CN110101909A - 一种产品性能可控的脱细胞生物羊膜的制备方法 - Google Patents

一种产品性能可控的脱细胞生物羊膜的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110101909A
CN110101909A CN201910169303.9A CN201910169303A CN110101909A CN 110101909 A CN110101909 A CN 110101909A CN 201910169303 A CN201910169303 A CN 201910169303A CN 110101909 A CN110101909 A CN 110101909A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
amnion
preparation
product
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910169303.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110101909B (zh
Inventor
刘伟
崔鑫
李宗燕
李燕青
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Qingyuan Weiye Bio Tissue Engineering Co ltd
Original Assignee
100 Macau (tianjin) Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 100 Macau (tianjin) Biotechnology Co Ltd filed Critical 100 Macau (tianjin) Biotechnology Co Ltd
Publication of CN110101909A publication Critical patent/CN110101909A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110101909B publication Critical patent/CN110101909B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/60—Materials for use in artificial skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种产品性能可控的脱细胞生物羊膜的制备方法，属于生物材料领域。产品性能可控指，采用下述公式通过控制脱细胞液的浓度、脱细胞处理时间和脱细胞处理温度来控制所述脱细胞生物羊膜的产品的拉伸强度、降解时间：Y1＝52.59‑7X1‑3X2‑4.5X3+0.25X1X2+0.25X1X3+1.75X2X3；Y2＝9.67‑1.77X1‑0.99X2‑1.12X3+0.34X1X2+0.36X1X3+0.54X2X3；上述公式中，Y1为降解时间，Y2为拉伸强度；X1代表脱细胞液的浓度；X2代表处理时间；X3代表处理温度。本发明可对产品性能做有效预测及控制，并能获得性能优良的脱细胞生物羊膜产品。

Description

一种产品性能可控的脱细胞生物羊膜的制备方法
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种产品性能可控的脱细胞生物羊膜的制备方法。
背景技术
羊膜是胎盘的最内层，主要由Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原组成，无神经和血管，具有一定的弹性，表面光滑，厚约0.02-0.5mm，其结构主要分为上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层。羊膜含有大量干细胞生长因子和成纤维细胞生长因子，可以促进细胞的分化和增值，为缺损组织的快速修复起到了关键的作用。同时生物羊膜还可以通过抑制某些特定转化因子如TGF-β的表达来抑制纤维母细胞的形成，进而减轻组织瘢痕的形成。另外，羊膜无HLA-A，B或DR抗原，免疫性极低，移植到体内几乎不会发生特异性排斥反应。由于其优越的生物学性能，已成为众多生物公司研究的热点。
国内已经有公司推出羊膜产品，其制备工艺各有不同，产品对应的适应症也有不同。目前国内的生物羊膜大部分被用于眼表修复、骨修复和表皮修复领域。脱细胞生物羊膜主要用到对免疫原性要求高的适应症，但羊膜的厚度较薄且质地柔软，一般的脱细胞液很难避免对其结构造成影响，脱细胞后生物羊膜的厚度和韧性会随之变低，降解时间变短，临床的应用产生局限性，脱细胞液的浓度对性能的影响研究显得格外重要。
目前常用来脱细胞的试剂主要有酸碱，高低渗盐溶液，十二烷基硫酸钠，胰蛋白酶等其中的一种或几种的混合，选用合适浓度的脱细胞试剂对羊膜进行处理是影响羊膜产品性能的关键，浓度过高时，试剂会对材料的结构性能产生影响；浓度过低时，试剂无法去除细胞。面对不同的医学需求，需要选择合适的脱细胞试剂对羊膜进行处理，对于不同的修复领域，需要选择各项性能不同的脱细胞羊膜产品，包括不同的力学强度、不同的降解时间等，本领域尚未出现一种在制备过程中根据不同的修复需求通过控制脱细胞液浓度、脱细胞时间来控制最终产品上述各方面性能的方法，因此本领域亟需开发一种产品性能可控的脱细胞羊膜的制备方法。
发明内容
基于本领域存在的客观问题及上述需求，本发明提供了一种产品性能可控的脱细胞生物羊膜的制备方法，能在制备过程中根据最终的产品应用领域所需的性能要求来控制制备步骤中的各参数
本发明的技术方案如下：
一种产品性能可控的脱细胞生物羊膜的制备方法，其特征在于：所述产品性能可控指，采用下述预测公式通过控制脱细胞液的浓度、处理时间和处理温度来控制所述脱细胞生物羊膜的产品的拉伸强度、降解时间：
Y1＝52.59-7X1-3X2-4.5X3+0.25X1X2+0.25X1X3+1.75X2X3；
Y2＝9.67-1.77X1-0.99X2-1.12X3+0.34X1X2+0.36X1X3+0.54X2X3；
上述公式中，Y1为降解时间，Y2为拉伸强度；X1代表脱细胞液的浓度；X2代表时间；X3代表温度；
所述制备方法包括：将消毒后的羊膜组织先后放入两种不同的脱细胞液中处理；所述脱细胞液的浓度、所述处理的时间和温度根据所述脱细胞生物羊膜的产品要求的拉伸强度、降解时间通过上述公式计算确定。
所述脱细胞液选自酸碱，高低渗盐溶液，十二烷基硫酸钠，胰蛋白酶；
所述将消毒后的羊膜组织先后放入两种不同的脱细胞液中处理指：将消毒后的羊膜组织先后放入两种不同的脱细胞液中浸泡。
所述将消毒后的羊膜组织先后放入两种不同的脱细胞液中处理指：将消毒后的羊膜组织先后放入胰蛋白酶液和十二烷基硫酸钠溶液中浸泡。
所述胰蛋白酶液的浓度为0.20％，0.30％，0.40％；所述胰蛋白酶液的中的浸泡时间为10-25h，优选18h，浸泡温度为2-26℃，优选2-8℃；
所述十二烷基硫酸钠溶液的浓度为0.20％，0.30％，0.40％；所述十二烷基硫酸钠溶中的浸泡时间为10-30min，优选20min，浸泡温度为15-30℃，优选为20-25℃。
所述十二烷基硫酸钠溶液中浸泡的同时伴随振荡，振荡频率为100-120r/min，优选110r/min；反复浸泡3-5次，优选4次。
一种产品性能可控的脱细胞生物羊膜的制备方法，还包括：在脱细胞液中处理之前将羊膜组织进行消毒、清洗；在脱细胞液中处理之后将羊膜组织清洗、冻干、灭菌。
所述消毒指，将羊膜组织先后放入消毒液：过氧化氢溶液和酒精中浸泡；
优选地，所述过氧化氢溶液浓度为3％；所述酒精为浓度为75％的酒精溶液；
更优选地，羊膜组织在过氧化氢溶液中的浸泡30min，且每隔10min搅拌一次；羊膜组织在过氧化氢溶液中浸泡完毕后清洗4-8次，再放入酒精中浸泡30min，每隔10min搅拌一次；酒精浸泡完毕后清洗羊膜组织4-8次，再放入脱细胞液中处理。
在脱细胞液中处理之后将羊膜组织清洗4-8次；所述灭菌指辐照灭菌。
所述羊膜组织取自胎盘羊膜；所述胎盘选自人胎盘，牛胎盘，羊胎盘。
根据上述制备方法制备得到的脱细胞生物羊膜。
本发明的有益效果在于，一方面，提供了一种产品性能可控的脱细胞生物羊膜的制备方法，并得到了羊膜材料力学拉伸强度、降解所需时间与脱细胞液浓度、处理时间、处理温度的关系，在面对不同修复领域、不同性能要求的羊膜产品要求时，可根据本发明提供的制备方法中的公式，将所需羊膜产品性能参数代入公式计算得到制备方法过程中所需的脱细胞液的浓度、脱细胞处理时间等环节的参数，使最终实际获得的脱细胞羊膜成品符合预期的产品性能要求。本发明通过试验验证了脱细胞生物羊膜产品的力学拉伸强度、降解时间等响应变量的预测值和实验值十分接近，降解时间和拉伸强度的预测值与实验平均值的相对误差分别为1.2％和1.1％，这说明能够利用响应变量回归模型对脱细胞条件下的降解时间和拉伸强度进行有效的预测和控制，另一方面，为不同医学需求选择合适性能的羊膜材料提供了一套最佳的脱细胞工艺，其中包括优化出最佳的脱细胞液浓度，并充分保证试剂在去除细胞的前提下对产品性能的影响最小。
说明书附图
图1中，a-d分别为胰蛋白酶和SDS浓度为0，0.20％，0.30％，0.40％；放大倍数1:200时，羊膜中细胞残留情况。
图2中，a，c为脱细胞羊膜；b，d分别为人真皮成纤维细胞培养后羊膜及肾小管细胞培养后羊膜
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，下述实施例只是说明性的，并不限制本发明保护范围。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
生物材料的来源
下面实施例和实验例用到的胎盘来自北京清华长庚妇产医院。
第1组实施例、本发明的脱细胞羊膜的制备方法
本组实施例提供一种产品性能可控的脱细胞生物羊膜的制备方法，其特征在于：所述产品性能可控指，采用下述预测公式通过控制脱细胞液的浓度、处理时间和处理温度来控制所述脱细胞生物羊膜的产品的拉伸强度、降解时间：
Y1(降解时间)＝52.59-7X1-3X2-4.5X3+0.25X1X2+0.25X1X3+1.75X2X3；
Y2(拉伸强度)＝9.67-1.77X1-0.99X2-1.12X3+0.34X1X2+0.36X1X3+0.54X2X3；
上述公式中，X1代表脱细胞液的浓度；X2代表时间；X3代表温度；
所述制备方法包括：将消毒后的羊膜组织先后放入两种不同的脱细胞液中处理；所述脱细胞液的浓度、所述处理的时间和温度根据所述脱细胞生物羊膜的产品要求的拉伸强度、降解时间通过上述公式计算确定。
在具体的实施例中：所述脱细胞液选自酸碱，高渗盐溶液，低渗液，十二烷基硫酸钠，胰蛋白酶等；
所述酸碱选自盐酸、醋酸、EDTA、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氨水等；
所述高渗盐溶液选自1-3mol/L的氯化钠或氯化钾溶液，所述低渗液选自质量分数为0.9％的氯化钠或氯化钾溶液或纯化水。
所述将消毒后的羊膜组织先后放入两种不同的脱细胞液中处理指：将消毒后的羊膜组织先后放入两种不同的脱细胞液中浸泡。
在一些实施例中：所述将消毒后的羊膜组织先后放入两种不同的脱细胞液中处理指：将消毒后的羊膜组织先后放入胰蛋白酶液和十二烷基硫酸钠溶液中浸泡。胰酶作用是从组织上分离细胞，SDS可以裂解细胞同时去除细胞碎片，顺序不能颠倒，否则影响脱细胞效果。
在优选的实施例中：所述胰蛋白酶液的质量浓度为0.10％-0.60％，优选0.10％，0.20％，0.30％，0.40％，0.50％，0.60％；所述胰蛋白酶液的中的浸泡时间为10-25h，优选18h，浸泡温度为2-26℃，优选2-8℃；
所述十二烷基硫酸钠溶液的质量浓度为0.10％-0.60％，优选0.10％，0.20％，0.30％，0.40％，0.50％，0.60％；所述十二烷基硫酸钠溶中的浸泡时间为10-30min，优选20min，浸泡温度为15-30℃，优选为20-25℃。
在另一些实施例中，所述十二烷基硫酸钠溶液中浸泡的同时伴随振荡，振荡频率为100-120r/min，优选110r/min；反复浸泡3-5次，优选4次。伴随振荡的好处是使充分反应，去除细胞更充分；所述反复浸泡指第一次浸泡完后，重新换液，再浸泡相同的时间，好处是移去已脱除的杂质，不被已经脱除的杂质影响脱细胞效果。而胰蛋白酶液处理时则无需反复浸泡。
优选地，所述第一次浸泡的时间为20min，时间太久会损坏基质。
在进一步的实施例中，所述制备方法还包括：在脱细胞液中处理之前将羊膜组织进行消毒、清洗；在脱细胞液中处理之后将羊膜组织清洗、冻干、灭菌。
在具体的实施例中，所述消毒指，将羊膜组织先后放入消毒液：过氧化氢溶液和酒精中浸泡；
优选地，所述过氧化氢溶液指质量分数为3％的过氧化氢溶液；所述酒精为浓度为75％的酒精溶液；
更优选地，羊膜组织在过氧化氢溶液中的浸泡30min，且每隔10min搅拌一次；羊膜组织在过氧化氢溶液中浸泡完毕后，用纯化水清洗4-8次，再放入酒精中浸泡30min，每隔10min搅拌一次；酒精浸泡完毕后用纯化水清洗羊膜组织4-8次，再放入脱细胞液中处理。搅拌的作用是使反应充分，使消毒效果更好。
在更具体的实施例中，在脱细胞液中处理之后将羊膜组织用纯化水清洗4-8次；所述灭菌指辐照灭菌。
在一些实施例中，所述羊膜组织取自胎盘羊膜；所述胎盘选自人胎盘，牛胎盘，羊胎盘。第2组实施例、本发明的脱细胞羊膜产品
本组实施例提供一种脱细胞羊膜产品。本组所有的实施例都具备如下特征：所述脱细胞羊膜产品为第1组实施例任一所述的制备方法制备得到的脱细胞生物羊膜。
在一些具体的实施例中，所述脱细胞羊膜产品可以用来进行眼表修复、骨修复、表皮修复，骨修复主要是针对骨科的肌腱修复。
在理论上，一般眼表修复需要的羊膜强度不如肌腱修复等应力性组织大，厚度的选择也是根据每个使用者的具体情况而定，而降解时间一般都是根据自身组织的修复周期来选择合适的工艺处理的羊膜，目前上市的羊膜产品，主要用到眼表、肌腱和表皮的修复。
在面对不同修复领域、不同性能要求的羊膜产品要求时，可根据本发明提供的制备方法中的公式，将所需羊膜产品性能参数代入公式计算得到制备方法过程中所需的脱细胞液的浓度、脱细胞处理时间等环节的参数，使最终实际获得的脱细胞羊膜成品符合预期的产品性能要求。
实验例1本发明预测公式的验证
表1本发明的预测公式
上述预测公式是以脱细胞液质量浓度(X1，％)、处理时间(X2，h)，和温度(X3，℃)3个因素作为自变量，以羊膜的降解时间(Y1，天)，拉伸强度(Y2，Mpa)，作为响应值，利用该预测公式进行羊膜产品的制备并对最终羊膜产品的性能进行实测验证，具体试验设计及结果分别见下表2和表3。
具体操作方法为：将产品的降解时间预估在38-65天，将拉伸强度预估在6.7-13.5Mpa，通过上述预测公式将制备工艺过程中需要控制的3个因素进行计算，得到如表2所示的自变量。同时，妇产医院取得新鲜人胎盘，前处理清洗去除残留血液，轻轻钝性分离出羊膜组织；配制浓度为3％的过氧化氢溶液1L，将上述分离的羊膜放入过氧化氢溶液中浸泡30min，每隔10min搅拌一次；清洗上述消毒的羊膜4-8次；配制浓度为75％的酒精，将上述清洗的羊膜放入酒精中浸泡30min，每隔10min搅拌一次；清洗上述消毒的羊膜4-8次；配制浓度为0.20％、0.30％、0.40％的胰蛋白酶溶液1L，将上述清洗的羊膜放入胰蛋白酶溶液浸泡15h，温度为2℃、4℃、8℃、15℃、26℃；配制浓度为0.20％、0.30％、0.40％的SDS溶液，将上述羊膜放入SDS溶液浸泡20min，震荡频率110r/min，共4次。将上述羊膜清洗4-8次，冻干，辐照灭菌保存。
表2羊膜脱细胞工艺设计的因素和水平表
表3利用预测公式设计羊膜脱细胞工艺及产品实际结果
可见，表3得到的羊膜脱细胞产品的降解时间和拉伸强度的实测结果均在预估范围内，初步验证本发明预测公式的准确性。
最优条件的确定
最大响应面预测值及最佳因素预测值如表4所示，降解时间和拉伸强度的最大预测值分别为66.37天和13.69Mpa，对应的工艺分别为脱细胞浓度0.2％、时间12.69h、温度4.28℃，由此可以看出，浓度低的脱细胞液和短的处理时间及低的处理温度会提高产品的降解时间和拉伸强度。这是由于酶浓度过高，导致对基质的破坏增大，温度增大也会增加酶的活性使酶更容易破坏基质。
表4最大响应面预测值及最佳因素预测值
本实验例用于测定产品的降解时间的实验如下：将脱细胞样品剪裁成大小为约2*2.5cm尺寸，烘干至恒重(或冻干)。放入装有25mL降解液的小烧杯中，降解液为:含12.5U/mLⅠ型胶原酶的模拟体液(PBS中)。37℃水浴100r/min振荡，肉眼观察直到样品基质彻底散架，此为降解终点。
本实验例用于测定产品的拉伸强度的实验如下：将脱细胞后的样品裁剪成打小为1.5*5cm尺寸，保持湿态，用万能力学试验机进行拉伸强度测试，速度为10mm/min，以羊膜完全断裂为判断终点。
本领域公知，羊膜产品并非降解时间越长越好，不同的修复应用领域需要的羊膜产品的降解时间不同，需要做适当的控制。专利201510727418.7中测试的京尼平交联的羊膜，其用的体外降解实验，胶原酶浓度为0.05mg/ml，本发明用的是一型胶原酶浓度为12.5U/mL，约为0.0625mg/ml，且降解终点以基质彻底溶解为判断标准，降解时间并非越长越好，不同组织修复领域有不同的要求。本发明最大的优势是提供一种可预估性能的样品制备方法来合理选用试剂和条件。
而在拉伸强度方面，本发明的制备方法获得的羊膜产品能达6.75Mpa-13.48Mpa，远高于现有技术。
本发明所述制备方法中用到的上述公式(方程)主要是基于脱细胞液的浓度、脱细胞处理时间、处理温度等变量对产品性能进行预测和控制，两种脱细胞液的浓度相同的情况，才适用本发明的预测公式；对于处理时间和温度，两种脱细胞液可以有差别，对最终产品性能的预测和控制影响不大；本发明的最优工艺中，处理时间和温度这两个变量主要以第一种脱细胞液：胰蛋白酶的处理时间和温度为准。
实验例2最优条件的验证
在最佳工艺下各个响应变量对应的预测值进行数据估算，重新生产3批羊膜样品，配制浓度为0.20％的胰蛋白酶溶液1L，将上述清洗的羊膜放入胰蛋白酶溶液浸泡12.7h，温度为4℃；配制浓度为0.20％的SDS溶液，将上述羊膜放入SDS溶液浸泡20min，震荡频率110r/min，共4次。将上述羊膜清洗4-8次，冻干，辐照灭菌保存。
表5最佳工艺下响应变量的预测值和实验值
最佳工艺下各个响应变量的预测值和实验值如表5所示，可以看出响应变量的预测值和实验值十分接近，降解时间和拉伸强度的预测值与实验平均值的相对误差分别为1.2％和1.1％，这说明能够利用响应变量回归模型对脱细胞条件下的降解时间和拉伸强度进行有效的预测。
实验例3最优条件的二次验证
重新生产3批不同工艺浓度羊膜样品，配制浓度为0.10％、0.50％、0.60％的胰蛋白酶溶液1L，将上述清洗的羊膜放入胰蛋白酶溶液浸泡5h，温度为8℃；配制浓度为0.10％、0.50％、0.60％的SDS溶液，将上述羊膜放入SDS溶液浸泡20min，震荡频率110r/min，共4次。将上述羊膜清洗4-8次，冻干，辐照灭菌保存。
表6不同工艺下响应变量的预测值和实验值
表6可以看出响应变量的预测值和实验值十分接近，降解时间和拉伸强度的预测值与实验平均值的相对误差分别为3.4％和6.1％(均小于10％)，这进一步说明能够利用响应变量回归模型对脱细胞条件下的降解时间和拉伸强度进行有效的预测。
实验例4本发明羊膜产品的脱细胞效果验证
对实验例1中不同工艺处理的羊膜进行脱细胞残留检测，通过HE染色，观察细胞残留，见图1。
结果显示，未脱细胞前，羊膜中存在着大量的的细胞(a图)，当用0.20％脱细胞液处理后，去除了大量的细胞(b图)，且细胞残留量随着脱细胞液浓度的增加继续降低，当脱细胞液浓度为0.30％(c图)时细胞基本去除，只有少量细胞碎片残留，当脱细胞液浓度为0.40％时(d图)，细胞彻底去除。
综上，羊膜中细胞残留量也随着胰蛋白酶溶液浓度和SDS溶液浓度的增大而减少，当胰蛋白酶溶液浓度和SDS溶液浓度为0.4％时，羊膜中细胞已彻底去除。
实验例5本发明羊膜产品的细胞相容性效果验证
对实验例1中试验1组处理的脱细胞羊膜进行细胞相容性研究，分别用人真皮成纤维细胞和肾小管细胞与脱细胞羊膜进行共培养48小时(37℃，二氧化碳浓度5％)，取出羊膜进行HE染色，观察细胞的长入情况，见图2。
结果显示，脱细胞后的羊膜未见任何细胞(a，c图)，将其分别与人真皮成纤维细胞和肾小管细胞共培养一段时间后，细胞均成功长入脱细胞羊膜(b，d图)，说明了脱细胞羊膜良好的细胞相容性。

Claims (10)

1.一种产品性能可控的脱细胞生物羊膜的制备方法，其特征在于：所述产品性能可控指，采用下述公式通过控制脱细胞液的浓度、脱细胞处理时间和脱细胞处理温度来控制所述脱细胞生物羊膜的产品的拉伸强度、降解时间：
Y1＝52.59-7X1-3X2-4.5X3+0.25X1X2+0.25X1X3+1.75X2X3；
Y2＝9.67-1.77X1-0.99X2-1.12X3+0.34X1X2+0.36X1X3+0.54X2X3；
上述公式中，Y1为降解时间，Y2为拉伸强度；X1代表脱细胞液的浓度；X2代表处理时间；X3代表处理温度；
所述制备方法包括：将消毒后的羊膜组织先后放入两种不同的脱细胞液中处理；所述脱细胞液的浓度、所述处理时间和处理温度根据所述脱细胞生物羊膜的产品要求的拉伸强度、降解时间通过上述公式计算确定。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述脱细胞液选自酸碱，高渗盐溶液，低渗液，十二烷基硫酸钠，胰蛋白酶；
所述酸碱选自盐酸、醋酸、EDTA、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氨水等；
所述高渗盐溶液选自1-3mol/L的氯化钠或氯化钾溶液，所述低渗液选自质量分数为0.9％的氯化钠或氯化钾溶液或纯化水；
所述将消毒后的羊膜组织先后放入两种不同的脱细胞液中处理指：将消毒后的羊膜组织先后放入两种不同的脱细胞液中浸泡。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述将消毒后的羊膜组织先后放入两种不同的脱细胞液中处理指：将消毒后的羊膜组织先后放入胰蛋白酶液和十二烷基硫酸钠溶液中浸泡。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述胰蛋白酶液的质量浓度为0.10％-0.60％，优选0.10％，0.20％，0.30％，0.40％，0.50％，0.60％；所述胰蛋白酶液的中的浸泡时间为10-25h，优选18h，浸泡温度为2-26℃，优选2-8℃；
所述十二烷基硫酸钠溶液的质量浓度为0.10％-0.60％，优选0.10％，0.20％，0.30％，0.40％，0.50％，0.60％；所述十二烷基硫酸钠溶中的浸泡时间为10-30min，优选20min，浸泡温度为15-30℃，优选为20-25℃。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述十二烷基硫酸钠溶液中浸泡的同时伴随振荡，振荡频率为100-120r/min，优选110r/min；反复浸泡3-5次，优选4次；
优选地，所述反复浸泡指第一次浸泡完后，重新换液，再浸泡相同的时间；所述第一次浸泡的时间为20min。
6.根据权利要求1-5任一所述的制备方法，还包括：在脱细胞液中处理之前将羊膜组织进行消毒、清洗；在脱细胞液中处理之后将羊膜组织清洗、冻干、灭菌。
7.根据权利要求6所述的制备方法，所述消毒指，将羊膜组织先后放入消毒液：过氧化氢溶液和酒精中浸泡；
优选地，所述过氧化氢溶液的质量浓度为3％；所述酒精为浓度为75％的酒精溶液；
更优选地，羊膜组织在过氧化氢溶液中的浸泡30min，且每隔10min搅拌一次；羊膜组织在过氧化氢溶液中浸泡完毕后清洗4-8次，再放入酒精中浸泡30min，每隔10min搅拌一次；酒精浸泡完毕后清洗羊膜组织4-8次，再放入脱细胞液中处理。
8.根据权利要求6所述的制备方法，在脱细胞液中处理之后将羊膜组织清洗4-8次；所述灭菌指辐照灭菌。
9.根据权利要求1-8任一所述的制备方法，所述羊膜组织取自胎盘羊膜；所述胎盘选自人胎盘，牛胎盘，羊胎盘。
10.根据权利要求1-9任一所述制备方法制备得到的脱细胞生物羊膜。
CN201910169303.9A 2018-12-20 2019-03-06 一种产品性能可控的脱细胞生物羊膜的制备方法 Active CN110101909B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2018115668837 2018-12-20
CN201811566883 2018-12-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110101909A true CN110101909A (zh) 2019-08-09
CN110101909B CN110101909B (zh) 2021-10-22

Family

ID=67484222

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910169303.9A Active CN110101909B (zh) 2018-12-20 2019-03-06 一种产品性能可控的脱细胞生物羊膜的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110101909B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110917382A (zh) * 2019-12-02 2020-03-27 江南大学 一种羊膜-海绵状壳聚糖复合双层伤口敷料的制备方法
CN112915261A (zh) * 2021-02-03 2021-06-08 英中再生医学(山东)有限公司 一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102218162A (zh) * 2011-05-24 2011-10-19 山西奥瑞生物材料有限公司 一种同种脱细胞真皮基质制备方法
CN103861151A (zh) * 2014-03-27 2014-06-18 成都青山利康药业有限公司 一种脱细胞胎盘基质材料的制备方法
CN105194735A (zh) * 2015-10-30 2015-12-30 成都青山利康药业有限公司 一种脱细胞生物羊膜及种以及京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102218162A (zh) * 2011-05-24 2011-10-19 山西奥瑞生物材料有限公司 一种同种脱细胞真皮基质制备方法
CN103861151A (zh) * 2014-03-27 2014-06-18 成都青山利康药业有限公司 一种脱细胞胎盘基质材料的制备方法
CN105194735A (zh) * 2015-10-30 2015-12-30 成都青山利康药业有限公司 一种脱细胞生物羊膜及种以及京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110917382A (zh) * 2019-12-02 2020-03-27 江南大学 一种羊膜-海绵状壳聚糖复合双层伤口敷料的制备方法
CN112915261A (zh) * 2021-02-03 2021-06-08 英中再生医学(山东)有限公司 一种化学交联脱细胞羊膜支架的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110101909B (zh) 2021-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hoganson et al. The retention of extracellular matrix proteins and angiogenic and mitogenic cytokines in a decellularized porcine dermis
US5916266A (en) Raw membranous material for medical materials and manufacturing methods thereof
Lu et al. Novel porous aortic elastin and collagen scaffolds for tissue engineering
CN107397978B (zh) 动物膀胱脱细胞基质的制备方法、所得的基质及应用
CN105797212A (zh) 一种用于皮肤难愈合创面修复的脱细胞羊膜制备方法及应用
CN104312140B (zh) 一种聚氨酯/小肠粘膜下层复合材料及用途
CN110101909A (zh) 一种产品性能可控的脱细胞生物羊膜的制备方法
CN109621010A (zh) 一种脱细胞软骨基质及其制备方法
CN108421087A (zh) 一种复合间充质干细胞的功能胶原支架及其应用
CN106075579A (zh) 鱼皮衍生组织修复材料及其制造方法
Lee et al. High-performance acellular tissue scaffold combined with hydrogel polymers for regenerative medicine
CN107233622A (zh) 一种脱细胞组织膜的制备方法
CN103861151A (zh) 一种脱细胞胎盘基质材料的制备方法
CN109602954A (zh) 一种脱细胞神经基质及其制备方法
CN108245708A (zh) 一种诱导肌腱组织再生的生物活性支架及其制备方法和用途
CN111084900A (zh) 一种脱细胞鱼皮基质的制备方法及其应用
Sokol et al. Comparison of bovine pericardium decellularization protocols for production of biomaterial for cardiac surgery
CN106563173B (zh) 一种脱细胞生物真皮材料及其制备方法和应用
JP2008228744A (ja) 生体由来移植用組織の石灰化を抑制するための処理方法および処理された組織
CN109529121A (zh) 一种脱细胞血管基质及其制备方法
CN104971386B (zh) 丝蛋白支架材料及其制备方法
CN108404212A (zh) 一种脱细胞真皮基质材料的制备方法
Xu et al. Effect of carbodiimide cross-linking of decellularized porcine pulmonary artery valvular leaflets
CN105497983A (zh) 一种简单高效的干细胞贴片制备方法
CN114306755B (zh) 一种后巩膜加固术用生物补片及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230327

Address after: Floor 3, Building 6, Yard 50, Huatuo Road, Daxing Biomedical Industry Base, Zhongguancun Science Park, Daxing District, Beijing 102600

Patentee after: BEIJING QINGYUAN WEIYE BIO-TISSUE ENGINEERING Co.,Ltd.

Address before: 301714 room 212-18, No.10 commercial district, Hexiwu Town, Wuqing District, Tianjin (centralized office area)

Patentee before: BAIAO RUIPAI (TIANJIN) BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.