CN114917400B - 一种聚赖氨酸抗菌组织粘合剂及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医用高分子材料和医疗器械领域，具体涉及一种聚赖氨酸抗菌组织粘合剂及应用。本发明以具有良好抗菌性能的阳离子聚合物为材料，基于模拟皮肤组织中蛋白多糖网络和胶原蛋白纤维网络出发，利用戊二醛交联功能化的壳聚糖和ε‑聚赖氨酸，构建拥有优异粘附性能和抗菌性能的仿生水凝胶支架用作皮肤组织粘合剂。同时，引入硅酸镁锂，其释放的金属离子与苯酚基团作用，构建了双交联网络，并显著增强了水凝胶的粘附性能和抗菌性能。本发明所述水凝胶组织粘合剂，具有优异的组织粘附性、抗菌性和止血性能，可以快速闭合伤口，反应条件温和，有着良好的应用前景。

Description

一种聚赖氨酸抗菌组织粘合剂及应用
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料和医疗器械领域，具体涉及一种聚赖氨酸抗菌组织粘合剂及应用。
背景技术
皮肤是身体的第一道保护屏障，面临着各种各样的外部危害，每年有数百万的意外创伤或外科手术造成的皮肤伤口需要治疗。目前，对于手术伤口、组织损伤主要的封闭方式还是传统的针线缝合，其作用于伤口闭合时，会对组织造成额外的伤害，可能引发炎症且需要较长修复时间。新兴的临床替代品，组织粘合剂的出现很大程度上弥补了传统缝合技术的不足，比如操作应用简单、节省时间；使用不受限于伤口的形状；随着伤口的愈合，组织粘合剂会逐渐降解，不会留下明显的疤痕。
同时，在伤口治疗过程中，常常会受到细菌污染，从而引发炎症可能会导致伤口的感染，危及生命。壳聚糖(CS)是具有生物相容性、生物降解性、无毒、抗菌的天然阳离子聚合物。CS上有大量带正电的氨基，展示出优异的抗菌活性。ε-聚赖氨酸(ε-PL)是一种天然的生物代谢产物，其支链上带有大量氨基，具有很好的杀菌能力。此外，研究发现ε-PL与其他天然抑菌剂配合使用，有明显的协同增强效果，显著提高其抑菌能力。
市面上在售的组织粘合剂如纤维蛋白胶和氰基丙烯酸酯胶，要么在潮湿的生理环境中表现出较差的粘附能力，要么不具备生物活性并形成坚硬的外层，使界面硬化并限制皮肤组织拉伸。
鉴于此，基于模拟皮肤组织中蛋白多糖网络和胶原蛋白纤维网络出发，开发一种兼具优异粘附性能和抗菌性能的水凝胶用作皮肤组织粘合剂，在皮肤创伤处能快速闭合伤口、与湿组织牢固粘附、承受动态机械运动、抑菌防止伤口感染并促进组织再生，具有重要的临床意义。
发明内容
针对上述现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种聚赖氨酸抗菌组织粘合剂及应用，本发明通过希夫碱反应与金属离子螯合，制备了一种仿生水凝胶作为组织粘合剂，该水凝胶组织粘合剂兼具优异的抗菌性能和粘附性能，反应条件温和，成型迅速，可以应用于皮肤伤口愈合。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种聚赖氨酸抗菌组织粘合剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将壳聚糖加入到去离子水中，加入盐酸溶液搅拌溶解，得到壳聚糖溶液；然后将酚酸类化合物溶于去离子水中，依次加入EDC、NHS，搅拌活化10～90min后滴入壳聚糖溶液中，置于氮气保护下搅拌反应12～24h，透析纯化3～5天，冷冻干燥后得到功能化的壳聚糖聚合物。
(2)将聚赖氨酸溶解在去离子水中，得到聚赖氨酸溶液；按照步骤(1)所述制备酚酸类化合物与EDC、NHS混合液并滴入聚赖氨酸溶液中，置于氮气保护下搅拌反应12～24h，透析纯化3～5天，冷冻干燥后得到功能化的聚赖氨酸聚合物。
(3)将步骤(1)中所述的功能化壳聚糖聚合物与步骤(2)中所述功能化聚赖氨酸聚合物分别溶解于PBS溶液中；在模具中依次加入功能化壳聚糖溶液、功能化聚赖氨酸溶液、硅酸镁锂，超声混合均匀后，加入戊二醛振荡混合均匀，即得聚赖氨酸抗菌组织粘合剂。
优选的，步骤(1)中所述壳聚糖、酚酸类化合物、EDC、NHS摩尔比设定为1∶(0.5～2)∶(0.5～2)∶(0.5～2)。
优选的，步骤(1)中酚酸类化合物包括但不限于3，4，5-三羟基苯甲酸、3，4-二羟基肉桂酸、3，4-二羟基苯乙酸酸、3-甲氧基-4-羟基肉桂酸、2-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸，酚酸类化合物溶解温度为30-60℃。
优选的，步骤(2)中所述聚赖氨酸、酚酸类化合物、EDC、NHS摩尔比设定为1∶(0.5～2)∶(0.5～2)∶(0.5～2)。
优选的，步骤(3)中所述功能化壳聚糖溶液的质量浓度为1～3％(w/v)，功能化聚赖氨酸溶液的质量浓度为5～15％(w/v)，硅酸镁锂的含量为0.2～1％(w/v)。
优选的，步骤(3)中所述壳聚糖和聚赖氨酸中氨基与戊二醛中醛基的摩尔比为1∶0.2～1。
所述制备方法的反应方程式为
Figure SMS_1
本发明还提供由上述方法制得的聚赖氨酸抗菌组织粘合剂。
本发明还提供由上述方法制得的聚赖氨酸抗菌组织粘合剂在医疗器械、组织工程材料领域中的应用。
所述应用包括：医用组织工程敷料、组织粘合剂、止血剂。
本发明的有益效果在于：
本发明以安全无毒、具有良好抗菌和止血效果的阳离子聚合物壳聚糖和聚赖氨酸为基材，利用酚酸类化合物制备苯酚功能化的壳聚糖与聚赖氨酸，以戊二醛与硅酸镁锂作为交联剂，通过希夫碱反应与金属离子螯合制备了一种具有优异粘附性能和抗菌性能的仿生水凝胶作为组织粘合剂。
本发明能够在皮肤伤口愈合过程中能与潮湿组织牢固粘附并承受动态机械运动，有效抑菌防止伤口感染、促进组织再生，在医用敷料、组织粘合剂领域具有广阔的临床应用前景。
附图说明
图1是本发明中所得组织粘合剂的内部微观结构图。
图2是本发明中所得组织粘合剂的体外降解示意图。
图3是本发明中所得组织粘合剂的流变学测试结果。
图4是本发明中所得组织粘合剂对不同组织器官粘合示意图。
图5是本发明中实施例1～4制得组织粘合剂的抗菌性能测试结果。
图6是本发明中实施例1～3制得组织粘合剂的粘附性能测试结果。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详述的本发明。
实施例1
(1)将1g壳聚糖加入500mL去离子水中，并加入2mL的盐酸(1mol/L)，搅拌均匀充分溶解。然后用2mol/L的氢氧化钠溶液将反应液调至pH＝5，备用。将3，4，5-三羟基苯甲酸溶于100mL去离子水中，置于50℃水浴下搅拌至充分溶解，然后加入EDC和NHS，室温下搅拌活化10min。将活化完成的3，4，5-三羟基苯甲酸混合液逐滴加入到壳聚糖溶液中，室温下搅拌反应24h；各物质的摩尔比如下，壳聚糖：3，4，5-三羟基苯甲酸：EDC∶NHS＝1∶0.5∶0.5∶0.5。反应结束后将反应物置于透析袋中，在盐酸溶液(pH＝5.5)中透析3天，冷冻干燥后得到邻苯三酚修饰的壳聚糖样品(CS-GA)。
(2)将10g聚赖氨酸加入100mL去离子水中，搅拌均匀充分溶解，备用。按照上述实验制备3，4，5-三羟基苯甲酸混合液，将活化完成的3，4，5-三羟基苯甲酸混合液逐滴加入到聚赖氨酸溶液中，用2mol/L的氢氧化钠溶液将反应液调至pH＝5.5，室温下搅拌反应24h；各物质的摩尔比如下，聚赖氨酸∶3，4，5-三羟基苯甲酸∶EDC∶NHS＝1∶0.5∶0.5∶0.5。反应结束后将反应物置于透析袋中，在去离子水中透析3天，冷冻干燥后得到邻苯三酚修饰的聚赖氨酸样品(PL-GA)。
(3)将步骤(1)所述CS-GA和步骤(2)所述PL-GA分别溶解于PBS溶液(pH＝7.2)中，制得1％(w/v)的CS-GA聚合物溶液和10％(w/v)的PL-GA聚合物溶液，将聚合物溶液各500μL与0.002g硅酸镁锂加入模具中，超声1h混合均匀备用。设定CS和PL上-NH2与戊二醛上-CHO的摩尔比为1∶0.5配置戊二醛溶液。将配置完成的戊二醛溶液加入聚合物溶液中，振荡混合均匀后，即得所述抗菌仿生型组织粘合剂。将制备的组织粘合剂切断、镀金后使用扫描电子显微镜进行微观形貌表征，结果如图1所示。
实施例2
(1)将1g壳聚糖加入500mL去离子水中，并加入2mL的盐酸(1mol/L)，搅拌均匀充分溶解。然后用2mol/L的氢氧化钠溶液将反应液调至pH＝6，备用。将3，4，5-三羟基苯甲酸溶于100mL去离子水中，置于50℃水浴下搅拌至充分溶解，然后加入EDC和NHS，室温下搅拌活化20min。将活化完成的3，4，5-三羟基苯甲酸混合液逐滴加入到壳聚糖溶液中，室温下搅拌反应24h；各物质的摩尔比如下，壳聚糖∶3，4，5-三羟基苯甲酸∶EDC∶NHS＝1∶1∶1∶1。反应结束后将反应物置于透析袋中，在盐酸溶液(pH＝5.5)中透析3天，冷冻干燥后得到邻苯三酚修饰的壳聚糖样品(CS-GA)。
(2)将10g聚赖氨酸加入100mL去离子水中，搅拌均匀充分溶解，备用。按照上述实验制备3，4，5-三羟基苯甲酸混合液，将活化完成的3，4，5-三羟基苯甲酸混合液逐滴加入到聚赖氨酸溶液中，用1mol/L的氢氧化钠溶液将反应液调至pH＝5.5，室温下搅拌反应12h；各物质的摩尔比如下，聚赖氨酸∶3，4，5-三羟基苯甲酸∶EDC∶NHS＝1∶1∶1∶1。反应结束后将反应物置于透析袋中，在去离子水中透析3天，冷冻干燥后得到邻苯三酚修饰的聚赖氨酸样品(PL-GA)。
(3)将步骤(1)所述CS-GA和步骤(2)所述PL-GA分别溶解于PBS溶液(pH＝7.2)中，制得2％(w/v)的CS-GA聚合物溶液和10％(w/v)的PL-GA聚合物溶液，将聚合物溶液各500μL与0.005g硅酸镁锂加入模具中，超声1h混合均匀备用。设定CS和PL上-NH2与戊二醛上-CHO的摩尔比为1∶0.5配置戊二醛溶液。将配置完成的戊二醛溶液加入聚合物溶液中，振荡混合均匀后，即得所述抗菌仿生型组织粘合剂。将所制备组织粘合剂置于37℃的生理盐水中进行体外降解评价，结果如图2所示。
实施例3
(1)将1g壳聚糖加入500mL去离子水中，并加入2mL的盐酸(1mol/L)，搅拌均匀充分溶解。然后用2mol/L的氢氧化钠溶液将反应液调至pH＝6，备用。将3，4，5-三羟基苯甲酸溶于100mL去离子水中，置于50℃水浴下搅拌至充分溶解，然后加入EDC和NHS，室温下搅拌活化30min。将活化完成的3，4，5-三羟基苯甲酸混合液逐滴加入到壳聚糖溶液中，室温下搅拌反应18h；各物质的摩尔比如下，壳聚糖∶3，4，5-三羟基苯甲酸∶EDC∶NHS＝1∶1∶1∶1。反应结束后将反应物置于透析袋中，在盐酸溶液(pH＝5.5)中透析3天，冷冻干燥后得到邻苯三酚修饰的壳聚糖样品(CS-GA)。
(2)将10g聚赖氨酸加入100mL去离子水中，搅拌均匀充分溶解，备用。按照上述实验制备3，4，5-三羟基苯甲酸混合液，将活化完成的3，4，5-三羟基苯甲酸混合液逐滴加入到聚赖氨酸溶液中，用1mol/L的氢氧化钠溶液将反应液调至pH＝6，室温下搅拌反应18h；各物质的摩尔比如下，聚赖氨酸∶3，4，5-三羟基苯甲酸∶EDC∶NHS＝1∶1∶1∶1。反应结束后将反应物置于透析袋中，在去离子水中透析3天，冷冻干燥后得到邻苯三酚修饰的聚赖氨酸样品(PL-GA)。
(3)将步骤(1)所述CS-GA和步骤(2)所述PL-GA分别溶解于PBS溶液(pH＝7.2)中，制得2％(w/v)的CS-GA聚合物溶液和15％(w/v)的PL-GA聚合物溶液，将聚合物溶液各500μL与0.005g硅酸镁锂加入模具中，超声1h混合均匀备用。设定CS和PL上-NH2与戊二醛上-CHO的摩尔比为1∶0.75配置戊二醛溶液。将配置完成的戊二醛溶液加入聚合物溶液中，振荡混合均匀后，即得所述抗菌仿生型组织粘合剂。将所制备组织粘合剂置于流变仪帕尔贴平板中央进行应力扫描测试，结果如图3所示。
实施例4
(1)将1g壳聚糖加入500mL去离子水中，并加入2mL的盐酸(1mol/L)，搅拌均匀充分溶解。然后用2mol/L的氢氧化钠溶液将反应液调至pH＝5.5，备用。将3，4，5-三羟基苯甲酸溶于100mL去离子水中，置于50℃水浴下搅拌至充分溶解，然后加入EDC和NHS，室温下搅拌活化30min。将活化完成的3，4，5-三羟基苯甲酸混合液逐滴加入到壳聚糖溶液中，室温下搅拌反应24h；各物质的摩尔比如下，壳聚糖∶3，4，5-三羟基苯甲酸∶EDC∶NHS＝1∶1.5∶1.5∶1.5。反应结束后将反应物置于透析袋中，在盐酸溶液(pH＝5.5)中透析3天，冷冻干燥后得到邻苯三酚修饰的壳聚糖样品(CS-GA)。
(2)将10g聚赖氨酸加入100mL去离子水中，搅拌均匀充分溶解，备用。按照上述实验制备3，4，5-三羟基苯甲酸混合液，将活化完成的3，4，5-三羟基苯甲酸混合液逐滴加入到聚赖氨酸溶液中，用1mol/L的氢氧化钠溶液将反应液调至pH＝5.5，室温下搅拌反应24h；各物质的摩尔比如下，聚赖氨酸∶3，4，5-三羟基苯甲酸∶EDC∶NHS＝1∶1.5∶1.5∶1.5。反应结束后将反应物置于透析袋中，在去离子水中透析3天，冷冻干燥后得到邻苯三酚修饰的聚赖氨酸样品(PL-GA)。
(3)将步骤(1)所述CS-GA和步骤(2)所述PL-GA分别溶解于PBS溶液(pH＝7.2)中，制得2％(w/v)的CS-GA聚合物溶液和15％(w/v)的PL-GA聚合物溶液，将聚合物溶液各500μL与0.01g硅酸镁锂加入模具中，超声1h混合均匀备用。设定CS和PL上-NH2与戊二醛上-CHO的摩尔比为1∶0.75配置戊二醛溶液。将配置完成的戊二醛溶液加入聚合物溶液中，振荡混合均匀后，即得所述抗菌仿生型组织粘合剂。将所制备组织粘合剂与不同湿组织器官进行粘合，结果如图4所示。
实施例5：粘附性能评价实验
对皮肤组织的粘附性能是组织粘合剂最为重要的性能之一。因猪皮组织与人体皮肤组织的构造类似，为测试实施例1-3所述组织粘合剂在湿润和动态环境下对皮肤组织的粘附能力，我们选用新鲜猪皮来模拟人体皮肤进行粘附性能测试，结果如图6所示。
实施例6：抗菌性能评价实验
采用抑菌圈法评估组织粘合剂的抗菌性能。将实施例1-4所述组织粘合剂样品，放置在涂有大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的固体培养基上，24h后观察产生的抑菌圈的大小，结果如图5所示。
实施例8～11
按照实施例1的方法制备抗菌仿生型组织粘合剂，不同在于分别选用其他酚酸类化合物修饰壳聚糖与聚赖氨酸，如3，4-二羟基肉桂酸、3，4-二羟基苯乙酸酸、3-甲氧基-4-羟基肉桂酸、2-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸。
实施例12～15
按照实施例2的方法制备抗菌仿生型组织粘合剂，不同在于分别选用其他酚酸类化合物修饰壳聚糖与聚赖氨酸，如3，4-二羟基肉桂酸、3，4-二羟基苯乙酸酸、3-甲氧基-4-羟基肉桂酸、2-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸。
实施例16～19
按照实施例3的方法制备抗菌仿生型组织粘合剂，不同在于分别选用其他酚酸类化合物修饰壳聚糖与聚赖氨酸，如3，4-二羟基肉桂酸、3，4-二羟基苯乙酸酸、3-甲氧基-4-羟基肉桂酸、2-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸。
实施例20～23
按照实施例4的方法制备抗菌仿生型组织粘合剂，不同在于分别选用其他酚酸类化合物修饰壳聚糖与聚赖氨酸，如3，4-二羟基肉桂酸、3，4-二羟基苯乙酸酸、3-甲氧基-4-羟基肉桂酸、2-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸。
在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种聚赖氨酸抗菌组织粘合剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将壳聚糖加入到去离子水中，加入盐酸溶液搅拌溶解，得到壳聚糖溶液；然后将酚酸类化合物溶于去离子水中，依次加入EDC、NHS，搅拌活化10～90min后滴入壳聚糖溶液中，置于氮气保护下搅拌反应12～24h，透析纯化3～5天，冷冻干燥后得到功能化壳聚糖聚合物；
(2)将聚赖氨酸溶解在去离子水中，得到聚赖氨酸溶液；按照步骤(1)所述制备酚酸类化合物与EDC、NHS混合液并滴入聚赖氨酸溶液中，置于氮气保护下搅拌反应12～24h，透析纯化3～5天，冷冻干燥后得到功能化聚赖氨酸聚合物；
(3)将步骤(1)中所述的功能化壳聚糖聚合物与步骤(2)中所述功能化聚赖氨酸聚合物分别溶解于PBS溶液中；在模具中依次加入功能化壳聚糖溶液、功能化聚赖氨酸溶液、硅酸镁锂，超声混合均匀后，加入戊二醛振荡混合均匀，即得聚赖氨酸抗菌组织粘合剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述壳聚糖、酚酸类化合物、EDC、NHS摩尔比设定为1∶(0.5～2)∶(0.5～2)∶(0.5～2)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中酚酸类化合物包括3，4，5-三羟基苯甲酸、3，4-二羟基肉桂酸、3，4-二羟基苯乙酸、3-甲氧基-4-羟基肉桂酸、2-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸，酚酸类化合物溶解温度为30-60℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述聚赖氨酸、酚酸类化合物、EDC、NHS摩尔比设定为1∶(0.5～2)∶(0.5～2)∶(0.5～2)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述功能化壳聚糖溶液的质量浓度为1～3％w/v，功能化聚赖氨酸溶液的质量浓度为5～15％w/v，硅酸镁锂的含量为0.2～1％w/v。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述功能化壳聚糖聚合物和功能化聚赖氨酸聚合物中氨基与戊二醛中醛基的摩尔比为1∶0.2～1。
7.权利要求1-6所述任一项制备方法制得的聚赖氨酸抗菌组织粘合剂。
8.权利要求1-6所述任一项制备方法制得的聚赖氨酸抗菌组织粘合剂在医疗器械、组织工程材料领域中的应用。
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