CN112516058A - 一种载氨基酸的改性羊膜面膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种载氨基酸的改性羊膜面膜及其制备方法。分离健康动物(绵羊、山羊、鹿)胎盘的羊膜和绒毛膜。羊膜经脱细胞处理成为羊膜脱细胞基质；绒毛膜经冻融破碎、离心分离等工艺制成绒毛膜全价氨基酸营养液。羊膜脱细胞基质以吸附的形式添加氨基酸而成为改性羊膜，后者与面膜载贴物粘合，成为载氨基酸的改性羊膜面膜。本发明面膜天然无添加，具有显著的营养皮肤、补水去皱，淡化疤痕、痘印，调节肌肤代谢及提高皮肤免疫力等美容护肤功能，对烧烫伤后皮肤的恢复有促进作用。

Description

一种载氨基酸的改性羊膜面膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及美容护肤品及美容护肤品制备方法的技术领域，尤其涉及一种载氨基酸的改性羊膜面膜及其制备方法。
背景技术
面膜通过阻隔肌肤与空气的接触、抑制皮脂分泌和汗水蒸发使肌肤温度上升，肌肤温度上升后,便会促进血液循环,使面膜内的有效成分渗入到表皮层或更深、更广的地方。血液循环加快会使皮肤红润、有光泽,而皮肤吸收更多水分、营养精华及各种有效成分后,可有效改善皮肤缺水和暗哑,减少细纹生成,延缓皮肤衰老,并在一定程度上起到祛斑和除痘的功效；使用面膜还可软化角质、扩张毛孔、促进汗腺分泌和清除表皮细胞代谢物,达到清洁与保养皮肤的效果。
英国咨询公司英敏特发布的一份报告显示，2014年，中国女性仅在面膜上的花费就达到了65亿元人民币，这比2013年高出了20％。据英敏特调查，在过去六个月内有95％的20岁～49岁的中国女性曾经使用面膜或撕式面膜。这家公司预计到2019年，中国的面膜市场预计将达到130亿元人民币。普及率升高和使用频率的增加都将促成面膜未来的增长，污染问题和极端天气将使得消费者更加频繁得使用面膜。消费者对于面膜种类的熟悉度和易于使用方式的细微差别，便利性以及合理的价格应该会在中国的推广进一步渗透。
按照面膜的功效可将其分为保湿面膜、美白面膜、淡斑面膜、紧致面膜、抗皱面膜、焕肤面膜、清洁面膜、紧致毛孔面膜和局部面膜；按照面膜的剂型可分为撕拉型面膜、泥膏面膜、乳霜面膜、啫喱面膜和贴式面膜。目前最受欢迎且销量最大的是贴式面膜，贴式面膜是将调配好的高浓度保养精华液吸附在棉布(纸)上，使用时撕开包装敷到脸上即可的一种面膜。目前市场上的面膜纸材质主要有无纺布、蚕丝、生物纤维和粘胶纤维等材质。
羊膜是众多哺乳动物胎盘的一种重要结构，为一种透明、有韧性，无神经、血管、淋巴管分布的天然生物膜，其厚度约0.02～0.05mm，光镜下自外向内分为五层。羊膜表面功能活跃的上皮层，细胞之间复杂的迷路管道系统，基底膜上丰富的半桥粒，以及基底膜和基质层中大量不同的胶原及纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等组织学特征，为羊膜在医学领域的应用提供了物质基础；透明、无血管使他成为理想的供体材料；丰富的胶原纤维增强了他的抗拉力；基底膜表面的特殊结构使上皮细胞易于生长及粘附；羊膜表面的迷路管道系统使其易于进行物质交换。羊膜的免疫学特性是它成为临床理想移植材料的基础，羊膜的抗原性很低，不易引起排斥反应，具有很好的抗炎作用和抗微生物性。
氨基酸是构成生物体蛋白质最基本的物质，并同生命活动密切相关，它在体内具有特殊的生理功能，也是机体不可缺少的营养成分，同时，具备了以下的美容与护肤功效：1.氨基酸可以提高皮肤免疫力，调节水分、酸碱，平衡油脂，可改善敏感性皮肤的抗敏能力，减少皱纹的发生。2.激活皮肤细胞SOD的活性，祛除皮肤细胞过剩的氧自由基，有效延缓皮肤衰老。3.激活巨噬细胞的吞噬功能，增强淋巴细胞的排毒、解毒功能，有效阻断外界有害物质对皮肤的侵害，并促进体内的有毒物质及衰老细胞分解代谢。4.氨基酸具有很强的锁水能力，是天然的保湿因子，这是因为氨基酸分子中含有大量亲水基团，如氨基、羟基、羧基等，它们均处于分子立体结构的表面，能大量吸收水分，在皮肤表面形成水性皮膜。5.可与皮肤内金属离子发生螯合反应，阻止过多的金属离子与皮肤胶原蛋白发生胶联作用，维持足够的胶原纤维和弹性纤维，使皮肤柔滑，细腻富有弹性。
随着对羊膜认识的不断深入，动物羊膜作为一种天然的高分子材料应用于面膜在技术上是可行的。首先，动物(绵羊、山羊、鹿)羊膜来源广泛，成本低廉；其次不存在因种间差异而产生的排异反应，且种间差异越大其生物学效应越好；第三，国内外大量的羊胎盘产品(如各种胎盘素、冻干粉、胶囊、口服液及外用产品等)通过注射、口服、外用的方式用于人类，其安全性、有效性毋容质疑，然而目前没有现有技术采用羊膜作为贴式面膜的制备原料。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提出了一种载氨基酸的改性羊膜面膜，该面膜天然无添加，具有显著的营养皮肤、补水去皱，淡化疤痕、痘印，调节肌肤代谢及提高皮肤免疫力等美容护肤功能，对烧烫伤后皮肤的恢复有促进作用。
本发明的第二发明目的在于提出了该载氨基酸的改性羊膜面膜的制备方法，该方法显著增加了羊膜吸纳外源性活性成分的能力，从而大大提高了此类面膜产品的特定功效。
为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：
一种载氨基酸的改性羊膜面膜，其特征在于，所述面膜包括氨基酸营养液，承载氨基酸营养液的羊膜基质层及面膜支持物。
其中，所述氨基酸营养液为以绒毛膜为原料制成的全价氨基酸营养液。
其中，所述羊膜基质层为动物羊膜脱去上皮细胞制成。
其中，所述羊膜基质层贴合在面膜支持物上。
其中，所述面膜中氨基酸不少于16种，氨基酸含量≥3.0mg/ml；
其中，所述动物为绵羊、山羊及鹿。
本发明的载氨基酸的改性羊膜面膜的制备方法，包括以下步骤：羊膜、绒毛膜分离→羊膜预处理→羊膜脱细胞处理→脱细胞羊膜、绒毛膜净化消毒→羊膜改性→支持物贴合→密封包装→载氨基酸改性羊膜面膜成品。
其制备方法具体步骤为：
(1)羊膜、绒毛膜分离：将胎盘清洗后钝性分离羊膜和绒毛膜，再分别清洗；
(2)羊膜预处理：将分离出的羊膜浸渍于1％的TritonX-100PBS溶液中，2～8℃振荡18～30小时，取出后洗净；
(3)羊膜脱细胞处理：首先，用胰蛋白酶+胰脂酶+EDTA混合液处理预处理后的羊膜，用蒸馏水反复清洗清除细胞碎片；其次，用DNA酶(1000～3000U/L)除去残留的细胞核成分，再用蒸馏水反复清洗去除细胞与细胞核残质；
(4)脱细胞羊膜、绒毛膜净化消毒：将脱细胞后的羊膜、分离出的绒毛膜清洗后分别用含有双抗的无菌生理盐水浸渍消毒，之后用灭菌生理盐水清洗、晾干；
(5)羊膜改性：将晾干的已消毒脱细胞羊膜浸渍于绒毛膜氨基酸营养液中，2～8℃作用15～30min；取出后，羊膜上皮面朝上，2～8℃晾干；
(6)支持物贴合：将改性羊膜上皮面朝上与涂了纤维蛋白胶的支持物贴合；
(7)检验：按《化妆品安全技术规范》(2015版)的要求抽样，对上述制成的面膜分别进行性状检验、微生物检验、氨基酸含量测定和毒理学检验；
(8)密封包装：检验合格的产品密封包装，即制成所述面膜。
所述步骤(1)中，羊膜、绒毛膜分离过程为：胎盘先用清水清洗2～3次，再用4℃预冷的磷酸盐缓冲液清洗2次；钝性分离羊膜、绒毛膜，分离的羊膜、绒毛膜再次用蒸馏水清洗2～3次。
所述步骤(2)中，1％TritonX-100的配制方法为：先配制成30％的Triton X-100储备液，临用时稀释至所需浓度；取Triton X-100及PBS混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀即可。
所述步骤(3)中，羊膜脱细胞处理的过程为：首先，用胰蛋白酶+胰脂酶+EDTA混合液处理预处理后的羊膜，使上皮细胞消化、溶解，用蒸馏水反复清洗清除细胞碎片；其次，用DNA酶(1000～3000U/L)除去残留的细胞核成分，再用蒸馏水反复清洗去除细胞与细胞核残质。
其中，所述胰蛋白酶+胰脂酶+EDTA混合液的制备方法为：0.25％胰蛋白酶7份、0.20％胰脂酶2份、0.05％EDTA 1份(V/V)按比例配制，保存于4℃备用。
其中，步骤(3)的具体操作为：取预处理后的羊膜浸渍于上述胰蛋白酶+胰脂酶+EDTA混合液中，37℃温育1小时，取出羊膜，用细胞刮子帮助脱去上皮细胞，反复冲洗；之后将其浸入DNA酶溶液中，37℃温育1小时后取出羊膜，反复冲洗，成为羊膜脱细胞基质。
其中，经过上述脱细胞处理后的羊膜，性状检验标准为：白色半透明膜；经HE染色后，在光学显微镜观查无上皮细胞残留。
所述步骤(4)中，脱细胞羊膜、绒毛膜净化消毒过程为：脱细胞羊膜先用蒸馏水清洗，再用含有双抗(青霉素500～1000U/L；链霉素300～500U/L)的无菌生理盐水浸渍消毒，浸渍时间不低于12个小时。浸渍后取出羊膜片，灭菌注射用水洗3次，再于无菌条件下2～8℃晾干。按同样的方法对绒毛膜进行净化消毒，备用。
其中，步骤(4)净化消毒过的羊膜和绒毛膜，按现行《化妆品安全技术规范》(2015版)微生物检验方法检验，应符合规定。
所述步骤(5)中，所述绒毛膜氨基酸营养液的制备方法为：(1)组织破碎：将绒毛膜组织绞碎；(2)组织匀浆：绞碎的组织按1:1与注射用水混合，经胶体磨匀浆处理15～30min得到组织匀浆液；(3)细胞破碎：将匀浆液反复冻融(-18～20℃)3～6次；(4)离心处理：将细胞破碎后的匀浆液于4℃下、4000～6000rpm离心15～30min，收集上清液；(5)灭活：离心上清液中加入浓度为0.01％的β-丙内酯，混匀，在2～8℃下灭活24h，灭活后置37℃下水解2h；(6)检验：按GB/T5009.124-2003法测定氨基酸种类和含量；(7)分装：在洁净条件下分装，即为绒毛膜氨基酸营养液。
其中，氨基酸含量测定方法为：应用全自动氨基酸分析仪，按GB/T5009.124-2003依法测定，应符合规定：氨基酸不少于16种，氨基酸含量≥3.0mg/ml。
所述步骤(6)中面膜支持物为无纺布、纤维蛋白胶膜等。
所述步骤(8)检验合格的产品密封包装，按生产日期确定产品批次。
所制成的载氨基酸改性羊膜面膜优选的贮存条件为2～8℃保存，保质期12个月。
本发明通过添加全价氨基酸，使羊膜成为载氨基酸的改性羊膜，所制成的面膜具有如下有益效果：
第一，本发明的面膜比普通面膜能更紧密的贴合皮肤，成分天然，不易过敏，不易滋生细菌，具有显著的营养皮肤、补水去皱，淡化疤痕、痘印，调节肌肤代谢及提高皮肤免疫力等美容护肤功能，因羊膜的特殊生物活性，使其对烧烫伤后皮肤的恢复有促进作用。
第二，本发明原料来源广泛，取材方便，制作成本低，相较于市场上昂贵的生物纤维面膜具有价格优势，适合工业化生产和市场推广。
具体实施方式
本发明的具体实施方式仅限于进一步解释和说明本发明，并不对本发明的内容构成限制。
本发明的载氨基酸的改性羊膜面膜的制备方法，包括以下步骤：羊膜、绒毛膜分离→羊膜预处理→羊膜脱细胞处理→脱细胞羊膜、绒毛膜净化消毒→羊膜改性→支持物贴合→密封包装→载氨基酸改性羊膜面膜成品。
实施例1：
以下以山羊胎盘为例说明。
(1)羊膜、绒毛膜分离：
健康的山羊胎盘先用清水洗净3次，再用4℃预冷的磷酸盐缓冲液清洗2次；钝性分离羊膜、绒毛膜，分离的羊膜、绒毛膜再次用蒸馏水清洗3次。
(2)羊膜预处理：
①1％TritonX-100的配制：取TritonX-100原液及PBS按体积比3:7混合，置37℃水浴中3h使其充分溶解混匀，配制成30％的TritonX-100储备液；临用时将此储备液稀释30倍配制成1％的TritonX-100溶液；
②羊膜预处理：将分离出的羊膜浸渍于1％的TritonX-100PBS溶液中，4℃振荡24小时，取出后洗净。
使用TritonX-100处理羊膜，具有溶解脂质、增加细胞膜通透性的作用，有利于细胞消化、溶解，同时，TritonX-100的去污作用，使羊膜得到进一步净化。
(3)羊膜脱细胞处理：
①配制：0.25％胰蛋白酶7份、0.20％胰脂酶2份、0.05％EDTA 1份(V/V)按比例配制成胰蛋白酶+胰脂酶+EDTA混合液，存4℃备用。
②操作：取预处理后的羊膜浸渍于上述胰蛋白酶+胰脂酶+EDTA混合液中，37℃温育1小时。之后取出羊膜，用细胞刮子帮助脱去上皮细胞，反复用蒸馏水冲洗，洗去细胞碎片。之后，再把上述羊膜浸入DNA酶溶液中，37℃温育1小时后取出羊膜，反复用蒸馏水冲洗，成为羊膜脱细胞基质。
③检验：脱细胞羊膜性状检验标准为：白色半透明膜；经HE染色后，在光学显微镜观查无上皮细胞残留。
天然羊膜具有网状结构特点，通过步骤(3)脱去其上皮细胞，使羊膜细胞外基质成为多孔的网状结构，显著增加了羊膜吸纳外源性活性成分的能力，提高值达25～30％，从而大大提高了此类面膜产品的特定功效。
(4)脱细胞羊膜、绒毛膜净化消毒：
脱细胞羊膜先用蒸馏水清洗，再用含有双抗(青霉素500～1000U/L；链霉素300～500U/L)的无菌生理盐水浸渍消毒，浸渍14个小时。浸渍后取出羊膜片，灭菌注射用水洗3次，再于无菌条件下2～8℃晾干。按同样的方法对绒毛膜进行净化消毒，备用。
上述净化消毒后的羊膜和绒毛膜按现行《化妆品安全技术规范》(2015版)微生物检验方法检验。
(5)羊膜改性：
①氨基酸营养液的制备：以净化消毒处理后的绒毛膜为原料，按以下方法制备山羊胎盘氨基酸营养液：组织破碎→组织匀浆→细胞破碎→离心处理→灭活→检验→分装。
a.组织破碎：将绒毛膜组织绞碎；
b.组织匀浆：绞碎的组织按1:1与注射用水混合，经胶体磨匀浆处理20min得到组织匀浆液；
c.细胞破碎：将匀浆液冷至-15℃，然后放于18℃迅速融化，如此反复冻融5次；
d.离心处理：将细胞破碎后的匀浆液于4℃下、5000rpm离心20min，收集上清液；
e.灭活：离心上清液中加入浓度为0.01％的β-丙内酯，混匀，在5℃下灭活24h，灭活后置37℃下水解2h；
f.检验：应用全自氨基酸分析仪,按GB/T5009.124-2003法测定氨基酸种类和含量；
g.分装：在洁净条件下分装，即为绒毛膜氨基酸营养液。
②氨基酸含量测定:按GB/T5009.124-2003测定结果符合规定：L氨基酸不少于16种，氨基酸含量≥3.0mg/ml。
使多孔的网状结构脱细胞羊膜吸附了大量的营养成分—游离氨基酸，从而具备了营养皮肤、补充水分、调节肌肤代谢的美容功能。由于羊膜本身的网状结构特点以及易吸纳外源性物质的特性，使得脱细胞处理后的羊膜细胞外基质不仅显著增加了吸附量，而且由于其缓释特性，成为一个天然的氨基酸缓释膜系统。
(6)支持物贴合：
取无纺布作为面膜支持物，涂好纤维蛋白胶，将上述改性羊膜上皮面朝上与支持物贴合，即成。
(7)检验：按《化妆品安全技术规范》(2015版)的要求抽样，对上述制成的面膜分别进行性状检验、微生物检验、氨基酸含量测定和毒理学检验。
①性状检验：脱细胞羊膜为白色半透明膜，HE染色，光学显微镜观查无上皮细胞残留。
②微生物检验：按现行《化妆品安全技术规范》(2015版)微生物检验方法检验，符合规定(同步骤(4)，合并执行)。
③氨基酸含量测定：应用全自动氨基酸分析仪，按GB/T5009.124-2003依法测定，符合以下规定：L氨基酸不少于16种，氨基酸含量≥3.0mg/ml。
④毒理学检验：按现行《化妆品安全技术规范》(2015版)毒理学检验方法检验，符合规定。
(8)密封包装：检验合格的产品密封包装，按生产日期确定产品批次，即制成所述面膜。
(9)贮存：2～8℃环境保存，保质期12个月。
为了进一步验证本发明面膜的有益效果，特找来50名各个年龄各种肤质的的女性，试用本实施例所制面膜和其它市售各品牌面膜，然后给各个指标打分，满分为10分。
本发明 品牌1 品牌2 品牌3 品牌4 品牌5 品牌6 品牌7
价格(元/片) —— 27 9 100 15 10 18 30
补水效果 9 10 7 8 8 8 8 9
肤感 10 7 8 5 7 7 8 10
吸收 10 9 8 10 7 7 7 9
满意度 9.5 9 7.5 8 7.5 8 8 9
从上表可以看出，面膜的价格和满意度没有必然的联系，有些是品牌的广告效益等因素所致，市场上的面膜大多专注在某一项功能上，功效不全面且不易持久。本发明面膜在补水效果、肤感及吸收方面都属于前列。由于羊膜具有缓释的生物特性，本发明面膜能慢慢的通过毛孔深入皮肤内层保养，且本发明面膜原料来源广泛，取材方便，制作成本低，作为一款全效面膜有很好的市场前景。

Claims (9)

1.一种载氨基酸的改性羊膜面膜，其特征在于，所述面膜包括氨基酸营养液，承载氨基酸营养液的羊膜基质层及面膜支持物，所述羊膜基质层为动物胎盘羊膜脱去上皮细胞制成，所述羊膜基质层贴合在面膜支持物上。
2.根据权利要求1所述的载氨基酸的改性羊膜面膜，其特征在于，所述氨基酸营养液为以绒毛膜为原料制成的全价氨基酸营养液。
3.根据权利要求1所述的载氨基酸的改性羊膜面膜，其特征在于，所述面膜中氨基酸不少于16种，氨基酸含量≥3.0mg/ml。
4.根据权利要求1所述的载氨基酸的改性羊膜面膜，其特征在于，所述动物为绵羊、山羊及鹿。
5.一种如权利要求1～4所述的载氨基酸的改性羊膜面膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：羊膜、绒毛膜分离→羊膜预处理→羊膜脱细胞处理→脱细胞羊膜、绒毛膜净化消毒→羊膜改性→支持物贴合→密封包装→载氨基酸改性羊膜面膜成品。
6.根据权利要求5所述的载氨基酸的改性羊膜面膜的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)羊膜、绒毛膜分离：将胎盘清洗后钝性分离羊膜和绒毛膜，再分别清洗；
(2)羊膜预处理：将分离出的羊膜浸渍于1％的TritonX-100PBS溶液中，2～8℃振荡18～30小时，取出后洗净；
(3)羊膜脱细胞处理：首先，用胰蛋白酶+胰脂酶+EDTA混合液处理预处理后的羊膜，用蒸馏水反复清洗清除细胞碎片；其次，用DNA酶(1000～3000U/L)除去残留的细胞核成分，再用蒸馏水反复清洗去除细胞与细胞核残质；
(4)脱细胞羊膜、绒毛膜净化消毒：将脱细胞后的羊膜、分离出的绒毛膜清洗后分别用含有双抗的无菌生理盐水浸渍消毒，之后用灭菌生理盐水清洗、晾干；
(5)羊膜改性：将消毒后的脱细胞羊膜浸渍于绒毛膜氨基酸营养液中，2～8℃作用15～30min；取出后，羊膜上皮面朝上，2～8℃晾干；
(6)支持物贴合：将改性羊膜上皮面朝上与涂了纤维蛋白胶的支持物贴合；
(7)检验：按《化妆品安全技术规范》(2015版)的要求抽样，对上述制成的面膜分别进行性状检验、微生物检验、氨基酸含量测定和毒理学检验；
(8)密封包装：检验合格的产品密封包装，即制成所述面膜。
7.根据权利要求6所述的载氨基酸的改性羊膜面膜的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中所述胰蛋白酶+胰脂酶+EDTA混合液的制备方法为：0.25％胰蛋白酶7份、0.20％胰脂酶2份、0.05％EDTA 1份(V/V)按比例配制，保存于4℃备用；步骤(3)的具体操作为：取预处理后的羊膜浸渍于上述混合液中，37℃温育1小时，取出羊膜，用细胞刮子帮助脱去上皮细胞，反复冲洗；之后将其浸入DNA酶溶液中，37℃温育1小时后取出羊膜，反复冲洗，成为羊膜脱细胞基质。
8.根据权利要求6所述的载氨基酸的改性羊膜面膜的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中所述浸渍时间不低于12小时。
9.根据权利要求6所述的载氨基酸的改性羊膜面膜的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中所述绒毛膜氨基酸营养液的制备方法为：(1)组织破碎：将绒毛膜组织绞碎；(2)组织匀浆：绞碎的组织按1:1与注射用水混合，经胶体磨匀浆处理15～30min得到组织匀浆液；(3)细胞破碎：将匀浆液反复冻融(-18～20℃)3～6次；(4)离心处理：将细胞破碎后的匀浆液于4℃下、4000～6000rpm离心15～30min，收集上清液；(5)灭活：离心上清液中加入浓度为0.01％的β-丙内酯，混匀，在2～8℃下灭活24h，灭活后置37℃下水解2h；(6)检验：按GB/T5009.124-2003法测定氨基酸的种类和含量；(7)分装：在洁净条件下分装，即为绒毛膜氨基酸营养液。
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