CN110075309B - 一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜及其制备方法，先制备脱胶后的家蚕丝素纤维，然后制备家蚕丝素溶解液，接着制备纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液，再制备丝素薄膜，最后制备具有调控血管细胞生长作用的丝素膜。该方法制备的产品可用于制备生物医用材料，作为药物载体或载药支架，从而应用于心血管等组织疾病的治疗、组织的修复或再生。该具有调控血管细胞生长作用的丝素膜属于非溶血性材料，溶血率<0.4％，具有优异的细胞相容性，更重要的是能够显著促进内皮细胞的粘附与增殖，同时对平滑肌细胞的增殖有一定的抑制作用，在制作人工血管或血管支架方面有利于快速内皮化和阻止内膜增生，抑制血栓形成。

Description

一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及载药的丝素蛋白材料的制备技术领域，具体涉及一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜及其制备方法。
背景技术
家蚕蚕丝是由家蚕合成与分泌的天然动物蛋白，来源广泛，其丝素蛋白具有良好的生物相容性，由20种人体可吸收的氨基酸组成，最终降解产物为氨基酸或小肽，易被细胞吸收或吞噬，不会引起明显的免疫反应。大量的研究表明丝素蛋白材料能够支持多种细胞的生长，在组织工程支架中越来越多地被研究与应用。
本发明旨在开发一种载有降钙素基因相关肽(CGRP)的丝素蛋白功能材料，应用于血管组织再生修复。CGRP是一个由37个氨基酸组成的广泛分布于中枢和外周神经系统的活性肽，是中枢和外周神经系统传递信息的重要递质。神经系统是遍布全身的调节机体各项生理功能与行为活动的系统。CGRP也是体内发现的最有效的舒血管活性肽，在调节血压、保护心脏和防止冠状动脉粥样硬化有着重要作用。几乎所有的血管中都分布着含有CGRP的神经纤维。CGRP活性肽具有刺激血管舒张，促进血管内皮细胞的增殖的作用，刺激血管内皮细胞的生长并迁移到受损血管壁。CGRP活性肽作为保护性成分，具有抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移，参与血管损伤修复等功能。因此，将CGRP活性肽载入血管组织工程支架中用于调控缺损血管再生或功能修复具有重大的应用前景。
发明内容
本发明目的是提供一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜及其制备方法，是针对心脑血管疾病治疗后仍易形成血栓和血管组织舒张活性较低而开发，以促进病变和缺损血管的组织再生与功能恢复。
本发明的一种技术方案是：
提供一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜，其加载了CGRP。
本发明的另一种技术方案是：
提供一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)制备脱胶后的家蚕丝素纤维：将家蚕蚕丝或茧壳放入碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液或生物酶水溶液中加温处理，清洗，拉松，干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维；
(2)制备家蚕丝素溶解液：将所述脱胶后的家蚕丝素纤维完全溶解于溴化锂水溶液中，获得丝素溶解液；
(3)制备纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液：将所述丝素溶解液灌注于透析袋内，然后置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或者纯水更换容器内的液体，持续透析3天后浓缩，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液；
(4)制备丝素薄膜；
(5)制备具有调控血管细胞生长作用的丝素膜：将所述丝素薄膜放入平皿中铺平，加入CGRP水溶液，再加入亲水性胶黏剂，轻微振荡混匀，然后置于4℃下反应8～15小时，最后取出用去离子水漂洗，风干，获得具有调控血管细胞生长作用的丝素膜。
进一步的，步骤(1)中所述将家蚕蚕丝或茧壳放入碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液或生物酶水溶液中加温处理是指将家蚕蚕丝或茧壳按1g:50mL的浴比放入质量浓度为0.2～0.8％的碳酸钠水溶液或0.5～1.0％碳酸氢钠的水溶液中在95～100℃的温度条件下处理2～3次，或1.0～2.5g/L的生物酶水溶液中在30～60℃的温度条件下处理2～3次，每次处理30分钟，所述干燥是指在60℃烘箱内干燥。
进一步的，步骤(2)中所述将所述脱胶后的家蚕丝素纤维完全溶解于溴化锂水溶液中是指称取所述脱胶后的家蚕丝素纤维，按1g:10mL的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，在温度为65℃的条件下处理直至丝素纤维完全溶解。
进一步的，步骤(3)中所述透析袋为半透膜，截留分子量为10～16kDa，所述浓缩具体为采用旋转蒸发器浓缩，使调整透析后的家蚕丝素蛋白水溶液的质量分数为5～12％。
进一步的，步骤(4)中所述制备丝素薄膜这一步骤具体为：将所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，于40～60℃烘干，取出烘干的薄膜放入盛有80％乙醇的容器中浸渍2小时，然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，然后取出风干，得到丝素薄膜。
进一步的，步骤(4)中所述制备丝素薄膜这一步骤具体为：向所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液中添加与丝素质量比为1:0.5～1:1.0的胶黏剂聚乙二醇双环氧丙烷醚，搅拌均匀，然后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，于40～60℃烘干，取出烘干的薄膜放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干，得到丝素薄膜。
进一步的，步骤(4)中所述制备丝素薄膜这一步骤具体为：向所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液中添加丝素质量20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和10％的N-羟基琥珀酰亚胺、含有终浓度为0.05M的2-吗啉乙磺酸，冰浴搅拌10～30分钟后，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，于40～60℃烘干，取出烘干的薄膜放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干，得到丝素薄膜。
进一步的，步骤(5)中所述CGRP水溶液的浓度为20～1000ng/cm2，所述亲水性胶黏剂中含有摩尔比是CGRP的1～1.5倍的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺、含有终浓度为0.05M的2-吗啉乙磺酸。
进一步的，步骤(5)中所述风干具体为在小于25℃的温度下风干。
本发明提供了一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜及其制备方法，所制得的产品可用于制备生物医用材料，作为药物载体或载药支架，从而应用于心血管等组织疾病的治疗、组织的修复或再生。该具有调控血管细胞生长作用的丝素膜属于非溶血性材料(溶血率<0.4％)，稳定载有一种活性肽，具有优异的细胞相容性，更重要的是这种载有活性肽的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜有效调控了血管内皮细胞与平滑肌细胞的竞争性生长，能快速促进内皮化，能够显著促进内皮细胞的粘附与增殖，同时对平滑肌细胞的增殖有一定的抑制作用，在制作人工血管、血管支架或心脏瓣膜等，将会在表面快速形成从根本上防止血栓形成的内皮层、阻止再狭窄或增厚，抑制血栓形成。
具体实施方式
本发明提供一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的制备方法，包括：
步骤一、制备脱胶后的家蚕丝素纤维：
将家蚕蚕丝或茧壳按1g:50mL的浴比放入质量浓度为0.2～0.8％的碳酸钠水溶液或0.5～1.0％碳酸氢钠的水溶液中在95～100℃的温度条件下处理2～3次，或1.0～2.5g/L的生物酶水溶液中在30～60℃的温度条件下处理2～3次，每次处理30分钟，清洗，拉松，在60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
步骤二、制备家蚕丝素溶解液：
称取所述脱胶后的家蚕丝素纤维，按1g:10mL的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，在温度为65℃的条件下处理直至丝素纤维完全溶解，获得丝素溶解液。
步骤三、制备纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液：
将所述丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋为半透膜，截留分子量为10～16kDa，然后置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或者纯水更换容器内的液体，持续透析3天后采用旋转蒸发器浓缩，得到质量分数为5～12％的纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。
步骤四、制备丝素薄膜：
方法一：将所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，于40～60℃烘干，取出烘干的薄膜放入盛有80％乙醇的容器中浸渍2小时，然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，然后取出风干，得到丝素薄膜。
方法二：向所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液中添加与丝素质量比为1:0.5～1:1.0的胶黏剂聚乙二醇双环氧丙烷醚，搅拌均匀，然后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，于40～60℃烘干，取出烘干的薄膜放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干，得到丝素薄膜。
方法三：向所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液中添加丝素质量20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和10％的N-羟基琥珀酰亚胺、含有终浓度为0.05M的2-吗啉乙磺酸，冰浴搅拌10～30分钟后，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，于40～60℃烘干，取出烘干的薄膜放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干，得到丝素薄膜。
步骤五、制备具有调控血管细胞生长作用的丝素膜。
将所述丝素薄膜放入平皿中铺平，加入浓度为20～1000ng/cm2的CGRP水溶液，再加入亲水性胶黏剂，所述亲水性胶黏剂中含有摩尔比是CGRP的1～1.5倍的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺、含有终浓度为0.05M的2-吗啉乙磺酸，轻微振荡混匀，然后置于4℃下反应8～15小时，最后取出用去离子水漂洗，风干，获得具有调控血管细胞生长作用的丝素膜。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
首先，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
本实施案例展示一种丝素膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白质量分数为5％。
4.向上述丝素蛋白溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干。取出烘干的薄膜放入盛有80％乙醇的容器中浸渍2小时，然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，然后取出风干，得到丝素薄膜。
5.将制备好的丝素薄膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定丝素薄膜的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素膜动态接触，测得丝素薄膜的溶血率<0.15％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
6.将制备好的丝素薄膜进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，接种1mL含有0.2～0.5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞的细胞悬液，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下培养，其中每天更换一次新鲜的细胞培养基。
7.细胞增殖实验结果显示：培养3天后，丝素薄膜上平滑肌细胞数量为接种时细胞数量的2.6倍。培养3天后，内皮细胞数量为接种时细胞数量的5.3倍。
实施例2
本实施案例展示一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白质量分数为5％。
4.向上述丝素蛋白溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干。取出烘干的薄膜放入盛有80％乙醇的容器中浸渍2小时，然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，然后取出风干，得到丝素薄膜。
5.将丝素薄膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入50ng/cm2的CGRP水溶液，然后分别加入与CGRP摩尔比为1～1.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸轻微振荡混合5分钟，然后置于4℃下反应12小时后取出，用去离子水漂洗并风干，得加载CGRP的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜。
6.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与具有调控血管细胞生长作用的丝素膜动态接触，测得具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血率<0.15％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
7.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，接种1mL含有0.2～0.5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞的细胞悬液，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下培养，其中每天更换一次新鲜的细胞培养基。
8.细胞增殖实验结果显示：培养3天后，CGRP修饰的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜上平滑肌细胞数量为接种时细胞数量的约2.5倍，与未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例1)上细胞增殖能力相当。培养3天后，内皮细胞数量为接种时细胞数量的6.5倍，是未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例1)上细胞增殖能力的1.2倍。
实施例3
本实施案例展示一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白质量分数为5％。
4.向上述丝素蛋白溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干。取出烘干的薄膜放入盛有80％乙醇的容器中浸渍2小时，然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，然后取出风干，得到丝素薄膜。
5.将丝素薄膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入100ng/cm2的CGRP水溶液，然后分别加入与CGRP摩尔比为1～1.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸轻微振荡混合5分钟，然后置于4℃下反应12小时后取出，用去离子水漂洗并风干，得加载CGRP的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜。
6.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与具有调控血管细胞生长作用的丝素膜动态接触，测得具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血率<0.15％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
7.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，接种1mL含有0.2～0.5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞的细胞悬液，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下培养，其中每天更换一次新鲜的细胞培养基。
8.细胞增殖实验结果显示：培养3天后，CGRP修饰的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜上平滑肌细胞数量为接种时细胞数量的2.2倍，与未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例1)上细胞增殖能力相比有显著下降。培养3天后，内皮细胞数量为接种时细胞数量的8.7倍，是未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例1)上细胞增殖能力的1.64倍。
实施例4
本实施案例展示一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白质量分数为5％。
4.向上述丝素蛋白溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干。取出烘干的薄膜放入盛有80％乙醇的容器中浸渍2小时，然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，然后取出风干，得到丝素薄膜。
5.将丝素薄膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入300ng/cm2的CGRP水溶液，然后分别加入与CGRP摩尔比为1～1.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸轻微振荡混合5分钟，然后置于4℃下反应12小时后取出，用去离子水漂洗并风干，得加载CGRP的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜。
6.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与具有调控血管细胞生长作用的丝素膜动态接触，测得具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血率<0.15％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
7.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，接种1mL含有0.2～0.5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞的细胞悬液，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下培养，其中每天更换一次新鲜的细胞培养基。
8.细胞增殖实验结果显示：培养3天后，CGRP修饰的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜上平滑肌细胞数量为接种时细胞数量的2倍，与未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例1)上细胞增殖能力相比有显著下降。培养3天后，内皮细胞数量为接种时细胞数量的9.5倍，是未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例1)上细胞增殖能力的1.8倍。
实施例5
本实施案例展示一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的制备方法，包括：1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白质量分数为5％。
4.向上述丝素蛋白溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干。取出烘干的薄膜放入盛有80％乙醇的容器中浸渍2小时，然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，然后取出风干，得到丝素薄膜。
5.将丝素薄膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入500ng/cm2的CGRP水溶液，然后分别加入与CGRP摩尔比为1～1.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸轻微振荡混合5分钟，然后置于4℃下反应12小时后取出，用去离子水漂洗并风干，得加载CGRP的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜。
6.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与具有调控血管细胞生长作用的丝素膜动态接触，测得具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血率<0.15％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
7.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，接种1mL含有0.2～0.5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞的细胞悬液，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下培养，其中每天更换一次新鲜的细胞培养基。
8.细胞增殖实验结果显示：培养3天后，CGRP修饰的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜上平滑肌细胞数量为接种时细胞数量的2倍左右，与未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例1)上细胞增殖能力相比有显著下降。培养3天后，内皮细胞数量为接种时细胞数量的约9.2倍，是未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例1)上细胞增殖能力的1.74倍，这与实施例4的内皮细胞增殖率相当，由于这两种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜上因内皮细胞的增殖均铺满了整个膜的表面。
实施例6
本实施案例展示一种丝素膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白质量分数为5％。
4.向上述丝素蛋白溶液中添加丝素质量比1:0.5～1:1.0的胶黏剂聚乙二醇双环氧丙烷醚、搅拌均匀，然后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干。取出烘干的薄膜放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干，得到丝素薄膜。
5.将制备好的丝素薄膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定丝素薄膜的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素膜动态接触，测得丝素薄膜的溶血率为0.25％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
6.将制备好的丝素薄膜进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，接种1mL含有0.2～0.5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞的细胞悬液，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下培养，其中每天更换一次新鲜的细胞培养基。
7.细胞增殖实验结果显示：培养3天后，丝素薄膜上平滑肌细胞数量为接种时细胞数量的3.9倍。培养3天后，内皮细胞数量为接种时细胞数量的8倍。
实施例7
本实施案例展示一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白质量分数为5％。
4.向上述丝素蛋白溶液中添加丝素质量比1:0.5～1:1.0的胶黏剂聚乙二醇双环氧丙烷醚、搅拌均匀，然后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干。取出烘干的薄膜放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干，得到丝素薄膜。
5.将丝素薄膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入50ng/cm2的CGRP水溶液，然后分别加入与CGRP摩尔比为1～1.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸轻微振荡混合5分钟，然后置于4℃下反应12小时后取出，用去离子水漂洗并风干，得加载CGRP的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜。
6.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与具有调控血管细胞生长作用的丝素膜动态接触，测得具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血率为0.31％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
7.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，接种1mL含有0.2～0.5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞的细胞悬液，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下培养，其中每天更换一次新鲜的细胞培养基。
8.细胞增殖实验结果显示：培养3天后，CGRP修饰的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜上平滑肌细胞数量为接种时细胞数量的3.7倍，与未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例6)上细胞增殖能力相比稍有下降。培养3天后，内皮细胞数量为接种时细胞数量的11.2倍，是未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例6)上细胞增殖能力的1.4倍。
实施例8
本实施案例展示一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白质量分数为5％。
4.向上述丝素蛋白溶液中添加丝素质量比1:0.5～1:1.0的胶黏剂聚乙二醇双环氧丙烷醚、搅拌均匀，然后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干。取出烘干的薄膜放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干，得到丝素薄膜。
5.将丝素薄膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入200ng/cm2的CGRP水溶液，然后分别加入与CGRP摩尔比为1～1.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸轻微振荡混合5分钟，然后置于4℃下反应12小时后取出，用去离子水漂洗并风干，得加载CGRP的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜。
6.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与具有调控血管细胞生长作用的丝素膜动态接触，测得具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血率为0.2％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
7.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，接种1mL含有0.2～0.5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞的细胞悬液，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下培养，其中每天更换一次新鲜的细胞培养基。
8.细胞增殖实验结果显示：培养3天后，CGRP修饰的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜上平滑肌细胞数量为接种时细胞数量的3.1倍，与未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例6)上细胞增殖能力相比有显著下降。培养3天后，内皮细胞数量为接种时细胞数量的13.6倍，是未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例6)上细胞增殖能力的1.7倍。
实施例9
本实施案例展示一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的制备方法，包括：1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白质量分数为5％。
4.向上述丝素蛋白溶液中添加丝素质量比1:0.5～1:1.0的胶黏剂聚乙二醇双环氧丙烷醚、搅拌均匀，然后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干。取出烘干的薄膜放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干，得到丝素薄膜。
5.将丝素薄膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入400ng/cm2的CGRP水溶液，然后分别加入与CGRP摩尔比为1～1.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸轻微振荡混合5分钟，然后置于4℃下反应12小时后取出，用去离子水漂洗并风干，得加载CGRP的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜。
6.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与具有调控血管细胞生长作用的丝素膜动态接触，测得具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血率为0.3％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
7.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，接种1mL含有0.2～0.5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞的细胞悬液，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下培养，其中每天更换一次新鲜的细胞培养基。
8.细胞增殖实验结果显示：培养3天后，CGRP修饰的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜上平滑肌细胞数量为接种时细胞数量的2.7倍，与未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例6)上细胞增殖能力相比有显著下降。培养3天后，内皮细胞数量为接种时细胞数量的13.8倍，是未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例6)上细胞增殖能力的1.7倍，这与实施例8的内皮细胞增殖率相当，由于这两种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜上因内皮细胞的增殖均铺满了整个膜的表面。
实施例10
本实施案例展示一种丝素膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白质量分数为5％。
4.向上述丝素蛋白溶液中添加丝素质量20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和10％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干。取出烘干的薄膜放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干，得到丝素薄膜。
5.将制备好的丝素薄膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定丝素薄膜的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素膜动态接触，测得丝素薄膜的溶血率为0.19％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
6.将制备好的丝素薄膜进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，接种1mL含有0.2～0.5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞的细胞悬液，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下培养，其中每天更换一次新鲜的细胞培养基。
7.细胞增殖实验结果显示：培养3天后，丝素薄膜上平滑肌细胞数量为接种时细胞数量的3.7倍。培养3天后，内皮细胞数量为接种时细胞数量的7.5倍。
实施例11
本实施案例展示一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白质量分数为5％。
4.向上述丝素蛋白溶液中添加丝素质量20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和10％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干。取出烘干的薄膜放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干，得到丝素薄膜。
5.将丝素薄膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入20ng/cm2的CGRP水溶液，然后分别加入与CGRP摩尔比为1～1.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸轻微振荡混合5分钟，然后置于4℃下反应12小时后取出，用去离子水漂洗并风干，得加载CGRP的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜。
6.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与具有调控血管细胞生长作用的丝素膜动态接触，测得具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血率为0.17％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
7.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，接种1mL含有0.2～0.5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞的细胞悬液，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下培养，其中每天更换一次新鲜的细胞培养基。
8.细胞增殖实验结果显示：培养3天后，CGRP修饰的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜上平滑肌细胞数量为接种时细胞数量的3.5倍，与未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例10)上细胞增殖能力相比稍有下降。培养3天后，内皮细胞数量为接种时细胞数量的9.2倍，是未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例10)上细胞增殖能力的1.2倍。
实施例12
本实施案例展示一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的制备方法，包括：1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白质量分数为5％。
4.向上述丝素蛋白溶液中添加丝素质量20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和10％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干。取出烘干的薄膜放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干，得到丝素薄膜。
5.将丝素薄膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入100ng/cm2的CGRP水溶液，然后分别加入与CGRP摩尔比为1～1.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸轻微振荡混合5分钟，然后置于4℃下反应12小时后取出，用去离子水漂洗并风干，得加载CGRP的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜。
6.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与具有调控血管细胞生长作用的丝素膜动态接触，测得具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血率为0.2％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
7.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，接种1mL含有0.2～0.5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞的细胞悬液，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下培养，其中每天更换一次新鲜的细胞培养基。
8.细胞增殖实验结果显示：培养3天后，CGRP修饰的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜上平滑肌细胞数量为接种时细胞数量的2.9倍，与未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例10)上细胞增殖能力相比有显著下降。培养3天后，内皮细胞数量为接种时细胞数量的11.4倍，是未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例10)上细胞增殖能力的1.52倍。
实施例13
本实施案例展示一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白质量分数为5％。
4.向上述丝素蛋白溶液中添加丝素质量20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和10％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干。取出烘干的薄膜放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干，得到丝素薄膜。
5.将丝素薄膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入200ng/cm2的CGRP水溶液，然后分别加入与CGRP摩尔比为1～1.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸轻微振荡混合5分钟，然后置于4℃下反应12小时后取出，用去离子水漂洗并风干，得加载CGRP的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜。
6.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与具有调控血管细胞生长作用的丝素膜动态接触，测得具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的溶血率为0.2％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
7.将制备好的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，接种1mL含有0.2～0.5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞的细胞悬液，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下培养，其中每天更换一次新鲜的细胞培养基。
8.细胞增殖实验结果显示：培养3天后，CGRP修饰的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜上平滑肌细胞数量为接种时细胞数量的2.6倍，与未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例10)上细胞增殖能力相比有显著下降。培养3天后，内皮细胞数量为接种时细胞数量的13.2倍，是未用CGRP修饰的丝素薄膜(实施例10)上细胞增殖能力的1.76倍。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.一种具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)制备脱胶后的家蚕丝素纤维：将家蚕蚕丝或茧壳放入碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液或生物酶水溶液中加温处理，清洗，拉松，干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维；
(2)制备家蚕丝素溶解液：将所述脱胶后的家蚕丝素纤维完全溶解于溴化锂水溶液中，获得丝素溶解液；
(3)制备纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液：将所述丝素溶解液灌注于透析袋内，然后置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或者纯水更换容器内的液体，持续透析3天后浓缩，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液，其中，所述透析袋为半透膜，截留分子量为10～16kDa，所述浓缩具体为采用旋转蒸发器浓缩，使调整透析后的家蚕丝素蛋白水溶液的质量分数为5～12％；
(4)制备丝素薄膜：
方法一，将所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，于40～60℃烘干，取出烘干的薄膜放入盛有80％乙醇的容器中浸渍2小时，然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡1～2天，每隔2小时更换一次容器内的去离子水，然后取出风干，得到丝素薄膜；
方法二，向所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液中添加与丝素质量比为1:0.5～1:1.0的胶黏剂聚乙二醇双环氧丙烷醚，搅拌均匀，然后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，于40～60℃烘干，取出烘干的薄膜放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干，得到丝素薄膜；
方法三，向所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液中添加丝素质量20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和10％的N-羟基琥珀酰亚胺、含有终浓度为0.05M的2-吗啉乙磺酸，冰浴搅拌10～30分钟后，倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，于40～60℃烘干，取出烘干的薄膜放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干，得到丝素薄膜；
(5)制备具有调控血管细胞生长作用的丝素膜：将所述丝素薄膜放入平皿中铺平，加入CGRP水溶液，再加入亲水性胶黏剂，轻微振荡混匀，然后置于4℃下反应8～15小时，最后取出用去离子水漂洗，风干，获得具有调控血管细胞生长作用的丝素膜，其中，所述CGRP水溶液的浓度为20～1000ng/cm2，所述亲水性胶黏剂中含有摩尔比是CGRP的1～1.5倍的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺、含有终浓度为0.05M的2-吗啉乙磺酸。
2.根据权利要求1所述的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述将家蚕蚕丝或茧壳放入碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液或生物酶水溶液中加温处理是指将家蚕蚕丝或茧壳按1g:50mL的浴比放入质量浓度为0.2～0.8％的碳酸钠水溶液或0.5～1.0％碳酸氢钠的水溶液中在95～100℃的温度条件下处理2～3次，或1.0～2.5g/L的生物酶水溶液中在30～60℃的温度条件下处理2～3次，每次处理30分钟，所述干燥是指在60℃烘箱内干燥。
3.根据权利要求1所述的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述将所述脱胶后的家蚕丝素纤维完全溶解于溴化锂水溶液中是指称取所述脱胶后的家蚕丝素纤维，按1g:10mL的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，在温度为65℃的条件下处理直至丝素纤维完全溶解。
4.根据权利要求1中任意一项所述的具有调控血管细胞生长作用的丝素膜的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述风干具体为在小于25℃的温度下风干。
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