KR100748038B1 - 생리활성물질 고정화 인공혈관 - Google Patents

생리활성물질 고정화 인공혈관 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생리활성물질 고정화 인공혈관에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 헤파린, 혈관내피세포 점착성 펩타이드 및 친수성 고분자로 표면개질된 생체적합성 고분자로 이루어진 고분자 지지체층을 포함하여 이루어지는 인공혈관에 관한 것이다.
본 발명의 인공혈관은 생체적합성 고분자에 친수성 고분자를 스페이서로 도입한 후, 혈관내피세포 점착성 펩타이드 및 헤파린을 화학적 표면개질을 통해 고정함으로써, 항혈전성이 개선되고 혈관내피세포화를 효과적으로 유도할 수 있다.
인공혈관, 헤파린, 혈관내피세포화, 펩타이드, 표면개질

Description

생리활성물질 고정화 인공혈관{BIOACTIVE AGENT IMMOBILIZED ARTIFICIAL VASCULAR GRAFT}
도 1은 본 발명에 따른 인공혈관의 개략적인 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 5의 Human Plasma Fibrinogen 흡착량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 5의 혈관내피세포 증식률을 측정하여 나타낸 그래프이다.
본 발명은 생리활성물질 고정화를 이용한 인공혈관에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 기존의 인공혈관에 사용되는 생체적합성 고분자에 화학적 표면재질을 통해 친수성 고분자, 헤파린 및 혈관내피세포 점착성 펩타이드를 도입함으로써 항혈전성을 갖고 혈관내피세포화를 효과적으로 유도할 수 있는 인공혈관에 관한 것이다.
인공혈관은 수술이나 약리적 치료로 치유 불가능한 생체혈관을 대체 이식하 는 인공장기로 정의된다. 이러한 인공혈관은 혈관기능을 만족시키면서 이식중이나 이식 후에 이상이 없기 위해서는, 소독이 가능하고, 꼬이지 않으며, 적당한 투과성과 봉합성을 갖고, 계속되는 수축 및 팽창에 견디는 탄성과 유연성의 기계적·물리적 특성을 충족하고, 인체 내에서 독성이 없고, 감염, 염증 및 면역반응을 일으키기 않으며, 혈관 내면에 혈액이 응고되지 않아야 한다.
이러한 인공혈관은 직경에 따라 보통 대구경 및 소구경 인공혈관으로 나눌 수 있다. 직경이 보통 5mm 이상인 대구경 인공혈관은 큰 직경에 의해서 혈류속도가 빠르기 때문에 혈액응고에 의해 혈관이 쉽게 막히지 않으므로 인공혈관으로서 별다른 문제가 없으며 장기간 물성이 변하지 않아 반영구적으로 사용할 수 있는 다크론(Dacron)이나 연신 폴리테트라플루오로에틸렌(ePTFE)가 사용되고 있다. 또한, 최근에는 이들 인공혈관의 표면에 알부민(albumin), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 피브린(fibrin) 및 알긴산(alginic acid) 등을 표면 처리하기도 한다.
한편, 직경이 5mm 이하인 소구경 인공혈관은 직경이 작고 혈류 속도가 느려 혈관이 쉽게 막혀버리므로 상용화에 어려움이 있어, 현재 소구경 인공혈관이 필요할 때는 환자의 다리에 있는 복재정맥을 채취하여 이식하는 자가접합 방법이 사용되고 이다. 그러나, 이 방법은 성공률은 높으나 환자의 복제정맥의 양이 한정되어 있고 채취방법 및 시간 등의 문제점이 있다.
인공혈관의 재료로 비분해성 고분자인 다크론(Dacron), 연신 폴리테트라플루 오로에틸렌(ePTFE)과 폴리우레탄(polyurethane)을 많이 사용되고 있으나, 혈액 속의 단백질이 혈관 표면과의 상호작용에 따라 흡착 및 재배열되면서 소수성 흡착 현상이 발생하는 문제점이 있다. 소수성 흡착을 한 단백질은 탈착이 되지 않고 혈소판, 백혈구 및 기타 조식세포를 유인하는 물질로서 작용하기 때문에 혈전 현상을 일으키는 근본 원인이 되고 있다.
이러한 혈전 현상을 개선하기 위한 방법은 크게 세 가지로 분류된다.
첫 번째는 이러한 흡착현상에 대하여 불활성 인공혈관을 사용함으로써 반응성을 작게 하는 것이며, 두 번째는 재료의 표면을 친수성으로 변화시키거나 헤파린과 같은 항혈전성 물질을 인공혈관 미세공에 채워 넣거나 인공혈관 내부에 가교 구조의 형태로 코팅하는 등 생물학적 활성을 가진 물질을 화학적으로 인공혈관 표면에 도입하는 표면개질법이고, 세 번째는 실제 혈관의 생물학적 작용특성과 유사하도록 혈관내피세포를 인공혈관 표면에 배양하는 방법이다.
그러나, 상술한 방법 중 혈관내피세포를 인공혈관 내벽에 부착하는 연구는 큰 성과를 거두지 못하고 있다.
따라서, 소구경 인공혈관의 상용화를 위해, 항혈전성을 갖고 혈관내피세포화를 효과적으로 유도할 수 있는 인공혈관의 개발이 요구되고 있다.
상기와 같은 기존의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 항혈전성이 개선되고 혈관내피세포의 성장을 효과적으로 유도하여 혈관내피세포화 할 수 있는 인공혈관을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,
헤파린, 혈관내피세포 점착성 펩타이드 및 친수성 고분자로 표면개질된 생체적합성 고분자로 이루어진 고분자 지지체층을 포함하여 이루어지는 인공혈관을 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 구현예는,
헤파린; RGD 펩타이드, YIGSR 펩타이드 또는 이들의 혼합물; 및 폴리에틸렌글리콜;로 표면개질된 생체적합성 고분자로 이루어진 고분자 지지체층을 포함하여 이루어지는 인공혈관을 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 구현예는,
헤파린; RGD 펩타이드, YIGSR 펩타이드 또는 이들의 혼합물; 및 폴리에틸렌글리콜;로 표면개질된 생체적합성 고분자로 이루어진 고분자 지지체층 및
상기 고분자 지지체층 상면에 형성되되, 폴리(락타이드-co-글리코리드); 헤파린; 및 RGD 펩타이드, YIGSR 펩타이드 또는 이들의 혼합물;을 포함하는 생분해성 코팅층을 포함하여 이루어지는 인공혈관을 제공한다.
본 발명의 인공혈관은 생리활성물질을 인공혈관의 고분자 지지체층을 이루는 생체적합성 고분자에 화학적 표면개질을 통해 도입됨으로써, 항혈전성이 개선되고 혈관내피세포의 생성을 효과적으로 유도할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 혈관에서 혈액과 직접 접촉하는 혈관내피세포층을 인공혈관 표면에 효과적으로 도입하기 위한 연구를 거듭한 결과, 생체적합성 고분자에 친수성 고분자를 스페이서로 도입한 후, 혈관내피세포 점착성 펩타이드 및 항응고제일 뿐만 아니라 혈관내피세포화 유도가 가능한 성장인자와 상호작용하는 헤파린을 화학적 표면개질을 통해 고정함으로써, 항혈전성이 개선되고 혈관내피세포화를 효과적으로 유도할 수 있다는 것을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 인공혈관은 기존의 인공혈관 재료로 사용되는 생체적합성 고분자를 헤파린, 혈관내피세포 점착성 펩타이드 및 친수성 고분자로 표면개질하여 이루어진 고분자 지지체층을 포함하는 것을 특징으로 한다.
도 1은 본 발명에 따른 인공혈관의 개략적인 모식도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 인공혈관의 고분자 지지체층은, 생체적합성 고분자로 이루어진 고분자 매트릭스에 친수성 고분자를 스페이서(spacer)로 도입한 후, 헤파린 및 혈관내피세포 점착성 펩타이드를 고정화하여, 생체적합성 고분자를 화학적으로 표면개질함으로써 제조된다.
상기 고분자 지지체층의 매트릭스인 생체적합성 고분자는 혈액적합성, 항(抗) 석회화 특성, 조직적합성 중에서 하나 이상의 특성을 갖추어야 한다.
이러한 특성을 갖는 생체적합성 고분자라면 생분해성 고분자 또는 비분해성 고분자 어떤 것이라도 사용할 수 있다. 이때, 상기 생분해성 고분자는 바람직하기로는 폴리글리콜산, 폴리락타이드, 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(락타이드-co-글리코리드), 폴리(락타이드-co-ε-카프로락톤), 폴리(ε-카프로락톤-co-글리코리드), 폴리(ε-카프로락톤-co-글리코리드-co-락타이드), 키토산 및 콜라겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용한다.
또한, 상기 비분해성 고분자는 폴리우레탄(polyurethane), 다크론(Dacron) 및 연신 폴리테트라플루오로에틸렌(ePTFE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있으며, 바람직하기로는 폴리우레탄을 사용한다.
스페이서로 도입되는 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), 폴리(아크릴산)계(poly(acrylic acid)), 폴리(아크릴산염)계(poly(acrylate)), 폴리(아크릴아마이드)계(poly(acrylamide)), 폴리(비닐에스테르)계(poly(vinylester)), 폴리옥사이드계(polyoxide), 폴리비닐 알코올계(poly(vinyl alcohol)), 폴리스티렌계(polystyrene) 및 이들의 유도체 또는 혼합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용한다. 이때, 바람직하기로는 폴리에틸렌글리콜을 사용하며, 그 분자량은 1,000 내지 8,000 달톤인 것이 더욱 바람직하 다. 상기 폴리에틸렌글리콜의 분자량이 1,000 달톤 미만인 경우 스페이서 길이가 짧아져 그 효과가 미미한 문제가 있으며, 분자량이 8,000 달톤을 초과하는 경우 인공혈관 표면에 혈관내피세포의 점착이 어려워지는 문제가 있다.
헤파린은 대표적인 항응고제인 동시에 혈관내피세포화 유도가 가능한 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 등의 성장인자와 상호작용한다. 따라서, 이러한 헤파린은 피브리노겐의 형성을 방지하여 인공혈관에 항혈전성을 부여하고, 다양한 성장인자와 상호작용함으로써 혈관내피세포화를 유도한다.
이때, 상기 헤파린은 헤파린, 재조합 헤파린(recombinant heparin), 헤파린 유도체(heparin derivative) 및 헤파린과 유사한 특성을 갖는 헤파린 유사체(heparin analogue)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
여기서, 상기 헤파린의 표면농도는 0.001 내지 10 ㎍/cm2인 것이 바람직하다. 상기 헤파린의 표면농도가 0.001 ㎍/cm2 미만인 경우 혈전형성의 원인이 될 수 있으며, 10 ㎍/cm2을 초과하는 경우 인공혈관 표면의 친수성이 너무 높아 혈관내피세포의 점착이 어려워지는 문제점이 있다.
혈관내피세포 점착성 펩타이드는 혈관내피세포의 점착 및 증식에 효과적인 펩타이드로 RGD 펩타이드, YIGSR 펩타이드를 사용할 수 있으며, 이들의 혼합물을 사용하는 경우 상승효과를 얻을 수 있어 바람직하다. 본 발명의 인공혈관은 혈관내피세포를 인공혈관의 표면에 직접 배양한 기존의 기술과는 달리, 혈관내피세포의 점착 및 증식에 효과적인 펩타이드로 인공혈관의 표면을 개질함으로써, 혈관내피세포의 성장을 효과적으로 유도할 수 있다.
이때, 상기 혈관내피세포 점착성 펩타이드의 표면농도는 0.001 내지 10 ng/cm2인 것이 바람직하다. 상기 혈관내피세포 점착성 펩타이드의 표면농도가 0.001 ng/cm2 미만인 경우 혈관내피세포의 초기 점착이 낮아 혈관내피세포화 정도가 낮아지며, 10 ng/cm2을 초과하는 경우 혈관내피세포의 초기 점착은 이루어지나, 세포의 이동 및 증식이 상대적으로 어려워 전체적인 인공혈관 표면의 혈관내피세포화 정도가 떨어지는 문제가 있다.
본 발명에 따른 인공혈관은 상기 고분자 지지체층 상면에 형성되되, 생분해성 고분자, 헤파린 및 혈관내피세포 유도 펩타이드를 포함하는 생분해성 코팅층을 더욱 포함하는 것이 바람직하다.
상기 고분자 지지체층은 비분해성 고분자에 생리활성물질들을 화학적으로 공유결합시킨 것이므로, 초기 항혈전성 및 혈관내피세포를 유도하기 위한 생체 내 표면 농도가 낮을 수 있다.
그러므로, 생분해성 고분자, 헤파린 및 혈관내피세포 점착성 펩타이드가 단순히 혼합되어 있는 생분해성 코팅층이 상기 고분자 지지체층에 형성되는 경우, 생 분해성 고분자에서 생리활성물질이 방출되면서 단기적인 효과를 얻을 수 있다.
여기서, 상기 생분해성 고분자는 폴리글리콜산, 폴리락타이드, 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(락타이드-co-글리코리드), 폴리(락타이드-co-ε-카프로락톤), 폴리(ε-카프로락톤-co-글리코리드), 폴리(ε-카프로락톤-co-글리코리드-co-락타이드), 키토산 및 콜라겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있으며, 바람직하기로는 폴리(락타이드-co-글리코리드)를 사용한다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(실시예)
(실시예 1)
(PEG, 헤파린, RGD로 표면개질된 폴리우레탄 인공혈관)
가. 다공성 폴리우레탄 인공혈관 제조
시판되어 있는 의료용 폴리우레탄(Bionate 90A)을 메틸에틸케톤(Methyl Ethyl Keton, MEK)와 디메틸아세트아미드(Dimethyl Acetamide, DMAc)를 1:2로 섞은 유기용매에 20%(w/v)의 비율로 교반하면서 용해시켰다. 용해시킨 용액을 몰드에 부은 후 염침출법으로 60℃, 진공에서 용매를 증발시켜 다공성 폴리우레탄 인공혈관을 얻었다. 그 후, 다공성 폴리우레탄 인공혈관에 묻은 불순물을 에탄올로 세척하 였다.
나. 폴리우레탄에 헤파린 도입
1. 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDI: Hexamethylene diisocyanate) 0.806g을 60㎖ 톨루엔(Toluene)에 녹인 후, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 2g을 20㎖ 톨루엔에 녹인 용액을 적가 깔대기(dropping funnel)을 사용해 HMDI 용액에 천천히 떨어뜨리면서, 60℃ 질소기류하에서 교반하였다. 그 결과 양 말단에 NCO 그룹이 치환된 폴리에틸렌글리콜 고분자(OCN-HMDI-PEG-HMDI-NCO)를 얻었다.
2. 이렇게 치환된 고분자(OCN-HMDI-PEG-HNDI-NCO)와 미리 제조된 폴리우레탄 인공혈관을 80㎖ 톨루엔 용매에서 촉매(DBTDL: Dibutyltin dilaurate, 95%) 1㎎을 첨가하여 폴리우레탄 사슬에 있는 아민 그룹과 치환된 폴리에틸렌글리콜 말단의 NCO 그룹을 반응시켜 폴리우레탄 표면에 폴리에틸렌글리콜 스페이서가 도입된 전단계 고분자(PU-PEG-NCO)로 이루어진 인공혈관을 얻었다.
3. 헤파린 3㎎/인공혈관 단위면적(cm2)을 포름아마이드(formamide) 75㎖에 녹인 후, DBTDL 1㎎을 사용해서 전단계 고분자(PU-PEG-NCO)의 NCO 작용기와 헤파린의 히드록시기(-OH) 또는 아민(-NH2) 작용기를 상온, 질소 하에서 48시간 동안 반응시켰다.
다. 혈관내피세포 점착성 펩타이드의 도입
인공혈관 단위면적(cm2)당 0.03㎎의 RGD를 40㎖ 증류수에 녹인 후, 0.046㎎의 EDC와 0.011㎎의 NHS를 이용하여 폴리우레탄 표면에 헤파린과 결합하지 않고 남 아 있는 작용기 및 헤파린에 존재하는 작용기(-NH2)와 펩타이드의 카르복시기(-COOH)를 30℃에서 48시간 동안 반응시켜, 헤파린 및 RGD가 모두 도입된 폴리우레탄 인공혈관을 얻었다. 제조된 인공혈관의 헤파린의 표면농도는 1.0㎍/cm2, RGD의 표면농도는 0.4 ng/cm2이었다.
(실시예 2)
(PEG, 헤파린, YIGSR로 표면개질된 폴리우레탄 인공혈관)
상기 실시예 1의 나. 항목에서 헤파린이　도입된　폴리우레탄　인공혈관에 존재하는 작용기(-NH2)와 인공혈관 단위면적(cm2)당 0.03㎎의 YIGSR 말단에　존재하는　카르복시기(-COOH)를 상온에서 가교제(0.039㎎, EDC/0.09㎎ NHS)를 사용하여 화학적으로 48시간　동안　결합시켜, 헤파린 및 YIGSR가 모두 도입된 폴리우레탄 인공혈관을 얻었다. 제조된 인공혈관의 헤파린의 표면농도는 1.0㎍/cm2, YIGSR의 표면농도는 0.5 ng/cm2이었다.
(실시예 3)
(PEG, 헤파린, RGD, YIGSR로 표면개질된 폴리우레탄 인공혈관)
상기 실시예 1의 나. 항목에서 헤파린이　도입된　폴리우레탄　인공혈관에 존재하는 작용기(-NH2)와 인공혈관 단위면적(cm2)당 RGD 0.03㎎ 및 YIGSR 0.03㎎의 말단에　존재하는　카르복시기(-COOH)를 상온에서 가교제(0.436㎎, EDC/0.101㎎ NHS)를 사용하여 화학적으로　48시간　동안　결합시켜, 헤파린, RGD 및 YIGSR가 모두 도입된 폴리우레탄 인공혈관을 얻었다. 제조된 인공혈관의 헤파린의 표면농도는 1.0㎍/cm2, RGD의 표면농도는 0.4 ng/cm2, YIGSR의 표면농도는 0.5 ng/cm2이었다.
(실시예 4)
(생분해성 코팅층이 형성된 인공혈관)
1. 분자량 100,000 달톤의 PLGA(75:25)를 메틸렌클로라이드(methylene chloride)에 7%(w/v)의 비율로 녹인 후, 분말상태의 헤파린 0.1g, YIGSR 1mg, RGD 1mg을 초음파 분쇄기(Ultra-homogenizer)를 사용해 골고루 분산시켰다.
2. 생리활성물질이 분산된 용액 5 ㎖을 상기 실시예 3에서 제조한 인공혈관의 표면에 분사시키고, 상온에서 24시간 건조시켜 생분해성 코팅층이 형성된 인공혈관을 얻었다.
(비교예 1)
(다공성 폴리우레탄 인공혈관)
시판되어 있는 의료용 폴리우레탄(Bionate 90A)을 메틸에틸케톤(Methyl Ethyl Keton, MEK)와 디메틸아세트아미드(Dimethyl Acetamide, DMAc)를 1:2로 섞은 유기용매에 20% (w/v)의 비율로 교반하면서 용해시켰다. 용해시킨 용액을 몰드에 부은 후 염침출법으로 60℃ 진공에서 용매를 증발시켜 다공성 폴리우레탄 인공혈관을 얻었다. 그 후, 다공성 폴리우레탄 인공혈관에 묻은 불순물들을 에탄올로 세척하였다.
(비교예 2)
(PEG로 표면개질된 폴리우레탄 인공혈관)
가. 헥사메틸렌 디아이소시아네이트(HMDI: Hexamethylene diisocyanate) 0.806g을 60㎖ 톨루엔(Toluene)에 녹인 후, 폴리에틸렌글리콜(PEG: Polyethylene glycol) 2g을 20㎖ 톨루엔에 녹인 용액을 적가 깔대기(dropping funnel)을 사용해 HMDI 용액에 천천히 떨어뜨리면서, 60℃ 질소기류하에서 교반하였다. 그 결과, 양말단에 NCO 그룹이 치환된 폴리에틸렌글리콜 고분자(OCN-HMDI-PEG-HMDI-NCO)를 얻었다.
나. 이렇게 치환된 고분자(OCN-HMDI-PEG-HNDI-NCO)와 미리 제조된 폴리우레탄 인공혈관을 80㎖의 톨루엔에서 촉매(DBTDL: Dibutyltin dilaurate, 95%) 1mg을 첨가하여 폴리우레탄 사슬에 있는 아민 그룹과 치환된 폴리에틸렌글리콜 말단의 NCO 그룹과 반응시켜 폴리우레탄 표면에 폴리에틸렌글리콜 스페이서가 도입된 전단계 고분자(PU-PEG-NCO)로 이루어진 인공혈관을 얻었다
(비교예 3)
(PEG, RGD로 표면개질된 폴리우레탄 인공혈관)
상기 실시예 1의 나. 2에서 제조한 전단계 고분자(PU-PEG-NCO)로 이루어진 인공혈관을 증류수에 담가 말단 NCO 그룹을 아민(NH2) 그룹으로 치환하였다. 이 말단의 아민 그룹과 단위면적당(cm2) 0.03mg의 RGD를 가교제(0.046g EDC/0.011mg NHS)하에 30℃에서 48시간 반응시켜, RGD로 개질된 폴리우레탄 인공혈관을 얻었다.
(비교예 4)
(PEG, YIGSR로 표면개질된 폴리우레탄 인공혈관)
상기 실시예 1의 나. 2에서 제조한 전단계 고분자(PU-PEG-NCO)로 이루어진 인공혈관을 증류수에 담가 말단 NCO 그룹을 아민(NH2) 그룹으로 치환하였다. 이 말단의 아민 그룹과 단위면적당(cm2) 0.03mg의 YIGSR를 가교제(0.39mg EDC/0.09mg NHS)하에 상온에서 48시간 반응시켜, YIGSR로 개질된 폴리우레탄 인공혈관을 얻었다.
(비교예 5)
(PEG, 헤파린으로 표면개질된 폴리우레탄 인공혈관)
상기 실시예 1의 나. 항목에서 제조한 PEG, 헤파린으로 표면개질된 폴리우레탄 인공혈관을 사용하였다.
(실험예)
(실험예 1)
(Human Plasma Fibrinogen 흡착 실험)
혈장단백질인 피브리노겐(Fibrinogen)을 이용하여 생리활성물질이 고정화된 폴리우레탄의 단백질 흡착실험을 하였다.
상기 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 5에서 제조한 인공혈관을 흡착실험을 위해 필름형태의 샘플(1×1cm2)로 잘라내었다. 그 다음 10ml 튜브에 PBS(Phosphate Buffered Saline)용액 (pH 7.4) 3㎖을 채운 뒤 샘플을 넣고 2시간 동안 흔들어 주었다. HPF(Human Plasma Fibrinogen)을 0.3% (w/v) 농도가 되도록 튜브에 주입한 다음, 3시간 동안 37℃에서 incubation 후, PBS용액 3㎖을 이용해 3회 씻어냈다. 그 다음, 1% (w/v)의 SDS(Sodium dodecyl sulfate)용액 3㎖를 첨가하여 1시간 초음파 분산(ultra-sonication)한 후, 용액을 채취하여 BCA kit를 사용하여 562nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험의 대조군인 폴리우레탄 자체보다 생리활성물질을 도입한 실험군이 피브리노겐의 흡착률이 낮다는 것은 항혈전성을 가진다는 것을 의미한다.
그 결과를 도 2 및 아래 표 1에 나타내었다.
구분 흡착량(㎍/cm2) 비고
실시예 1 0.30 PU-PEG-Heparin-RGD
실시예 2 0.33 PU-PEG-Heparin-YIGSR
실시예 3 0.34 PU-PEG-Heparin-RGD-YIGSR
실시예 4 0.20 PU-PEG-Heparin-RGD-YIGSR/생분해성 코팅층
비교예 1 0.68 PU
비교예 2 0.43 PU-PEG
비교예 3 0.47 PU-PEG-RGD
비교예 4 0.43 PU-PEG-YIGSR
비교예 5 0.24 PU-PEG-Heparin
상기 표 1에서 보듯이, 비교예 1에 비해 친수성을 가지는 PEG 스페이서(spacer)에 의해 비교예 2는 흡착되는 정도가 40% 정도 낮아졌다. 그리고, 펩타이드만을 도입했을 경우인 비교예 3, 비교예 4의 흡착률은 거의 차이가 없어, 펩타이드와 혈장 단백질과는 특별한 상호작용이 없음을 알 수 있었다.
하지만, PEG와 헤파린을 도입한 비교예 5(PU-PEG-Heparin)에는 비교예 2(PU-PEG) 보다 흡착량이 50% 정도 더 낮아짐을 보였다. 본 발명에 따른 실시예 1, 실시예 2의 경우(PU-PEG-Hep-RGD, PU-PEG-Hep-YIGSR), 헤파린 하나만을 도입한 비교예 5에 비해서는 높지만 PEG만 도입한 비교예 2보다는 낮은 흡착률을 보였다.
(실험예 2)
(Human Umbilical Vein Endothelial Cell 증식 실험)
혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cell)을 이용하여 생리활성물질이 고정화된 폴리우레탄의 혈관내피세포 증식실험을 시행하였다.
상기 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 5에서 제조한 인공혈관을 증식실험을 위해 필름형태의 샘플(1×1cm2)로 잘라내었다.
샘플을 48 well plate에 넣고 멸균한 후, 2×103개의 세포 및 EGM (Endothelial cell Growth Medium) 배지를 첨가하여 배양기간에 따라 37℃에서 CO2 incubation을 하였다. 해당 배양기간에서 기존의 배지를 제거하고, 250㎕의 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 용액을 첨가하여 37℃에서 4시간 CO2 incubation 후, PBS로 세척하였다. 225㎕의 DMSO (25㎕의 Glycine 완충용액 함유) 용액을 첨가하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험의 대조군인 폴리우레탄 자체보다 생리활성물질을 도입한 실험군이 혈관내피세포의 증식률이 높다는 것은 재료표면의 혈관내피세포 점착이 잘되며, 항혈전성이 우수하다는 것을 의미한다.
그 결과를 도 3 및 아래 표 2에 나타내었다.
구분 증식률 % (5일) 비고
실시예 1 181 PU-PEG-Heparin-RGD
실시예 2 175 PU-PEG-Heparin-YIGSR
실시예 3 210 PU-PEG-Heparin-RGD-YIGSR
실시예 4 232 PU-PEG-Heparin-RGD-YIGSR/생분해성 코팅층
비교예 1 132 PU
비교예 2 72 PU-PEG
비교예 3 165 PU-PEG-RGD
비교예 4 163 PU-PEG-YIGSR
비교예 5 150 PU-PEG-Heparin
상기 표 2에서 보듯이, 비교예 1에 비해 친수성 고분자가 도입된 비교예 2는 혈관내피세포 배양 5일 후의 증식률이 낮았으나, 생리활성물질이 고정화된 비교예 3, 비교예 4, 비교예 5의 증식률이 비교예 1에 비해 증가한 것으로 보아 고정화된 생리활성물질인 헤파린 또는 RGD 또는 YIGSR이 혈관내피세포의 증식을 효과적으로 유도했음을 알 수 있었다.
실시예 1, 실시예 2의 경우 단일 생리활성물질을 사용한 비교예 3(PU-PEG-RGD), 비교예 4(PU-PEG-YIGSR), 비교예 5(PU-PEG-Heparin)에 비해 혈관내피세포의 증식률이 높았으며, 특히 헤파린, RGD, YIGSR이 모두 고정화된 실시예 3은 우수한 혈관내피세포 증식률을 보였다. 또한, 생분해성 코팅층이 형성된 실시예 4의 경우 가장 높은 혈관내피세포 증식률을 보였다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 인공혈관은 생체적합성 고분자에 친수성 고분자를 스페이서로 도입한 후, 혈관내피세포 점착성 펩타이드 및 항응고제일 뿐만 아니라 혈관내피세포화 유도가 가능한 성장인자와 상호작용하는 헤파린을 화학적 표면개질을 통해 고정함으로써, 항혈전성이 개선되고 혈관내피세포화를 효과적으로 유도할 수 있다.

Claims (13)

  1. 헤파린, 혈관내피세포 점착성 펩타이드 및 친수성 고분자로 표면개질된 생체적합성 고분자로 이루어진 고분자 지지체층
    을 포함하여 이루어지는 인공혈관.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 고분자 지지체층 상면에 형성되되, 생분해성 고분자, 헤파린 및 혈관내피세포 점착성 펩타이드를 포함하는 생분해성 코팅층
    을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 인공혈관.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 헤파린은,
    헤파린, 재조합 헤파린(recombinant heparin), 헤파린 유도체(heparin derivative) 및 헤파린과 유사한 특성을 갖는 헤파린 유사체(heparin analogue)로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 인공혈관.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 헤파린의 표면농도는,
    0.001 내지 10 ㎍/cm2인 것을 특징으로 하는 인공혈관.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혈관내피세포 점착성 펩타이드는,
    RGD, YIGSR 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 인공혈관.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혈관내피세포 점착성 펩타이드의 표면농도는,
    0.001 내지 10 ng/cm2인 것을 특징으로 하는 인공혈관.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 친수성 고분자는,
    폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), 폴리(아크릴산)계(poly(acrylic acid)), 폴리(아크릴산염)계(poly(acrylate)), 폴리(아크릴아마이드)계(poly(acrylamide)), 폴리(비닐에스테르)계(poly(vinylester)), 폴리옥사이드계(polyoxide), 폴리비닐 알코올계(poly(vinyl alcohol)), 폴리스티렌계(polystyrene) 및 이들의 유도체 또는 혼합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인공혈관.
  8. 제7항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 1,000 내지 8,000 달톤인 것을 특징으로 하는 인공혈관.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는,
    생분해성 고분자 또는 비분해성 고분자인 것을 특징으로 하는 인공혈관.
  10. 제9항에 있어서, 상기 비분해성 고분자는,
    폴리우레탄(polyurethane), 다크론(Dacron) 및 연신 폴리테트라플루오로에틸렌(ePTFE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인공혈관.
  11. 제9항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는,
    폴리글리콜산, 폴리락타이드, 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(락타이드-co-글리코리드), 폴리(락타이드-co-ε-카프로락톤), 폴리(ε-카프로락톤-co-글리코리드), 폴리(ε-카프로락톤-co-글리코리드-co-락타이드), 키토산 및 콜라겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인공혈관.
  12. 헤파린; RGD 펩타이드, YIGSR 펩타이드 또는 이들의 혼합물; 및 폴리에틸렌글리콜;로 표면개질된 생체적합성 고분자로 이루어진 고분자 지지체층
    을 포함하여 이루어지는 인공혈관.
  13. 헤파린; RGD 펩타이드, YIGSR 펩타이드 또는 이들의 혼합물; 및 폴리에틸렌글리콜;로 표면개질된 생체적합성 고분자로 이루어진 고분자 지지체층 및
    상기 고분자 지지체층 상면에 형성되되, 폴리(락타이드-co-글리코리드); 헤파린; 및 RGD 펩타이드, YIGSR 펩타이드 또는 이들의 혼합물;을 포함하는 생분해성 코팅층
    을 포함하여 이루어지는 인공혈관.
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