CN111939321B - 一种猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法，先将猪皮在三元溶液中进行第一次处理，利用其分层现象，剥除表皮和皮下组织，获得猪真皮层，从而有利于缩短处理时间、提高进一步脱细胞的效率；然后在三元溶液中进行第二次处理，脱除细胞及可溶性胶原，通过控制三元溶液的温度与处理时间，在提高脱细胞效率的同时避免了胶原蛋白的严重损失；然后利用DnaseⅠ酶去除剩余的细胞碎片，最后在三元溶液中进行第三次处理，提高猪脱细胞真皮基质的透明度和柔软度。本发明制备方法简单，适合工业化生产。

Description

一种猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法，属于医学皮肤组织工程技术领域。

背景技术

皮肤是人体内部与外部环境之间的天然屏障，由表皮、真皮和皮下组织层组成。在日常生活中，皮肤易受到伤害，人体本身具有一定的重建功能可实现受损皮肤的自我修复。但当皮肤受损面积大、受损程度严重时，如严重的烧伤、外伤或一些不能愈合的慢性创伤引起的皮肤缺损，会引起休克、全身感染等严重并发症问题，必须借助外科手术才可保证皮肤结构与功能的重建。目前修复大面积皮肤缺损最有效的办法仍然是自体皮肤移植。皮肤移植需要足够的皮源，然而患者可用的自体皮肤数量十分有限，而且取皮的过程将会给患者造成附加疼痛以及二次创伤。另一种可移植的皮肤来源于尸体皮。但尸体皮来源有限，且大多是老化及不健康的。更为重要的是，尸体皮肤的使用具有传染疾病的风险，且受到伦理学的制约。

因此，人工皮肤的开发已经成为医学皮肤组织工程领域的热点。现有技术中采用无细胞真皮基质作为皮肤替代物，其将动物皮肤经过脱细胞处理，去除表皮和真皮中的细胞成分，保留真皮中的胶原成分和三维网状结构，以及基底膜复合物。这种无细胞真皮基质由于去除了皮肤中具有强抗原性的细胞成分，减少了排斥反应；同时保留了天然真皮结构，由此可以诱导移植后宿主的细胞成分按照其三维结构生长。在移植手术中，采用无细胞真皮基质与自体刃厚皮复合移植，无细胞真皮基质支持成纤维细胞的浸润，新生血管的形成，促使成纤维细胞与移植的自体表皮成分逐渐融合，最终形成完整的皮肤结构，基本恢复皮肤的原有功能。而在这个移植过程中，需要无细胞真皮基质在短时间内与创面基底建立良好的血液循环，并为其上移植的表皮提供足够的营养，否则移植就会失败。这需要无细胞真皮基质的三维结构能够呈网状结构，且网眼能够细密均匀，使得创面基本渗液能够透过网眼营养移植的皮片，微血管可以通过网眼再生。

在无细胞真皮基质的制备过程中，通常选用结构与免疫学与人体皮肤相似的猪皮，利用物理、化学或生物方法处理，获得猪脱细胞真皮基质。猪脱细胞真皮基质需满足两个要求：最大程度的脱除细胞以及较好地保留皮肤的三维结构。理论研究表明，在设计皮肤替代物时，孔径是一个重要的因素，而现有的猪脱细胞真皮基质中缺乏互相连通的孔洞，其微结构不符合利于细胞生长的理想条件。即使是已经用于临床的猪脱细胞真皮基质

(英国)，仍然缺乏理想的多孔结构而保留了较为致密的三维网状结构，导致其弹性较差，进而促进伤口愈合效果不够理想。此外，材料的不透明性，也令伤口愈合的实时监测成为难题。第二军医大夏照帆等研究工作者尝试用机械或激光密集打孔的方法来调控猪脱细胞真皮基质宏观结构，提高孔隙率改善皮肤的愈合质量，但该法无法改善与细胞行为直接相关的微结构，同时增加设备与操作成本，破坏材料的天然结构，且孔径过大不宜细胞的黏附生长，破坏保障临床应用的机械力学性能。因此利用物理手段对材料的宏观调控难以弥补该缺陷。如果在脱细胞过程中能够自然形成相互连通的多孔结构，那么材料的微结构将得到有效改善，从而利于在伤口愈合过程中细胞的黏附、增殖和迁移过程。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法。

除特殊说明外，本发明所述百分比均为质量百分比。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法，包括第一次三元溶液处理、第二次三元溶液处理、DnaseⅠ酶处理和第三次三元溶液处理四个步骤，其特征在于：所述三元溶液由无水氯化钙、去离子水、无水酒精的摩尔比为1：7～9：1～3配制而成；所述第一次三元溶液处理为将猪皮用三元溶液浸没，于70～80℃反应0.5～1.5h，然后将猪皮取出，放入去离子水中浸泡，待观察到皮片出现从上往下依次为表皮层、真皮层和皮下组织的分层现象时，用取皮机切取猪真皮层；所述第二次三元溶液处理为将猪真皮层放入抽滤瓶中，加入三元溶液浸没，抽滤3次；取出皮片(猪真皮层)，置于广口瓶中，加入三元溶液浸没，于70～80℃反应1～10h，然后将皮片取出放入去离子水中浸泡清洗至无丝滑感；所述DnaseⅠ酶处理为将无丝滑感的皮片与DnaseⅠ酶在密闭环境中以37℃条件下按照120～180r/m的转速反应60～120min，然后用磷酸盐缓冲液漂洗去除细胞残留物；所述第三次三元溶液处理为将经过DnaseⅠ酶处理后的皮片用三元溶液浸没，于70～80℃反应1～2h，然后将皮片取出，用去离子水彻底冲洗，置于95％乙醇内浸泡10min消毒，再用磷酸盐缓冲液漂洗3次，即得本发明透明的猪脱细胞真皮基质。

优选的，上述三元溶液由无水氯化钙、去离子水、无水酒精的摩尔比为1：8：2配制而成。

由于猪真皮层结构较为致密，通过第一次三元溶液处理后切取真皮层，可有效缩短脱细胞所需时间。而真皮层厚度越大，所需处理时间也会相应增加，且对产品的透明度、柔软性有不良影响。经实验验证，当猪真皮层厚度为1.4mm-1.8mm时，脱细胞后得到的猪脱细胞真皮基质皮肤替代物产品厚度为0.9mm-1.3mm。因此，上述方法中，猪真皮层的厚度为1.4mm-1.8mm，优选1.6mm。

研究发现，三元溶液的脱细胞过程中，温度高于80℃时，猪皮会发生严重皱缩，其主要成分胶原蛋白结构将遭到破坏，细胞外基质的有效成分(硫酸化糖胺聚糖、透明质酸等)含量明显降低；而当处理温度低于70℃时，难以得到材料透明、柔软的猪脱细胞真皮基质皮肤替代物产品。因此，上述方法中，用三元溶液处理猪皮(含第一次三元溶液处理、第二次三元溶液处理和第三次三元溶液处理)的反应温度为70～80℃，优选75℃。

脱细胞材料的制备往往需要反复、多次的处理才能实现细胞的有效脱除，且需要通过控制脱细胞时间实现对材料孔径的调节。通过SEM图像得知，由于钙离子的螯合作用，脱细胞材料的孔径随脱细胞处理时间的增加而增大，而合适的孔径大小有利于伤口愈合过程中细胞的迁移、粘附和增殖。所以将三元溶液进行的脱细胞过程分为两次处理进行。探究第二次三元溶液处理的最佳时间，当第二次处理时间为1-10h，间隔1h取样，当处理时间低于4h时，细胞的脱除效果不好；由于随着脱细胞时间的增加，材料的机械性能呈现降低趋势，当处理时间大于6h时，虽然细胞脱除情况良好，但材料的机械性能变差。综合考虑，第二次三元溶液的处理时间为4～6h；优选5h。

上述猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法中，经过第二次三元溶液处理后皮片中存在一定的细胞碎片，需要借助酶处理进行清除。在DnaseⅠ酶处理过程中发现，酶浓度与处理时间呈负相关，酶浓度越高，所需处理时间越短。37℃为该酶活性的最佳温度，设定酶浓度为40U/ml，处理时间设定为30min、60min、90min、120min、180min。实验研究发现，酶处理也会对材料的机械性能造成较大影响，当酶处理时间大于120min时，材料会出现破碎情况，低于90min时，通过DAPI染色发现，细胞碎片未能较好清楚。综上，上述DnaseⅠ酶处理步骤中，酶浓度为40U/ml，反应温度为37℃，转速为150r/m，反应时间为90～120min。

第三次三元溶液处理的目的是使材料更柔软、透明，同时具有一定的弹性。考虑到机械性能在脱细胞过程中的损失，设定处理时间为1h、2h、3h、4h。结果发现，在处理1h时，材料的贴肤性不够，而处理2h及以上时间时，材料发生卷缩，因此，第三次三元溶液处理的合适时间为90min左右。

一种猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法，采用如下步骤：

(1)第一次三元溶液处理：将新鲜的猪皮切为7cm×7cm，置于广口瓶中，以固液比1：4加入三元溶液浸没后，置于75℃的水浴锅中反应1h，处理完成后将皮片取出，放入去离子水中浸泡清洗、冷却3h，每1h更换一次去离子水。待观察到皮片出现明显的分层现象时(从上往下依次为表皮层、真皮层和皮下组织层)，用取皮机切取约1.6mm厚的真皮层。

(2)第二次三元溶液处理：将猪真皮层放入抽滤瓶中，再加入适量三元溶液至浸没，抽滤3次，取出皮片，置于250mL的广口瓶中，再以固液比1：10加入三元溶液至浸没后，置于75℃的水浴锅中反应5h。处理完成后将皮片取出放入去离子水中浸泡清洗至无丝滑感，每1h更换一次去离子水，除去残留的钙离子。

(3)DnaseⅠ酶处理：将皮片放入烧杯中，加入适量DnaseⅠ酶溶液(含40U/mlDNaseⅠ酶，10mmol/L氯化镁的磷酸盐缓冲液溶液)后，用保鲜膜封口，放入37℃水浴锅中以150r/m的转速反应90min随后用磷酸盐缓冲液漂洗6次，每次15分钟，进一步去除细胞残留物；

(4)第三次三元溶液处理：将经过酶处理后的皮片置于广口瓶中，再以固液比1：10加入三元溶液至浸没后，置于75℃的水浴锅中反应90min，处理完成后将皮片取出，用去离子水反复冲洗至无丝滑感，获得透明的猪脱细胞真皮基质。

有益效果：

本发明提供一种猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法，通过三元溶液与胶原蛋白氨基酸侧链的羟基协同作用破坏了部分肽链内的氢键，导致胶原纤维膨胀，相互排斥，胶原束分散，形成疏松的空间结构，同时三元溶液的侵蚀作用将进一步去除非胶原蛋白成分，分解疏松的胶原原纤维，最终形成相互连通的孔道，多孔结构被认为适合设计皮肤替代物，为细胞的增殖、迁移提供更适宜的微环境，提高创面愈合效果。本发明不同于常规的猪脱细胞真皮基质的制备方法(直接利用取皮机取出一定厚度的真皮层)，先将猪皮在三元溶液中进行第一次处理，利用其分层现象，剥除表皮和皮下组织，获得猪真皮层，从而有利于缩短处理时间、提高进一步脱细胞的效率；然后在三元溶液中进行第二次处理，脱除细胞及可溶性胶原，通过控制处理温度与时间，在提高脱细胞效率的同时避免了胶原蛋白的严重损失；然后利用DnaseⅠ酶去除剩余的细胞碎片，最后在三元溶液中进行第三次处理，提高猪脱细胞真皮基质的透明度和柔软度。本发明制备方法简单，适合工业化生产。

附图说明

图1是猪脱细胞真皮基质制备流程图；

图2是猪真皮层厚度与脱细胞后得到的猪脱细胞真皮基质厚度关系图；

图3是第二次三元溶液处理的时间与猪脱细胞真皮基质拉伸强度的关系图；

图4是猪脱细胞真皮基质实物(图A)及形貌图(图B)；

图5是猪真皮层脱细胞前后DAPI染色(A)及H&E染色切片(B)结果图；

图6是细胞活死双染结果图；

图7是伤口愈合原理图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

(一)制备本发明猪脱细胞真皮基质皮肤替代物

实施例1

一种猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法，将新鲜的猪皮经过第一次三元溶液处理后，利用其明显的分层现象，切除多余成分后得到猪真皮层，接着依次经过第二次三元溶液处理、酶处理和第三次三元溶液处理，从而获得透明、多孔的猪脱细胞真皮基质。猪脱细胞真皮基质制备流程如图1所示。具体步骤如下：

配制三元溶液——无水氯化钙、去离子水、无水酒精的摩尔比为1：8：2。

将648mL去离子水添加到含500g无水氯化钙的干净烧杯中，在室温下以400r/m的转速进行机械搅拌，待溶液冷却后，再加入518mL无水酒精，机械搅拌至溶液冷却，获得三元溶液。

第一次三元溶液处理——选取猪背部的中厚皮利于皮片所受的内外处理彻底而均匀。

将新鲜的猪皮切为约7cm×7cm大小，置于650mL的广口瓶中，以固液比1：4加入三元溶液至浸没后，置于75℃的水浴锅中反应1h。处理完成后将皮片取出，放入去离子水中浸泡清洗、冷却3h，每1h更换一次去离子水。待观察到皮片出现明显的分层现象时(从上往下依次为表皮层、真皮层和皮下组织层)，用取皮机切取约1.6mm厚的真皮层。

第二次三元溶液处理——脱除细胞及可溶性胶原。

由于猪真皮层呈现致密网状结构，为使三元溶液的有效成分能够渗透进皮片结构中，在脱细胞之前进行抽滤：将猪真皮层放入抽滤瓶中，再加入适量三元溶液至浸没，抽滤3次。取出皮片，置于250mL的广口瓶中，再以固液比1：10加入三元溶液至浸没后，置于75℃的水浴锅中反应5h。处理完成后将皮片取出放入去离子水中浸泡清洗3h至无丝滑感，每1h更换一次去离子水，除去多余的钙离子。

酶处理——利用DnaseⅠ酶去除剩余的细胞碎片。

将皮片放入250mL烧杯中，加入适量DnaseⅠ酶溶液(含40U/mlDNaseⅠ酶，10mmol/L氯化镁的磷酸盐缓冲液溶液)后，用保鲜膜封口，放入37℃水浴锅中以150r/m的转速反应90min随后用磷酸盐缓冲液漂洗6次，每次15分钟，进一步去除细胞残留物。

第三次三元溶液处理——提高猪脱细胞真皮基质的透明度和柔软度。

将经过酶处理后的皮片置于250mL的广口瓶中，再以固液比1：10加入三元溶液至浸没后，置于75℃的水浴锅中反应90min。处理完成后将皮片取出，用去离子水反复冲洗至无丝滑感，获得透明的猪脱细胞真皮基质。

(二)影响因素考察实验：

参照实施例1运行以下影响因素考察实验。

由于猪真皮层结构较为致密，通过第一次三元溶液处理后切取真皮层，可有效缩短脱细胞所需时间。而真皮层厚度越大，所需处理时间也会相应增加，且对产品的透明度、柔软度有不良影响。研究发现，猪真皮层厚度与脱细胞后得到的猪脱细胞真皮基质厚度关联性如图2所示，当猪真皮层厚度为1.4mm-1.8mm时，脱细胞后得到的猪脱细胞真皮基质皮肤替代物产品厚度为0.6mm-1.3mm。综合脱细胞时间、透明度、柔软度考虑，猪真皮层厚度优选1.6mm。

研究发现，三元溶液的脱细胞过程中，温度高于80℃时，猪皮会发生严重皱缩，其主要成分胶原蛋白结构将遭到破坏，细胞外基质的有效成分(硫酸化糖胺聚糖、透明质酸等)含量明显降低；而当处理温度低于70℃时，难以得到材料透明、柔软的猪脱细胞真皮基质皮肤替代物产品。优选的，上述方法中，用三元溶液处理猪皮(含第一次三元溶液处理、第二次三元溶液处理和第三次三元溶液处理)的反应温度为75℃。

脱细胞材料的制备往往需要反复、多次的处理才能实现细胞的有效脱除，且需要通过控制脱细胞时间实现对材料孔径的调节。通过SEM图像得知，由于钙离子的螯合作用，脱细胞材料的孔径随脱细胞处理时间的增加而增大，而合适的孔径大小有利于伤口愈合过程中细胞的迁移、粘附和增殖。所以将三元溶液进行的脱细胞过程分为两次处理进行。探究第二次三元溶液处理的最佳时间，当第二次处理时间为1-10h(单因素实验，其余处理条件参照实施例1)，间隔1h取样，结果如图3所示。当处理时间低于4h时，细胞的脱除效果不好；由于脱细胞时间的增加，材料的机械性能呈现降低趋势，当处理时间大于6h时，虽然细胞脱除情况良好，但材料的机械性能变差。综合考虑，第二次三元溶液的处理时间为4～6h；优选5h。

上述猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法中，经过第二次三元溶液处理后皮片中存在一定的细胞碎片，需要借助酶处理进行清除。在DnaseⅠ酶处理过程中发现，酶浓度与处理时间呈负相关，酶浓度越高，所需处理时间越短。37℃为该酶活性的最佳温度，设定酶浓度为40U/ml，处理时间设定为30min、60min、90min、180min。实验研究发现，酶处理也会对材料的机械性能造成较大影响，当酶处理时间大于2h时，材料会出现破损情况，低于90min时，通过DAPI染色发现，细胞碎片未能较好清除。综上，上述DnaseⅠ酶处理步骤中，酶浓度为40U/ml，反应温度为37℃，转速为150r/m，反应时间为90～100min。

第三次三元溶液处理的目的是使材料更柔软、透明，同时具有一定的弹性。考虑到机械性能在脱细胞过程中的损失，设定处理时间为1h、2h、3h、4h。结果发现，在处理1h时，材料的贴肤性不够，而处理2h及以上时间时，材料发生卷缩，因此，第三次三元溶液处理的合适时间为90min左右。

(三)本发明猪脱细胞真皮基质性能测定实验：

将本发明实施例1制备的猪脱细胞真皮基质与猪真皮层、现有技术的猪脱细胞真皮基质进行电镜扫描，结果见图4。相比与真皮层及商品化的猪脱细胞真皮基质，本发明实施例1制备的猪脱细胞真皮基质产品呈现出明显的多孔结构，且随着脱细胞时间的增长，孔径逐渐增大。

将本发明实施例1制备的猪脱细胞真皮基质与猪真皮层进行DAPI染色，结果如图5A所示，猪真皮层中可以发现大量蓝色荧光的细胞核，而在猪脱细胞真皮基质中没有发现明显蓝色荧光的细胞核；H&E染色(图5B)也证明了这个结果，在猪脱细胞真皮基质未见到蓝紫色染的细胞核分布，证实细胞已经成功脱除，并且胶原结构也得到了很好的保留。

小鼠成纤维细胞活死双染结果如图6所示，结果表明：本发明实施例1制备的猪脱细胞真皮基质具有良好的生物相容性，能够促进细胞增殖。

通过建立动物皮肤全缺损模型验证脱细胞真皮基质促进伤口愈合的能力。伤口愈合原理如图7所示。将猪脱细胞真皮基质移植到伤口处后，具有多孔结构的猪脱细胞真皮基质由于保留了原有的细胞外基质，为成纤维细胞的黏附、增殖和迁移提供了合适的微环境，从而加速创面修复的过程。

Claims (10)

1.一种猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法，包括第一次三元溶液处理、第二次三元溶液处理、DnaseⅠ酶处理和第三次三元溶液处理四个步骤，其特征在于：所述三元溶液由无水氯化钙、去离子水、无水酒精的摩尔比为1：7～9：1～3配制而成；所述第一次三元溶液处理为将猪皮用三元溶液浸没，于70～80℃反应0.5～1.5h，然后将猪皮取出，放入去离子水中浸泡，待观察到皮片出现从上往下依次为表皮层、真皮层和皮下组织层的分层现象时，用取皮机切取猪真皮层；所述第二次三元溶液处理为将猪真皮层放入抽滤瓶中，加入三元溶液浸没，抽滤；取出皮片，置于广口瓶中，加入三元溶液浸没，于70～80℃反应1～10h，然后将皮片取出放入去离子水中浸泡清洗至无丝滑感；所述DnaseⅠ酶处理为将无丝滑感的皮片与DnaseⅠ酶在密闭环境中以36～38℃条件下按照120～180r/m的转速反应80～100min，然后用磷酸盐缓冲液漂洗去除细胞残留物；所述第三次三元溶液处理为将经过DnaseⅠ酶处理后的皮片用三元溶液浸没，于70～80℃反应1～2h，然后将皮片取出，用去离子水冲洗，即得。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述三元溶液由无水氯化钙、去离子水、无水酒精的摩尔比为1：8：2配制而成。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述猪真皮层的厚度为1.4mm-1.8mm。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述猪真皮层的厚度为1.6mm。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一次三元溶液处理的反应温度为75℃；所述第二次三元溶液处理的反应温度为75℃；所述第三次三元溶液处理的反应温度为75℃。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述第二次三元溶液的处理时间为4～6h。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述第二次三元溶液的处理时间为5h。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述DnaseⅠ酶处理步骤中酶浓度为40U/ml，反应温度为37℃，转速为150r/m，反应时间为90～100min。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述第三次三元溶液处理的时间为90min。

10.一种猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法，采用如下步骤：

(1)第一次三元溶液处理：将新鲜的猪皮切为7cm×7cm，置于广口瓶中，以固液比1：4加入三元溶液浸没后，置于75℃的水浴锅中反应1h，处理完成后将皮片取出，放入去离子水中浸泡清洗、冷却3h，每1h更换一次去离子水；待观察到皮片出现明显的分层现象时，用取皮机切取1.6mm厚的真皮层；所述分层现象是从上往下依次为表皮层、真皮层和皮下组织层；

(2)第二次三元溶液处理：将猪真皮层放入抽滤瓶中，再加入适量三元溶液至浸没，抽滤3次，取出皮片，置于250mL的广口瓶中，再以固液比1：10加入三元溶液至浸没后，置于75℃的水浴锅中反应5h；处理完成后将皮片取出放入去离子水中浸泡清洗至无丝滑感，每1h更换一次去离子水，除去多余的钙离子；

(3)DnaseⅠ酶处理：将皮片放入烧杯中，加入适量DnaseⅠ酶溶液后，用保鲜膜封口，放入37℃水浴锅中以150r/m的转速反应90min随后用磷酸盐缓冲液漂洗6次，每次15分钟，进一步去除细胞残留物；所述DnaseⅠ酶溶液为含40U/ml DNaseⅠ酶，10mmol/L氯化镁的磷酸盐缓冲液溶液；

(4)第三次三元溶液处理：将经过酶处理后的皮片置于广口瓶中，再以固液比1：10加入三元溶液至浸没后，置于75℃的水浴锅中反应90min，处理完成后将皮片取出，用去离子水中反复冲洗至无丝滑感，获得透明的猪脱细胞真皮基质皮肤替代物。

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