CN109833518B - 一种生物心脏瓣膜促进内皮化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物心脏瓣膜促进内皮化的方法，所述方法包括将戊二醛交联的心包膜浸泡于透明质酸以及内皮细胞生长因子(VEGF)水溶液当中，加入1,4‑丁二醇二缩水甘油醚在心包膜上实现透明质酸的原位交联。本发明提供的方法能够提升生物材料的内皮化、减少钙化，潜在地延长其使用寿命。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物医学材料以及医疗器械技术领域，特别是一种生物心脏瓣膜促进内皮化的方法。
背景技术
目前临床上使用的生物瓣膜通常是采用戊二醛交联的猪或牛的心包膜制备而成。但是戊二醛交联的生物瓣膜仍然存在钙化的问题。生物瓣膜的钙化引发的重要原因之一是无法内皮化。在人体正常工作的心脏瓣膜上，内皮细胞能够预防凝血、减少钙化。由于戊二醛具有很大的细胞毒性，戊二醛交联的生物瓣膜不利于内皮细胞的生长和增殖，导致其无法内皮化。
内皮细胞生长因子(VEGF)能够促进内皮细胞的粘附和增殖。有报道表明，采用VEGF装载的表面改性涂层能够促进生物瓣膜的内皮化(Biomaterials.2018.172:14-29)。然而，基于静电作用装载的VEGF含量以及稳定性有限。
透明质酸是一种天然存在的多糖，在人体心脏瓣膜总糖胺多糖占比60％左右。透明质酸水凝胶可以通过1,4-丁二醇二缩水甘油醚交联制备而成(Biomaterials.2005.26(9):999-1010)。透明质酸水凝胶可以用于装载生物活性分子以及细胞。
通过透明质酸水凝胶装载VEGF，可以提高VEGF的载药量和稳定性，进而促进生物瓣膜的内皮化以及抗钙化性能。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足而提供一种提升生物材料的内皮化、减少钙化，潜在地延长其使用寿命的生物心脏瓣膜促进内皮化的方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
一种生物心脏瓣膜促进内皮化的方法，包括以下步骤：
S1、获取生物材料，并采用柔和摩擦和流体压力在4℃、100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，直至没有可见的粘附的非心包或非胶原组织；
S2、戊二醛交联:对步骤S1清洗后的生物材料使用戊二醛的浓度为0.1％至10％的水溶液或PBS缓冲液进行处理1天至7天；
S3、将步骤S2清洗后的生物材料进行透明质酸以及内皮细胞生长因子(VEGF)水溶液浸泡，使用的透明质酸质量溶度为0.1％至20％，使用的VEGF浓度为0.1-10μg/ml，确保透明质酸和VEGF的充分浸入；
S4、将步骤S3处理的生物材料进行透明质酸与1,4-丁二醇二缩水甘油的原位交联，使用的1,4-丁二醇二缩水甘油浓度为0.1％至50％；
S5、最后用蒸馏水浸泡清洗，清除没有反应的小分子。
进一步的，在步骤S1中，所述生物材料为动物组织，包括心包膜、瓣膜、肠膜、脑膜、肺膜、血管、皮肤或韧带的一种或多种。
进一步的，在步骤S3中，所述透明质酸分子量为1000至200万。
本发明的有益效果是：本发明提供的方法通过将戊二醛交联的心包膜浸泡于透明质酸以及内皮细胞生长因子(VEGF)水溶液当中，加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚在心包膜上实现透明质酸的原位交联。本发明提供的方法能够提升生物材料的内皮化、减少钙化，潜在地延长其使用寿命。
附图说明
图1是透明质酸水凝胶复合心包膜制备原理示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实例对本发明进一步详细说明，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，全部实例中，新鲜的动物组织材料来自于当地屠宰场。
实施例1
新鲜采集的猪心包于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时。然后浸泡在0.625％戊二醛当中24小时。然后将心包膜浸泡于5％透明质酸和0.5μg/ml VEGF当中24小时。最后将心包膜浸泡于10％的1,4-丁二醇二缩水甘油醚水溶液当中24小时。蒸馏水清洗。
如图1所示，图为本发明所述的制备流程中通过透明质酸的羟基与透明质酸水凝胶1,4-丁二醇二缩水甘油醚的环氧基团的交联反应制备透明质酸水凝胶的原理示意图。
实施例2
新鲜采集的猪心包于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时。然后浸泡在0.625％戊二醛当中24小时。然后将心包膜浸泡于5％透明质酸和1μg/ml VEGF当中24小时。最后将心包膜浸泡于10％的1,4-丁二醇二缩水甘油醚水溶液当中24小时。蒸馏水清洗。
如图1所示，图为本发明所述的制备流程中通过透明质酸的羟基与透明质酸水凝胶1,4-丁二醇二缩水甘油醚的环氧基团的交联反应制备透明质酸水凝胶的原理示意图。
实验例
在实施例1以及实施例2制备处理过程当中，还设置了的对照组即将心包膜浸泡于0.625％的戊二醛当中24小时。
内皮细胞存活率结果如表1所示，表明采用实施例1以及实施例2制备的生物膜相比于戊二醛对照组内皮细胞存活率提高。
| 内皮细胞存活率 | |
| 戊二醛对照组 | 27.53±6.62 |
| 实施例1 | 58.04±8.92 |
| 实施例2 | 86.41±12.41 |
表1
采用优选的实施例2方案制备生物膜的大鼠皮下钙化实验结果如表2所示，表明实施例2制备的生物膜挂钙量相比于戊二醛对照组减少。
| 挂钙量μg/mg | |
| 戊二醛对照组 | 28.63±1.56 |
| 实施例2 | 2.37±0.39 |
表2
本发明的有益效果是：本发明提供的方法通过将戊二醛交联的心包膜浸泡于透明质酸以及内皮细胞生长因子(VEGF)水溶液当中，加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚在心包膜上实现透明质酸的原位交联。本发明提供的方法能够提升生物材料的内皮化、减少钙化，潜在地延长其使用寿命。
当然，以上只是本发明的典型实例，除此之外，本发明还可以有其它多种具体实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。
Claims (4)
1.一种生物心脏瓣膜促进内皮化的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、获取生物材料，并采用柔和摩擦和流体压力在4℃、100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，直至没有可见的粘附的非心包或非胶原组织；
S2、戊二醛交联:对步骤S1清洗后的生物材料使用戊二醛的浓度为0.1%至10%的水溶液或PBS缓冲液进行处理1天至7天；
S3、将步骤S2清洗后的生物材料进行透明质酸以及内皮细胞生长因子（VEGF）水溶液浸泡，使用的透明质酸质量浓度为0.1%至20%，使用的VEGF浓度为0.1-10 µg/ml，确保透明质酸和VEGF的充分浸入；
S4、将步骤S3处理的生物材料进行透明质酸与1,4-丁二醇二缩水甘油醚的原位交联，使用的1,4-丁二醇二缩水甘油醚浓度为0.1%至50%；
S5、最后用蒸馏水浸泡清洗，清除没有反应的小分子。
2.根据权利要求1所述一种生物心脏瓣膜促进内皮化的方法，其特征在于：在步骤S1中，所述生物材料为动物组织。
3.根据权利要求2所述一种生物心脏瓣膜促进内皮化的方法，其特征在于：在步骤S1中，所述生物材料包括心包膜、瓣膜、肠膜、脑膜、肺膜、血管、皮肤或韧带的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种生物心脏瓣膜促进内皮化的方法，其特征在于：在步骤S3中，所述透明质酸分子量为1000至200万。
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