CN109833517B - 一种提高生物瓣膜弹性蛋白稳定性的交联处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高生物瓣膜弹性蛋白稳定性的交联处理方法，所述方法包括将戊二醛交联的心包膜浸泡于弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶水溶液当中，在心包膜上实现弹性蛋白的原位交联。然后采用茶多酚稳定弹性蛋白。本发明提供的方法能够提升生物材料的弹性蛋白含量及抗钙化性能，潜在地延长其使用寿命。

Description

一种提高生物瓣膜弹性蛋白稳定性的交联处理方法
技术领域
本发明涉及一种生物医学材料以及医疗器械技术领域，特别是一种提高生物瓣膜弹性蛋白稳定性的交联处理方法。
背景技术
心脏瓣膜疾病是一种常见的瓣膜衰退疾病。在解剖学上表现为血液通路变窄或瓣膜关闭不全。
心脏瓣膜疾病的治疗包括开胸瓣膜置换手术以及经皮心脏瓣膜置换手术。开胸手术对病人创伤大、风险高、恢复慢、需体外循环支持，很多患者无法接受。经皮心脏瓣膜置换手术因为对病人创伤小、风险低，成为未来瓣膜手术的主要趋势。
生物心脏瓣膜是指一类用于替换人体病变心脏瓣膜的生物医学材料。生物心脏瓣膜一般由猪心包膜、牛心包膜等通过戊二醛交联制备而成。
戊二醛交联处理具有操作简单，成本低以及胶原蛋白交联程度高的特点，是目前生物心脏瓣膜化学交联的行业首选。然而，戊二醛交联的生物心脏瓣膜存在容易降解以及钙化的问题，导致生物心脏瓣膜只有10年左右的有效使用年限。戊二醛可以实现胶原蛋白的稳定交联，但是不能交联弹性蛋白，导致其有一定技术局限性。
可溶性弹性蛋白主要通过锁链素结构形成不可溶弹性蛋白。有研究表明在体外弹性蛋白前驱体可以在赖氨酰氧化酶作用下可以形成锁链素从而获得不可溶性弹性蛋白(BiochemicalJournal1978；173:857-62)。
因此，通过优化生物心脏瓣膜的化学交联方法，特别是开发能够提高弹性蛋白含量以及结构稳定性的新型材料处理方法，将提升生物心脏瓣膜的整体结构稳定性以及抗钙化性能，对于科学研究以及相关产业领域的发展具有重大意义，而目前并没有很好的方法，因此需要改进。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足而提供一种能够提升生物材料的弹性蛋白含量及抗钙化性能，潜在地延长其使用寿命的提高生物瓣膜弹性蛋白稳定性的交联处理方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
一种提高生物瓣膜弹性蛋白稳定性的交联处理方法，具体包括以下步骤：
S1、获取生物材料，并采用柔和摩擦和流体压力在4℃、100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，直至没有可见的粘附的非心包或非胶原组织，同时通过渗压休克实现对心包组织有效脱细胞；
S2、戊二醛交联:对步骤S1清洗后的新鲜猪或牛的心包膜使用戊二醛的浓度为0.1％至10％的水溶液或PBS缓冲液进行处理1天至7天；
S3、然后将步骤S2清洗后的生物材料进行弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶的原位交联，使用的弹蛋白原与心包膜的质量投料比为0.01：1至0.5：1，使用的赖氨酰氧化酶与心包膜的质量投料比为0.1g：1mg至10ug：1mg；
S4、将步骤S3处理后的生物材料浸泡茶多酚，使用的茶多酚质量浓度为0.1％-10％，茶多酚通过氢键作用吸附于弹性蛋白纤维的疏水段，从而提高弹性蛋白的结构稳定性能；
S5、最后用蒸馏水浸泡清洗，清除没有反应的茶多酚、弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶。
进一步的，在步骤S1中，所述生物材料为动物组织，包括心包膜、瓣膜、肠膜、脑膜、肺膜、血管、皮肤或韧带的一种或多种。
进一步的，在步骤S4中，所述茶多酚包括单宁酸(TA)、儿茶素(EC)、没食子儿茶素(EGC)、儿茶素没食子酸酯(ECG)和没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的一种或多种。
本发明的有益效果是：本发明提供的方法通过将戊二醛交联的心包膜浸泡于弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶水溶液当中，在心包膜上实现弹性蛋白的原位交联。然后采用茶多酚稳定弹性蛋白。本发明提供的方法能够提升生物材料的弹性蛋白含量及抗钙化性能，潜在地延长其使用寿命。
附图说明
为了进一步澄清一个或多个本发明的上述以及其他的优点和特性，通过参照附图中示出的特定实施方案，呈现一个或多个本发明更具体的描述。
图1是本发明制备的生物心脏瓣膜的具体流程图。
图2是采用弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶交联以及茶多酚组合处理提高心包膜弹性蛋白含量和稳定性的原理示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实例对本发明进一步详细说明，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
本实施例提供的一种提高生物瓣膜弹性蛋白稳定性的交联处理方法，在全部实施方案中，新鲜猪心包膜来自当地屠宰场。
如图1所示，将新鲜采集的猪心包于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后浸泡在0.625％戊二醛当中24小时，然后将心包膜浸泡于弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶水溶液当中24小时，质量投料比为0.01mg弹性蛋白原：1mg心包膜和1ug赖氨酰氧化酶：1mg心包膜。最后将心包膜浸泡于1％表没食子儿茶素没食子酸酯水溶液当中24小时。
如图2所示，为采用弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶交联以及茶多酚组合处理提高心包膜弹性蛋白含量和稳定性的原理示意图。
处理过程当中，设置了一个对照组：戊二醛(GLUT)处理组。即将心包膜浸泡于0.625％的戊二醛当中24小时。
实施例2：
本实施例提供的一种提高生物瓣膜弹性蛋白稳定性的交联处理方法，在全部实施方案中，新鲜猪心包膜来自当地屠宰场。
如图1所示，将新鲜采集的猪心包于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后浸泡在0.625％戊二醛当中24小时，然后将心包膜浸泡于弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶水溶液当中24小时，质量投料比为0.05mg弹性蛋白原：1mg心包膜和1ug赖氨酰氧化酶：1mg心包膜。最后将心包膜浸泡于1％表没食子儿茶素没食子酸酯水溶液当中24小时。
如图2所示，为采用弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶交联以及茶多酚组合处理提高心包膜弹性蛋白含量和稳定性的原理示意图。
实施例3：
本实施例提供的一种提高生物瓣膜弹性蛋白稳定性的交联处理方法，在全部实施方案中，新鲜猪心包膜来自当地屠宰场。
如图1所示，将新鲜采集的猪心包于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后浸泡在0.625％戊二醛当中24小时，然后将心包膜浸泡于弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶水溶液当中24小时，质量投料比为0.25mg弹性蛋白原：1mg心包膜和1ug赖氨酰氧化酶：1mg心包膜。最后将心包膜浸泡于1％表没食子儿茶素没食子酸酯水溶液当中24小时。
如图2所示，为采用弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶交联以及茶多酚组合处理提高心包膜弹性蛋白含量和稳定性的原理示意图。
实施例4：
本本实施例提供的一种提高生物瓣膜弹性蛋白稳定性的交联处理方法，在全部实施方案中，新鲜猪心包膜来自当地屠宰场。
如图1所示，新鲜采集的猪心包于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后浸泡在0.625％戊二醛当中24小时，然后将心包膜浸泡于弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶水溶液当中24小时，质量投料比为0.05mg弹性蛋白原：1mg心包膜和0.5ug赖氨酰氧化酶：1mg心包膜。最后将心包膜浸泡于1％表没食子儿茶素没食子酸酯水溶液当中24小时。
如图2所示，为采用弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶交联以及茶多酚组合处理提高心包膜弹性蛋白含量和稳定性的原理示意图。
实施例5：
本实施例提供的一种提高生物瓣膜弹性蛋白稳定性的交联处理方法，在全部实施方案中，新鲜猪心包膜来自当地屠宰场。
如图1所示，新鲜采集的猪心包于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后浸泡在0.625％戊二醛当中24小时，然后将心包膜浸泡于弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶水溶液当中24小时，质量投料比为0.05mg弹性蛋白原：1mg心包膜和1ug赖氨酰氧化酶：1mg心包膜。最后将心包膜浸泡于1％表没食子儿茶素没食子酸酯水溶液当中24小时。
如图2所示，为采用弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶交联以及茶多酚组合处理提高心包膜弹性蛋白含量和稳定性的原理示意图。
实施例6：
本实施例提供的一种提高生物瓣膜弹性蛋白稳定性的交联处理方法，在全部实施方案中，新鲜猪心包膜来自当地屠宰场。
如图1所示，新鲜采集的猪心包于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后浸泡在0.625％戊二醛当中24小时，然后将心包膜浸泡于弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶水溶液当中24小时，质量投料比为0.05mg弹性蛋白原：1mg心包膜和5ug赖氨酰氧化酶：1mg心包膜。最后将心包膜浸泡于1％表没食子儿茶素没食子酸酯水溶液当中24小时。
如图2所示，为采用弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶交联以及茶多酚组合处理提高心包膜弹性蛋白含量和稳定性的原理示意图。
实验例
六组实施例以及戊二醛对照组最终的锁链素以及不可溶性弹性蛋白的含量分析结果如表1所示，挂钙量如表2所示。
表1
表2
可以发现采用实施例1至实施例6的方法对生物膜进行处理后，生物膜所含的锁链素以及不可溶性弹性蛋白含量都得到了提高，挂钙量均减少。
本发明的有益效果是：本发明提供的方法通过将戊二醛交联的心包膜浸泡于弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶水溶液当中，在心包膜上实现弹性蛋白的原位交联。然后采用茶多酚稳定弹性蛋白。本发明提供的方法能够提升生物材料的弹性蛋白含量及抗钙化性能，潜在地延长其使用寿命。
当然，以上只是本发明的典型实例，除此之外，本发明还可以有其它多种具体实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。

Claims (2)

1.一种提高生物瓣膜弹性蛋白稳定性的交联处理方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、获取生物材料，并采用柔和摩擦和流体压力在4℃、100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，直至没有可见的粘附的非心包或非胶原组织，同时通过渗压休克实现对心包组织有效脱细胞；
S2、戊二醛交联:对步骤S1清洗后的新鲜猪或牛的心包膜使用戊二醛的浓度为0.1％至10％的水溶液或PBS缓冲液进行处理1天至7天；
S3、然后将步骤S2清洗后的生物材料进行弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶的原位交联，使用的弹性蛋白原与心包膜的质量投料比为0.01：1至0.5：1，使用的赖氨酰氧化酶与心包膜的质量投料比为0.1g：1mg至10ug：1mg；
S4、将步骤S3处理后的生物材料浸泡茶多酚，使用的茶多酚质量浓度为0.1％-10％，茶多酚通过氢键作用吸附于弹性蛋白纤维的疏水段，从而提高弹性蛋白的结构稳定性能；
S5、最后用蒸馏水浸泡清洗，清除没有反应的茶多酚、弹性蛋白原和赖氨酰氧化酶。
2.根据权利要求1所述的一种提高生物瓣膜弹性蛋白稳定性的交联处理方法，其特征在于：在步骤S4中，所述茶多酚包括单宁酸(TA)、儿茶素(EC)、没食子儿茶素(EGC)、儿茶素没食子酸酯(ECG)和没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的一种或多种。
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