CN113769156A - 兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵及其制备方法，该杂化纤维海绵是由多酚改性壳聚糖与蛋白类材料交联形成的具有复合三维网络结构的水凝胶在冷冻干燥后形成的冻干海绵经1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N‑羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液浸泡后处理形成的，冻干海绵在1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N‑羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液中的浸泡过程中，冻干海绵中的羧基与氨基应形成了酰胺键，同时冻干海绵中的蛋白类材料变性形成了β折叠，该杂化纤维海绵具有多孔结构。本发明提供的杂化纤维海绵在止血的同时可起到抑菌和促进组织再生，且适用于体表可压迫出血和体内不可压迫性出血等多种出血模型。

Description

兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵及其制备方法
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，涉及兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵及其制备方法，该杂化纤维海绵在止血、创面修复以及组织工程等方面具有良好的应用前景。
背景技术
据报道，全球30％以上的创伤性死亡是由失血过多引起的。同时，出血时往往伴随着细菌感染和皮肤损失的风险，严重威胁病人的生命健康。因此，开发具有快速止血作用，能抑制细菌感染并促进创面伤口愈合的止血材料，对于临床治疗具有至关重要的意义。尽管现有的明胶、壳聚糖、戊二醛交联白蛋白以及纤维蛋白基绷带等止血材料，对体表可压迫出血有较好的止血效率，但这些止血材料通常无法阻止体内的不可压迫性出血，而且对于抑菌和组织再生也没有好处，有些甚至需要二次手术去除。
壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物，壳聚糖上具有丰富的氨基和羟基，使其具有多种生物活性。壳聚糖表面的正电荷与血细胞表面的负电荷之间的静电相互作用使得壳聚糖具有理想的止血性能，壳聚糖还具有天然的抑菌活性，能够抑制多种细菌的生长，目前已经有多种基于壳聚糖的止血产品商品化。然而，单一的壳聚糖材料存在着止血效果较弱，抑菌能力不理想的缺点，其疗效不稳定，适应症范围有限。因此，以壳聚糖为基础，开发能够适用于多种出血模型，可生物降解，同时具有抑菌和组织再生能力的止血材料仍然是一项挑战，也是本领域亟待解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵及其制备方法，以在止血的同时起到抑菌和促进组织再生，并同时适用于体表可压迫出血和体内不可压迫性出血等多种出血模型。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵，该杂化纤维海绵是由多酚改性壳聚糖与蛋白类材料交联形成的具有复合三维网络结构的水凝胶在冷冻干燥后形成的冻干海绵经1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液浸泡后处理形成的，该杂化纤维海绵具有多孔结构；
所述具有复合三维网络结构的水凝胶由多酚改性壳聚糖氧化自交联以及多酚改性壳聚糖与蛋白类材料通过迈克加成反应形成；冻干海绵在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液中的浸泡过程中，冻干海绵中的羧基与氨基应形成了酰胺键，同时冻干海绵中的蛋白类材料变性形成了β折叠。
上述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵的技术方案中，所述复合三维网络水凝胶是按照多酚改性壳聚糖与蛋白类材料的质量比为(0.1～10):1，优选为(0.2～5):1，进一步优选为(0.5～2):1的比例，由多酚改性壳聚糖与蛋白类材料在氧化剂存在的条件下反应形成的。
上述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵的技术方案中，所述多酚改性壳聚糖是将多酚接枝在壳聚糖或羧甲基壳聚糖的氨基上形成的，多酚接枝在壳聚糖或羧甲基壳聚糖上之后形成的多酚改性壳聚糖中保留了多酚中的多酚基团，所述壳聚糖或羧甲基壳聚糖的分子量为1～5000kDa，优选为100～300kDa，多酚改性的壳聚糖中，多酚的接枝率为1％～50％，优选为5％～20％。
进一步地，上述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵的技术方案中，用于改性壳聚糖或羧甲基壳聚糖的多酚包括但不限于没食子酸、儿茶酚、花青素、白藜芦醇中的任意一种或几种。例如，没食子酸改性的壳聚糖的结构如下：
Figure BDA0003230736540000021
上述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵的技术方案中，所述蛋白类材料包括但不限于丝素蛋白、明胶、胶原、弹性蛋白、多肽中的任意一种或几种。
本发明提供的兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵，具有优异的力学性能，快速吸水能力，优异的保水性能和适当的水蒸气透过率，体内可降解，对蛋白质具有强吸附性能，还具有抑菌性能和优异的血液相容性。我们对该兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵进行了理化性质表征，体外血细胞黏附和凝血实验，体外细胞增殖实验，以及体内止血和皮肤修复性能实验，结果表明：
(1)理化实验表明，本发明提供的杂化纤维海绵在经过浸泡后处理后，具有良好的力学性能和快速的吸水能力，在1min内的吸水量可达到其最大吸水量的近90％，还具有优秀的形状回复性能，可在去除负载后快速回复至原有形状，有利于在体内不可压缩止血中应用。
(2)体外血细胞黏附和凝血实验表明，本发明提供的杂化纤维海绵对血小板和其他血细胞有强烈的黏附能力，并且形成了凝血蛋白网络，具有优异的凝血性能，与商品化明胶海绵相比，本发明提供的杂化纤维海绵在1min内的凝血率增加了近70％。
(3)体外细胞增殖实验表明，NIH-3T3细胞在本发明提供的杂化纤维海绵中的生长情况良好，细胞紧密贴附于杂化纤维海绵的孔隙生长，增殖明显，且铺展状况良好，无团聚生长的现象出现。
(4)体内止血实验表明，本发明提供的杂化纤维海绵在不同的止血模型中都能快速有效的止血，止血效果明显优于商品化的明胶海绵和商品化的壳聚糖海绵，尤其是在不可压迫的肝脏缺损出血模型中，本发明的杂化纤维海绵的出血量仅为商品化明胶海绵和壳聚糖海绵的49％和27％。
(5)皮肤修复实验表明，本发明提供的杂化纤维海绵能加速伤口的愈合，减少疤痕的产生，并促进血管和毛囊的再生。
基于以上实验结果，本发明提供的兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵可在制备止血材料，创面修复材料，负载细胞、药物或其他生物活性物质的医用材料中应用。
本发明还提供了上述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将多酚改性壳聚糖和蛋白类材料溶解形成混合液，然后加入高碘酸钠溶液，充分混合得到反应液，去除反应液中的气泡，转移至模具中，在室温静置至各组分充分交联，得到具有复合三维网络结构的水凝胶；
(2)将步骤(1)所得具有复合三维网络结构的水凝胶冷冻干燥，得到冻干海绵；
(3)将步骤(2)所得冻干海绵置于1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液中充分浸泡，以使冻干海绵中的羧基与氨基反应形成酰胺键并使冻干海绵中的蛋白类材料变性形成β折叠，干燥，即得兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵。
上述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵的制备方法的步骤(1)中，将多酚改性壳聚糖和蛋白类材料溶解形成的混合液中，多酚改性壳聚糖的浓度优选为1wt.％～20wt.％，蛋白类材料的浓度优选为1wt.％～20wt.％。
上述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵的制备方法的步骤(1)中，高碘酸钠溶液的加入量应使高碘酸钠与多酚改性壳聚糖的质量比为1:(10～30)，高碘酸钠的浓度优选为2～10mg/mL。
上述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵的制备方法的步骤(3)中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液是将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶解于无水乙醇中形成的，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的浓度优选为0.1wt.％～10wt.％，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度优选为0.1wt.％～10wt.％。
上述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵的制备方法的步骤(3)中，浸泡时间优选为10～12h。
上述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵的制备方法的技术方案中，多酚改性的壳聚糖可参照现有技术中的方法制备，一种可行的多酚改性壳聚糖的制备方法如下：
(1)将壳聚糖或羧甲基壳聚糖溶解于盐酸水溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和多酚，调节并保持反应溶液的pH值在4.75～5之间，在氮气保护下反应15～24h；控制壳聚糖或羧甲基壳聚糖、NHS、EDC·HCl与多酚的质量为(100～150):(100～150):(100～200):(150～200)；
(2)将步骤(1)所得反应液转入透析袋中，置于pH值为3.3～3.5的盐酸溶液中透析，即得多酚改性壳聚糖。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案产生了以下有益的技术效果：
1.本发明提供了兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵，由多酚改性壳聚糖与蛋白类材料交联形成的具有复合三维网络结构的水凝胶在冷冻干燥后形成的冻干海绵经1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)的乙醇溶液浸泡后处理形成的，具有多孔结构。本发明在壳聚糖的基础上，引入多酚对壳聚糖进行改性，同时引入了蛋白(例如丝素蛋白)与多酚改性壳聚糖一起形成了三维网络结构，在此基础上，还通过EDC/NHS的乙醇溶液进行了浸泡后处理，使三维网络结构中的羧基与氨基反应形成了酰胺键，并使蛋白类材料变性形成了β折叠。通过多酚改性和引入丝素蛋白，有效改善了现有壳聚糖止血海绵的抑菌性欠佳，难以用于体内不可压迫性出血的止血，促进组织再生的能力不佳以及不利于创面修复等问题。
2.本发明提供的兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵，具有优异的力学性能和形状回复性，该特性使得该杂化纤维海绵可压缩体积塞入狭窄不可压迫的出血位置，或用于鼻中隔手术的止血，可有效解决了现有的止血海绵产品在这些方面的不足。
3.本发明提供的兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵的多孔结构和经过后处理后的内部结构，使得其有利于水分的吸收和细胞的长入，具有快速形状回复性，快速吸水能力，优异的保水性和适当的水蒸气透过率，同时具有优异的血液相容性和抑菌性能，对蛋白质具有强吸附性能，这些特性不但有利于刺激血细胞和血小板激活凝血过程，实现快速的凝血，而且有利于创面修复和防止创面细菌感。此外，该杂化纤维海绵因其优异的蛋白吸附能力，还可负载药物、活性因子等作为生物医用载体使用。
4.本发明通过体外血细胞黏附和凝血实验表明，该杂化纤维海绵对血小板和其他血细胞有强烈的黏附能力，并且形成了凝血蛋白网络，具有优异的凝血性能，与商品化明胶海绵相比，本发明提供的杂化纤维海绵在1min内的凝血率增加了近70％；通过体外细胞增殖实验表明，细胞紧密贴附于杂化纤维海绵的孔隙生长，增殖明显，且铺展状况良好，无团聚生长的现象出现；通过体内止血实验表明，该杂化纤维海绵在不同的止血模型中都能快速有效的止血，止血效果明显优于商品化的明胶海绵和商品化的壳聚糖海绵，尤其是在不可压迫的肝脏缺损出血模型中，该杂化纤维海绵的出血量仅为商品化明胶海绵和壳聚糖海绵的49％和27％；通过皮肤修复实验表明，本发明提供的杂化纤维海绵能加速伤口的愈合，减少疤痕的产生，并促进血管和毛囊的再生。因此，该杂化纤维海绵不仅是理想的止血材料，而且可作为创面修复材料及生物医用材料使用，应用范围广泛。
附图说明
图1是实施例1制备的没食子酸修饰壳聚糖与壳聚糖的核磁共振氢谱图。
图2是实施例2制备的丝素蛋白的傅里叶红外光谱图。
图3是实施例3制备的C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1内部孔隙结构的扫描电镜图。
图4是C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1的溶胀曲线。
图5是C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1的压缩应力-应变曲线。
图6是C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1的循环压缩曲线。
图7是C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1的拉伸性能图。
图8是C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1的保水率曲线。
图9是C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1链霉蛋白酶溶液中的降解曲线。
图10是C1S1W、C1S1、C1S2、C2S1、Gel和CS的透气性能图。
图11是C1S1W、C1S1、C1S2、C2S1和Gel的蛋白吸附图。
图12是C1S1、Gel和CS的抑菌圈大小图(A、B图)和抑菌效果图(C图)。
图13是C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1的溶血率曲线。
图14是C1S1W、C1S1、C1S2、C2S1和Gel的体外凝血的扫描电镜图。
图15是C1S1W、C1S1、C1S2、C2S1和Gel的凝血率图。
图16是NIH-3T3细胞在C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1中的细胞增殖情况图。
图17是NIH-3T3细胞在C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1中培养不同时间后的的激光共聚焦扫描电镜图。
图18是C1S1、Gel和CS在不同动物出血模型中的出血量和止血时间图。
图19是C1S1、Gel和CS在小鼠全层皮肤缺损实验中的修复效果大体观图(A图)和伤口修复率(B图)。
图20是C1S1、Gel和CS在小鼠全层皮肤缺损实验中的修复效果HE切片染色图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵及其制备方法作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例中，制备没食子酸改性壳聚糖(CS-GA)，步骤如下：
(1)将分子量约为200kDa的壳聚糖(CS)溶解于盐酸水溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和没食子酸(GA)，用0.1mol/L和1mol/L的NaOH溶液、以及0.1mol/L和1mol/L的HCl溶液调节并保持反应溶液的pH值在4.75～5之间，在氮气保护下反应15～24h；该步骤中，CS、NHS、EDC·HCl与GA的质量为129:102:170:152。
(2)将步骤(1)所得反应液转入cut off MW＝8000～13000的透析袋中，置于pH值为3.3～3.5的盐酸溶液中透析5天，冷冻干燥，得到没食子酸改性壳聚糖(CS-GA)。
本实施例制备的CS-GA与采用的原料CS的核磁共振氢谱图如图1所示，由图可知，CS-GA在1～4ppm间出现了多个新的特征峰，而纯的CS在相应位置无特征峰出现，说明成功合成了CS-GA。测试本实施例制备的CS-GA中的GA的接枝率，结果发现CS-GA中GA的接枝量为85mg/g，接枝率约为8.5％。CS-GA的结构如下式所示：
Figure BDA0003230736540000061
通过调整步骤(1)中CS、NHS、EDC·HCl与GA的质量比，CS的分子量，可以改变CS-GA中多酚的接枝率，以调整CS-GA中多酚的接枝率在1％～50％之间。
实施例2
本实施例中，从蚕茧中提取丝素蛋白(SF)，步骤如下：
(1)将蚕茧剪碎剥开，按浴比1:100置入煮沸的0.5％碳酸氢钠水溶液中煮30min，重复该操作两次，然后用去离子水冲洗，在通风橱中风干。
(2)将步骤(1)所得干燥的脱丝胶蚕丝加入9.5mol/L的溴化锂溶液中，配置成10％(w/v)的溶液，在室温搅拌3～4天，将所得反应溶液用蒸馏水稀释后转入cut off MW＝8000～13000的透析袋中，用蒸馏水透析3天，冷冻干燥。
(3)将步骤(2)冷冻干燥所得产物以浴比1:10置于氯化钙-水-乙醇混合液(氯化钙、水与乙醇的摩尔比为1:8:2)中，在73℃下搅拌1h，将所得反应溶液用蒸馏水稀释后转入cut off MW＝8000～13000的透析袋中，用蒸馏水透析3天，冷冻干燥，得到可溶性SF。
本实施例制备的SF的傅里叶红外光谱图如图2所示，由图可知，本实施例制备的SF保留了天然的结构。
实施例3
本实施例中，制备兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵，步骤如下：
(1)将实施例1制备的CS-GA和实施例2制备的SF溶解于去离子水中形成混合溶液，该混合溶液中，CS-GA与SF的质量比为1:1，CS-GA与SF的浓度均为3wt.％。然后按照高碘酸钠与CS-GA的质量比为1:10的比例，向所述混合溶液中加入浓度为5mg/mL的高碘酸钠溶液，立即摇晃混合均匀得到反应液，用离心机离心去除反应液中的气泡，注入模具中，在室温静置至各组分充分交联，得到具有复合三维网络结构的水凝胶。
(2)将步骤(1)所得具有复合三维网络结构的水凝胶冷冻干燥，得到冻干海绵，记作记作C1S1W。
(3)将步骤(2)所得冻干海绵置于1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液(EDC与NHS的乙醇溶液)中浸泡12h，以使冻干海绵中的羧基与氨基反应形成酰胺键并使冻干海绵中的蛋白类材料变性形成β折叠，自然风干，即得兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵，记作C1S1。
该步骤中，EDC与NHS的乙醇溶液是将EDC和NHS溶解于无水乙醇中形成的，EDC与NHS的乙醇溶液中，EDC的浓度为1wt.％，NHS的浓度为1wt.％。
按照步骤(1)～(3)同样的操作，改变步骤(1)中CS-GA与SF的质量比为1:2，CS-GA与SF的混合溶液中，CS-GA的浓度为2wt.％、SF的浓度均为4wt.％，将制备得到的杂化纤维海绵记作C1S2。
按照步骤(1)～(3)同样的操作，改变步骤(1)中CS-GA与SF的质量比为2:1，CS-GA与SF的混合溶液中，CS-GA的浓度为4wt.％、SF的浓度均为2wt.％，将制备得到的杂化纤维海绵记作C2S1。
对本实施例制备的C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1进行喷金处理后置于扫描电子显微镜下扫描，结果如图3所示，由图可知，海绵都具有相互贯通的孔隙结构，该结构有利于实现液体的快速吸收，也有利于细胞的生长。
实施例4
本实施例中，测试实施例3制备的C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1的溶胀率。
将C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1称重，然后浸没于PBS缓冲液中，置于室温吸水溶胀，每隔一段时间取出称重，计算溶胀率：溶胀率＝(Wt-Wo)/Wo，其中，Wo为置于PBS缓冲液之前的海绵的重量，Wt为在PBS缓冲液中浸没一段时间后取出称重时的重量。
根据不同时间点的溶胀率，绘制溶胀曲线，结果如图4所示，由图可知，C1S1、C1S2和C2S1能在1min内完成快速吸水，达到最大溶胀的90％以上，且具有较好的平衡溶胀性能，有利于对血液、渗出液等的快速吸收。相对于C1S1W，经过EDC与NHS的乙醇溶的浸泡后处理得到的C1S1的快速吸水能力明显增强，说明浸泡后处理可有效改善海绵的快速吸水能力。
实施例5
本实施例中，测试实施例3制备的C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1的力学性能。
将C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1浸没于水中，达到溶胀平衡后，置于万能力学试验机上以加载力1N/s的速度压缩海绵，得到压缩应力-应变曲线，如图5所示，由图可知，C1S1具有良好的压缩性能，应变达到80％也没有破碎，而未经过EDC与NHS的乙醇溶液浸泡处理的C1S1W在应变不到80％时即发生了破碎。
将C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1浸没于水中，达到溶胀平衡后，置于万能力学试验机上以10μm/s的应变速度压缩至80％，以恒定的速率释放至0％，循环5次，结果如图6所示，由图可知，C1S1、C1S2和C2S1具有良好的形状回复性，经过多次压缩-回复也能保持完整的形状和适宜的力学性能，而未C1S1W的循环压缩曲线杂乱，说明其形状回复性较差。
将C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1用水浸湿，用动态力学测试仪(DMA)以2000μm/min的应变速率拉伸，结果如图7所示，由图可知，C1S1的拉伸模量约为60KPa，对使用过程中的拉伸有一定的抵抗能力，而C1S1W的拉伸模量约为30KPa，而C1S2和C2S1的拉伸模量较C1S1W也有不同程度的提升。
以上实验结果说明，经过EDC与NHS的乙醇溶液的浸泡后处理，可有效改善海绵的力学性能。
实施例6
本实施例中，测试实施例3制备的C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1的保水性能。
将C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1称重，然后浸没于PBS缓冲液中达到溶胀平衡，再次称重，然后置于温度20℃、相对湿度40％的环境中，每隔一段时间取出称重，计算保水率，保水率＝(Wt-Wo)/(Wp-Wo)×100％，其中，Wo为置于PBS缓冲液之前的海绵的重量，Wp为海绵达到溶胀平衡之后的重量，Wt为在温度20℃、相对湿度40％的环境中放置一段时间后取出称重时的重量。
根据不同时间点的保水率，绘制保水曲线，结果如图8所示，由图可知，C1S1和C2S1具有优秀的保水能力，在温度20℃、相对湿度40％的环境中经过20h仍未完全干燥，这一性质有利于缓解大面积皮肤损伤导致的失水。相对于C1S1W，经过EDC与NHS的乙醇溶液的浸泡后处理的C1S1、C1S2和C2S1的保水性能得到了不同程度的提升。
实施例7
本实施例中，测试实施例3制备的C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1的生物降解性能。
将C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1称重，浸没于含5U/mL链酶蛋白酶的PBS缓冲液中，放置在20℃的恒温条件下降解，每隔一段时间取出，冷冻干燥后称重，计算降解率，降解率＝(Wo-Wt)/Wo×100％，其中，Wo为置于含链酶蛋白酶的PBS缓冲液之前的海绵的重量，Wt为降解一段时间后取出冷冻干燥后的海绵的重量。
根据不同时间点的降解率，绘制海绵的降解曲线，结果如图9所示，由图可知，C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1均具有生物降解性能，可在酶的作用下生物降解，有利于组织的再生修复。经过EDC与NHS的乙醇溶液的浸泡后处理，可减缓海绵的降解速率。
实施例8
本实施例中，测试实施例3制备的C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1的水蒸气透过率。
在瓶口面积为S的小瓶中装入1mL去离子水，分别用C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1封住瓶口，称重，然后置于温度37℃、相对湿度40％的恒温恒湿箱中，放置24h后取出称重，计算水蒸气透过率，水蒸气透过率＝(Wo-Wt)/S/1day，其中，Wo为刚封住瓶口时的重量，Wt为在温度37℃、相对湿度40％的恒温恒湿箱中放置24h后的重量。以商品化的明胶海绵(Gel)和壳聚糖海绵作(CS)为产品对照组，以未封口组作为空白对照组(Black)。
各实验组中海绵的水蒸气透过率如图10所示，由图可知，C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1都具有适宜的透气性能，因有研究表明2000～2500g/m2/day的水蒸气透过率最有利于皮肤修复，说明本发明提供的兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵有利于伤口处的气体交换。
实施例9
本实施例中，测试实施例3制备的C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1的蛋白吸附能力。
将C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1称重，以质量体积比为5:1的比例浸泡在5mg/mL的牛血清蛋白(BSA)水溶液中，置于37℃下孵育2h，取BSA吸附后的液体，使用BCA试剂盒测量吸光度，与标准曲线对比，计算BSA吸附量Wr，则每毫克海绵吸附的BSA质量为Wr/Wo，其中Wo为海绵浸泡在BSA水溶液之前的重量。以商品化的明胶海绵(Gel)作为对照。结果如图11所示，C1S1、C1S2和C2S1比商品化的明胶海绵具有更强的蛋白吸附能力，这使得它们用作止血材料时，可快速提高局部凝血相关蛋白的富集，加速凝血，同时使得它们用作皮肤修复材料时，可促进细胞的黏附，加快伤口愈合；此外，该特性还有利于它们吸附生物活性物质，用于其他生物医学领域。而C1S1W与商品化的明胶海绵的蛋白吸附能力接近，说明经过EDC与NHS的乙醇溶液的浸泡后处理，可有效增加海绵的蛋白吸附能力，这主要是因为经过浸泡后处理形成的β折叠有增强对蛋白质的吸附作用。
实施例10
本实施例中，测试实施例3制备的C1S1的抑菌性能。
将复苏好的大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)分别与50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂固体培养基混合均匀，最终浓度为106CFU/mL，迅速铺在培养皿中，水平静置，待成胶后用直径8mm的穿孔器钻孔，将相同直径的C1S1复水后放在孔内，在细菌培养箱中培养16h后，观察并记录抑菌圈大小。以商品化的明胶海绵(Gel)和壳聚糖海绵(CS)作为对照。结果如图12所示，C1S1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有明显的抑制作用，但商品化的明胶海绵对以上两种细菌无抑制作用。
实施例11
本实施例中，测试实施例3制备的C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1的血液相容性。
将兔的抗凝全血以2040rpm的速率离心10min，得到富红细胞的血浆，用PBS缓冲液清洗三次，最后将富红细胞的血浆稀释至5％v/v。将C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1用组织破碎仪破碎均匀(加水)，浓度分别为15、12.5、10、7.5、5mg/mL，取0.3mL破碎后的材料液体加至等体积稀释富红细胞血浆中，在37℃下孵育1h，之后以10000rpm的速率离心10min，取上清液在540nm处测量吸光度，记作A，以0.1％的Triton X-100作为阳性对照(At)，PBS作为阴性对照(Ap)，计算溶血率，溶血率＝(A-Ap)/(At-Ap)×100％。
根据不同浓度的溶血率，绘制海绵的溶血曲线，如图13所示，C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1有着良好的血液相容性，溶血率低于1％，几乎不会对红细胞产生有害作用。经过EDC与NHS的乙醇溶液的浸泡后处理，基本不会改变海绵的血液相容性。
实施例12
本实施例中，测试实施例3制备的C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1的体外血细胞黏附和凝血性能。
将兔的抗凝全血以2040rpm的速率离心10min，分离上中两层，再以2350rpm离心10min，取得中间层的富血小板血浆(prp)。取20μL的PRP或者全血滴在海绵上，在37℃下孵育1h，之后用PBS缓冲液清洗三次。然后将海绵用戊二醛固定，经二氧化碳临界点干燥后用SEM观察。以商品化的明胶海绵(Gel)作为对照。
向5mL兔的抗凝全血中加入0.05mL浓度为0.1mol/L的氯化钙水溶液，混合均匀，取40μL血液滴于海绵上，在37℃下孵育1min，之后用10mL去离子水缓慢冲洗血块，洗液放置30min后在540nm处测量吸光度。以商品化的明胶海绵(Gel)作为对照。
结果如图14、15所示，C1S1对血小板和其他血细胞有强烈的黏附能力，具有优秀的凝血功能；与商品化明胶海绵相比，C1S1在1min内的凝血率增加了近70％。相对于C1S1W，经过EDC与NHS的乙醇溶液的浸泡后处理，海绵的血细胞吸附和凝血效果得到了一定程度的提升。
实施例13
本实施例中，测试实施例3制备的C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1的细胞相容性。
将C1S1W、C1S1、C1S2和C2S1紫外线灭菌，浸泡于无菌PBS缓冲液中过夜，将NIH-3T3细胞用胰酶消化，离心重悬至1.25×107cells/mL，以每块海绵2.5×105个细胞的密度，分别将细胞悬液滴加于海绵上，在培养箱中静置30min，之后补充培养基，置于培养箱中在37℃、5％的CO2的条件下培养，培养期间，每隔一天更换一次培养基。
所述培养基是在DMEM基础培养基的基础上加入青霉素和链霉素混合液和胎牛血清得到，DMEM培养基中青霉素和链霉素混合液的质量浓度为1％，胎牛血清的质量浓度为10％，青霉素和链霉素混合液由HyClone公司提供。
培养1天、3天和7天后取出海绵，使用CCK-8测试其中细胞增殖的情况，结果如图16所示。培养1天、3天后，取出海绵，用PBS缓冲液清洗2遍，将清洗后的海绵浸没于含有FDA和PI的PBS溶液中染色1min，通过激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察细胞的生长状态和分布情况，结果如图17所示。
由图16、17可知，NIH-3T3细胞在C1S1中生长情况良好，在C1S1中的增殖情况比其他组更好，NIH-3T3细胞紧密贴附于C1S1的孔隙生长，增殖情况明显，说明C1S1的细胞相容性良好。而NIH-3T3细胞在C1S1W中的增殖较慢，且出现了团聚生长的现象，铺展状况不好。说明经过EDC与NHS的乙醇溶液的浸泡后处理，可促进细胞在海绵上的铺展和增殖。
实施例14
本实施例中，测试实施例3制备的C1S1作为止血材料的应用效果。
将7～8周龄的KM小鼠用水合氯醛麻醉后，在鼠尾1/2处剪断，自然流血15s后，将紫外灭菌后的C1S1轻轻压在断口处止血，记录出血量和出血时间。
将7～8周龄的KM小鼠用水合氯醛麻醉后，用手术剪刀暴露老鼠腹腔，轻轻找出肝脏，用纱布轻轻擦拭肝脏表面液体，用手术剪刀沿肝脏边缘剪出3～4mm的伤口，将紫外灭菌后的C1S1轻轻放在伤口上，记录出血量和出血时间。
将新西兰兔用戊巴比妥钠麻醉后，用手术剪刀暴露腹腔，轻轻找出肝脏，用纱布轻轻擦拭肝脏表面液体，用直径为6mm的活检穿孔器造圆柱形缺损，厚度为3mm，立即将直径为8mm的紫外灭菌后的C1S1压缩体积放入缺损处止血，记录出血量和出血时间。
以上实验，同时设置未处理组(Black)、商品化的明胶海绵组(Gel)和商品化的壳聚糖海绵组(CS)作为对照。止血实验结果如图18所示，其中的(A1)(A2)(A1)图分别为KM小鼠尾部止血部位、出血时间和出血量图，(B1)(B2)(B3)图分别为KM小鼠肝脏止血部位、出血量和出血时间图，(C1)(C2)(C3)图分别为新西兰兔的止血部位、出血量和出血时间图。由图可知，在三种出血模型中，C1S1都能快速有效的止血，且止血效果明显优于商品化的明胶海绵和壳聚糖海绵，尤其是在不可压迫的肝脏缺损出血模型(新西兰兔)中，C1S1的出血量仅为商品化明胶海绵的49％、为商品化壳聚糖海绵的27％，表现出强力的止血效果。
实施例15
本实施例中，测试实施例3制备的C1S1作为皮肤修复材料的应用效果。将7～8周龄的KM小鼠用水合氯醛麻醉，背部备毛干净。用穿孔器在小鼠背部造直径6mm的全层皮肤缺损，之后将内径为8mm，外径15mm的硅胶圆环缝在伤口周围以避免伤口收缩。将紫外灭菌后的直径为8mm，厚度为2mm的C1S1放置在硅胶圆环的中间，然后上面贴一层3M透明敷料，再用弹力绷带绕腰腹部一圈固定。同时设置未处理组(Black)、商品化的明胶海绵组(Gel)和商品化的壳聚糖海绵组(CS)作为对照。分别在术后7天、14天和21天处死小鼠，记录皮肤伤口大体观和面积，并计算伤口修复率，结果如图19所示。将伤口修复处连同周围的皮肤一起取下，用4％的多聚甲醛溶液固定，之后进行石蜡切片和HE染色，结果如图20所示。
由图19可知，C1S1能加速伤口的愈合，减少疤痕的产生，由图20可知，对于以C1S1作为修复材料的实验组，在术后第14天观察到了明显的血管再生情况，在术后第21天，观察到了明显的毛囊再生，说明C1S1可有效促进血管和毛囊的再生，具有良好的皮肤修复功能。

Claims (10)

1.一种兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵，其特征在于，该杂化纤维海绵是由多酚改性壳聚糖与蛋白类材料交联形成的具有复合三维网络结构的水凝胶在冷冻干燥后形成的冻干海绵经1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液浸泡后处理形成的，该杂化纤维海绵具有多孔结构；
所述具有复合三维网络结构的水凝胶由多酚改性壳聚糖氧化自交联以及多酚改性壳聚糖与蛋白类材料通过迈克加成反应形成；冻干海绵在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液中的浸泡过程中，冻干海绵中的羧基与氨基应形成了酰胺键，同时冻干海绵中的蛋白类材料变性形成了β折叠。
2.根据权利要求1所述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵，其特征在于，所述复合三维网络水凝胶是按照多酚改性壳聚糖与蛋白类材料的质量比为(0.1～10):1的比例，由多酚改性壳聚糖与蛋白类材料在氧化剂存在的条件下反应形成的。
3.根据权利要求1所述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵，其特征在于，所述多酚改性壳聚糖是将多酚接枝在壳聚糖或羧甲基壳聚糖的氨基上形成的，多酚改性的壳聚糖中，多酚的接枝率为1％～50％。
4.根据权利要求3所述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵，其特征在于，用于改性壳聚糖或羧甲基壳聚糖的多酚包括没食子酸、儿茶酚、花青素、白藜芦醇中的任意一种或几种。
5.根据权利要求1至3中任一权利要求所述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵，其特征在于，所述蛋白类材料包括丝素蛋白、明胶、胶原、弹性蛋白、多肽中的任意一种或几种。
6.权利要求1至5中任一权利要求所述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将多酚改性壳聚糖和蛋白类材料溶解形成混合液，然后加入高碘酸钠溶液，充分混合得到反应液，去除反应液中的气泡，转移至模具中，在室温静置至各组分充分交联，得到具有复合三维网络结构的水凝胶；
(2)将步骤(1)所得具有复合三维网络结构的水凝胶冷冻干燥，得到冻干海绵；
(3)将步骤(2)所得冻干海绵置于1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液中充分浸泡，以使冻干海绵中的羧基与氨基反应形成酰胺键并使冻干海绵中的蛋白类材料变性形成β折叠，干燥，即得兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵。
7.根据权利要求6所述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将多酚改性壳聚糖和蛋白类材料溶解形成的混合液中，多酚改性壳聚糖的浓度为1wt.％～20wt.％，蛋白类材料的浓度为1wt.％～20wt.％。
8.根据权利要求6或7所述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，高碘酸钠溶液的加入量应使高碘酸钠与多酚改性壳聚糖的质量比为1:(10～30)，高碘酸钠的浓度为2～10mg/mL。
9.根据权利要求6或7所述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液是将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶解于无水乙醇中形成的，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的浓度为0.1wt.％～10wt.％，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.1wt.％～10wt.％。
10.根据权利要求9所述兼具止血和创面修复的杂化纤维海绵的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的浸泡时间为10～12h。
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