CN114949347B - 一种改性交联生物瓣膜及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种改性交联生物瓣膜，它是肝素或其盐通过磺化壳聚糖接枝、羧基噁唑烷交联的生物膜片；所述生物膜片是心包膜、主动脉瓣、颈动脉、肠膜、脑膜、肺膜、皮肤或韧带中的至少一种。本发明改性交联生物瓣膜力学性能优异，具有优异的抗血栓能力、抗凝血能力、抗钙化性能，可促内皮细胞增殖，不易引起炎症反应，作为心脏瓣膜材料具有很好的应用前景。

Description

一种改性交联生物瓣膜及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种改性交联生物瓣膜及其制备方法和用途。
背景技术
心脏瓣膜置换术是严重心脏瓣膜病的一线治疗方法。经导管心脏瓣膜置换术提供了一种新的选择，并因其无需开胸、手术时间短、创伤小、风险相对较低、术后恢复快等优点逐渐成为主流治疗方法。与机械心脏瓣膜相比，生物人工心脏瓣膜(BHV)因其优良的流体力学性能和无需终身抗凝而受到老年人、孕妇或可能面临手术出血风险的患者的青睐。目前，临床上使用的瓣膜材料主要是戊二醛交联的猪心包(PP)或牛心包(BP)。然而，戊二醛的细胞毒性可引起炎症反应和亚临床小叶血栓。临床数据表明，接受经导管BHV置换术的患者在植入后的头几个月仍有血栓形成的风险。尤其是对于肺动脉瓣和静脉瓣膜置换术患者，肺动脉瓣血流缓慢会增加血栓形成的风险。在更严重的情况下，血栓可能导致危及生命的中风或心内膜炎。血栓和炎症会进一步促进瓣膜钙化，影响瓣膜功能，缩短瓣膜的寿命。因此，必须提高瓣膜自身的抗血栓和抗钙化性能，以提高其综合性能。
为了避免戊二醛交联带来的潜在风险，研究人员开发了一系列具有良好生物相容性和减少钙化的非戊二醛交联BHV材料——噁唑烷交联猪心包。其机械性能与戊二醛交联猪心包相当，且噁唑烷交联猪心包制成的BHV在超过3.5亿次的加速疲劳试验中表现出良好的耐久性(Yu T,Chen X,Zhuang W,et al.Nonglutaraldehyde treated porcinepericardium with good biocompatibility,reduced calcification and improvedAnti-coagulation for bioprosthetic heart valve applications[J].ChemicalEngineering Journal,2021,414(5):128900.)。然而，上述噁唑烷交联猪心包的抗血栓性能还需要进一步改善。
肝素钠是一种临床常用的抗血栓药物。将肝素固定在瓣膜上被证明是促进抗血栓性能的良好选择。有研究采用肝素与新鲜猪心包混合，然后用戊二醛交联，得到肝素修饰的BHV(Heparin in Calcification Prevention of Porcine PericardialBioprostheses.Biomaterials,1997,18(16):1109-1113)。然而，这种方法会锁定肝素的空间结构，并大大降低肝素的生物活性。鉴于心包的大多数氨基都是通过戊二醛的交联反应来使用的，如何提高肝素的移植密度成为了肝素在交联心包表面修饰的难点。用中间体增加交联心包表面的氨基是一种可行的方法，但是，聚乙烯亚胺或者壳聚糖等中间产物的高正电荷很容易导致严重的血液凝结(Ultrafast Self-Gelling and Wet Adhesive Powderfor Acute Hemostasis and Wound Healing.Advanced Functional Materials,2021，31(33):2102583.)。
因此，进一步探索具有良好的抗血栓性能、力学性能、抵抗酶降解能力、生物安全性、抗钙化性能和促内皮细胞增殖能力的人工心脏瓣膜材料，仍是研究的重点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗凝、抗钙化和内皮化的改性交联动物心包生物瓣膜。
本发明提供了一种改性交联生物瓣膜，它是肝素或其盐通过磺化壳聚糖接枝、羧基噁唑烷交联的生物膜片；所述生物膜片是心包膜、主动脉瓣、颈动脉(颈动脉瓣)、肠膜、脑膜、肺膜、皮肤或韧带中的至少一种；
所述磺化壳聚糖是O-磺化壳聚糖；
所述羧基噁唑烷的结构为：
Figure BDA0003672508360000021
进一步地，上述肝素的接枝率为10～90μg/cm2，所述磺化壳聚糖的接枝率为20～50μg/cm2；
优选地，所述肝素的接枝率为43.93±15.32μg/cm2，所述磺化壳聚糖的接枝率为31.57±1.32μg/cm2。
进一步地，上述O-磺化壳聚糖是3,6-O-磺化壳聚糖。
进一步地，它是按照包括如下步骤的方法制备而成的：
(1)脱细胞生物膜片与羧基噁唑烷反应得到交联生物膜片；
(2)交联生物膜片与O-磺化壳聚糖在活化剂和缩合剂的作用下反应得到磺化壳聚糖接枝的生物膜片；
(3)磺化壳聚糖接枝的生物膜片与肝素或其盐在活化剂和缩合剂的作用下反应，即得。
进一步地，上述活化剂是NHS，缩合剂是EDC。
进一步地，上述步骤(1)所述反应是将脱细胞生物膜片浸泡在羧基噁唑烷溶液中20～37℃反应70～75h；
和/或，步骤(2)所述反应是将交联生物膜片浸泡在活化剂和缩合剂的溶液中1～3h后，加磺化壳聚糖至溶液中，20～37℃反应20～30h；
和/或，步骤(3)所述反应是将肝素或其盐的溶液与活化剂和缩合剂混合搅拌1-3h后，再将磺化壳聚糖接枝的生物膜片浸泡其中，20～37℃反应20～30h。
更进一步地，上述步骤(1)所述羧基噁唑烷溶液的浓度为1％～7％wt，优选为3％wt；
和/或，步骤(2)所述的溶液中活化剂浓度为0.05～0.15M，缩合剂浓度为0.05～0.15M，磺化壳聚糖浓度为0.5～1.5％wt；
和/或，步骤(3)所述的溶液中活化剂浓度为0.05～0.15M，缩合剂浓度为0.05～0.15M，肝素或其盐的浓度为0.5～1.5％wt。
进一步地，上述心包膜是猪心包或牛心包，所述主动脉瓣是猪主动脉瓣、所述颈动脉是牛颈动脉。
本发明还提供了上述的改性交联生物瓣膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)脱细胞动物心包与羧基噁唑烷反应得到交联动物心包；
(2)交联动物心包与O-磺化壳聚糖在活化剂和缩合剂的作用下反应得到磺化壳聚糖接枝的动物心包；
(3)磺化壳聚糖接枝的动物心包与肝素或其盐在活化剂和缩合剂的作用下反应，即得。
本发明还提供了上述的改性交联生物瓣膜在制备心脏瓣膜材料中的用途。
本发明的有益效果：本发明设计了带有羧基官能团的双环噁唑烷交联剂对猪心包进行交联，创造性的使用磺化壳聚糖作提供丰富的可供肝素钠进一步接枝的氨基，进而成功将肝素钠通过磺化壳聚糖桥接枝到噁唑烷交联瓣膜上，得到的改性交联生物瓣膜力学性能优异，具有优异的抗血栓能力、抗凝血能力、抗钙化性能，可促内皮细胞增殖，不易引起炎症反应，作为心脏瓣膜材料具有很好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为(A)OX-CO的制备路线；(B)OX-CO的质谱分析。
图2为磺化壳聚糖的红外光谱。
图3为用茚三酮法测定不同浓度OX-CO溶液处理PP后的游离胺相对含量。
图4为磺化壳聚糖(A)和肝素钠(B)的标准曲线。
图5为生物瓣膜的微观形态。
图6为(A)D-PP或交联PP的热收缩温度(n＝3)。抗胶原酶(B)或弹性蛋白酶(C)降解。(D)与瓣膜浸提液孵育24小时或48小时后的细胞活力评估。(E)通过TRITC-pholloidin(红色)和DAPI(蓝色)染色观察24小时和48小时后HUVEC与瓣膜的粘附。(标尺＝50μm)。
图7为(A)G-PP、OX-CO-PP、OX-SC-PP和OX-SH-PP的溶血作用；(B)与瓣膜孵育后的血浆APTT和PT；(C)与瓣膜孵育后血浆TAT含量；(D)用瓣膜处理后血浆中C3a的浓度。顽固性全血凝固后PPs表面生成的血栓数量(E)和图像(F)。(*p＜0.05，**＜0.01，***＜0.001)。
图8为通过动静脉血液置换2小时，评估G-PP、OX-CO-PP、OX-SC-PP和OX-SH-PP的血液相容性。(A)房室分流试验图解。(B)体外房室分流试验后交联瓣膜的SEM图像。(C)体外房室分流试验后交联瓣膜的图像。
图9为兔离体房室分流术后出现G-PP、OX-CO-PP、OX-SC-PP、OX-SH-PP或空白组导管图。
图10为(A)SD大鼠皮下植入30天和60天后G-PP、OX-CO-PP、OX-SC-PP和OX-SH-PP的钙含量。(n＝6，***p＜0.001)。(B)植入30天和60天后不同交联瓣膜的茜素红染色切片。(标尺＝200μm)。(C)大鼠皮下植入7天后，用不同交联瓣膜的CD3和CD68标记物进行免疫组织化学。(标尺＝100μm)。(D)植入7天后，CD3阳性细胞和CD68阳性细胞聚集在标本周围。
具体实施方式
除另有说明外，本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
1、本发明羧基噁唑烷(OX-CO)的制备：
噁唑烷OX-OH(24.00g，165.5mmol)和琥珀酸酐(18.10g，179.8mmol)的合成溶解在干燥的四氢呋喃(100mL)中。在130℃下回流8小时后，通过旋转蒸发获得白色晶体，并按照上述相同方法通过重结晶纯化。成功制备了OX-CO(28.00g，69％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝9.94(s，1H)，4.49(dd，J＝25.0Hz，5.5Hz，4H)，4.20(s，2H)，3.90-3.73(m，4H)，2.88-2.54(m，4H)ppm。13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝177.0,171.8,88.0,73.7,71.3,66.5,28.8ppm。MS(ESI+)：计算C10H16NO6[M+H]+246.10。
制备路线与质谱结果如图1所示。
Figure BDA0003672508360000041
2、3,6-O-磺化壳聚糖的制备。
按照之前报道的方法(Biomacromolecular Affinity:Interactions betweenLysozyme and Regioselectively Sulfated Chitosan.Colloids Surfaces BBiointerfaces 2009,73(2),346–350)制备了3,6-O-磺化壳聚糖。将壳聚糖(2.0g)分散在10ml二氯乙酸和90mL甲酰胺的溶剂中。然后将混合物逐滴添加到由10mL HClSO3和50ml超干DMF组成的硫酸化试剂中，然后在50℃下搅拌1h。将所得反应混合物倒入5倍体积的冷乙醇中，然后通过真空过滤收集沉淀。用乙醇洗涤数次后，将产物溶解在去离子水中，并用NaHCO3调节至中性。将所得溶液用3000MW截止透析袋对水透析72小时。通过冷冻干燥成功获得O-磺化壳聚糖，然后通过傅里叶变换红外光谱和元素分析对其进行表征。
结果如图2、表1所示：
表1、元素分析结果
Figure BDA0003672508360000051
图2中1226cm-1的峰是S＝O的拉伸振动峰，810cm-1的峰是C-O-S的拉伸振动吸收峰。这表明磺酸基团成功接枝到壳聚糖的羟基位置。根据元素分析结果(表1)计算，壳聚糖磺酸的取代度为148％，这表明羟基的不止一个位置被取代，3-羟基和6-羟基都被修饰，因此，制得的磺化壳聚糖是3,6-O-磺化壳聚糖。
3、脱细胞猪心包(D-PP)的制备
新鲜PP与含有0.5％十二烷基磺酸钠和0.5％脱氧胆酸钠的脱细胞溶液一起振荡培养12小时。然后，将所得脱细胞猪心包(D-PP)用蒸馏水冲洗数次，并储存在PBS溶液中。
实施例1、本发明改性交联生物瓣膜的制备
1、OX-CO交联猪心包(OX-CO-PP)的制备
将D-PP浸入不同浓度的OX-CO溶液(3％，wt％)中，振荡72小时。用去离子水彻底清洗后，制备OX-CO-PP。
2、磺化壳聚糖接枝交联猪心包(OX-SC-PP)的制备
将OX-CO-PP与羧基活化溶液(由NHS(0.1M)和EDC(0.1M)组成)孵育。搅拌2小时后，添加3,6-O-磺化壳聚糖(1％，wt％)，并振荡24小时。然后用去离子水彻底清洗所得PP，得到磺化壳聚糖接枝的OX-CO交联PP(OX-SC-PP)。
3、肝素钠接枝交联猪心包(OX-SH-PP)的制备
肝素钠溶液中(1％，wt％)加入NHS(0.1M)和EDC(0.1M)活化2小时后，将OX-SC-PP浸泡在其中，孵育24小时。然后，用去离子水彻底清洗所得PP，成功制备了以磺化壳聚糖(OX-SH-PP)为桥键连接的肝素钠接枝OX-CO交联猪心包。
整个制备过程的温度控制在20～37℃。
对比例1、戊二醛交联生物瓣膜的制备
将D-PP连接到5cm×5cm的方形框架上，进行后续交联反应。然后用戊二醛溶液(0.625％，wt％)处理D-PP 72小时。交联过程结束后，将所得PP用大量蒸馏水冲洗几次，得到G-PP。
对比例2、羧基噁唑烷交联生物瓣膜的制备
参照实施例1的步骤1，制备OX-CO-PP。
对比例3、磺化壳聚糖接枝交联生物瓣膜的制备
参照实施例1的步骤1、2，制备磺化壳聚糖接枝的OX-CO交联PP(OX-SC-PP)。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
涉及的实验方法如下：
1、游离胺基的测量
交联瓣膜的游离胺基
通过茚三酮分析进行定量。简言之，分别对D-PP、G-PP或OX-CO-PP(约1cm×1cm大小)进行称重。将每个样品放入含有1mL茚三酮溶液的离心管中，该茚三酮溶液由50％v/v茚三酮(1％W/v)柠檬酸钠(0.1M，pH＝5)和50％v/v二甘醇单甲醚组成，然后在水浴中加热至95℃20分钟。在所得溶液冷却后，向每个样品中添加250μL异丙醇水溶液(50％，v/v)。将100μL上清液吸入96孔板中，并使用微孔板读取器在567nm处测量
2、热收缩温度测量
采用差示扫描量热法(DSC)测定热收缩温度。冷冻干燥后将样品切成1cm×1cm大小。通过DSC 2920在包括N2气氛和10℃/min加热速率的条件下获得加热曲线。
3、微观形貌观察
微观形态观察将交联的瓣膜样品切成6mm的圆形薄片并冷冻干燥。金溅射后，用扫描电子显微镜观察了微观形貌。
4、单轴拉伸试验
将试样沿纤维方向切割成40mm×10mm，用测厚仪随机测量三点的厚度。使用拉伸速度为12.5mm/min的单轴拉伸试验机进行拉伸试验。计算极限拉伸强度、延伸率、切线模量和延伸率。
5、抗酶解能力试验
胶原酶和弹性蛋白酶降解将交联和未交联的样品切成1cm×1cm大小后进行冻干和称重。将样品与浓度为1mg/mL(125U/mL)的1mL胶原酶或弹性蛋白酶溶液在37℃下孵育24小时。用蒸馏水彻底清洗样品，最后冷冻干燥并称重。酶解前后的重量分别命名为W0和W1。
Figure BDA0003672508360000061
6、细胞毒性评估材料的细胞毒性
根据国家标准中描述的方法进行评估。简单地说，交联瓣膜用75％乙醇灭菌，然后在37℃的DMEM培养基(6cm2/mL，表面积/体积)中提取72小时。用0.25％胰蛋白酶消化L929细胞，并将其种植在密度为5000/孔的96孔板中。孵育24小时后，添加100μL培养基浸提液，以取代原始培养基24或48小时。用CCK-8试剂盒检测细胞活性。
7、内皮细胞粘附和增殖
将交联瓣膜切割成直径为12mm的圆盘，置于48孔板中，并按照细胞毒性评估的相同方法进行灭菌。消化生长良好的人内皮细胞，然后以20000个细胞/孔的密度浸泡样品。培养24或48小时后，将样品转移到一个新的48孔板上，用PBS清洗，用2.5％戊二醛固定液固定，并分别用TRITC phalloidin和DAPI标记。在共聚焦激光显微镜下观察交联PPs上的细胞形态。
8、溶血率测定
从耳中动脉提取的兔血以1000rpm的转速离心15分钟。丢弃上层血清，留下下层红细胞。用PBS溶液将血液稀释10倍。将交联PP切割成直径为10mm的圆形，置于1.5mL离心管中，并用200μL PBS溶液渗透。超纯水和PBS溶液分别作为阳性对照和阴性对照。向每个孔中加入稀释的红细胞(800μL)并培养24小时。去除交联PP并离心。通过微孔板读取器测试545nm处上清液的吸光度。
9、全血凝固实验
将交联PP制成直径为10mm的圆形板，置于48孔板中，用PBS彻底清洗。新鲜兔血以3000rpm离心15分钟，取出高频血小板血浆(FPP)。将FPP(500μL)添加到每个孔中，并在37℃下培养90分钟。培养后，用半自动血液分析仪分析血清凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血酶时间(APTT)。
10、再钙化全血凝块实验
3％(V/V)CaCl2(100mm)加入新采集的兔血中制备再钙化血液。将交联PP成型为直径为6mm的圆板，然后放入96孔板中。添加再钙化血液200μL，并在37℃下培养10分钟。然后将所得样品转移到新的96孔板上，并用PBS清洗3次。向每个样品中添加300μL TritonX-100(0.5％，V/V)以溶解血栓。使用微孔板分析仪在405nm处测量上清液的吸光度。
11、体外房室分流实验(AV分流)
试验动物的使用和所有方案均经四川省实验动物管理委员会批准，并根据机构和NIH关于研究动物护理和使用的指南进行。将交联瓣膜切成10mm×15mm的矩形，灭菌后用无菌PBS清洗(与细胞毒性评估方法相同)，并放置在直径约2mm的导管中。空白组为空白导管，无交联PPS。新西兰大白兔(约3kg)在手术前用2％戊巴比妥钠30mg/kg麻醉，并注射100U/kg肝素钠。切开兔子颈部的皮肤和肌肉，通过导管将颈动脉和颈静脉从外部连接起来，以建立血液循环。两小时后，拔出导管，用生理盐水清洗。记录样本重量W1(手术前)或W2(手术后)。血栓用2.5％戊二醛固定液固定1h，然后用梯度乙醇脱水干燥。血栓通过SEM观察(日本JEOLJSM-5900LV)。
血栓量＝W2-W1
12、补体活化测量
将交联瓣膜分成直径为10mm的圆盘，并放置在48孔板中。然后将其浸入通过离心法从500μL全血中分离的血浆中(与凝血试验相同)。将血浆在37℃下振荡1小时。收集所得血浆并用C3a酶免疫分析试剂盒测定。
13、钙化与炎症
将交联瓣膜切成1cm×1cm，灭菌后用无菌PBS彻底冲洗。通过腹腔注射2％戊巴比妥钠(剂量为30mg/kg)麻醉SD大鼠(100g±10g)。背部的头发被剃了。，背部皮肤用擦拭式聚维酮碘溶液消毒。中间切开两个孔(约1cm)，两侧开两个口袋。将交联瓣膜放入口袋中并缝合。分别在第7天、第30天和第60天采集样本。部分样品在冷冻干燥后称重，并在100℃水浴中用浓硝酸加热，直到所有固体溶解。采用ICP-AES分析钙含量。另一部分用4％多聚甲醛固定，梯度脱水，包埋，切片，HE染色，免疫组织化学和茜素红染色。用Image pro plus计数CD3阳性细胞数和CD68阳性细胞数。
实验例1、制备原料用量的筛选和表征
在功能性交联剂OX-CO的作用下，用OX-CO处理D-PP得到OX-CO-PP。根据不同浓度的OX-CO-PP的氨基转化率，得到的结果如图3。可见，3％wt浓度的OX-CO交联后，氨基转化率基本稳定，因此选择3％wt为最佳制备浓度。
在OX-CO-PP上保留了大量羧基的情况下，通过酰胺基的化学连接，用磺化壳聚糖对OX-CO-PP进行改性，得到OX-SC-PP，接着，将肝素钠与磺化壳聚糖作为间隔物进一步接枝，以获得功能性BHV材料OX-SH-PP。根据磺化壳聚糖和肝素钠的标准曲线(图4)，通过溶液中磺化壳聚糖和肝素钠的残留量，计算出磺化壳聚糖和肝素钠的接枝率分别为31.57±1.32μg/cm2和43.93±15.32μg/cm2。
实验例2、机械性能和抵抗酶降解性
猪心包纤维的形态和取向与机械性能和抵抗酶降解性能密切相关。D-PP、OX-CO-PP、OX-SC-PP和OX-SH-PP的形态如图5所示。在扫描电镜样品制备过程中，D-PP的胶原纤维消失，而这些交联PP的间隙减小，表面更加致密。热收缩温度可以用来表征胶原材料的稳定性。如图6A所示，G-PP的热收缩温度(88.4℃±3.51℃)显著高于D-PP(77.27℃±1.62℃)。OX-CO-PP的DSC(93.11℃±1.17℃)高于G-PP，表明OX-CO能显著稳定PP材料。此外，OX-SH-PP的热收缩温度(96.67℃±3.67℃)略高于OX-CO-PP，这可能是磺化壳聚糖与肝素钠接枝后形成氢键所致。
PP主要由胶原蛋白和弹性蛋白组成。胶原酶处理后(图6B)，D-PP、G-PP、OX-CO-PP和OX-SH-PP的失重率分别为93.69％、2.73％、7.06％和1.73％。经弹性蛋白酶处理后(图6C)，D-PP、G-PP、OX-CO-PP和OX-SH-PP的失重率分别为17.36％、7.32％、7.38％和7.32％。由于胶原蛋白主要由亲水性氨基酸组成，化学交联可以大大提高其稳定性。弹性蛋白主要由疏水性氨基酸组成，交联的稳定性也能在一定程度上提高OX-SH-PP弹性蛋白的稳定性，这与G-PP相似。
表2、交联瓣膜的力学性能
Figure BDA0003672508360000091
心脏瓣膜在人体内充当单向阀，以防止血液回流，需要打开和关闭数亿次。良好的机械强度对它们的长寿至关重要。通过单轴拉伸试验对交联BHV的力学性能进行了评价。
如表2所示，G-PP(19.48MPa±2.42MPa)、OX-CO-PP(19.43MPa±1.02MPa)和OX-SH-PP(20.21MPa±1.93MPa)的极限拉伸强度与G-PP(19.25MPa±1.17MPa)相当，显著高于D-PP(8.63MPa±2.44MPa)。同时，所有交联PPs(G-PP:102.78MPa±9.82MPa；OX-CO-PP:102.83MPa±14.32MPa；OX-SC-PP:110.88MPa±13.56MPa和OX-SH-PP:102.33MPa±9.30MPa)的高切向模量也显著高于D-PP(49.89MPa±14.83MPa)，表明这些噁唑烷交联瓣膜的力学性能优异。
PPs的细胞毒性如图6D所示，经G-PP提取物处理的L929细胞在24小时后的存活率为44.38％±3.53％，48小时后为33.71％±7.78％，表明对G-PP的毒性相对较高。经OX-CO-PP、OX-SC-PP和OX-SH-PP处理的细胞在24小时或48小时后的存活率接近100％。同时，在图6E中还观察到交联PPs中内皮细胞的生长。24小时或48小时后，只有少数内皮细胞附着在G-PP上，其形态表型和生长条件较差。OX-CO-PP、OX-SC-PP和OX-SH-PP的细胞在24小时后呈梭形，48小时后细胞数量显著增加，形态表型正常，生长状况良好，表明OX-SH-PP具有良好的细胞相容性和内皮细胞生长增强。
实验例3、体外血液学表征
研究了交联瓣膜的血液相容性和抗凝血能力。作为一种植入式血液接触医疗设备，有必要评估BHV材料的溶血率。如图7A所示，G-PP(对比例1)、OX-CO-PP(对比例2)、OX-SC-PP(对比例3)和OX-SH-PP(实施例1)的溶血率分别为1.41％±0.28％、0.79％±0.32％、0.37％±0.33％和0.24％±0.23％，远低于小于3％的可接受溶血率标准。此外，使用凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血酶时间(APTT)来评估这些交联PPs的抗凝能力。如图7B所示，空白对照组、G-PP组、OX-CO-PP组、OX-SC-PP组和OX-SH-PP组的PT值分别为8.27s±0.27s、8.18s±0.12s、8.03s±0.08s、8.28s±0.15s和9.03s±0.75s，所有组的PT值均无显著差异。空白对照组、G-PP和OX-CO-PP的APTT分别为17.2s±2s、20.7±0.34s和20.35±0.77s，OX-SC-PP的APTT为50.52s±1.92s，OX-SH-PP的APTT为110.65s±12.69s，分别是空白对照组的2.94倍和6.43倍。通过凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)Elisa试剂盒测定TAT的浓度。如图7C所示，与对照组的TAT浓度(191.36pg/mL)相比，OX-SC-PP和OX-SH-PP的TAT浓度分别为282.32pg/mL和393.66pg/mL，表明引入磺化壳聚糖和肝素钠可显著增强抗凝血酶结合凝血酶形成TAT复合物的能力40，抑制凝血因子活性，延长APTT。
当血液与异物接触时，宿主的补体系统将被激活，成分C3的成分将分裂为C3a和C3b。41因此，补体激活水平可以通过C3a的浓度来评估。如图7D所示，G-PP、OX-CO-PP、OX-SC-PP和OX-SH-PP中的C3a浓度分别为28.29ng/mL、29.59ng/mL、28.94ng/mL和30.55ng/mL，均低于对照组(31.17ng/mL)，表明这些交联PP的低免疫原性。通过全血再修饰凝血试验评价交联瓣膜的体外抗血栓能力。图7F直观地反映了四组的抗血栓能力。与难钙化全血孵育后，G-PP组形成大量血栓，OX-CO-PP组形成部分血栓，而OX-SC-PP和OX-SH-PP组仅形成一小部分血栓。血红蛋白的吸光度(图7E)进一步反映了血栓形成的体积，表明本发明OX-SH-PP具有优越的抗血栓能力。
通过体外房室分流测试了交联瓣膜在活体血流中的抗凝能力(图8A)。如图9所示，在通过导管的血流2小时后，空白组没有血栓形成，表明导管本身没有引起凝血。G-PP组、OX-CO-PP组和OX-SC-PP组均被阻断。G-PP和OX-CO-PP组形成大量血栓，OX-SC-PP组形成部分血栓。OX-SH-PP组导管通透性好，无明显血栓形成(图8C)。扫描电子显微镜(图8B)显示，在G-PP、OX-CO-PP和OX-SC-PP组中，可以观察到纤维蛋白和血细胞结合形成血栓，而OX-SH-PP表面几乎没有血细胞，表明通过磺化壳聚糖间隔基对肝素进行改性成功地提高了交联瓣膜的抗凝能力。
实验例4、钙化及炎症表达
如图10A所示，60天后，G-PP(对比例1)上有大量暗红色钙化点，而OX-CO-PP(对比例2)、OX-SC-PP(对比例3)和OX-SH-PP(实施例1)中未发现明显的钙化点。还通过ICP-AES对钙化进行了定量分析。如图10B所示，植入SD大鼠30天后，虽然G-PP的钙含量为11.45μG/mg，但OX-CO-PP(1.38μG/mg)、OX-SC-PP(2.79μG/mg)和OX-SH-PP(1.42μG/mg)的钙含量显著低于G-PP。60天后，钙含量进一步增加至126.46μG/mg。OX-CO-PP(2.84μg/mg)、OX-SC-PP(3.74μg/mg)和OX-SH-PP(2.41μg/mg)的钙化程度仍然很低。
用茜素红染色切片进一步确定钙化程度。以CD3和CD68分别作为T淋巴细胞和巨噬细胞数量的特异性标记物，通过免疫组化切片研究交联瓣膜s植入后的免疫排斥反应。如图10C和图10D所示，与G-PP相比，观察到的OX-CO-PP、OX-SC-PP和OX-SH-PP的T淋巴细胞(CD3)和巨噬细胞(CD68)抗体少得多，表明这些噁唑烷交联瓣膜具有更好的生物相容性。已有研究表明，钙化与多种因素有关，如残余醛基和炎症反应。非戊二醛交联聚苯硫醚具有良好的抗钙化性能，这可能是由于其良好的生物相容性、交联后无醛残留以及低炎症反应。
因此，本发明生物瓣膜生物相容好，不易造成炎症反应。
综上，本发明提供了一种肝素钠通过磺化壳聚糖桥接枝到噁唑烷交联的猪心包上的生物瓣膜，其力学性能优异，具有优异的抗血栓能力、抗凝血能力、抗钙化性能，可促内皮细胞增殖，不易引起炎症反应，作为心脏瓣膜材料具有很好的应用前景。

Claims (10)

1.一种改性交联生物瓣膜，其特征在于，它是肝素或其盐通过磺化壳聚糖接枝、羧基噁唑烷交联的生物膜片；所述生物膜片是心包膜、主动脉瓣、颈动脉、肠膜、脑膜、肺膜、皮肤或韧带中的至少一种；
所述磺化壳聚糖是O-磺化壳聚糖；
所述羧基噁唑烷的结构为：
；
所述改性交联生物瓣膜是按照包括如下步骤的方法制备而成的：
（1）脱细胞生物膜片与羧基噁唑烷反应得到交联生物膜片；所述反应是将脱细胞生物膜片浸泡在羧基噁唑烷溶液中20~37℃反应70~75h；
（2）交联生物膜片与O-磺化壳聚糖在活化剂和缩合剂的作用下反应得到磺化壳聚糖接枝的生物膜片；所述反应是将交联生物膜片浸泡在活化剂和缩合剂的溶液中1~3h后，加磺化壳聚糖至溶液中，20~37℃反应20~30h；
（3）磺化壳聚糖接枝的生物膜片与肝素或其盐在活化剂和缩合剂的作用下反应，即得；所述反应是将肝素或其盐的溶液与活化剂和缩合剂混合搅拌1-3h后，再将磺化壳聚糖接枝的生物膜片浸泡其中，20~37℃反应20~30h。
2.如权利要求1所述的改性交联生物瓣膜，其特征在于，所述肝素的接枝率为10~90μg/cm2，所述磺化壳聚糖的接枝率为20~50μg/cm2。
3.如权利要求2所述的改性交联生物瓣膜，其特征在于，所述肝素的接枝率为43.93±15.32μg/cm2，所述磺化壳聚糖的接枝率为31.57±1.32μg/cm2。
4.如权利要求1所述的改性交联生物瓣膜，其特征在于，所述O-磺化壳聚糖是3,6-O-磺化壳聚糖。
5.如权利要求4所述的改性交联生物瓣膜，其特征在于，所述活化剂是NHS，缩合剂是EDC。
6.如权利要求1所述的改性交联生物瓣膜，其特征在于，步骤（1）所述羧基噁唑烷溶液的浓度为1%~7%wt；
和/或，步骤（2）所述的溶液中活化剂浓度为0.05~0.15M，缩合剂浓度为0.05~0.15M，磺化壳聚糖浓度为0.5~1.5%wt；
和/或，步骤（3）所述的溶液中活化剂浓度为0.05~0.15M，缩合剂浓度为0.05~0.15M，肝素或其盐的浓度为0.5~1.5%wt。
7.如权利要求6所述的改性交联生物瓣膜，其特征在于，步骤（1）所述羧基噁唑烷溶液的浓度为3%wt。
8.如权利要求1~3任一项所述的改性交联生物瓣膜，其特征在于，所述心包膜是猪心包或牛心包，所述主动脉瓣是猪主动脉瓣、所述颈动脉是牛颈动脉。
9.权利要求1~8任一项所述的改性交联生物瓣膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）脱细胞动物心包与羧基噁唑烷反应得到交联动物心包；所述反应是将脱细胞生物膜片浸泡在羧基噁唑烷溶液中20~37℃反应70~75h；
（2）交联动物心包与O-磺化壳聚糖在活化剂和缩合剂的作用下反应得到磺化壳聚糖接枝的动物心包；所述反应是将交联生物膜片浸泡在活化剂和缩合剂的溶液中1~3h后，加磺化壳聚糖至溶液中，20~37℃反应20~30h；
（3）磺化壳聚糖接枝的动物心包与肝素或其盐在活化剂和缩合剂的作用下反应，即得；所述反应是将肝素或其盐的溶液与活化剂和缩合剂混合搅拌1-3h后，再将磺化壳聚糖接枝的生物膜片浸泡其中，20~37℃反应20~30h。
10.权利要求1~8任一项所述的改性交联生物瓣膜在制备心脏瓣膜材料中的用途。
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