CN112773936B - 一种改性心包膜及其制备方法、人工心脏瓣膜假体 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种改性心包膜及其制备方法、人工心脏瓣膜假体，主要采用的技术方案为：所述改性心包膜的制备方法，包括如下步骤：对动物心包膜进行脱细胞处理，得到脱细胞处理后的心包膜；对脱细胞处理后的心包膜上的羧基进行封端处理，得到封端心包膜；对封端心包膜进行京尼平交联处理，得到改性心包膜。优选的，在对封端心包膜进行京尼平交联处理的步骤之前，还包括对封端心包膜进行接枝两性离子聚合物处理的步骤。本发明通过封端、交联的手段对心包膜的羧基、氨基等活性基团进行改性，减少其与血液和离子的相互作用；在心包膜表面接枝两性离子聚合物，不仅提高人工心包瓣膜假体的血液相容性，还有效抵抗钙离子的聚集沉降，实现长期抗钙化功能。

Description

一种改性心包膜及其制备方法、人工心脏瓣膜假体
技术领域
本发明涉及一种医用材料及器件领域，特别是涉及一种改性心包膜及其制备方法、人工心脏瓣膜假体。
背景技术
随着老龄化的日益严重，心脏瓣膜疾病的发病率日益增高。每年在世界范围内外科手术涉及到瓣膜置换的病例超过200000例。传统的开胸瓣膜置换手术需要在体外建立循环，手术风险高。近年来随着微创介入技术的发展，经导管的介入式心脏瓣膜手术无需开胸，手术风险低，为老年患者提供新的治疗方案。
目前，临床上使用的介入式心脏瓣膜由瓣膜支架和生物质瓣膜组成，生物质瓣膜具有和天然瓣膜相似的机械强度和血液动力学性质。并且生物质瓣膜具有较高的生物相容性，可以支持细胞粘附，增殖和分化。但是，由于异种组织导致的免疫原性应答，钙化和生物酶解会导致生物质瓣膜的使用寿命较短。
目前，商用生物质瓣膜来源均为戊二醛固定的异种组织。利用戊二醛固定可以显著降低生物质瓣膜的免疫原性和生物酶解并降低植入后的炎症反应。但是，本发明的发明人发现：由于戊二醛固定的异种组织在交联过程并没有封闭钙离子亲和的羧基等基团，使得钙离子容易在羧基处富集并沉积，最终导致瓣膜的钙化。虽然当前也有其他交联剂的相关报道，主要包括碳化亚胺，环氧化合物等；但是，这些交联方法得到的组织稳定性不佳。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种改性心包膜及其制备方法、人工心脏瓣膜假体，主要目的在于对动物心包膜上的活性基团(如，羧基、氨基)进行封端、改性，以阻止钙离子与其结合，使得改性心包膜及人工心脏瓣膜假体具有抗钙化性能。
为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：
一方面，本发明的实施例提供一种改性心包膜的制备方法，其包括如下步骤：
对动物心包膜进行脱细胞处理，得到脱细胞处理后的心包膜；
对所述脱细胞处理后的心包膜上的羧基进行封端处理，得到封端心包膜；
对所述封端心包膜进行京尼平交联处理，得到改性心包膜。
优选的，在对所述封端心包膜进行京尼平交联处理的步骤之前，还包括对封端心包膜进行接枝两性离子聚合物处理的步骤；优选的，所述两性离子聚合物为聚磺基甜菜碱、聚羧基甜菜碱、聚磷酸胆碱中的一种或几种。
优选的，对所述动物心包膜进行脱细胞处理的步骤，包括：采用表面活性剂浸泡所述动物心包膜；将浸泡后的动物心包膜清洗干净后，再将其浸泡在DNA酶和RNA酶的混合溶液中，在设定温度下进行振荡处理后，得到脱细胞处理后的心包膜。优选的，所述表面活性剂选用体积分数为0.5-3％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液；优选的，聚乙二醇辛基苯基醚溶液是将聚乙二醇辛基苯基醚溶解于三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液后得到的溶液。优选的，表面活性剂浸泡所述动物心包膜的时间为12-36小时。优选的，在表面活性剂浸泡所述动物心包膜之后，采用无菌磷酸盐缓冲盐水对动物心包膜进行清洗，清洗至无泡沫。优选的，在所述DNA酶和RNA酶的混合溶液中：所述DNA酶的浓度为10-1000U/mL、RNA酶的浓度为10-100μg/mL。优选的，设定温度为37±2℃，优选为37℃。优选的，所述振荡处理的时间为8-24h。
优选的，对所述脱细胞处理后的心包膜上的羧基进行封端处理的步骤，包括：先使所述脱细胞处理后的心包膜在羟基苯乙胺溶液中浸泡；然后，再向其中加入乙基[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺得到反应溶液，进行封端反应后，得到封端处理后的心包膜。优选的，所述羟基苯乙胺溶液的浓度为0.05-0.5mol/L。优选的，在加入乙基[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺的步骤之前，先使所述脱细胞处理后的心包膜在羟基苯乙胺溶液中浸泡2-6h。优选的，所述反应溶液中，所述乙基[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐的浓度为1-100mmol/L。优选的，在所述反应溶液中，所述N-羟基丁二酰亚胺的浓度为1-100mmol/L。优选的，所述封端反应的时间为12-48小时。优选的，在所述封端反应过程中，对所述反应溶液以设定转速进行振荡；进一步优选的，所述设定转速为145-155rpm。
优选的，对所述封端心包膜进行京尼平交联处理的步骤，包括：将所述封端处理后的心包膜浸泡在质量分数为0.05-0.3％的京尼平溶液中，进行京尼平交联反应后，得到改性心包膜；优选的，所述京尼平溶液是将京尼平溶解在磷酸盐缓冲液后配制而成；优选的，所述京尼平交联反应的温度为37±2℃，优选为37℃；优选的，所述京尼平交联反应的时间为8-24h。
优选的，所述对封端心包膜进行接枝两性离子聚合物处理的步骤，包括：
接枝偶联分子：将所述封端心包膜浸泡在偶联剂溶液中，孵育后，得到接枝偶联分子的封端心包膜；
光催化点击反应：将所述接枝偶联分子的封端心包膜浸泡在由两性离子聚合物溶液和光引发剂配制成的光催化反应溶液中，在紫外光的照射下进行光催化点击反应后，得到接枝两性离子聚合物的封端心包膜；
优选的，在所述接枝偶联分子的步骤中，所述偶联剂选用硅烷偶联剂或巯基化聚乙二醇；
优选的，在所述接枝偶联分子的步骤中，所述偶联剂溶液选用浓度为1-5mmoL/L的巯基聚乙二醇溶液；进一步优选的，所述巯基聚乙二醇溶液是将巯基聚乙二醇溶解在碳酸氢钠缓冲液中配制而成；进一步优选的，所述碳酸氢钠缓冲液的浓度为45-50mmol/L，进一步优选的，所述碳酸氢钠缓冲液的pH值为8.5；进一步优选的，所述巯基聚乙二醇的平均分子量为2000-8000，优选为5000；
优选的，在所述接枝偶联分子的步骤中：孵育的时间为24-48h，孵育的温度为室温。
优选的，在所述光催化点击反应的步骤中：先将两性离子聚合物溶液和光引发剂混合成光催化反应溶液，再将所述接枝偶联分子的封端心包膜浸泡在所述光催化反应溶液中；优选的，所述两性离子聚合物溶液的浓度为5-20mmol/L；优选的，所述光引发剂为2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯乙酮的乙醇溶液；进一步优选的，所述2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯乙酮的乙醇溶液的浓度为0.1-0.5g/mL；优选的，所述光引发剂与所述两性离子聚合物溶液的体积比为(0.5-1.5)：(95-105)，优选为1:100。
优选的，在所述光催化点击反应的步骤中：采用紫外光对浸泡在所述光催化反应溶液中的所述接枝偶联分子的封端心包膜的正面和反面中的每一面均照射20-30分钟；优选的，所述紫外光的波长为300-425nm，优选为365nm。
另一方面，本发明实施例还提供一种改性心包膜，所述改性心包膜是对动物心包膜进行脱细胞处理后、将其上的羧基进行封端处理、并进行京尼平交联处理后得到的心包膜；
优选的，所述改性心包膜是对动物心包膜进行脱细胞处理后、将其上的羧基进行封端处理、并进行接枝两性离子聚合物处理和经京尼平交联处理后得到的心包膜；进一步优选的，所述两性离子聚合物为聚磺基甜菜碱、聚羧基甜菜碱、聚磷酸胆碱中的一种或几种；
优选的，对羧基进行封端处理是将羧基改性成如下基团：
Figure GDA0003480020670000041
优选的，所述改性心包膜是由上述任一项所述的制备方法制备而成。
再一方面，本发明的实施例提供一种人工心脏瓣膜假体，其中，所述人工心脏瓣膜假体包括生物质心瓣膜；其中，所述生物质心瓣膜是将改性心包膜按照设定尺寸裁剪而成；其中，所述改性心包膜为上述任一项所述的改性心包膜的制备方法制备而成的改性心包膜；或所述改性心包膜为上述所述的改性心包膜。
优选的，所述人工心脏瓣膜假体还包括瓣膜支架；其中，所述生物质心瓣膜缝制于所述瓣膜支架的内部；优选的，所述瓣膜支架选用自膨式镍钛支架；优选的，瓣膜支架的开口尺寸为21-29mm；优选的，人工心脏瓣膜假体的有效开口面积为1.0-2.3cm2，返流比＜25％。
与现有技术相比，本发明的改性心包膜及其制备方法、人工心脏瓣膜假体至少具有下列有益效果：
一方面，本发明实施例提供的一种改性心包膜及其制备方法，通过依次对动物心包膜进行脱细胞处理、羧基进行封端处理、京尼平交联处理，以对心包膜上的羧基、氨基等活性基团进行封端、改性(在此需要说明的是：主要对心包膜上的羧基、氨基进行反应，如果存在一些双键、羟基等活性基团可能会发生反应，但不是需要的主要反应)，减少这些活性基团与血液和离子(如，钙离子)的相互作用。因此，本发明实施例所制备的改性心包膜用作人工心脏瓣膜假体上的生物质瓣膜时，能够阻止钙离子与其结合，使得该生物质瓣膜具有抗钙化性能，从而能提升瓣膜器件使用寿命。
进一步地，本发明实施例提供的一种改性心包膜及其制备方法，在上述的基础上，还进行了接枝两性离子处理，能够有效阻止血液中血小板的粘附、以及避免钙离子在改性心包膜内聚集和渗透。因此，本发明实施例所制备的改性心包膜用作人工心脏瓣膜假体上的生物质瓣膜时，能够提高人工心包瓣膜假体的血液相容性，还能够有效抵抗钙离子的聚集沉降，实现长期抗钙化功能。
另一方面，本发明实施例还提供一种人工心脏瓣膜假体，该人工心脏瓣膜假体中的生物质瓣膜是将上述的改性心包膜按照设定尺寸裁剪缝制而成，因此，本发明实施例提供的人工心脏瓣膜假体具有上述所述的有益效果。另外，本发明实施例提供的人工心脏瓣膜假体具有优异的流体动力学性能，有效开口面积1.0-2.3cm2，返流比<25％。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为脱细胞处理后的心包膜经体外14天流体冲刷钙化模拟实验的形貌图片；
图2为实施例1制备的改性心包膜经体外14天流体冲刷钙化模拟实验的形貌图片；
图3为实施例2制备的改性心包膜经体外14天流体冲刷钙化模拟实验的形貌图片；
图4为脱细胞处理后的心包膜经血小板黏附实验后的表面形貌图片；
图5为实施例2制备的改性心包膜经血小板黏附实验后的表面形貌图片；
图6为实施例3制备的人工心脏瓣膜假体的示意图；
图7为实施例3制备的人工心脏瓣膜假体的流体动力学检测曲线；
图8为实施例4制备的人工心脏瓣膜假体的流体动力学检测曲线；
图9为实施例5制备的人工心脏瓣膜假体的流体动力学检测曲线；
图10为实施例6制备的人工心脏瓣膜假体的流体动力学检测曲线。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
京尼平是由栀子果实中分离得到的栀子苷经b-葡萄糖苷酶进行酶解后所得。京尼平通过与伯胺的连接在动物组织中表现出高交联特性；并且由于交联过程没有醛基参与，因此交联产物具有较高的生物相容性。
两性离子聚合物是一类整体呈电中性,在同一单体侧链上同时含有阴、阳离子基团的高分子材料，在自然界中广泛存在，包括渗透液、细胞膜及蛋白质等。在心包膜中接枝两性离子，能够有效抵抗血小板的黏附及钙离子的静电吸附作用。
本发明针对现有的生物质瓣膜存在寿命短、易钙化的问题。以动物心包膜(在此的动物心包膜是动物心脏外面的一层包围于心脏外的膜，本发明的动物心包膜可以是猪心包膜，也可以是牛心包膜等)为原料，利用羧基封端技术和京尼平交联处理心包膜，以解决现有的生物质人工瓣膜存在的游离醛基造成的细胞毒性及离子聚集的问题，并利用两性离子聚合物在心包膜表面接枝，以解决钙离子在心包膜内聚集和渗透的问题。并且，通过体外表征人工瓣膜抗钙化性能并将处理后的瓣膜进行介入瓣膜器件的缝制。
本发明的具体方案如下：
一方面，本发明实施例提供一种改性心包膜的制备方法，其包括如下步骤：
脱细胞处理：对动物心包膜进行脱细胞处理，得到脱细胞处理后的心包膜。
该步骤具体为：先将动物心包膜浸泡于体积分数为0.5-3％(v/v)的聚乙二醇辛基苯基醚溶液中(在此，本发明中提到的术语“浸泡”指的是溶液能淹没心包膜；优选的，每平方厘米的心包膜用0.5-3mL的溶液浸泡)，至心包膜破裂，浸泡时间为12-36小时。然后将动物心包膜清洗干净(用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)彻底清洗，漂洗至无泡沫)，再浸泡于DNA酶和RNA酶的混合溶液中(DNA酶的浓度为10-1000U/mL、RNA酶的浓度为10-100μg/mL、)，在37±2℃，优选37℃下振荡处理(过夜振荡，振荡时间为8-24h)，以去除动物心包膜上的细胞器及细胞内DNA、RNA等物质，以降低植入器件的免疫原性，去除磷脂等易于钙化的成分。
聚乙二醇辛基苯基醚溶液是将聚乙二醇辛基苯基醚溶解于三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中配制而成(10mmol/L Tris、pH值为8.0)。
封端处理：对所述脱细胞处理后的心包膜上的羧基进行封端处理，得到封端心包膜。
该步骤具体为：先将脱细胞处理后的心包膜加入羟基苯乙胺溶液(羟基苯乙胺溶液的浓度为0.05-0.5mol/L)中浸泡2-6小时(以让羟基苯乙胺充分浸入脱细胞处理后心包膜)，然后向其中加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和乙基[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)，得到反应溶液(反应溶液中的NHS、EDC的最终浓度为1-100mmol/L)，并以150RPM恒定振荡12-48小时，进行封端反应。其中，化学反应式如下式所示，其中R代表心包膜中的胶原分子。
Figure GDA0003480020670000081
在此，在EDC/NHS存在的条件下，羟基苯乙胺与心包膜表面及内部的羧基结合，从而减少羧基与血液中钙离子结合导致的瓣膜钙化。
京尼平交联处理：对所述封端心包膜进行京尼平交联处理，得到改性心包膜。
该步骤具体为：使用质量分数为0.05-0.3wt％的京尼平溶液浸泡封端心包膜，在37±2℃(优选37℃)的温度下交联反应8-24小时。化学反应式如下式所示，其中R代表心包膜中的胶原分子。
Figure GDA0003480020670000082
较佳地，在对所述封端心包膜进行京尼平交联处理的步骤之前，还包括对封端心包膜进行接枝两性离子聚合物处理的步骤，具体如下：
接枝两性离子聚合物：对封端心包膜进行接枝两性离子聚合物处理。
在该步骤中：首先将封端心包膜接枝偶联分子，再将两性离子聚合物通过点击化学的方法与偶联分子结合，组成长链分子。其中，两性离子聚合物包括但不限于聚磺基甜菜碱(pSBMA)、聚羧基甜菜碱(pCBMA)、聚磷酸胆碱(pMPC)等，偶联分子可以为硅烷偶联剂、巯基化聚乙二醇分子等。
较佳地，该步骤具体为：
接枝偶联分子：将封端心包膜浸泡在偶联剂溶液中，孵育后，得到接枝偶联分子的封端心包膜。
孵育后，将接枝偶联分子的封端心包膜在磷酸缓冲液中充分洗涤以除去残余试剂。
光催化点击反应：将接枝偶联分子的封端心包膜浸泡在由两性离子聚合物溶液和光引发剂配制成的光催化反应溶液中，在紫外光的照射下进行光催化点击反应后，得到接枝两性离子聚合物的封端心包膜。
两性离子聚合物溶液是将两性离子聚合物溶解于去离子水中配制而成。
光催化点击反应的具体步骤为：先将两性离子聚合物溶液和光引发剂混合成光催化反应溶液，再将所述接枝偶联分子的封端心包膜浸泡在所述光催化反应溶液中。两性离子聚合物溶液的浓度为5-20mmol/L。光引发剂为2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯乙酮的乙醇溶液。2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯乙酮的乙醇溶液的浓度为0.1-0.5g/mL。所述光引发剂与所述两性离子聚合物溶液的体积比为(0.5-1.5)：(95-105)，优选为1:100。采用紫外光对浸泡在光催化反应溶液中的接枝偶联分子的封端心包膜的正面和反面中的每一面均照射20-30分钟；其中，紫外光的波长为365nm。
在此，以偶联分子选用巯基聚乙二醇(MW5000)为例说明接枝两性离子聚合物的具体步骤：将巯基聚乙二醇(MW5000)溶解在50mmol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.5)中，得到偶联剂溶液(其中，巯基聚乙二醇的浓度为1-5mmol/L)。将封端的心包膜浸泡在该偶联剂溶液中，在室温条件下孵育24-48小时。反应后，将得到的巯基化的封端心包膜在磷酸缓冲液中充分洗涤以除去残余试剂。化学反应式如下式所示(其中，下述化学反应式中的黑色长条代表心包膜上的胶原分子)：
Figure GDA0003480020670000101
将光引发剂与两性离子聚合物溶液按照体积比为(0.5-1.5)：(95-105)，优选为1:100的比例混合得到光催化反应溶液。将巯基化的封端心包膜浸泡在光催化反应溶液中，对巯基化的封端心包膜的每面(正反面)照射波长为300-425nm紫外光20-30分钟以充分反应。
化学反应式如下式所示：
Figure GDA0003480020670000102
综上，本发明实施例提供的改性心包膜的制备方法，主要是采用两种方案对动物心包膜进行改性。第一种方案是：对动物心包膜依次进行脱细胞处理、封端处理、京尼平交联处理得到改性心包膜。第二种方案是：对动物心包膜依次进行脱细胞处理、封端处理、接枝两性离子聚合物、京尼平交联处理得到改性心包膜。在此需要说明的是：上述两种方案中的各个步骤的处理顺序至关重要，上述处理顺序能确保封端处理、京尼平交联、以及接枝两性离子聚合物都能成功。
另一方面，本发明实施例提供一种改性心包膜，该改性心包膜主要是通过上述的改性心包膜的制备方法制备而成。
上述改性心包膜的制备方法所制备的心包膜或上述提供的改性心包膜主要用作生物质瓣膜使用。
再一方面，本发明实施例提供一种人工心脏瓣膜假体，其中，该人工心脏瓣膜假体包括生物质心瓣膜和瓣膜支架。具体地，将上述改性心包膜裁剪成特定尺寸，利用医用缝合线在医用涤纶布的辅助下将改性心包膜缝制在瓣膜支架内部。缝合后保证三个瓣叶在自然状态下能够良好贴合。
下面通过具体实施例进一步对本发明进行如下说明：
实施例1
本实施例采用新鲜健康的牛心包膜作为原料，对该心包膜进行改性，得到改性心包膜。该改性心包膜可以用作抗钙化生物质瓣膜。具体的改性步骤如下：
脱细胞处理：将聚乙二醇辛基苯基醚溶解于三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液(10mmol/L Tris、pH值为8.0)中，得到作为表面活性剂的聚乙二醇辛基苯基醚溶液，且该聚乙二醇辛基苯基醚溶液的体积分数为1％(v/v)；用该表面活性剂浸泡处理牛心包膜24小时。然后，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)对由表面活性剂浸泡后的牛心包膜进行彻底清洗，漂洗至无泡沫。最后，用DNA酶和RNA酶的混合溶液(DNA酶的浓度为100U/mL、RNA酶的浓度为20μg/mL)浸泡牛心包膜，在37℃振荡处理12小时，得到脱细胞处理后的心包膜。
封端处理：用浓度为0.2mol/L的羟基苯乙胺(酪胺)溶液浸泡脱细胞处理后的心包膜4小时。然后向其中加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和乙基[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)，得到反应溶液(反应溶液中的NHS、EDC的最终浓度为10mmol/L)，并对该反应溶液以150rpm的转速恒定振荡24小时后，得到封端心包膜。
京尼平交联处理：将京尼平用磷酸盐缓冲液溶解，得到质量分数为0.1wt％的京尼平溶液；向京尼平溶液中放入封端心包膜(京尼平溶液浸没封端心包膜)，在37℃的温度下下反应12h后，得到改性心包膜。
对本实施例制备的改性心包膜、单纯的脱细胞处理后的心包膜进行体外流体冲刷钙化试验。其中，单纯的脱细胞处理后的心包膜经体外14天流体冲刷钙化模拟实验的形貌图片参见图1所示。本实施例制备的改性心包膜经体外14天流体冲刷钙化模拟实验的形貌图片参见图2所示。
从图2可以明显看出，本实施例制备的改性心包膜具有较好的抗钙化性能。
实施例2
本实施例采用新鲜健康的牛心包膜作为原料，对该心包膜进行改性，得到改性心包膜。该改性心包膜可以用作抗钙化生物质瓣膜。具体的改性步骤如下：
脱细胞处理：该步骤与实施例1中的脱细胞处理的步骤一致。
封端处理：该步骤与实施例1中的封端处理的步骤一致。
接枝两性离子聚合物：(1)接枝偶联分子：将巯基聚乙二醇(MW5000)和50mmol/L的碳酸氢钠缓冲液(pH 8.5)配制成偶联剂溶液，其中，在偶联剂溶液中，巯基聚乙二醇的浓度为3mmol/L。将封端心包膜浸泡在偶联剂溶液中，在室温条件下孵育24小时。孵育后，将接枝偶联分子的封端心包膜(巯基化的封端心包膜)在磷酸盐缓冲液中充分洗涤以除去残余试剂。
(2)光催化点击反应：将光引发剂与浓度为12mol/L的两性离子聚合物溶液按照体积比为为1:100的比例混合得到光催化反应溶液(其中，光引发剂为2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯乙酮的乙醇溶液，其中，2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯乙酮的浓度为0.3g/mL)。将巯基化的封端心包膜浸泡在光催化反应溶液中，对巯基化的封端心包膜的每一面(正反面)照射波长为365nm紫外光30分钟以充分反应，得到接枝两性离子聚合物的封端心包膜。
京尼平交联处理：将京尼平用磷酸盐缓冲液溶解，得到质量分数为0.1wt％的京尼平溶液；向京尼平溶液中放入接枝两性离子聚合物的封端心包膜(京尼平溶液浸没接枝两性离子聚合物的封端心包膜)，在37℃的温度下下反应12h后，得到改性心包膜。
对本实施例制备的改性心包膜、单纯的脱细胞处理后的心包膜进行体外流体冲刷钙化试验。其中，单纯的脱细胞处理后的心包膜经体外14天流体冲刷钙化模拟实验的形貌图片参见图1所示。本实施例制备的改性心包膜经体外14天流体冲刷钙化模拟实验的形貌图片参见图3所示。从图3可以明显看出，本实施例制备的改性心包膜具有较好的抗钙化性能。
对本实施例制备的改性心包膜、单纯的脱细胞处理后的心包膜进行血小板粘附试验。图4为脱细胞处理后的心包膜经血小板黏附实验后的表面形貌图片；图5为实施例2制备的改性心包膜经血小板黏附实验后的表面形貌图片。从图4和图5可以看出：相比于单纯的脱细胞处理后的心包膜，本实施例制备的改性心包膜基本没有血小板粘附现象。
实施例3
本实施例制备一种人工心脏瓣膜假体，具体步骤如下：
制备改性心包膜：本实施例制备改性心包膜的步骤与实施例1的步骤一致。
介入瓣的缝合：将所制备的改性心包膜裁剪成特定尺寸。利用医用缝合线在医用涤纶布的辅助下将裁剪成特定尺寸的改性心包膜缝制在内径为21mm的瓣膜支架内部。缝合后保证三个瓣叶在自然状态下能够良好贴合，得到的人工心脏瓣膜假体具体参见图6所示。
对本实施例的人工心脏瓣膜假体进行流体动力学评价；评价结果参见图7所示，结果表明：本实施例制备的人工心脏瓣膜假体具有良好的流体动力学性能，其有效开口面积大于1.02cm2、返流比小于3.2％，达到ISO-5840-3标准。
实施例4
本实施例制备一种人工心脏瓣膜假体，具体步骤如下：
制备改性心包膜：本实施例制备改性心包膜的步骤与实施例1的步骤一致。
介入瓣的缝合：将所制备的改性心包膜裁剪成特定尺寸。利用医用缝合线在医用涤纶布的辅助下将裁剪成特定尺寸的改性心包膜缝制在内径为25mm的瓣膜支架内部。缝合后保证三个瓣叶在自然状态下能够良好贴合，得到的人工心脏瓣膜假体。
对本实施例的人工心脏瓣膜假体进行流体动力学评价；评价结果参见图8所示，结果表明：本实施例制备的人工心脏瓣膜假体具有良好的流体动力学性能，其有效开口面积大于1.73cm2、返流比小于6.2％，达到ISO-5840-3标准。
实施例5
本实施例制备一种人工心脏瓣膜假体，具体步骤如下：
制备改性心包膜：本实施例制备改性心包膜的步骤与实施例1的步骤一致。
介入瓣的缝合：将所制备的改性心包膜裁剪成特定尺寸。利用医用缝合线在医用涤纶布的辅助下将裁剪成特定尺寸的改性心包膜缝制在内径为29mm的瓣膜支架内部。缝合后保证三个瓣叶在自然状态下能够良好贴合，得到的人工心脏瓣膜假体。
对本实施例的人工心脏瓣膜假体进行流体动力学评价；评价结果参见图9所示，结果表明：本实施例制备的人工心脏瓣膜假体具有良好的流体动力学性能，其有效开口面积大于1.21cm2、返流比小于11.8％，达到ISO-5840-3标准。
实施例6
本实施例制备一种人工心脏瓣膜假体，具体步骤如下：
制备改性心包膜：本实施例制备改性心包膜的步骤与实施例2的步骤一致。
介入瓣的缝合：将所制备的改性心包膜裁剪成特定尺寸。利用医用缝合线在医用涤纶布的辅助下将裁剪成特定尺寸的改性心包膜缝制在内径为21mm的瓣膜支架内部。缝合后保证三个瓣叶在自然状态下能够良好贴合，得到的人工心脏瓣膜假体。
对本实施例的人工心脏瓣膜假体进行流体动力学评价；评价结果参见图10所示，结果表明：本实施例制备的人工心脏瓣膜假体具有良好的流体动力学性能，其有效开口面积大于1.20cm2、返流比小于4.1％，达到ISO-5840-3标准。
综上，本发明实施例提供的改性心包膜及其制备方法、人工心脏瓣膜假体，通过封端、交联的手段对心包膜上的羧基、氨基等活性基团进行改性，减少其与血液和离子的相互作用；在心包膜表面接枝两性离子聚合物，不仅能提高人工心包瓣膜假体的血液相容性，还能够有效抵抗钙离子的聚集沉降，实现长期抗钙化功能。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (37)

1.一种改性心包膜的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
对动物心包膜进行脱细胞处理，得到脱细胞处理后的心包膜；
对所述脱细胞处理后的心包膜上的羧基进行封端处理，得到封端心包膜；
对所述封端心包膜进行京尼平交联处理，得到改性心包膜；
其中，在对所述封端心包膜进行京尼平交联处理的步骤之前，还包括对封端心包膜进行接枝两性离子聚合物处理的步骤；其中，所述两性离子聚合物为聚磺基甜菜碱、聚羧基甜菜碱、聚磷酸胆碱中的一种或几种；
其中，所述对封端心包膜进行接枝两性离子聚合物处理的步骤，包括：
接枝偶联分子：将所述封端心包膜浸泡在偶联剂溶液中，孵育后，得到接枝偶联分子的封端心包膜；其中，所述偶联剂溶液中的偶联剂选用巯基聚乙二醇；
光催化点击反应：将所述接枝偶联分子的封端心包膜浸泡在由两性离子聚合物溶液和光引发剂配制成的光催化反应溶液中，在紫外光的照射下进行光催化点击反应后，得到接枝两性离子聚合物的封端心包膜。
2.根据权利要求1所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，对所述动物心包膜进行脱细胞处理的步骤，包括：
采用表面活性剂浸泡所述动物心包膜；将浸泡后的动物心包膜清洗干净后，再将其浸泡在DNA酶和RNA酶的混合溶液中，在设定温度下进行振荡处理后，得到脱细胞处理后的心包膜。
3.根据权利要求2所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，
所述表面活性剂选用体积分数为0.5-3%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液；其中，聚乙二醇辛基苯基醚溶液是将聚乙二醇辛基苯基醚溶解于三（羟甲基）氨基甲烷缓冲液后得到的溶液。
4.根据权利要求2所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，表面活性剂浸泡所述动物心包膜的时间为12-36小时。
5.根据权利要求2所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，在表面活性剂浸泡所述动物心包膜之后，采用无菌磷酸盐缓冲盐水对动物心包膜进行清洗，清洗至无泡沫。
6.根据权利要求2所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，在所述DNA酶和RNA酶的混合溶液中：所述DNA酶的浓度为10-1000U/mL、RNA酶的浓度为10-100μg/mL。
7.根据权利要求2所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，设定温度为37±2℃。
8.根据权利要求2所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，所述振荡处理的时间为8-24h。
9.根据权利要求1所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，对所述脱细胞处理后的心包膜上的羧基进行封端处理的步骤，包括：
先使所述脱细胞处理后的心包膜在羟基苯乙胺溶液中浸泡；然后，再向其中加入乙基[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺得到反应溶液，进行封端反应后，得到封端处理后的心包膜。
10.根据权利要求9所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，所述羟基苯乙胺溶液的浓度为0.05-0.5mol/L。
11.根据权利要求9所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，在加入乙基[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺的步骤之前，先使所述脱细胞处理后的心包膜在羟基苯乙胺溶液中浸泡2-6h。
12.根据权利要求9所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，所述反应溶液中，所述乙基[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐的浓度为1-100mmol/L。
13.根据权利要求9所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，所述反应溶液中，所述N-羟基丁二酰亚胺的浓度为1-100mmol/L。
14.根据权利要求9所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，所述封端反应的时间为12-48小时。
15.根据权利要求9所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，在所述封端反应过程中，对所述反应溶液以设定转速进行振荡。
16.根据权利要求15所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，所述设定转速为145-155rpm。
17.根据权利要求1所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，对所述封端心包膜进行京尼平交联处理的步骤，包括：
将所述封端处理后的心包膜浸泡在质量分数为0.05-0.3wt%的京尼平溶液中，进行京尼平交联反应后，得到改性心包膜。
18.根据权利要求17所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，所述京尼平溶液是将京尼平溶解在磷酸盐缓冲液后配制而成。
19.根据权利要求17所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，所述京尼平交联反应的温度为37±2℃。
20.根据权利要求17所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，所述京尼平交联反应的时间为8-24h。
21.根据权利要求1所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，在所述接枝偶联分子的步骤中，所述偶联剂溶液选用浓度为1-5mmoL/L的巯基聚乙二醇溶液。
22.根据权利要求21所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，所述巯基聚乙二醇溶液是将巯基聚乙二醇溶解在碳酸氢钠缓冲液中配制而成；其中，所述碳酸氢钠缓冲液的浓度为45-50mmol/L，所述巯基聚乙二醇的平均分子量为2000-8000。
23.根据权利要求22所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，所述碳酸氢钠缓冲液的pH值为8.5。
24.根据权利要求1所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，在所述接枝偶联分子的步骤中：孵育的时间为24-48h，孵育的温度为室温。
25.根据权利要求1所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，在所述光催化点击反应的步骤中：
先将两性离子聚合物溶液和光引发剂混合成光催化反应溶液，再将所述接枝偶联分子的封端心包膜浸泡在所述光催化反应溶液中。
26.根据权利要求25所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，所述两性离子聚合物溶液的浓度为5-20mmol/L。
27.根据权利要求25所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，所述光引发剂为2-羟基-4-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯乙酮的乙醇溶液；其中，所述2-羟基-4-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯乙酮的乙醇溶液的浓度为0.1-0.5g/mL。
28.根据权利要求27所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，所述光引发剂与所述两性离子聚合物溶液的体积比为（0.5-1.5）：（95-105）。
29.根据权利要求28所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，所述光引发剂与所述两性离子聚合物溶液的体积比为1:100。
30.根据权利要求1所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，在所述光催化点击反应的步骤中：
采用紫外光对浸泡在所述光催化反应溶液中的所述接枝偶联分子的封端心包膜的正面和反面中的每一面均照射20-30分钟。
31.根据权利要求30所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，所述紫外光的波长为300-425nm。
32.根据权利要求31所述的改性心包膜的制备方法，其特征在于，所述紫外光的波长为365nm。
33.一种改性心包膜，其特征在于，所述改性心包膜是对动物心包膜进行脱细胞处理后、将其上的羧基进行封端处理、并进行接枝两性离子聚合物处理和京尼平交联处理后得到的心包膜；其中，所述两性离子聚合物为聚磺基甜菜碱、聚羧基甜菜碱、聚磷酸胆碱中的一种或几种；其中，所述改性心包膜是由权利要求1-32任一项所述的制备方法制备而成。
34.根据权利要求33所述的改性心包膜，其特征在于，对羧基进行封端处理是将羧基改性成如下基团：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
35.一种人工心脏瓣膜假体，其特征在于，所述人工心脏瓣膜假体包括生物质心瓣膜；其中，所述生物质心瓣膜是将改性心包膜按照设定尺寸裁剪而成；其中，所述改性心包膜为权利要求1-32所述的改性心包膜的制备方法制备而成的改性心包膜；或所述改性心包膜为权利要求33或34所述的改性心包膜。
36.根据权利要求35所述的人工心脏瓣膜假体，其特征在于，所述人工心脏瓣膜假体还包括瓣膜支架；其中，所述生物质心瓣膜缝制于所述瓣膜支架的内部。
37.根据权利要求36所述的人工心脏瓣膜假体，其特征在于，
所述瓣膜支架选用自膨式镍钛支架；和/或
所述瓣膜支架的开口尺寸为21-29mm；和/或
人工心脏瓣膜假体的有效开口面积为1.0-2.3cm2，返流比＜25%。
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