能材料，应用于血管组织再生修复。CGRP是一个由37个氨基酸组成的广泛分布于中枢和外周神经系统的活性肽，是中枢和外周神经系统传递信息的重要递质。神经系统是遍布全身的调节机体各项生理功能与行为活动的系统。CGRP也是体内发现的最有效的舒血管活性肽，在调节血压、保护心脏和防止冠状动脉粥样硬化有着重要作用。几乎所有的血管中都分布着含有CGRP的神经纤维。CGRP活性肽具有刺激血管舒张，促进血管内皮细胞的增殖的作用，刺激血管内皮细胞的生长并迁移到受损血管壁。CGRP活性肽作为保护性成分，具有抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移，参与血管损伤修复等功能。因此，将CGRP活性肽载入血管组织工程支架中用于调控缺损血管再生或功能修复具有重大的应用前景。
发明内容
本发明目的是提供一种功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜及其制备方法，是针对血管组织工程易形成血栓和血管组织再生早期舒张活性较低而开发，以促进病变和缺损血管的组织再生与功能恢复。
本发明的一种技术方案是：
提供一种功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜，其加载了CGRP。
本发明的另一种技术方案是：
提供一种功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)制备脱胶后的家蚕丝素纤维：将家蚕蚕丝或茧壳放入碳酸钠水溶液中，加温处理，清洗，拉松，干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维；
(2)制备家蚕丝素溶解液：将所述脱胶后的家蚕丝素纤维完全溶解于溴化锂水溶液中，获得丝素溶解液；
(3)制备纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液：将所述丝素溶解液灌注于透析袋内，然后置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或者纯水更换容器内的液体，持续透析3天后浓缩，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液；
(4)制备丝素蛋白多孔材料或丝素蛋白膜：将所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，冻干或烘干，取出置于盛有80％乙醇的容器中浸渍2小时，然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，取出后再次冻干或风干，得到丝素蛋白多孔材料或丝素蛋白膜；
(5)制备功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜：将所述丝素蛋白多孔材料浸于混合溶液中，或者在所述丝素蛋白膜上加入混合溶液，然后置于4℃下反应8～15小时后取出，用去离子水漂洗并冻干或在低于25℃的条件下风干，得到功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜。
进一步的，步骤(1)中所述将家蚕蚕丝或茧壳放入碳酸钠水溶液中是指将家蚕蚕丝或茧壳按1g:50mL的浴比放入质量浓度为0.2～0.8％的碳酸钠水溶液中；所述加温处理是指在98～100℃处理2～3次，每次处理30分钟，所述干燥是指在60℃烘箱内干燥。
进一步的，步骤(2)中所述将所述脱胶后的家蚕丝素纤维完全溶解于溴化锂水溶液中是指称取所述脱胶后的家蚕丝素纤维，按1g:10mL的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，在温度为65℃的条件下处理直至丝素纤维完全溶解。
进一步的，步骤(3)中所述透析袋为半透膜，截留分子量为10～14kDa，所述浓缩具体为采用旋转蒸发器浓缩，使调整透析后的家蚕丝素蛋白水溶液的质量分数为5～15％。
进一步的，步骤(4)中将所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，冻干或烘干，取出置于盛有80％乙醇的容器中浸渍2小时替换为：向所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液中添加与丝素蛋白质量比为1:0.5～1:1.0的胶黏剂聚乙二醇双环氧丙烷醚，搅拌均匀，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中冻干或烘干；又或者替换为：加入丝素蛋白质量20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和10％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中冻干或烘干。
进一步的，步骤(4)中所述冻干具体为：先在温度为-80℃～-20℃的条件下预冷冻2～24小时，再放入冷冻干燥机冻干。
进一步的，步骤(4)中所述烘干的温度为40℃～60℃。
进一步的，步骤(5)中将所述丝素蛋白多孔材料浸于混合溶液中具体为：配置含终浓度10～1000nM的CGRP的胶黏剂溶液，所述CGRP的胶黏剂溶液中含有摩尔比是CGRP的1～1.5倍的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸，将所述丝素蛋白多孔材料浸渍于配置的CGRP的胶黏剂溶液中，溶液量以浸透丝素材料为宜。
进一步的，步骤(5)中在所述丝素蛋白膜上加入混合溶液具体为：将所述丝素蛋白膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入20～1000ng/cm2的CGRP水溶液，然后分别加入与CGRP摩尔比为1～1.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸，轻微振荡混合5分钟。
本发明提供了一种功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜的制备方法，所制备的功能丝素蛋白多孔材料和功能丝素蛋白膜属于非溶血性材料(溶血率<0.4％)，功能丝素蛋白多孔材料和功能丝素蛋白膜稳定载有一种活性肽，这种活性肽能够调控血管内皮细胞与平滑肌细胞的竞争性生长及活化血管的舒张功能。本发明获得的功能丝素蛋白多孔材料和功能丝素蛋白膜用于组装人工血管、造瘘等血管组织工程具有广阔的应用前景。
具体实施方式
本发明提供一种功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜的制备方法，包括：
步骤一、制备脱胶后的家蚕丝素纤维：
将家蚕蚕丝或茧壳按1g:50mL的浴比放入质量浓度为0.2～0.8％的碳酸钠水溶液中，在98～100℃处理3次，每次处理30分钟，清洗，拉松，在60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
步骤二、制备家蚕丝素溶解液：
称取所述脱胶后的家蚕丝素纤维，按1g:10mL的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，在温度为65℃的条件下处理直至丝素纤维完全溶解，获得丝素溶解液。
步骤三、制备纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液：
将所述丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋为半透膜，截留分子量为10～14kDa，然后置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或者纯水更换容器内的液体，持续透析3天后采用旋转蒸发器浓缩，得到质量分数为5～15％的纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。
步骤四、制备丝素蛋白多孔材料或丝素蛋白膜：
方法一：将所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，先在温度为-80℃～-20℃的条件下预冷冻2～24小时，再放入冷冻干燥机冻干，取出置于盛有80％乙醇的容器中浸渍2小时，然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，取出后再次冻干，得到丝素蛋白多孔材料。
方法二：向所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液中添加与丝素蛋白质量比为1:0.5～1:1.0的胶黏剂聚乙二醇双环氧丙烷醚，搅拌均匀，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中先在温度为-80℃～-20℃的条件下预冷冻2～24小时，再放入冷冻干燥机冻干，然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，取出后再次冻干，得到丝素蛋白多孔材料。
方法三：向所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液中添加丝素蛋白质量20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和10％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中先在温度为-80℃～-20℃的条件下预冷冻2～24小时，再放入冷冻干燥机冻干，然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，取出后再次冻干，得到丝素蛋白多孔材料。
方法四：将所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，在温度为40℃～60℃的条件下烘干，取出置于盛有80％乙醇的容器中浸渍2小时，然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，取出后再次风干，得到丝素蛋白膜。
方法五：向所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液中添加与丝素蛋白质量比为1:0.5～1:1.0的胶黏剂聚乙二醇双环氧丙烷醚，搅拌均匀，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，在温度为40℃～60℃的条件下烘干，然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，取出后再次风干，得到丝素蛋白膜。
方法六：向所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液中添加丝素蛋白质量20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和10％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，在温度为40℃～60℃的条件下烘干，然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，取出后再次风干，得到丝素蛋白膜。
步骤五、制备功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜。
方法一(与步骤四的方法一、二、三对应)：配置含终浓度10～1000nM的CGRP的胶黏剂溶液，所述CGRP的胶黏剂溶液中含有摩尔比是CGRP的1～1.5倍的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸，将所述丝素蛋白多孔材料浸渍于配置的CGRP的胶黏剂溶液中，溶液量以浸透丝素材料为宜，然后置于4℃下反应8～15小时后取出，用去离子水漂洗并冻干，得到功能丝素蛋白多孔材料。
方法二(与步骤四的方法四、五、六对应)：将所述丝素蛋白膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入20～1000ng/cm2的CGRP水溶液，然后分别加入与CGRP摩尔比为1～1.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸，轻微振荡混合5分钟，然后置于4℃下反应8～15小时后取出，用去离子水漂洗并在低于25℃的条件下风干，得到功能丝素蛋白膜。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
首先，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
本实施案例展示一种功能丝素蛋白多孔材料的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白水溶液质量分数为8％。
4.向上述丝素蛋白水溶液中，然后分别加入丝素蛋白质量20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和10％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于-80℃～-20℃冷冻2～24小时。
5.取出冷冻的丝素材料于冷冻干燥机冻干，然后置于盛有去离子水的容器内浸泡24小时，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，取出后再次冻干，得到丝素蛋白多孔材料。
6.配置含终浓度10～1000nM的CGRP的胶黏剂溶液，溶液中含有摩尔比是CGRP的1～1.5倍的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸。将丝素蛋白多孔材料浸渍于配置的混合溶液中，溶液量以刚刚浸透丝素材料为宜，然后置于4℃下反应12小时后取出，用去离子水漂洗并冻干，得加载CGRP的功能丝素蛋白多孔材料。同时收集反应剩余溶液及漂洗液。
7.采用酶联免疫吸附和紫外吸收光谱法测定没有与丝素蛋白反应的CGRP含量，计算得功能丝素蛋白多孔材料中CGRP的最大加载能力为每克丝素大于4.5nmoL。
8.将制备好的功能丝素蛋白多孔材料剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定功能丝素蛋白多孔材料的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素蛋白膜动态接触，测得功能丝素蛋白多孔材料的溶血率<0.3％，符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
实施例2
本实施案例展示一种功能丝素蛋白多孔材料的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白水溶液质量分数为8％。
4.向上述丝素蛋白水溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于-80℃～-20℃冷冻2～24小时，取出冷冻的丝素材料于冷冻干燥机冻干，然后置于盛有80％乙醇的容器中浸渍2小时，取出后放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，取出后再次冻干。
5.配置含终浓度10～1000nM的CGRP的胶黏剂溶液，溶液中含有摩尔比是CGRP的1～1.5倍的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸。将丝素蛋白多孔材料浸渍于配置的混合溶液中，溶液量以刚刚浸透丝素材料为宜，然后置于4℃下反应12小时后取出，用去离子水漂洗并冻干，得加载CGRP的功能丝素蛋白多孔材料。同时收集反应剩余溶液及漂洗液。
6.采用酶联免疫吸附和紫外吸收光谱法测定没有与丝素蛋白反应的CGRP含量，计算得功能丝素蛋白多孔材料中CGRP的最大加载能力为每克丝素可达7.0nmoL以上。
7.将制备好的功能丝素蛋白多孔材料剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定功能丝素蛋白多孔材料的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素蛋白膜动态接触，测得功能丝素蛋白多孔材料的溶血率<0.2％，符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
实施例3
本实施案例展示一种功能丝素蛋白多孔材料的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白水溶液质量分数为8％。
4.向上述丝素蛋白溶液中添加丝素质量比1:0.5～1:1.0的胶黏剂聚乙二醇双环氧丙烷醚、搅拌均匀，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于-80℃～-20℃冷冻2～24小时。取出冷冻的丝素材料于冷冻干燥机冻干，然后置于盛有去离子水的容器内浸泡24小时，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，取出后再次冻干，得到丝素蛋白多孔材料。
5.配置含终浓度10～1000nM的CGRP的胶黏剂溶液，溶液中含有摩尔比是CGRP的1～1.5倍的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸。将丝素蛋白多孔材料浸渍于配置的混合溶液中，溶液量以刚刚浸透丝素材料为宜，然后置于4℃下反应12小时后取出，用去离子水漂洗并冻干，得加载CGRP的功能丝素蛋白多孔材料。同时收集反应剩余溶液及漂洗液。
6.采用酶联免疫吸附和紫外吸收光谱法测定没有与丝素蛋白反应的CGRP含量，计算得功能丝素蛋白多孔材料中CGRP的最大加载能力为每克丝素可达6.0nmoL以上。
7.将制备好的功能丝素蛋白多孔材料剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定功能丝素蛋白多孔材料的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与功能丝素蛋白多孔材料动态接触，测得功能丝素蛋白多孔材料的溶血率<0.4％，符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
实施例4
本实施案例展示一种功能丝素蛋白膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白质量分数为5％。
4.向上述丝素蛋白溶液中添加丝素质量20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和10％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干。取出烘干的薄膜放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干，得到丝素蛋白膜。
5.将丝素蛋白膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入20～1000ng/cm2的CGRP水溶液，然后分别加入与CGRP摩尔比为1～1.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸轻微振荡混合5分钟，然后置于4℃下反应12小时后取出，用去离子水漂洗并在低于25℃的条件下风干，得加载CGRP的功能丝素蛋白膜。同时收集反应剩余溶液及漂洗液。
6.采用酶联免疫吸附和紫外吸收光谱法测定没有与丝素蛋白反应的CGRP含量，计算得功能丝素蛋白膜表面CGRP的最大接枝能力可达200ng/cm2以上。
7.将制备好的功能丝素蛋白膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定功能丝素蛋白膜的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与功能丝素蛋白膜动态接触，测得功能丝素蛋白膜的溶血率<0.2％，符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
实施例5
本实施案例展示一种功能丝素蛋白膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白质量分数为5％。
4.向上述丝素蛋白溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干。取出烘干的薄膜放入盛有80％乙醇的容器中浸渍2小时，然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，然后取出风干，得到丝素蛋白膜。
5.将丝素蛋白膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入20～1000ng/cm2的CGRP水溶液，然后分别加入与CGRP摩尔比为1～1.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸轻微振荡混合5分钟，然后置于4℃下反应12小时后取出，用去离子水漂洗并风干在低于25℃的条件下，得加载CGRP的功能丝素蛋白膜。同时收集反应剩余溶液及漂洗液。
6.采用酶联免疫吸附和紫外吸收光谱法测定没有与丝素蛋白反应的CGRP含量，计算得功能丝素蛋白膜表面CGRP的最大接枝能力可达450ng/cm2以上。
7.将制备好的功能丝素蛋白膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定功能丝素蛋白膜的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素蛋白膜动态接触，测得功能丝素蛋白膜的溶血率<0.2％，符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
实施例6
本实施案例展示一种功能丝素蛋白膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白质量分数为5％。
4.向上述丝素蛋白溶液中添加丝素质量比1:0.5～1:1.0的胶黏剂聚乙二醇双环氧丙烷醚、搅拌均匀，然后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干。取出烘干的薄膜放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干，得到丝素蛋白膜。
5.将丝素蛋白膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入20～1000ng/cm2的CGRP水溶液，然后分别加入与CGRP摩尔比为1～1.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸轻微振荡混合5分钟，然后置于4℃下反应12小时后取出，用去离子水漂洗并在低于25℃的条件下风干，得加载CGRP的功能丝素蛋白膜。同时收集反应剩余溶液及漂洗液。
6.采用酶联免疫吸附和紫外吸收光谱法测定没有与丝素蛋白反应的CGRP含量，计算得功能丝素蛋白膜表面CGRP的最大接枝能力可达345ng/cm2以上。
7.将制备好的功能丝素蛋白膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定丝素薄膜的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素蛋白膜动态接触，测得功能丝素蛋白膜的溶血率<0.35％，符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.一种功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)制备脱胶后的家蚕丝素纤维：将家蚕蚕丝或茧壳放入碳酸钠水溶液中，加温处理，清洗，拉松，干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维；
(2)制备家蚕丝素溶解液：将所述脱胶后的家蚕丝素纤维完全溶解于溴化锂水溶液中，获得丝素溶解液；
(3)制备纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液：将所述丝素溶解液灌注于透析袋内，然后置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或者纯水更换容器内的液体，持续透析3天后浓缩，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液；
(4)制备丝素蛋白多孔材料或丝素蛋白膜：将所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，冻干或烘干，取出置于盛有80％乙醇的容器中浸渍2小时，或者替换为向所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液中添加与丝素蛋白质量比为1:0.5～1:1.0的胶黏剂聚乙二醇双环氧丙烷醚，搅拌均匀，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中冻干或烘干；又或者替换为：加入丝素蛋白质量20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和10％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中冻干或烘干，然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，取出后再次冻干或风干，得到丝素蛋白多孔材料或丝素蛋白膜；
(5)制备功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜：配置含终浓度10～1000nM的CGRP的胶黏剂溶液，所述CGRP的胶黏剂溶液中含有摩尔比是CGRP的1～1.5倍的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸，将所述丝素蛋白多孔材料浸渍于配置的CGRP的胶黏剂溶液中，溶液量以浸透丝素材料为宜，或者将所述丝素蛋白膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入20～1000ng/cm2的CGRP水溶液，然后分别加入与CGRP摩尔比为1～1.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸，轻微振荡混合5分钟，然后置于4℃下反应8～15小时后取出，用去离子水漂洗并冻干或在低于25℃的条件下风干，得到功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜。
2.根据权利要求1所述的功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述将家蚕蚕丝或茧壳放入碳酸钠水溶液中是指将家蚕蚕丝或茧壳按1g:50mL的浴比放入质量浓度为0.2％～0.8％的碳酸钠水溶液中；所述加温处理是指在98～100℃处理2～3次，每次处理30分钟，所述干燥是指在60℃烘箱内干燥。
3.根据权利要求1所述的功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述将所述脱胶后的家蚕丝素纤维完全溶解于溴化锂水溶液中是指称取所述脱胶后的家蚕丝素纤维，按1g:10mL的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，在温度为65℃的条件下处理直至丝素纤维完全溶解。
4.根据权利要求1所述的功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述透析袋为半透膜，截留分子量为10～16kDa，所述浓缩具体为采用旋转蒸发器浓缩，使调整透析后的家蚕丝素蛋白水溶液的质量分数为5～15％。
5.根据权利要求1所述的功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述冻干具体为：先在温度为-80℃～-20℃的条件下预冷冻2～24小时，再放入冷冻干燥机冻干。
6.根据权利要求1所述的功能丝素蛋白多孔材料或功能丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述烘干的温度为40℃～60℃。
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