CN107441556B - 一种聚氨基酸封端的组织修补材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种聚氨基酸修饰的组织修补材料的制备方法，其特征在于，以去抗原处理后的脱细胞外基质材料为支架结构，经交联剂、封端剂处理后，复合生物活性物质。本发明利用封端剂处理，降低了交联剂的剩余毒性，形成共价键封端游离醛基等交联基团，形成的保护更稳定，提高了产品安全性和材料的抗钙化能力，同时聚阳离子封端使得材料表面可以通过氢键更好的吸附聚阴离子(透明质酸钠、硫酸软骨素等)使得材料的表面处理更稳定；最后在上述得到的材料表面修饰具有生物活性的多糖分子或生长因子，促进组织再生，最终得到一种具有一定强度和抗钙化的组织修复材料。

Description

一种聚氨基酸封端的组织修补材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种聚氨基酸封端的组织修补材料及其制备方法，属于生物医用材料技术领域。
背景技术
生物医用材料是用于和生物系统结合、治疗或替换生物机体中的组织、器官或增进其功能的材料。脱细胞外基质材料是其中较为新颖的一类组织修补材料，主要由纤维胶原蛋白构成，还包含氨基葡聚糖和糖蛋白等，由于其出色的修复再生功能，逐渐被临床所接受，并在越来越多的组织修复手术中应用。随着脱细胞外基质材料的应用，其本身的降解快，组织转归过程中力学强度降低等问题也逐渐暴露，而经过交联后的材料明显增强了生物组织的结构强度和植入寿命。
目前该种材料的交联手段主要包括，化学交联和物理交联。物理交联虽然可以一定程度上实现交联的目的，但是由于其交联效率较低，通常不能取得较为理想的交联效果。化学交联一般采用双/多官能度的醛、异氰酸酯，双/多官能度环氧或EDC等试剂，通过偶联该种材料主要的活性基团是胶原蛋白中含有的游离氨基、羟基和羧基等达到交联的目的。目前比较成熟的交联剂主要以戊二醛和多官能环氧交联的材料为主。这两种交联剂都是与脱细胞外基质中的胶原蛋白中游离氨基产生化学反应，生成牢固的交联键达到目的。
然而无论是戊二醛还是环氧试剂处理材料后都存在残留和悬挂修饰的残端造成的材料毒性的问题。交联剂残留通过反复的清洗和工艺验证可以较为彻底的消除，但对于悬挂修饰后残端造成的材料的性的问题不是通过清洗可以解决的。与此同时经过处理的脱细胞外基质材料却对视了大量的可溶性蛋白，胶原的羧基和磷酸键暴露，为钙离子沉积提供了有利条件。钙盐沉积现象对于脱细胞外基质材料应用于组织修复时的影响有时是致命的。钙盐的沉积直接导致了材料的失效，并且需要再次手术进行处理。所以通常在交联改性技术后必须采用新型低毒性的封端试剂对材料进行处理，以达到材料性能更稳定，毒性更低，更安全的目的。
CN104667336B公开用了用同种异体真皮组织通过戊二醛处理后用甘氨酸等氨基酸溶液进行封端处理，降低戊二醛带来的毒性。CN102114269B公开了用人工生物瓣膜材料通过戊二醛处理后用异氰酸基和多元醇的溶液处理，进行抗钙化处理，并用PBS充分漂洗。处理材料的剩余毒性。CN102114270B公开了同样中国的微创公司用人工生物瓣膜材料分布进行处理，达到防钙化目的，材料先后进行氨基封端、羧基封端、羰基封端集技术离子竞争剂处理、游离醛基处理最后漂洗处理材料剩余毒性。然而，这些方法都存在一定缺陷：(1)单纯的清洗并不能完全去除交联剂带来的毒性问题；(2)复杂的封端处理可能带来新的毒性问题，且成本也很高；(3)单纯的氨基酸封端处理仅解决了游离醛基的问题，可能增加游离羧基的数量，而游离羧基的增多使得材料植入体内后钙化的问题依然严重；(4)目前的封端技术不能弥补已经失衡的材料表面羧基游离过多的问题。
发明内容
针对上述存在的技术缺陷，本申请提供了一种聚氨基酸修饰的组织修补材料及其制备方法。所得材料具有一定的生物力学特性，很好的生物相容性及降解性，保持了天然细胞外基质的三维结构，同时降低了处理过程带来的毒性风险，延缓钙盐沉积的组织修复材料。
本发明所述技术方案如下：
一种聚氨基酸修饰的组织修补材料的制备方法，以去抗原处理后的脱细胞外基质材料(ECM)为支架结构，经交联剂、封端剂分别浸泡处理后，复合生物活性物质。
其中，所述去抗原处理后的脱细胞外基质材料选自牛真皮基质、牛心包基质、牛跟腱基质、牛腹膜基质、猪腹膜基质、猪膀胱粘膜下层基质、猪小肠小肠粘膜下层基质、猪真皮基质等保持天然结构和性能的主要由胶原蛋白组成的材料。
所述交联剂选自甲醛、戊二醛、二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)、甲苯二异氰酸酯(TDI)、异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI)、乙二醇缩水甘油醚、聚乙二醇缩水甘油醚的溶液或其生理缓冲溶液中一种或多种；所述交联剂的总浓度为0.001M-1M。所述的生理缓冲溶液选自NaCl、KCl、Na2HPO3、KH2PO3、Na2CO3、K2CO3中一种或多种，其pH范围5-8。
所述交联剂的具体处理方法如下：将ECM浸泡在交联剂中10min-30天；具体浸泡时间与交联剂具体选择及浓度有关，如较低浓度的甲醛可能需要浸泡10天时间，而较高浓度的MDI则可能浸泡10min就可以；本领域技术人员可根据所掌握的专业常识来选择具体浸泡时间，以提高材料的力学强度和抗降解性，处理后将ECM取出用去离子水、生理盐水或PBS缓冲液充分冲洗；擦干ECM表面水分，进行真空冷冻干燥，得到交联后的ECM支架。
所述封端剂选自含有聚赖氨酸或聚赖氨酸-天冬氨酸共聚物的溶液。所述封端剂总浓度为0.001％-40％，在浓度范围内有效成分可按任意比例混合，优选聚赖氨酸0.5％；所述聚赖氨酸或聚赖氨酸-天冬氨酸共聚物分子量为1000-100000，浸泡时间为0.5-48h，优选浸泡4h。
所述生物活性物质选自含有硫酸软骨素、透明质酸钠、海藻酸钠、骨骼生长因子(SGF)中的一种或多种的溶液。所述生物活性物质的浓度为0.01％-2％，浸泡时间为0.5-24h。优选透明质酸钠溶液0.01％溶液，浸泡1h。
在经交联剂、封端剂及复合生物活性物质各处理后，均须对材料进行真空冷冻干燥。具体方法为：将所得材料进行0.5-48小时的预冻，预冻温度为-10℃～-80℃，而后对产品进行真空低温干燥，干燥过程中温度在原有预冻温度上升到4℃-90℃。优选冷冻4小时，预冻温度为-30℃。
作为本发明优选的实施方式之一，所述聚氨基酸修饰的组织修补材料的制备方法包括如下步骤：
1)将抗原处理后的脱细胞外基质材料ECM浸泡在交联剂中处理10min-30天，以提高材料的力学强度和抗降解性，处理后将ECM取出用去离子水、生理盐水或PBS缓冲液充分冲洗；擦干ECM表面水分，进行真空冷冻干燥，得到交联后的ECM支架；
2)将得到的交联后的ECM支架在封端剂中浸泡，处理完成后用去离子水、生理盐水或PBS缓冲液充分冲洗；真空冷冻干燥处理，得到封端处理后的ECM；
3)将上述得到的封端后的ECM在生物活性物质中浸泡，真空冷冻干燥或保存在生理缓冲溶液中无菌封装，通过Co60放射或环氧乙烷灭菌后包装保存。
本发明还提供上述制备方法得到的聚氨基酸修饰的组织修补材料。
本发明所述技术方案的有益效果如下：
本发明保持了脱细胞外基质材料的天然三维结构，有利于细胞的生长、增殖和分化；通过交联剂和封端剂的处理，在提高材料的力学和抗降解性能的同时，降低了交联剂的剩余毒性，形成共价键封端游离醛基等交联基团，使保护更加稳定，提高了产品安全性和材料的抗钙化能力，同时聚阳离子封端使得材料表面可以通过氢键更好的吸附聚阴离子(透明质酸钠、硫酸软骨素等)使得材料的表面处理更稳定；最后在上述得到的材料表面修饰具有生物活性的多糖分子或生长因子，促进组织再生，最终得到一种具有一定强度和抗钙化的组织修复材料。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 一种聚氨基酸修饰的组织修补材料的制备方法
步骤如下：
(1)制备去抗原后猪小肠粘膜下层，将其浸泡0.1M戊二醛的PH＝8.8的磷酸缓冲液中，放在37℃摇床中使其充分交联12小时取，取出用去离子水充分冲洗；然后用滤纸擦干表面水分，放入液氮中迅速冷冻2小时，-80℃进行真空冷冻干燥8小时，得到交联处理后的ECM；
(2)将所得交联后的ECM浸泡在0.5％分子量为6000的聚赖氨酸溶液中，并在37℃摇床中以120转/分的速度摇动4小时，取出用去离子水充分清洗。放入液氮中迅速冷冻2小时，-80℃进行真空冷冻干燥8小时，得到交联处理后的ECM；
(3)再将材料浸泡在0.1％透明质酸钠溶液中2h，最后冷冻干燥后得到一种聚阳离子封端并用天然多糖修饰的低毒性、抗钙化的组织修复材料。
实施例2 一种聚氨基酸修饰的组织修补材料的制备方法
步骤如下：
(1)制备去抗原后牛真皮基质，将其浸泡1M的MDI中的氯化钠溶液中，放在37℃摇床中使其充分交联10min，取出用去离子水充分冲洗；然后用滤纸擦干表面水分，放入冰箱中冷冻6小时，-20℃进行真空冷冻干燥16小时，得到交联处理后的ECM；
(2)将所得交联后的ECM浸泡在0.001％分子量为100000的聚赖氨酸-天冬氨酸共聚物溶液中，并在37℃摇床中以120转/分的速度摇动4小时，取出用去离子水充分清洗。放入液氮中迅速冷冻2小时，-80℃进行真空冷冻干燥16小时，得到交联处理后的ECM；
(3)再将材料浸泡在0.01％SGF溶液中2h，最后冷冻干燥后得到一种聚阳离子封端并用天然多糖修饰的低毒性、抗钙化的组织修复材料。
实施例3 一种聚氨基酸修饰的组织修补材料的制备方法
步骤如下：
(1)制备去抗原后牛跟腱基质，将其浸泡1M聚乙二醇缩水甘油醚处理，放在37℃摇床中使其充分交联20天，取出用去离子水充分冲洗；然后用滤纸擦干表面水分，放入液氮中迅速冷冻2小时，-80℃进行真空冷冻干燥8小时，得到交联处理后的ECM；
(2)将所得交联后的ECM浸泡在40％分子量为1000的聚赖氨酸溶液中，并在37℃摇床中以120转/分的速度摇动48小时，取出用去离子水充分清洗。放入液氮中迅速冷冻2小时，-80℃进行真空冷冻干燥8小时，得到交联处理后的ECM；
(3)再将材料浸泡在0.5％硫酸软骨素溶液中4h，最后冷冻干燥后得到一种聚阳离子封端并用天然多糖修饰的低毒性、抗钙化的组织修复材料。
对比例 一种未经聚氨基酸修饰的组织修补材料(传统方法制备)
步骤如下：
(1)制备去抗原后猪小肠粘膜下层，将其浸泡0.1M甲醛的PH＝6.9的磷酸缓冲液中，放在37℃摇床中使其充分交联1小时取，取出用去离子水充分冲洗；然后用滤纸擦干表面水分，放入液氮中迅速冷冻2小时，-80℃进行真空冷冻干燥8小时，得到交联处理后的ECM；
(2)再将材料浸泡在0.5％透明质酸钠溶液中4h，最后冷冻干燥后得到一种传统方法制备的组织修复材料。
效果验证：
1、毒性测试
细胞毒性测试方法参照GB/T 16886.5-2003方法。将实施例1-3及对比例所制得的组织修补材料用生理盐水37℃浸提24h，浸提液培养Vero细胞和pK15细胞，MTT法荧光定量测试组织修补材料的细胞毒性，结果如下表1所示：
表1
Figure BDA0001342508800000071
由表1可知，本发明实施例1-3所得组织修补材料的细胞毒性较处理的对照例在细胞毒性方面明显降低，对比例的细胞毒性经过计算也能够达到1级，但实施例1-3均达到了细胞毒性0级。由此可见，本发明所述方法制备的材料在生物相容性方面对比传统方法有明显优势。
2、钙含量测定
钙含量测定方法参照：Rupak M.Rajachar,Elyse Tung,Anh Q.Truong,etal.Role of carbonic anhydrase II in ectopic calcification.CardiovascularPathology,2009,18:77-82。文献方法测定。
将实施例1-3及对比例所制得的组织修补材料植入小鼠体内，检测35天后的钙含量，结果如下表2所示：
表2
实施例 平均干基含量
实施例1 55±6.3
实施例2 78±20.3
实施例3 12±7.8
对比例 769±70.5
由表2可知，本发明实施例1-3所得组织修补材料较对比例在钙含量方面显著提高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种聚氨基酸修饰的组织修补材料的制备方法，其特征在于，以去抗原处理后的脱细胞外基质材料为支架结构，经交联剂、封端剂分别浸泡处理后，复合生物活性物质；
所述封端剂选自含有聚赖氨酸或聚赖氨酸-天冬氨酸共聚物的溶液；
所述生物活性物质选自含有硫酸软骨素、透明质酸钠、海藻酸钠、骨骼生长因子中的一种或多种的溶液。
2.根据权利要求1所述的聚氨基酸修饰的组织修补材料的制备方法，其特征在于，所述脱细胞外基质材料选自牛真皮基质、牛心包基质、牛跟腱基质、牛腹膜基质、猪腹膜基质、猪膀胱粘膜下层基质、猪小肠粘膜下层基质、猪真皮基质中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的聚氨基酸修饰的组织修补材料的制备方法，其特征在于，所述交联剂选自甲醛、戊二醛、二苯基甲烷二异氰酸酯、甲苯二异氰酸酯、异佛尔酮二异氰酸酯、乙二醇缩水甘油醚、聚乙二醇缩水甘油醚的溶液中一种或多种。
4.根据权利要求1所述的聚氨基酸修饰的组织修补材料的制备方法，其特征在于，在交联剂、封端剂及复合生物活性物质各处理后，均须对材料进行真空冷冻干燥。
5.根据权利要求4所述的聚氨基酸修饰的组织修补材料的制备方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥步骤如下：将所得材料进行0.5-48小时的预冻，预冻温度为-10℃~-80℃，而后对产品进行真空低温干燥，干燥过程中温度在原有预冻温度上升到4℃-90℃。
6.根据权利要求1所述的聚氨基酸修饰的组织修补材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将去抗原处理后的脱细胞外基质材料ECM浸泡在交联剂中处理，取出用去离子水、生理盐水或PBS缓冲液充分冲洗；擦干ECM表面水分，进行真空冷冻干燥，得到交联后的ECM支架；
2）将得到的交联后的ECM支架在封端剂中浸泡，处理完成后用去离子水、生理盐水或PBS缓冲液充分冲洗；真空冷冻干燥处理，得到封端处理后的ECM；
3）将上述得到的封端后的ECM在生物活性物质中浸泡，真空冷冻干燥或保存在生理缓冲溶液中无菌封装，通过Co60放射或环氧乙烷灭菌后包装保存。
7.权利要求1-6任一所述制备方法得到的聚氨基酸修饰的组织修补材料。
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