CN112915261A - 一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法，包括以下步骤：(1)取预处理后得到的羊膜置于脱脂液中，封口膜密封，搅拌；(2)冲洗，沥干后置于脱细胞液中浸泡，搅拌；(3)冲洗，沥干后置于SDS溶液中搅拌；(4)冲洗，沥干后称重并粉碎，期间不间断的加入乙酸溶液；(5)将粉碎后的脱细胞羊膜过滤，向粉碎后的羊膜溶液中加入为胰蛋白酶消化，过滤获得滤液，真空冻干并粉碎；(6)将PEG溶液与脱细胞羊膜粉末混合，静置，置于37℃恒温箱反应后冷冻干燥，获得化学交联脱细胞羊膜支架；本发明中通过采用化学交联剂能够改善ECM的机械性能和稳定性；且采用本发明中的制备方法得到的羊膜支架无免疫反应。

Description

一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法
技术领域
本发明涉及医用材料技术领域，更具体的说是涉及一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，重大皮肤损伤严重危害人类健康，但目前缺乏有效治疗方法。支架材料复合干细胞的皮肤组织工程产品是治疗重大皮肤损伤理想手段，其中，脱细胞基质支架联合细胞培养构建“人工皮肤”是有效的治疗手段。脱细胞基质支架保留基质原有的胶原纤维，维持基质的基本结构，还含有细胞培养的细胞因子，将种子细胞接种于其上，基质能够为种子细胞提供适宜的生长增殖环境，是一种良好的器官培养支架。脱细胞基质支架能够作为重大皮肤损伤修复产品，其原因在于：一方面，在人体内，各种细胞生存和功能活动的微环境都可称为细胞外基质，是人体固有成分，而脱细胞基质是去除了免疫原的人体细胞外基质。另一方面，人体的细胞外基质本身就是为细胞提供一种适宜的生存和活动的微环境，去除免疫原性的脱细胞基质理论上能为各种细胞提供生长增殖的微环境。因此，脱细胞基质联合种子细胞构建人工皮肤能够很好的修复皮肤创面。
羊膜是胎盘最内层的光滑，无血管、神经及淋巴，具有一定的弹性，厚约0.02～0.5mm半透明组织，分为上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层，羊膜基底膜和羊膜基质层含有大量不同的胶原。羊膜是一种天然的细胞外基质，具有抗原性低，排异反应小，可吸收及存储方便的特点，并且它本身含有多种胶原和神经生长因子，适合临床应用。早在20世纪50年代就有人将羊膜直接应用于创面修复，随后越来越多的应用研究表明羊膜具有免疫原性低，延展性好，机械强度佳等优点。然而，由于羊膜中含有单层上皮细胞，限制了其在组织工程领域的应用。
因此，如何研制出一种能够将羊膜中的免疫原成分即细胞成分利用脱细胞技术去除，获得无免疫原细胞的羊膜基质是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法，采用化学交联剂能够与ECM(细胞外基质)中不同多肽链的氨基或羧基形成共价键，从而改善ECM的机械性能和稳定性。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜胎盘进行分离得到羊膜置于脱脂液中，封口膜密封，低温不断搅拌，得到含脱脂液的脱细胞羊膜；
(2)采用ddH2O冲洗含脱脂液的羊膜至无异味以去除脱脂液，沥干水分后置于脱细胞液中浸泡，不断搅拌，得到含脱细胞液的羊膜；
(3)采用ddH2O冲洗含脱细胞液的羊膜以去除脱细胞液，沥干水分后置于SDS溶液中低温搅拌，得到含SDS溶液的脱细胞羊膜；
(4)采用ddH2O冲洗含SDS溶液的脱细胞羊膜以去除SDS溶液，沥干水分后称重并粉碎，期间不间断的加入乙酸溶液；
(5)将粉碎后的脱细胞羊膜过滤，向粉碎后的羊膜溶液中按质量比(1:100)加入为胰蛋白酶消化6-10h，过滤获得滤液，真空冻干并粉碎；
(6)将PEG溶液与脱细胞羊膜粉末混合均匀，室温静置，置于37℃恒温箱反应后冷冻干燥，获得化学交联脱细胞羊膜支架。
本发明中的有益效果：本发明中通过采用化学交联剂能够与ECM(细胞外基质)中不同多肽链的氨基或羧基形成共价键，从而改善ECM的机械性能和稳定性；且采用本发明中的制备方法得到的羊膜支架无免疫反应。
优选地，步骤(1)中，所述取新鲜胎盘进行分离的具体操作为：取新鲜胎盘，钝性分离羊膜，去除绒毛膜组织，采用ddH2O冲洗干净。
采用上述技术方案的有益效果：通过上述步骤将除去羊膜之外的组织全部去除。
优选地，步骤(1)中，所述低温搅拌的温度为2-8℃，速度为200-1000rpm，时间为8-18h；所述羊膜与脱脂液的质量体积比为50-100g：200mL；所述脱脂液由甲醇和氯仿混合得到，所述甲醇与氯仿的体积比为1:1-2。
采用上述技术方案的有益效果：采用上述脱脂液用于脱去羊膜上的油脂，而且采用上述甲醇和氯仿混合液的脱脂效果最佳。
优选地，步骤(2)中，所述含脱脂液的羊膜与脱细胞液的质量体积比为(50-100)g：(200-500)mL；所述脱细胞液由胰蛋白酶、EDTA溶液混合得到，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.05-0.1％，所述EDTA溶液的质量浓度为0.05-0.1％。
采用上述技术方案的有益效果：脱细胞液能够保证整个细胞的完整性，减少脱细胞基质在脱细胞过程中的氧化损伤，从而增加最终得到的脱细胞羊膜支架的生物相容性。
优选地，步骤(2)中，所述浸泡温度为2-8℃，时间为8-18h；所述搅拌速度为200-1000rpm，时间为8-18h。
优选地，步骤(3)中，所述含脱细胞液的羊膜与SDS溶液的质量体积比为(50-100)g：(200-500)mL；所述SDS溶液为质量浓度为0.5-2％的十二烷基硫酸钠溶液；所述低温搅拌的温度为2-8℃，速度为200-1000rpm。
采用上述技术方案的有益效果：采用SDS溶液能够进一步脱去残骸细胞。
优选地，步骤(4)中，所述含SDS溶液的脱细胞羊膜与乙酸溶液的质量体积比为(50-100)g：500mL；所述乙酸溶液的体积浓度为0.5-2％。
采用上述技术方案的有益效果：采用乙酸溶液是为了防治升温过快。优选地，步骤(5)中，所述真空冻干的温度为-80℃，时间为48-72h；所述粉碎至脱细胞羊膜粉末的粒径为0.1-0.5mm；所述羊膜溶液和胰蛋白酶质量比为1:100，所述消化时间为6-10h。
优选地，步骤(6)的具体操作为：
(61)称取0.1g脱细胞羊膜粉末置于20mL的螺口玻璃瓶中，加入9mL体积浓度为0.1％的乙酸溶液，搅拌至完全溶解，得到脱细胞羊膜溶液；
(62)称取0.1g PEG粉末溶于1mL PBS溶液并置于1mL PEG溶液与9mL SIS溶液的混合液中，室温静置30s，随后置于25-37℃恒温箱反应18-60min，冷冻干燥后形成化学交联脱细胞羊膜支架。
本发明中还提供了一种化学交联脱细胞羊膜支架在皮肤创面修复中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法，本发明中采用的材料洁净无杂质，含有脱细胞羊膜支架的主要活性成分，将羊膜中的免疫原成分即细胞成分利用脱细胞技术去除，获得无免疫原细胞的羊膜基质，且化学交联后物理性能优，机械性能佳，能够较好的应用于重大皮肤损伤修复。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明脱细胞前后的RNA和DNA的电镜图；
图2附图为本发明脱细胞前后的RNA的含量曲线图；
图3附图为本发明脱细胞前后的DNA的含量曲线图；
图4附图为脱细胞羊膜支架外观、机械强度以及细胞毒性附图；
图5附图为脱细胞羊膜支架无免疫排斥附图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜胎盘钝性分离羊膜，去除绒毛膜组织，采用ddH2O冲洗干净；将干净的羊膜置于500mL脱脂液中，封口膜密封，在4℃下，以200rpm的速度不断搅拌，得到含脱脂液的脱细胞羊膜；其中，脱脂液由甲醇和氯仿混合得到，所述甲醇与氯仿的体积比为1:1；
(2)采用ddH2O冲洗含脱脂液的羊膜至无异味以去除脱脂液，沥干水分后置于500mL脱细胞液中浸泡，以200rpm的速度不断搅拌，得到含脱细胞液的羊膜；其中，脱细胞液由胰蛋白酶、EDTA溶液混合得到，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.05％，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.05％；
(3)采用ddH2O冲洗含脱细胞液的羊膜以去除脱细胞液，沥干水分后置于500mLSDS溶液中低温搅拌，得到含SDS溶液的脱细胞羊膜；其中，SDS溶液为质量浓度为0.5％的十二烷基硫酸钠溶液；
(4)采用ddH2O冲洗含SDS溶液的脱细胞羊膜以去除SDS溶液，沥干水分后称重并粉碎，期间不间断的加入500mL体积浓度为0.5％的乙酸溶液；
(5)将粉碎后的脱细胞羊膜过滤，向粉碎后的羊膜溶液中按质量比(1:100)加入为胰蛋白酶消化6h，过滤获得滤液，真空冻干并粉碎；(6)称取0.1g脱细胞羊膜粉末置于20mL的螺口玻璃瓶中，加入9mL体积浓度为0.1％的乙酸溶液，搅拌至完全溶解，得到脱细胞羊膜溶液；
称取0.1g PEG粉末溶于1mL PBS溶液并置于1mL PEG溶液与9mL脱细胞羊膜溶液的混合液中，室温静置30s，随后置于37℃恒温箱反应18min，冷冻干燥后形成化学交联脱细胞羊膜支架。
实施例2
化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜胎盘钝性分离羊膜，去除绒毛膜组织，采用ddH2O冲洗干净；将干净的羊膜置于200mL脱脂液中，封口膜密封，在2℃下，以500rpm的速度不断搅拌，得到含脱脂液的脱细胞羊膜；其中，脱脂液由甲醇和氯仿混合得到，所述甲醇与氯仿的体积比为1:1.5；
(2)采用ddH2O冲洗含脱脂液的羊膜至无异味以去除脱脂液，沥干水分后置于500mL脱细胞液中浸泡以500rpm的速度不断搅拌，得到含脱细胞液的羊膜；其中，脱细胞液由胰蛋白酶、EDTA溶液混合得到，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.05％，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.05％；
(3)采用ddH2O冲洗含脱细胞液的羊膜以去除脱细胞液，沥干水分后置于500mLSDS溶液中低温搅拌，得到含SDS溶液的脱细胞羊膜；其中，SDS溶液为质量浓度为1％的十二烷基硫酸钠溶液；
(4)采用ddH2O冲洗含SDS溶液的脱细胞羊膜以去除SDS溶液，沥干水分后称重并粉碎，期间不间断的加入500mL体积浓度为0.5％的乙酸溶液；
(5)将粉碎后的脱细胞羊膜过滤，向粉碎后的羊膜溶液中按质量比(1:100)加入为胰蛋白酶消化6h，过滤获得滤液，真空冻干并粉碎；
(6)称取0.1g脱细胞羊膜粉末置于20mL的螺口玻璃瓶中，加入9mL体积浓度为0.1％的乙酸溶液，搅拌至完全溶解，得到脱细胞羊膜溶液；
称取0.1g PEG粉末溶于1mL PBS溶液并置于1mL PEG溶液与9mL脱细胞羊膜溶液的混合液中，室温静置30s，随后置于37℃恒温箱反应30min，冷冻干燥后形成化学交联脱细胞羊膜支架。
实施例3
化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜胎盘钝性分离羊膜，去除绒毛膜组织，采用ddH2O冲洗干净；将干净的羊膜置于500mL脱脂液中，封口膜密封，在4℃下，以1000rpm的速度不断搅拌，得到含脱脂液的脱细胞羊膜；其中，脱脂液由甲醇和氯仿混合得到，所述甲醇与氯仿的体积比为1:2；
(2)采用ddH2O冲洗含脱脂液的羊膜至无异味以去除脱脂液，沥干水分后置于500mL脱细胞液中浸泡，以1000rpm的速度不断搅拌，得到含脱细胞液的羊膜；其中，脱细胞液由胰蛋白酶、EDTA溶液混合得到，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.1％，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.1％；
(3)采用ddH2O冲洗含脱细胞液的羊膜以去除脱细胞液，沥干水分后置于500mLSDS溶液中低温搅拌，得到含SDS溶液的脱细胞羊膜；其中，SDS溶液为质量浓度为1％的十二烷基硫酸钠溶液；
(4)采用ddH2O冲洗含SDS溶液的脱细胞羊膜以去除SDS溶液，沥干水分后称重并粉碎，期间不间断的加入500mL体积浓度为0.5％的乙酸溶液；
(5)将粉碎后的脱细胞羊膜过滤，向粉碎后的羊膜溶液中按质量比(1:100)加入为胰蛋白酶消化8h，过滤获得滤液，真空冻干并粉碎；
(6)称取0.1g脱细胞羊膜粉末置于20mL的螺口玻璃瓶中，加入9mL体积浓度为0.1％的乙酸溶液，搅拌至完全溶解，得到脱细胞羊膜溶液；
称取0.1g PEG粉末溶于1mL PBS溶液并置于1mL PEG溶液与9mL脱细胞羊膜溶液的混合液中，室温静置30s，随后置于37℃恒温箱反应60min，冷冻干燥后形成化学交联脱细胞羊膜支架。
以上实例中制备的羊膜支架均达到脱细胞佳，材料机械强度好，细胞相容性好，无免疫排斥的效果，附图为代表性测试结果。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取新鲜胎盘进行分离得到羊膜并置于脱脂液中，封口膜密封，低温不断搅拌，得到含脱脂液的羊膜；
(2)采用ddH2O冲洗含脱脂液的羊膜至无异味以去除脱脂液，沥干水分后置于脱细胞液中浸泡，不断搅拌，得到含脱细胞液的羊膜；
(3)采用ddH2O冲洗含脱细胞液的羊膜以去除脱细胞液，沥干水分后置于SDS溶液中低温搅拌，得到含SDS溶液的脱细胞羊膜；
(4)采用ddH2O冲洗含SDS溶液的脱细胞羊膜以去除SDS溶液，沥干水分后称重并粉碎，期间不间断的加入乙酸溶液；
(5)将粉碎后的脱细胞羊膜过滤，向粉碎后的羊膜溶液中加入胰蛋白酶消化，过滤获得滤液，真空冻干并粉碎；
(6)将PEG溶液与脱细胞羊膜粉末混合均匀，室温静置，置于37℃恒温箱反应后冷冻干燥，获得化学交联脱细胞羊膜支架。
2.根据权利要求1所述的一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述取新鲜胎盘进行分离的具体操作为：取新鲜胎盘，钝性分离羊膜，去除绒毛膜组织，采用ddH2O冲洗干净。
3.根据权利要求1所述的一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述低温搅拌的温度为2-8℃，速度为200-1000rpm，时间为8-18h；所述羊膜与脱脂液的质量体积比为50-100g：200mL；所述脱脂液由甲醇和氯仿混合得到，所述甲醇与氯仿的体积比为1:1-2。
4.根据权利要求1所述的一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述含脱脂液的羊膜与脱细胞液的质量体积比为(50-100)g：(200-500)mL；所述脱细胞液由胰蛋白酶、EDTA溶液混合得到，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.05-0.1％，所述EDTA溶液的质量浓度为0.05-0.1％。
5.根据权利要求1所述的一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述浸泡温度为2-8℃，时间为8-18h；所述搅拌速度为200-1000rpm，时间为8-18h。
6.根据权利要求1所述的一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述含脱细胞液的羊膜与SDS溶液的质量体积比为(50-100)g：(200-500)mL；所述SDS溶液为质量浓度为0.5-2％的十二烷基硫酸钠溶液；所述低温搅拌的温度为2-8℃，速度为200-1000rpm。
7.根据权利要求1所述的一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述含SDS溶液的脱细胞羊膜与乙酸溶液的质量体积比为(50-100)g：500mL；所述乙酸溶液的体积浓度为0.5-2％。
8.根据权利要求1所述的一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述真空冻干的温度为-80℃，时间为48-72h；所述粉碎至脱细胞羊膜粉末的粒径为0.1-0.5mm；所述羊膜溶液和胰蛋白酶质量比为1:100，所述消化时间为6-10h。
9.根据权利要求1所述的一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法，其特征在于，步骤(6)的具体操作为：
(61)称取0.1g脱细胞羊膜粉末置于20mL的螺口玻璃瓶中，加入9mL体积浓度为0.1％的乙酸溶液，搅拌至完全溶解，得到脱细胞羊膜溶液；
(62)称取0.1g PEG粉末溶于1mL PBS溶液并置于1mL PEG溶液与9mL脱细胞羊膜溶液的混合液中，室温静置30s，随后置于25-37℃恒温箱反应18-60min，冷冻干燥后形成化学交联脱细胞羊膜支架。
10.一种如权利要求书1-6任一项所述的制备方法制得的化学交联脱细胞羊膜支架在皮肤创面修复中的应用。
CN202110152324.7A 2021-02-03 2021-02-03 一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法 Pending CN112915261A (zh)

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