CN112915260B - 一种非戊二醛交联生物材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种非戊二醛交联生物材料及其制备方法，其制备方法包括以下步骤：将动物生物组织进行清洗预处理，然后进行脱细胞处理，再浸入功能噁唑烷溶液中进行交联固定，得非戊二醛交联生物材料。本发明还包括采用上述方法制得的非戊二醛交联生物材料。相比与传统戊二醛交联处理生物材料，本发明制备得到的非戊二醛交联生物材料不仅具有良好的机械性能，还具有更加优异的生物相容性，抗钙化和低炎症性能，表现出非常广阔的临床应用前景。

Description

一种非戊二醛交联生物材料及其制备方法
技术领域
本发明属于医学材料制备技术领域，具体涉及一种非戊二醛交联生物材料及其制备方法。
背景技术
生物材料是用于与生命系统接触和发生相互作用的，并能对其细胞、组织和器官进行诊断治疗、替换修复或诱导再生的一类天然或人工合成的特殊功能材料。生物材料，特别是动物源的生物材料植入体内会发生降解和产生严重的免疫排斥反应，因此，对于特定功能的生物材料需进行交联固定，以减小其酶降解和降低其免疫原性。
传统的戊二醛交联人工生物材料由于戊二醛的高毒性，植入体内后会存在生物相容性较差、钙化、凝血等风险。因此，发展生物相容性更优的、性能易于调控的新型交联剂有望从根本上克服戊二醛交联剂固有的缺陷，从而获得既具有优异抗钙化和抗凝血性能，又具有优异生物相容性的新型瓣膜材料。目前已报道利用京尼平、碳二亚胺等交联剂制备非戊二醛交联人工生物材料，虽然这些非戊二醛交联人工生物材料的钙化和细胞相容性得到一定的改善，但仍存在交联程度低、力学性能和长期稳定性差、来源困难，价格昂贵以及难以进一步功能化等缺点，目前基本未进入临床使用。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种非戊二醛交联生物材料及其制备方法，在保证人工生物材料机械性能的同时，解决了传统戊二醛交联时存在的生物相容性差，易钙化和高炎症反应等问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种非戊二醛交联生物材料的制备方法，包括以下步骤：将动物生物组织进行清洗预处理，然后进行脱细胞处理，再浸入功能噁唑烷溶液中进行交联固定，得非戊二醛交联生物材料。
进一步，功能噁唑烷溶液浓度为0.1-20wt％。
进一步，功能噁唑烷溶液为含有羟甲基的双环噁唑烷，其结构式如下：
Figure BDA0002929301810000021
进一步，在-4-40℃温度下交联固定1-7d。
进一步，清洗预处理的具体步骤为：采集新鲜的动物生物组织，用去离子水在3-5℃和80-120rpm振荡条件下清洗1.5-3h。
进一步，动物生物组织为心包膜、瓣膜、硬脑膜、小肠、血管或皮肤。
进一步，脱细胞处理的具体步骤为：采用DNA酶、RNA酶、胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠和脱氧胆酸混合液对动物生物组织脱细胞处理3h-7d。
进一步，DNA酶使用浓度为100-1000U/ml，RNA酶使用浓度为10-250μg/ml，胰蛋白酶使用浓度为100-1000U/ml，十二烷基硫酸钠使用浓度为0.1-2wt％，脱氧胆酸使用浓度为0.1-2wt％。
进一步，非戊二醛交联生物材料为人工心脏瓣膜、人工血管、硬脑膜、疝气补片或人工皮肤置换及修补材料。
上述的非戊二醛交联生物材料的制备方法制得的非戊二醛交联生物材料。
综上所述，本发明具备以下优点：
1、本发明所得非戊二醛交联生物材料稳定性较好，交联程度较高，具有优异抗钙化和抗凝血性能，在保证人工生物材料机械性能的同时，解决了传统戊二醛交联时存在的生物相容性差，易钙化和高炎症反应等问题。
2、在交联固定处理之前，先对动物生物组织进行清洗预处理，在3-5℃的低温湿润状态，采用柔和摩擦和流体压力在振荡条件下用去离子水进行清洗，清洗效果较好；然后进行脱细胞处理，采用多种酶及十二烷基硫酸钠和脱氧胆酸混合液进行脱细胞处理，再进行交联固定，所得人工生物材料交联程度较高，生物相容性更佳。
3、噁唑烷交联避免了传统戊二醛交联过程中的醛基残留，可以从根本上避免了戊二醛交联剂所固有的生物相容性较差、钙化、凝血等风险，从而获得具有优异机械性能、生物相容性，抗钙化、抗凝血和低免疫排斥性能的人工生物材料。且后续实验结果表明：1、噁唑烷交联人工生物材料具有与戊二醛交联人工生物材料相当的力学性能和抗酶降解性能(图1)；2、相比于戊二醛交联人工生物材料，噁唑烷交联人工生物材料具有更优的生物相容性(图2)；3、相比于戊二醛交联人工生物材料，噁唑烷交联人工生物材料具有更优的促内皮细胞生长和粘附的能力(图3)；4、相比于戊二醛交联人工生物材料，噁唑烷交联人工生物材料具有更低的炎症反应(图4)和钙化发生(图5)。
附图说明
图1为力学性能和抗酶降解性能研究结果；
图2为细胞毒性和体外炎症反应研究结果；
图3为内皮细胞黏附研究结果；
图4为大鼠皮下植入炎症反应情况；
图5为大鼠皮下植入钙化情况。
具体实施方式
实施例1
一种非戊二醛交联生物材料，其制备方法包括以下步骤：
采集新鲜的猪心包膜，用去离子水在4℃和100rpm振荡条件下清洗2h；然后采用DNA酶、RNA酶、胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠和脱氧胆酸混合液对动物生物组织脱细胞处理3d，再浸入10wt％的功能噁唑烷溶液中在25℃温度下交联固定2d，得非戊二醛交联生物材料。其中，DNA酶使用浓度为100U/ml，RNA酶使用浓度为10μg/ml，胰蛋白酶使用浓度为100U/ml，十二烷基硫酸钠使用浓度为0.1wt％，脱氧胆酸使用浓度为0.1wt％。
其中，功能噁唑烷溶液为含有羟甲基的双环噁唑烷，其结构式如下：
Figure BDA0002929301810000041
实施例2
一种非戊二醛交联生物材料，其制备方法包括以下步骤：
采集新鲜的猪小肠，用去离子水在4℃和100rpm振荡条件下清洗2h；然后采用DNA酶、RNA酶、胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠和脱氧胆酸混合液对动物生物组织脱细胞处理2d，再浸入1wt％的功能噁唑烷溶液中在25℃温度下交联固定2d，得非戊二醛交联生物材料。其中，DNA酶使用浓度为200U/ml，RNA酶使用浓度为100μg/ml，胰蛋白酶使用浓度为300U/ml，十二烷基硫酸钠使用浓度为1wt％，脱氧胆酸使用浓度为1wt％。
其中，功能噁唑烷溶液为含有羟甲基的双环噁唑烷，其结构式如下：
Figure BDA0002929301810000042
实施例3
一种非戊二醛交联生物材料，其制备方法包括以下步骤：
采集新鲜的猪小血管，用去离子水在4℃和100rpm振荡条件下清洗2h；然后采用DNA酶、RNA酶、胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠和脱氧胆酸混合液对动物生物组织脱细胞处理4d，再浸入4wt％的功能噁唑烷溶液中在4℃温度下交联固定7d，得非戊二醛交联生物材料。其中，DNA酶使用浓度为500U/ml，RNA酶使用浓度为150μg/ml，胰蛋白酶使用浓度为500U/ml，十二烷基硫酸钠使用浓度为1.5wt％，脱氧胆酸使用浓度为1.5wt％。
其中，功能噁唑烷溶液为含有羟甲基的双环噁唑烷，其结构式如下：
Figure BDA0002929301810000051
实施例4
一种非戊二醛交联生物材料，其制备方法包括以下步骤：
采集新鲜的猪瓣膜，用去离子水在4℃和100rpm振荡条件下清洗2h；然后采用DNA酶、RNA酶、胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠和脱氧胆酸混合液对动物生物组织脱细胞处理1d，再浸入4wt％的功能噁唑烷溶液中在4℃温度下交联固定4d，得非戊二醛交联生物材料。其中，DNA酶使用浓度为1000U/ml，RNA酶使用浓度为250μg/ml，胰蛋白酶使用浓度为1000U/ml，十二烷基硫酸钠使用浓度为2wt％，脱氧胆酸使用浓度为2wt％。
其中，功能噁唑烷溶液为含有羟甲基的双环噁唑烷，其结构式如下：
Figure BDA0002929301810000061
实验例
首先，分别对实施例1所得非戊二醛交联生物材料与采用戊二醛交联所得人工生物材料的力学性能和抗酶降解性能进行研究，其结果见图1。图1中，图A、B、C、D、E和F分别为拉伸性能、拉伸断列伸长率、缝合强度、缝合断裂伸长率、胶原蛋白酶降解实验和弹性蛋白酶降解；D-PP表示脱细胞人工生物材料；OX-OH-PP表示噁唑烷的交联人工生物材料；Glut-PP表示戊二醛交联的人工生物材料。
由图1可知，本发明采用噁唑烷交联固定所得人工生物材料具有与戊二醛交联猪心包膜材料相当的力学性能，最大断裂强度大于35MPA，缝合强度大于2.5MPA。噁唑烷交联猪心包材料的抗酶降解能力与戊二醛交联猪心包材料相当，胶原蛋白酶降解失重小于5％，弹性蛋白酶降解失重小于10％。
然后，分别对实施例1所得非戊二醛交联生物材料与采用戊二醛交联所得人工生物材料进行细胞毒性和体外炎症反应研究以及内皮细胞黏附研究，其结果分别见图2和3。图2中，图A为细胞毒性研究结果；图B为促炎细胞因子TNF-α含量。图3中，图A为噁唑烷交联的人工生物材料的内皮细胞黏附研究结果；图B为戊二醛交联的人工生物材料的内皮细胞黏附研究结果。
由图2-3可知，相比于戊二醛交联猪心包材料的高细胞毒性(细胞生存率低于20％)，噁唑烷交联猪心包材料具有优异的生物相容性，细胞生存率接近100％，并表现出低的炎症反应和促内皮细胞粘附和增殖的能力。
最后，分别对实施例1所得非戊二醛交联生物材料与采用戊二醛交联所得人工生物材料进行大鼠皮下植入实验，进行体内炎症性能研究和钙化性能研究，其结果分别见图4和图5。图4中，图A为CD 3和CD 68炎症染色切片；图B为CD 3和CD 68标记炎症细胞定量数据。图5中，图A为茜素红染色钙化切片；图B为钙化定量结果。
由图4可知，噁唑烷交联猪心包材料低的炎症反应，CD3特异性标记的T-淋巴细胞和CD68特异性标记的巨噬细胞等炎症细胞量大幅低于戊二醛交联猪心包材料。
由图5可知，噁唑烷交联猪心包材料表现出优异的抗钙化能力；相比于戊二醛交联猪心包材料高的挂钙量(166.27μg/mg)，噁唑烷交联猪心包材料呈现出极低的挂钙量(1.56μg/mg)。
综上所述，本发明所得非戊二醛交联生物材料稳具有与戊二醛交联处理相当的力学性能和抗酶降解能力，比戊二醛更好的生物相容性和抗钙化能力以及低的炎症反应。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (6)

1.一种非戊二醛交联生物材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将动物生物组织进行清洗预处理，然后进行脱细胞处理，再浸入功能噁唑烷溶液中在-4-40℃温度下交联固定1-7d，得非戊二醛交联生物材料；所述功能噁唑烷溶液浓度为0.1-20wt%；
所述功能噁唑烷溶液为含有羟甲基的双环噁唑烷，其结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
所述脱细胞处理的具体步骤为：采用DNA酶、RNA酶、胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠和脱氧胆酸混合液对动物生物组织脱细胞处理3h-7d。
2.如权利要求1所述的非戊二醛交联生物材料的制备方法，其特征在于，所述清洗预处理的具体步骤为：采集新鲜的动物生物组织，用去离子水在3-5℃和80-120rpm振荡条件下清洗1.5-3h。
3.如权利要求1或2所述的非戊二醛交联生物材料的制备方法，其特征在于，所述动物生物组织为心包膜、瓣膜、硬脑膜、小肠、血管或皮肤。
4.如权利要求1所述的非戊二醛交联生物材料的制备方法，其特征在于，所述DNA酶使用浓度为100-1000U/ml，所述RNA酶使用浓度为10-250μg/ml，所述胰蛋白酶使用浓度为100-1000U/ml，所述十二烷基硫酸钠使用浓度为0 .1-2wt%，所述脱氧胆酸使用浓度为0.1-2wt%。
5.如权利要求1所述的非戊二醛交联生物材料的制备方法，其特征在于，所述非戊二醛交联生物材料为人工心脏瓣膜、人工血管、硬脑膜、疝气补片或人工皮肤置换及修补材料。
6.权利要求1-5任一项所述的非戊二醛交联生物材料的制备方法制得的非戊二醛交联生物材料。
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