CN112007201A - 一种可粘附抗菌止血海绵及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可粘附抗菌止血海绵及其制备方法。该止血海绵由N‑马来酰化壳聚糖、丙烯酰胺、ε‑聚赖氨酸、丙烯酸酯PEG‑N羟基琥珀酰亚胺酯、N,N'‑亚甲基双丙烯酰胺充分反应，加入丙烯酸和第一部分光引发剂，经预聚合后，加入丙烯酸N‑羟基琥珀酰亚胺酯和第二部分光引发剂的混合液，充分聚合后，程序冻干制得。本发明制备的止血海绵不但可快速吸收血液或渗透液，形成凝胶，对腔体表面损伤血管形成压迫，促进止血，而且可粘附腔体表面，在进一步促进止血的同时，防止位移。本发明所述止血海绵可缓慢释放壳聚糖和ε‑聚赖氨酸，具有长效抗菌功能。故本止血海绵具有快速高效止血、可粘附和抗菌的功效。

Description

一种可粘附抗菌止血海绵及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，涉及一种可粘附抗菌止血海绵及其制备方法。本申请的医用止血海绵具有可膨胀快速止血的同时，起到可粘附、防止位移、抗菌的功效。
背景技术
在突发性事故的急救、手术以及在战争中，50%的死亡是因大量出血导致。一些传统的止血材料，例如止血纱布、止血绷带、止血棉纱等，他们的止血能力有限，止血效果并不十分理想。因此，开发出高效而且快速可吸收的止血材料及产品，在出血发生后的1-2分钟，甚至更短的时间内，有效地快速止血，这成为止血材料研发的主要目标之一。止血海绵是一种用于在进行外科手术时对伤口进行止血的材料，当将止血海绵贴敷到血管破损处时，其中亲水性高分子材料会与血小板发生粘着和凝聚作用，然后形成血小板血栓，继而凝成纤维蛋白栓塞来堵住血管破损处，从而达到止血作用。
在伤口修复过程，防止愈合过程中感染已经成为很重要的方面。壳聚糖能够增加细菌细胞外膜和内膜的渗透性，且其质子化的氨基可破坏细菌细胞膜的结构和功能，进而使细胞膜的完整性遭到破坏，从而抑制细菌活性。虽然壳聚糖止血海绵有一定的抗菌活性，但存在机械性能差，止血效果有限，且术后抗感染性能较差，无法对伤口形成强有力粘附的缺点。
例如在申请号为201910709760.2的发明专利中，公开了一种高吸水抗菌止血海绵及其制备方法。该海绵以醋酸水溶液、壳聚糖、KH560、多巴胺盐酸盐、CaCl2溶液为原料。具体制备方法为：(1)配置一定浓度的壳聚糖醋酸水溶液，加入相应比例的KH560和多巴胺盐酸盐；(2)将所得的聚合物溶液预冷，将所得冰晶冷冻干燥；(3)配置一定浓度的CaCl2溶液，将冻干后的海绵在CaCl2溶液中浸泡，之后再次冷冻干燥；(4)将冻干后的海绵用水和丙酮溶液清洗，真空干燥，再用PBS缓冲液反复冲洗，采用钴60照射消毒，将消毒后的海绵进行切割，包装，放入37℃的干燥箱中备用。最终制得的海绵较纯壳聚糖止血海绵，利用KH560和多巴胺盐酸盐的自聚合，对壳聚糖网络形成了物理及化学交联，从而增强了止血海绵的机械性能，但该止血海绵仍然存在抑菌成分单一，对组织粘附力偏差，机械性能仍不够强，且有机试剂残留量偏多，影响生物相容性的问题。
申请号为201210033793.8的发明专利中，公开了一种具有凝血酶固定化作用的壳聚糖基止血海绵，其由具有凝血酶固定化作用的壳聚糖基和止血剂制成的多孔状海绵。此发明提供的壳聚糖基止血海绵，制备方法是：用壳聚糖或羧甲基壳聚糖固定凝血酶，并加入其他止血剂、冻干保护剂、交联剂制成多孔状止血海绵，其中壳聚糖或羧甲基壳聚糖与凝血酶的重量比例为100∶0.1～20，然后经预冻、真空冷冻干燥、倒模、切割、封装，灭菌即得。此发明通过壳聚糖或羧甲基壳聚糖对凝血酶进行固定化，提高了凝血酶的稳定性和凝血活性，制得的壳聚糖基止血海绵的性质更加稳定，凝血愈创效果显著增强。但该壳聚糖基止血海绵仍然存在机械强度低、粘附性能差、易位移的缺点。
综上所述，临床上急需一种生物相容性好、不易位移、强度高、膨胀率高、具有长效高效抑菌功能的止血海绵。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物相容性好、不易位移、强度高、膨胀率高、具有长效高效抑菌功能的止血海绵。
一种可粘附抗菌止血海绵，所述止血海绵由N-马来酰化壳聚糖、丙烯酰胺、ε-聚赖氨酸、丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯和N, N'-亚甲基双丙烯酰胺充分反应，加入丙烯酸和第一部分光引发剂，在紫外灯下预聚合后，加入丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和第二部分光引发剂的混合液，在紫外灯下二次聚合后，经程序冻干、灭菌制得。
进一步的，所述N-马来酰化壳聚糖重量百分比为1.5-2.5%，优选为1.75-2.25%。丙烯酰胺重量百分比为20-30%，优先为22.5-27.5%。丙烯酸重量百分比为10-15%，优选为12-13%。ε-聚赖氨酸重量百分比为0.02-0.8%，优选为0.04-0.06%。丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯重量百分比为2-6%，优选为3-5%。N, N'-亚甲基双丙烯酰胺重量百分比为0.01-0.02%。第一部分光引发剂重量百分比为0.9-1.5%。丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯重量百分比为0.4-0.8%，优先为0.5-0.7%。第二部分光引发剂重量百分比为0.002-0.006%。
所述N-马来酰化壳聚糖的分子量为20-200KDa，优选为20-80KDa。马来酰化取代度为20-40%，优先为25-35%。
所述丙烯酰胺与丙烯酸的重量比为12 : 4-9，优先为:2:1。
所述第一部分光引发剂和第二部分光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮。
所述预聚所用紫外灯功率为150W，波长为365nm，照射时间为20-40min，优先为30min。
所述二次聚合所用紫外灯功率为150W，波长为365nm，照射时间为10-20min，优先为15min。
所述ε-聚赖氨酸分子量为3600-4300Da。
所述丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯分子量为1-10KDa，例如1KDa、2 KDa、3.4KDa、5KDa和10KDa，优选为2-5KDa。
本发明还提供了可粘附抗菌止血海绵的制备方法包括以下步骤：
（1）交联反应：将N-马来酰化壳聚糖、丙烯酰胺、ε-聚赖氨酸、丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯、N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，得经交联反应后的混合液。
（2）预聚反应：将步骤（1）中得到的混合液，加入丙烯酸和第一部分光引发剂，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于紫外灯下预聚，得凝胶预聚体。
（3）二次聚合反应：向步骤（2）中得到的凝胶预聚体中加入丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和第二部分光引发剂的混合液，使混合液均匀分散到凝胶预聚体表面，在紫外灯下二次聚合，得凝胶产物。
（4）冻干：将步骤（3）中得到的凝胶状产物置于模具中，置入冻干机中，经预冻和程序升华干燥后得到未灭菌可粘附抗菌止血海绵。
（5）灭菌：将步骤（4）中得到的未灭菌可粘附抗菌止血海绵，经包装、15-25K电子束辐照灭菌，得可粘附抗菌止血海绵成品
所述的一种可粘附抗菌止血海绵的制备方法步骤（3）中所述使混合液均匀分散到凝胶预聚体表面的方法为雾化喷涂。
所述的一种可粘附抗菌止血海绵的制备方法步骤（4）中所述预冻和程序冻干的方法为：-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。
本发明所使用的组分均可以是商购产品，其结构和组成也是本领域技术人员所知晓的。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
1.本发明的N-马来酰化壳聚糖、丙烯酰胺和ε-聚赖氨酸上的氨基可与丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯发生亲核取代反应，而丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯中的双键又可与N-马来酰化壳聚糖、丙烯酰胺、丙烯酸、N, N'-亚甲基双丙烯酰胺在光引发剂下发生自由基聚合反应，从而形成多维度和高混度的化学交联方式，保证了止血海绵溶胀后的机械强度。
2.本发明利用链段较长的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯和链段较短的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺共同作为交联剂，将N-马来酰化壳聚糖、丙烯酰胺、丙烯酸和ε-聚赖氨酸交联起来的同时，为交联网络留足了溶胀空间，在保证止血海绵溶胀后机械强度的同时，又保证了止血海绵的溶胀度。
3.本发明利用二次聚合的方法，将丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯通过自由基聚合的方式交联到止血海绵表面，使止血海绵在吸收组织液和血液的同时，可充分粘附的组织表面，以免发生位移，影响止血效果。
4.本发明将壳聚糖和ε-聚赖氨酸通过化学键交联到止血海绵整个网络体系中，随着止血海绵在伤口处的降解，可缓慢释放壳聚糖和ε-聚赖氨酸，不但起到了长效抑菌的作用，而且可避免单纯壳聚糖抑菌成分单一，抑菌效果差的问题。
5.本发明利用特定的程序冻干、灭菌和保存工艺，在保证止血海绵无菌提供的同时，还可保证止血海绵高效粘附功能。
附图说明
附图1是实施例1所述止血海绵降解曲线图。
附图2是止血海绵止血机理图。
具体实施方式
以下结合实施例和比较例对本发明的技术方案作进一步的详细说明。但本发明不受这些具体实施例的限制。实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。本发明中对止血海绵的检测采用以下检测方法：
（1）表面粘附力测试
将大鼠背部皮肤切开一个1cm×1cm的创面，然后将试验材料贴附于创面区域，按压10min后，从材料侧面进行剥离，测定拉力值，即为创面表面粘附力强度，每个样品测试6次取平均值。
（2）压缩模量试验
压缩模量采用微机电子万能试验机，运行速度5mm/min，完全溶胀后的海绵试样直径10mm、高5mm，重复5次取平均值。
（3）体积溶胀率试验
体积的测试方法选用排液法，将止血海绵材料置于装有一定体积液体的量筒中，读取液面升高数值，分别测得止血海绵材料吸水溶胀前的体积V0及充分吸水溶胀后的体积V1。体积溶胀率计算方法为：饱和溶胀后的体积V1与初始体积V0的差值占初始体积V0的百分比，每个样品测试6次取平均值。
（4）吸水倍率试验
将0.025g止血海绵置于2ml水中进行静置10min，然后在500rpm转速下进行离心10分钟后取出，称重计算残液量，每个样品测试6次取平均值。
（5）抑菌试验
根据《GB15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准》中附录C4溶出性抗（抑）菌产品抑菌性能试验方法进行测定。
1.准备试验材料：PBS、营养琼脂、沙氏琼脂培养基、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、试管、一次性平皿、培养箱等；
2.试验菌与菌液制备：
试验菌：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌；
菌液制备：将事先准备好的菌悬液，用PBS稀释至要求浓度(要求浓度为：用100μl滴于对照样品上，回收菌数为1×104~9×104/片)。
3.操作步骤：
取被试样品（5g）和对照样品（与试样同质材料，同等质量，但不含抗菌材料，且经灭菌处理）各4管（置于灭菌试管内）。
取上述菌悬液，分别在每个被试样品和对照样品上滴加100μl，均匀混合，开始计时，作用20min，投入含5m1 PBS的试管内，充分混匀，作适当稀释，然后取其中2~3个稀释度，分别吸取0.5m1，置于两个平皿，用凉至40~45℃的营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15m1作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，在35±2℃培养箱中培养48h （细菌）、72h（酵母菌），作活菌菌落计数。
4.计算方法
试验重复3次，按下式计算抑菌率：
X4 =（A-B）×100%
式中：X4—抑菌率，%；A—对照样品平均菌落数；B—被试验样品平均菌落数。
5.评价标准
抑菌率≥50%-90%，产品有抑菌作用，抑菌率≥90%，产品有较强抑菌作用。
（6）体外细胞毒性试验
按照医疗器械生物学评价第5部分：细胞毒性试验GB/T16886.5-2017进行。
（7）皮肤刺激和致敏试验
按照医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验GB/T16886.10-2017进行。
实施例1将质量分数为2.0%的N-马来酰化壳聚糖（20-80KDa，取代度25-35%）、25%的丙烯酰胺、0.04%的ε-聚赖氨酸、4%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）和0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min。加入12.5%的丙烯酸和1.2%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下预聚合30min，雾化喷涂0.6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.008%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的混合液，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下聚合15min后，在-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。所得冻干产物经包装、20K电子束辐照灭菌制得可粘附抗菌止血海绵。
实施例2将质量分数为1.5%的N-马来酰化壳聚糖（90-120KDa，取代度20-30%）、30%的丙烯酰胺、0.08%的ε-聚赖氨酸、2%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（2KDa）和0.02%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min。加入10%的丙烯酸和1.25%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下预聚合40min，雾化喷涂0.4%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.002%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的混合液，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下聚合10min后，在-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。所得冻干产物经包装、15K电子束辐照灭菌制得可粘附抗菌止血海绵。
实施例3将质量分数为2.5%的N-马来酰化壳聚糖（100-200KDa，取代度30-40%）、20%的丙烯酰胺、0.02%的ε-聚赖氨酸、6%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（5KDa）和0.01%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min。加入15%的丙烯酸和1.1%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下预聚合20min，雾化喷涂0.4%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.005%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的混合液，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下聚合20min后，在-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。所得冻干产物经包装、25K电子束辐照灭菌制得可粘附抗菌止血海绵。
实施例4将质量分数为2.0%的N-马来酰化壳聚糖（20-80KDa，取代度25-35%）、30%的丙烯酰胺、0.04%的ε-聚赖氨酸、6%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（1KDa）和0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min。加入15%的丙烯酸和1.4%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下预聚合30min，雾化喷涂0.6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.008%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的混合液，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下聚合15min后，在-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。所得冻干产物经包装、20K电子束辐照灭菌制得可粘附抗菌止血海绵。
实施例5将质量分数为2.0%的N-马来酰化壳聚糖（20-80KDa，取代度25-35%）、20%的丙烯酰胺、0.04%的ε-聚赖氨酸、2%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（10KDa）和0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min。加入10%的丙烯酸和0.9%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下预聚合30min，雾化喷涂0.6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.008%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的混合液，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下聚合15min后，在-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。所得冻干产物经包装、20K电子束辐照灭菌制得可粘附抗菌止血海绵。
实施例6将质量分数为2.0%的N-马来酰化壳聚糖（20-80KDa，取代度25-35%）、25%的丙烯酰胺、0.08%的ε-聚赖氨酸、6%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）和0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min。加入12.5%的丙烯酸和1.2%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下预聚合30min，雾化喷涂0.6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.008%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的混合液，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下聚合15min后，在-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。所得冻干产物经包装、20K电子束辐照灭菌制得可粘附抗菌止血海绵。
实施例7将质量分数为2.0%的N-马来酰化壳聚糖（20-80KDa，取代度25-35%）、25%的丙烯酰胺、0.02%的ε-聚赖氨酸、2%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）和0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min。加入12.5%的丙烯酸和1.2%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下预聚合30min，雾化喷涂0.6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.008%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的混合液，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下聚合15min后，在-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。所得冻干产物经包装、20K电子束辐照灭菌制得可粘附抗菌止血海绵。
实施例8将质量分数为2.0%的N-马来酰化壳聚糖（20-80KDa，取代度25-35%）、25%的丙烯酰胺、0.04%的ε-聚赖氨酸、4%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）和0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min。加入12.5%的丙烯酸和1.2%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下预聚合30min，雾化喷涂0.8%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.012%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的混合液，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下聚合15min后，在-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。所得冻干产物经包装、20K电子束辐照灭菌制得可粘附抗菌止血海绵。
实施例9将质量分数为2.0%的N-马来酰化壳聚糖（20-80KDa，取代度25-35%）、25%的丙烯酰胺、0.04%的ε-聚赖氨酸、4%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）和0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min。加入12.5%的丙烯酸和1.2%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下预聚合30min，雾化喷涂0.4%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.005%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的混合液，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下聚合15min后，在-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。所得冻干产物经包装、20K电子束辐照灭菌制得可粘附抗菌止血海绵。
比较例1将质量分数为2.0%的N-马来酰化壳聚糖（20-80KDa，取代度25-35%）、25%的丙烯酰胺、4%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）和0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min。加入12.5%的丙烯酸和1.2%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下预聚合30min，雾化喷涂0.6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.008%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的混合液，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下聚合15min后，在-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。所得冻干产物经包装、20K电子束辐照灭菌制得可粘附抗菌止血海绵。
比较例2将质量分数为3.0%的N-马来酰化壳聚糖（20-80KDa，取代度25-35%）、40%的丙烯酰胺、1.0%的ε-聚赖氨酸、4%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）和0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min。加入20%的丙烯酸和2.0%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下预聚合30min，雾化喷涂0.6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.008%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的混合液，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下聚合15min后，在-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。所得冻干产物经包装、20K电子束辐照灭菌制得可粘附抗菌止血海绵。
比较例3将质量分数为25%的丙烯酰胺、0.04%的ε-聚赖氨酸、4%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）和0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min。加入12.5%的丙烯酸和1.2%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下预聚合30min，雾化喷涂0.6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.008%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的混合液，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下聚合15min后，在-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。所得冻干产物经包装、20K电子束辐照灭菌制得可粘附抗菌止血海绵。
比较例4将质量分数为2.0%的N-马来酰化壳聚糖（20-80KDa，取代度25-35%）、25%的丙烯酰胺、0.04%的ε-聚赖氨酸、4%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）和0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min。加入0.8%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下预聚合30min，雾化喷涂0.6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.008%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的混合液，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下聚合15min后，在-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。所得冻干产物经包装、20K电子束辐照灭菌制得可粘附抗菌止血海绵。
比较例5将质量分数为2.0%的N-马来酰化壳聚糖（20-80KDa，取代度25-35%）、0.04%的ε-聚赖氨酸、4%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）和0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min。加入12.5%的丙烯酸和0.4%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下预聚合30min，雾化喷涂0.6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.008%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的混合液，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下聚合15min后，在-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。所得冻干产物经包装、20K电子束辐照灭菌制得可粘附抗菌止血海绵。
比较例6将质量分数为2.0%的N-马来酰化壳聚糖（20-80KDa，取代度25-35%）、25%的丙烯酰胺、0.04%的ε-聚赖氨酸和0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min。加入12.5%的丙烯酸和1.2%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下预聚合30min，雾化喷涂0.6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.008%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的混合液，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下聚合15min后，在-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。所得冻干产物经包装、20K电子束辐照灭菌制得可粘附抗菌止血海绵。
比较例7将质量分数为2.0%的N-马来酰化壳聚糖（20-80KDa，取代度25-35%）、25%的丙烯酰胺、0.04%的ε-聚赖氨酸、4%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）和0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min。加入12.5%的丙烯酸和1.2%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下预聚合3min，雾化喷涂0.6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.008%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的混合液，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下聚合3min后，在-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。所得冻干产物经包装、20K电子束辐照灭菌制得可粘附抗菌止血海绵。
比较例8将质量分数为2.0%的N-马来酰化壳聚糖（20-80KDa，取代度25-35%）、25%的丙烯酰胺、0.04%的ε-聚赖氨酸、4%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）和0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min。加入12.5%的丙烯酸和1.2%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下预聚合30min，雾化喷涂0.6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.008%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的混合液，在功率为150W，波长为365nm，紫外灯下聚合15min后，在-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每10℃为一个阶段升温，升温时间1小时，恒温时间2小时，直到升温至30℃结束。所得冻干产物经包装、20K电子束辐照灭菌制得可粘附抗菌止血海绵。
分别按照表面粘附力测试方法、压缩模量试验方法、体积溶胀率试验方法、吸水倍率试验方法、体外细胞毒性试验方法、皮肤刺激和致敏试验方法对止血海绵的理化性能和生物学进行了检测，结果如表1和表2所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure 127178DEST_PATH_IMAGE002
通过表1中实施例1-3和表2中比较例8可知，止血海绵的表面粘附力与海绵表面的N羟基琥珀酰亚胺含量有关，随着N羟基琥珀酰亚胺含量的升高，止血海绵的粘附力逐渐提高，当止血海绵的粘附力提高到一定强度，N羟基琥珀酰亚胺的含量再增加，止血海绵的粘附力提高不大。
通过表1中实施例1-8和表2中比较例1-6、比较例8可知，止血海绵的压缩模量、体积溶胀率、吸水倍率与海绵中的交联密度和交联剂长度有关，当海绵中交联密度越高、交联剂长度约低，海绵的压缩模量越大、体积溶胀率和吸水倍率越低。
通过表1中实施例1和和表2中比较例7可知，反应体系内紫外灯照射时间会影响反应进程，照射时间太短使交联不完全，引起细胞毒、刺激致敏反应等。
通过表1实施例1-9可知，止血海绵的生物相容性较好，止血海绵的细胞毒性试验、皮肤刺激和致敏试验均符合医用止血海绵的生物相容性要求。
按照抑菌试验方法对止血海绵的抑菌进行了检测，结果如表3和表4所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
Figure 841056DEST_PATH_IMAGE004
由表3和表4可知，单纯的壳聚糖或ε-聚赖氨酸均不能达到很好的依据效果，当两者互相配合时，抑菌率可达100%。
取实施例1所述样品，按以下试验方案，做了体外降解试验，结果如附图1所示，止血海绵可在93天内完全降解。取降解30天、60天和90天的止血海绵测定其对大肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌抑菌率，结果均为100%，说明本发明所述可粘附抗菌止血海绵，具有长效抗菌作用。
体外降解时间的检测：
1.待测样品的制备：将样品切成1cm*1cm*1cm的正方体海绵备用。
2.配制pH值为7.4的PBS缓冲溶液。
3.体外降解时间的检测：将1制备好的样品放入装有PBS缓冲溶液的密闭容器中，并转移到37±1℃培养箱内，每隔72h称量一次重量，观察样品在缓冲液中的变化情况，直至肉眼看不见为止，即为样品体外降解时间。
止血试验：
取实施例1所述样品（试验组）和比较例1所述样品（对照组），按以下试验方案，做了相关止血试验，结果如表2所示。
（1）股动脉止血试验
以SD大鼠的股动脉损伤出血为模型，麻醉后剃掉腿部毛，露出腹股沟与后肢，横切大腿皮肤和肌肉，露出动脉，手术针刺穿动脉制造大出血。将0.5g样品立即覆盖在伤口处，并用纱布按压操作，每隔5s抬起纱布观察，直到止血结束。统计止血时间和出血量。
（2）肝创伤止血试验
以SD大鼠的肝脏损伤出血为模型，通过水合氯醛水溶液腹腔注射麻醉及腹毛而剃掉，在腹部被打开，露出肝脏。用手术刀开一个长度1cm，深度1cm的伤口。用0.1g材料直接洒在出血肝脏的顶部，盖上纱布垫，同时实施常规的按压操作。每隔5s抬起纱布，观察出血情况直到止血，统计出血时间和出血量。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
由表5可知，在用可粘附自修复止血海绵进行的肝脏止血和股动脉止血试验效果明显好于对照组，其肝脏止血时间较对照组下降48%，肝脏出血量下降47%，股动脉止血时间较对照组下降28%，股动脉出血量下降54%。可见，ε-聚赖氨酸不但可以提高止血海绵的抑菌效率，而且可优化止血海绵的网络结构，从而使其止血作用效果有较大提升。
以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种可粘附抗菌止血海绵，其特征在于，由重量百分比为1.5-2.5%的N-马来酰化壳聚糖、20-30%的丙烯酰胺、0.02-0.8%的ε-聚赖氨酸、2-6%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯和0.01-0.02%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺充分反应，加入10-15%的丙烯酸和0.9-1.5%的第一部分光引发剂，在紫外灯下预聚合后，加入0.4-0.8%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.005-0.012%的第二部分光引发剂的混合液，在紫外灯下二次聚合后，经程序冻干、灭菌制得。
2.根据权利要求1所述的一种可粘附抗菌止血海绵，其特征在于，所述N-马来酰化壳聚糖的分子量为20-200KDa，马来酰化取代度为20-40%。
3.根据权利要求1所述的一种可粘附抗菌止血海绵，其特征在于，所述丙烯酰胺与丙烯酸的重量比为12 : 4-9。
4.根据权利要求1所述的一种可粘附抗菌止血海绵，其特征在于，所述第一部分光引发剂和第二部分光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮。
5.根据权利要求1所述的一种可粘附抗菌止血海绵，其特征在于，所述预聚所用紫外灯功率为150W，波长为365nm，照射时间为20-40min；所述二次聚合所用紫外灯功率为150W，波长为365nm，照射时间为10-20min。
6.根据权利要求1所述的一种可粘附抗菌止血海绵，其特征在于，所述ε-聚赖氨酸分子量为3600-4300Da，所述丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯分子量为1-10KDa。
7.根据权利要求1所述的一种可粘附抗菌止血海绵，其特征在于包括以下步骤：
（1）交联反应：将N-马来酰化壳聚糖、丙烯酰胺、ε-聚赖氨酸、丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯、N, N'-亚甲基双丙烯酰胺加入到纯化水中，在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，得经交联反应后的混合液；
（2）预聚反应：将步骤（1）中得到的混合液，加入丙烯酸和第一部分光引发剂，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于紫外灯下预聚，得凝胶预聚体；
（3）二次聚合反应：向步骤（2）中得到的凝胶预聚体中加入丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和第二部分光引发剂的混合液，使混合液均匀分散到凝胶预聚体表面，在紫外灯下二次聚合，得凝胶产物；
（4）冻干：将步骤（3）中得到的凝胶状产物置于模具中，置入冻干机中，经预冻和程序升华干燥后得到未灭菌可粘附抗菌止血海绵；
（5）灭菌：将步骤（4）中得到的未灭菌可粘附抗菌止血海绵，经包装、15-25K电子束辐照灭菌，得可粘附抗菌止血海绵成品。
8.根据权利要求7所述的一种可粘附抗菌止血海绵的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述使混合液均匀分散到凝胶预聚体表面的方法为雾化喷涂。
9.根据权利要求7所述的一种可粘附抗菌止血海绵的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述预冻和程序冻干的方法为：-50℃预冻6小时，结束后抽真空，真空度应小于15pa；此后，每5℃为一个阶段升温，升温时间2小时，恒温时间1小时，直到升温至5℃结束。
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