CN112089892B - 一种仿生改性的瓣膜材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种仿生改性的瓣膜材料及其制备方法和应用，包括以下步骤A.合成装载药物的载药纳米颗粒；B.制备细胞膜囊泡；C.将载药纳米颗粒与细胞膜囊泡混合并多次挤出，制备细胞膜包裹的载药纳米颗粒；D.将细胞膜包裹的载药纳米颗粒交联到生物瓣膜表面，即得。本发明方法具有操作简单、反应条件温和等优点，通过本发明方法制备的细胞膜包裹纳米载药颗粒仿生改性瓣膜材料，可以很好地解决目前戊二醛交联瓣膜存在的易血栓、钙化和内皮化困难等问题。同时将细胞膜仿生给药系统与瓣膜相结合的策略，为安全、高效的瓣膜心脏病的治疗提供了新一代的治疗模式。

Description

一种仿生改性的瓣膜材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，尤其涉及一种仿生改性的瓣膜材料及其制备方法和应用。
背景技术
目前，瓣膜性心脏病(VHD)影响着全世界1亿多人，主要包括瓣膜狭窄或反流。随着人口老龄化的加剧，在发展中国家老年人群中，退行性瓣膜病和风湿性心脏病发病率居高不下，已成为一个日益严重的问题。近些年，针对心脏瓣膜功能障碍的医学治疗尚在探索之中，而且由于对VHD的病理生理及进展了解较少，大大限制了其医学治疗的发展。在瓣膜功能严重障碍的情况下，用人工瓣膜(主要包括机械和生物瓣膜)替换受损瓣膜是最有效的解决方案。到2050年，预计有超过850000患者需要心脏瓣膜置换。此外，基于异种移植或同种移植的生物心脏瓣膜(BHVs)也已经被广泛使用，并且相关的研究报道接受BHVs的患者比例逐年增加，已经超过80％。
为了解决这些问题，戊二醛(GLU)通常被用来处理生物心脏瓣膜。然而最新的临床资料显示，介入人工心脏瓣膜产品植入后1年内发生瓣膜血栓的风险较高，发生率在15％～40％。大多数瓣膜血栓形成在临床上主要体现为瓣膜增厚和瓣膜运动能力降低,如果未能较好的干预可能导致瓣膜运动性障碍和流体力学恶化,甚至有些病人还可能经历瓣膜再次狭窄,导致心脏衰竭、昏厥和心绞痛的出现。同时,瓣膜血栓的形成可能进一步加重钙化的发生,迫使病人进行二次瓣膜植入手术。目前临床应用的经导管主动脉瓣置换术(transcatheter aortic valve replacement,TAVR)的瓣膜是由戊二醛交联的猪心包或牛心包制成。前期研究发现GLU交联的猪心包有吸附蛋白和血小板粘附的倾向，并具有一定的致血栓性。瓣叶作为一种异质材料，可促进血小板的粘附，使凝血因子局部富集，从而导致瓣叶血栓形成。抗凝药物虽然能在一定程度上降低血凝的风险，但也会给患者带来额外的出血风险和经济负担。因此，目前迫切需要改善瓣膜材料的血液相容性，降低瓣膜血栓的发生率。另一方面，临床资料也显示，GLU处理的BHVs由于GLU的高毒性，会抑制内皮细胞的粘附和增殖，并且GLU处理的BHVs显示出免疫原性反应、钙化等缺点。因此，GLU处理的BHVs会导致瓣膜血栓形成、内皮化困难、钙化严重以及由于机械性能改变和功能受损导致瓣膜寿命缩短(通常只有10-15年)等问题。因此，寻找一种新的改性方法来改善生物瓣膜的内皮化、抗凝、抗钙化、耐受性等性能，使瓣膜置换术中及术后的副作用降到最低，成为目前研究的重点。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述现有技术存在的不足，提供一种仿生改性的瓣膜材料及其制备方法和应用。
本发明采用的技术方案如下：
一种仿生改性的瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：
A.合成装载药物的载药纳米颗粒；
B.制备细胞膜囊泡；
C.将步骤A的载药纳米颗粒与步骤B的细胞膜囊泡混合并多次挤出，制备细胞膜包裹的载药纳米颗粒；
D.将步骤C的细胞膜包裹的载药纳米颗粒交联到生物瓣膜表面，即得。
由于经GLU处理的BHVs表面有大量的羧基和少量残存的氨基，同时细胞膜表面也有大量的羧基和氨基基团。因此，经GLU处理的BHVs会在催化剂的条件下与细胞膜仿生载药纳米颗粒进行酰胺化反应，最终在GLU处理的BHVs表面出现大量的细胞膜仿生载药纳米颗粒。基于此，本发明提供一种仿生改性的瓣膜材料及其制备方法和应用。利用细胞膜包裹的纳米颗粒来实现生物瓣膜的抗凝血性能，再将促内皮细胞增殖和迁移的药物以及抗钙化的药物载入到纳米颗粒中，可以更有效地促进生物瓣膜的内皮化过程和抑制心脏瓣膜置入术后的钙化问题。
本发明的仿生载药纳米颗粒可以很好地交联到生物瓣膜的表面，可以有效地增强生物瓣膜的抗凝血/内皮化和抗钙化的作用。这为改良心脏瓣膜提供了一种有效的策略，也为利用仿生纳米材料治疗生物心脏瓣膜疾病打开了一扇新的窗口。最重要的是，为安全、有效地治疗心脏瓣膜病提供了一种新的治疗模式，具有很大的临床转化潜力。
进一步地，步骤A中载药纳米颗粒呈粒径均一的球形，且能够实现可控的药物释放。
进一步地，步骤A中载药纳米颗粒由有机高分子聚合物或者无机纳米材料制备得到。包括壳聚糖、明胶、海藻酸钠、PEG、PLA、SiO2、ZrO等。
进一步地，步骤A中载药纳米颗粒中装载一种或两种不同药理活性的疏水性药物。该药物按药理活性可分为抗炎药物，抗凝血药物，免疫抑制剂以及促内皮细胞粘附、增殖药物等。
进一步地，步骤B中细胞膜为红细胞膜、血小板膜、巨噬细胞膜、中性粒细胞膜和T淋巴细胞膜中的至少一种。
进一步地，通过将全血离心获得红细胞或血小板，然后冲洗并重悬，再离心收集得到红细胞膜或血小板膜；培养并收集巨噬细胞，然后重悬，通过梯度密度离心出去亚细胞器，得到巨噬细胞膜。
进一步地，步骤C中通过挤出机挤压10-40次。
进一步地，步骤D中交联具体为：利用细胞膜表面的氨基和羧基基团与生物瓣膜表面的羧基和氨基基团在催化剂存在的条件下进行酰胺化反应。
进一步地，交联具体为：将生物瓣膜和细胞膜包裹的载药纳米颗粒在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与N-N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中浸泡；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-N-羟基琥珀酰亚胺的浓度分别为0.1M。细胞膜仿生载药纳米粒子可以在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在的情况下通过酰胺化反应交联到生物瓣膜的表面。
进一步地，步骤D中生物瓣膜包括猪心包瓣膜、牛心包瓣膜、羊心包瓣膜。
采用上述的方法制备得到的仿生改性的瓣膜材料。
上述的仿生改性的瓣膜材料在制备抗凝血、促内皮细胞生长以及抗钙化功能材料中的应用。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明的载药纳米颗粒材料来源广泛，制备简单，可以根据装载药物的不同而更换不同的载体，载药纳米颗粒具有长期的稳定性，可以实现可控的药物释放；本发明所用的细胞膜制备过程简便易行，可大量制备；本发明的仿生载药纳米颗粒可通过简单的操作过程来制备；本发明的仿生改性心脏瓣膜制备过程简单，且条件温和，不会改变其结构成分；本发明的改性心脏瓣膜在修饰仿生载药纳米颗粒之后仍然具有良好的力学性能和机械性能；本发明提供的仿生改性心脏瓣膜具有良好的细胞相容性和血液相容性；本发明的改性心脏瓣膜在修饰仿生载药纳米颗粒之后通过可控的药物释放大大增强了抗凝血性能、抗钙化能力以及促进内皮化过程。
综上，本发明提供的仿生改性瓣膜材料的制备方法代表了一种将仿生纳米递药系统和心脏瓣膜有机结合的全新概念和设计策略，具有优越的临床应用前景。本发明提供的仿生改性瓣膜材料大大增强了抗凝血性能、抗钙化能力以及促进内皮化过程，很好的解决了目前临床上瓣膜所出现的问题。总的来说，这项工作为瓣膜疾病的治疗提供了一种有效的治疗方式。新的仿生改性瓣膜材料可以作为一种有前途的生物瓣膜材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是实施例1中仿生载药纳米颗粒的透射电镜图；
图2是实施例1中仿生改性心脏瓣膜的扫描电镜图；
图3是实施例1中仿生改性心脏瓣膜的红外光谱图；
图4是实施例1中仿生改性心脏瓣膜的热收缩温度图；
图5是仿生改性心脏瓣膜的酶稳定性图；
图6是仿生改性心脏瓣膜的药物释放图；
图7是仿生改性心脏瓣膜的抗凝血图；
图8是仿生改性心脏瓣膜的内皮细胞粘附与增殖图；
图9是仿生改性心脏瓣膜的体内茜素红染色图；
图10是仿生改性心脏瓣膜的体内钙含量图；
图11是本发明的制备过程示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明较佳的实施例提供一种仿生改性的瓣膜材料的制备方法，具体为一种红细胞膜包裹纳米载药颗粒用于猪心包瓣膜仿生改性的制备方法，由如下步骤获得：
1)载药PLGA纳米粒的制备(RAPA&AC@PLGA)
PLGA(10mg,MW.50000,50:50)，RAPA(1mg)，AC(1mg)溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中。然后将混合溶液滴加到3mL水中，轻轻搅拌。2h后，使用透析袋(MWCO＝3500da)透析48h，制备得到载药纳米颗粒，如图1。
2)制备红细胞膜囊泡
将全血在4℃(2000rpm,10min)离心除去血清。用pH＝7.4的磷酸缓冲盐水(PBS,3次)冲洗红细胞。然后，在4℃含EDTAK2的0.25×PBS(pH＝7.4)中重新悬浮红细胞。30min后，在4℃(12000rpm,10min)离心红细胞溶液，收集粉红色沉淀，4℃保存。
3)红细胞膜包覆载药纳米粒子的制备(RBC/RAPA&AC@PLGA)
首先将RBC囊泡与RAPA&AC@PLGA纳米颗粒(2mg/mL)混合，超声处理5min。然后用迷你挤出仪(Avanti Polar Lipids,USA)将混合溶液通过聚碳酸酯多孔膜(100nm)挤压20次，制得RBC/RAPA&AC@PLGA纳米颗粒。
4)心脏瓣膜和RBC/RAPA&AC@PLGA纳米颗粒的交联
戊二醛(GLU)-交联心脏瓣膜在0.1M EDC和0.1M NHS存在的情况下搅拌3h，然后加入RBC/RAPA&AC@PLGA纳米颗粒水溶液室温反应2天。经3次水洗后，得到交联RBC/RAPA&AC@PLGA纳米颗粒的心脏瓣膜，即可，扫描电镜图如图2，红外光谱图如图3，热收缩温度图如图4，本发明的改性的瓣膜在修饰仿生载药纳米颗粒之后仍然具有良好的力学性能和机械性能。
实施例2
本发明较佳的实施例提供一种仿生改性的瓣膜材料的制备方法，具体为一种血小板膜包裹纳米载药颗粒用于猪心包瓣膜仿生改性的制备方法，由如下步骤获得：
1)载药纳米粒的制备
PLGA(10mg,MW.50000,50:50)，疏水性抗炎药物(1mg)溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中。然后将混合溶液滴加到3mL水中，轻轻搅拌。2h后，使用透析袋(MWCO＝3500da)透析48h，制备得到载药纳米颗粒。
2)制备血小板膜
首先，将全血1600转/分离心20min，获得血小板。用pH＝7.4的磷酸缓冲盐水(PBS,3次)冲洗血小板。然后，在4℃含EDTAK2的0.25×PBS(pH＝7.4)中重新悬浮血小板。30min后，在4℃(12000rpm,10min)离心收集，4℃保存。
3)血小板膜包覆载药纳米粒子的制备
首先将血小板膜与载药纳米粒混合，超声处理5min。然后用迷你挤出仪(AvantiPolar Lipids,USA)将混合溶液通过聚碳酸酯多孔膜(100nm)挤压20次。
4)心脏瓣膜和血小板膜包覆载药纳米粒子的交联
戊二醛(GLU)-交联心脏瓣膜在0.1M EDC和0.1M NHS存在的情况下搅拌3小时。然后加入血小板膜包覆载药纳米粒子水溶液室温反应2天。经3次水洗后，得到血小板膜包覆载药纳米粒子交联的心脏瓣膜，即可。
实施例3
本发明较佳的实施例提供一种仿生改性的瓣膜材料的制备方法，具体为一种巨噬细胞膜包裹纳米载药颗粒用于猪心包瓣膜仿生改性的制备方法，由如下步骤获得：
1)载药纳米粒的制备
PLGA(10mg,MW.50000,50:50)，疏水性抗凝血药物(1mg)溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中。然后将混合溶液滴加到3mL水中，轻轻搅拌。2h后，使用透析袋(MWCO＝3500da)透析48h，制备得到载药纳米颗粒。
2)制备巨噬细胞膜
首先培养和收集巨噬细胞。然后，在4℃0.25×PBS(pH＝7.4)中重新悬浮巨噬细胞。30min后，通过梯度密度离心法除去巨噬细胞的细胞核等亚细胞器，收集巨噬细胞膜并4℃保存。
3)巨噬细胞膜包覆载药纳米粒子的制备
首先将巨噬细胞膜与载药纳米粒混合，超声处理5min。然后用迷你挤出仪(AvantiPolar Lipids,USA)将混合溶液通过聚碳酸酯多孔膜挤压20次。
4)心脏瓣膜和巨噬细胞膜包覆载药纳米粒子的交联
戊二醛(GLU)-交联心脏瓣膜在0.1M EDC和0.1M NHS存在的情况下搅拌3小时。然后加入巨噬细胞膜包覆载药纳米粒子水溶液室温反应2天。经3次水洗后，得到巨噬细胞膜包覆载药纳米粒子交联的心脏瓣膜。
实验例
1、仿生改性心脏瓣膜的酶稳定性
将实施例1制得的干燥的仿生心脏瓣膜片称重(W0)，分别在胶原酶II(125U mL-1,pH7.4)或弹性酶(30U mL-1,pH 7.4)tris缓冲液中孵育24小时。然后，用水冲洗心脏瓣膜3次，冷冻干燥后称重(Wt)。减重百分比按下式计算：减重百分比(w/w％)＝(W0-Wt)/W0×100％。结果如图5所示，分别得到弹性酶和胶原酶的减重百分比，可知本发明仿生改性心脏瓣膜的酶稳定性较高。
2、药物的体外释放
向透析袋中加入1mg/mL实施例1的RBC/RAPA&AC@PLGA纳米颗粒溶液(n＝6)。在不同时间点吸取3mL PBS(pH 7.4)，并加入3mL新鲜PBS。采用高效液相色谱法测定药物的累积释放量。结果如图6所示，药物释放情况稳定。
3、仿生改性心脏瓣膜的抗凝血性能研究
对于全血黏附，将仿生改性心脏瓣膜安装在蠕动泵的流动腔内，在37℃条件下，全血在流动腔内持续流动45min。对于血小板的黏附，将全血1600转/分离心20min，获得血小板。
实施例1制得的仿生改性心脏瓣膜在37℃条件下与血小板孵育，以恒定的频率振动。2h后用PBS冲洗心脏瓣膜3次，用2.5％戊二醛固定。最后，用扫描电子显微镜(SEM,S4800，日立，日本)对瓣膜样品进行观察。结果如图7所示，可知实施例1制得的仿生改性瓣膜具有良好的抗凝血性能。
4、仿生改性心脏瓣膜的促内皮化性能研究
内皮细胞(HUVEC)在37℃孵育。心脏瓣膜样本(每组6个平行标本)用75％乙醇溶液消毒24h,用PBS洗涤后置于96孔板。100μL的HUVEC悬液被播种，密度为2×104个细胞/孔。共培养1天和3天后,用双醋酸荧光素(FDA)对细胞染色，在FDA中染色10min，用荧光显微镜观察细胞形态(Leica DMI 4000，德国)。结果如图8所示，细胞增殖情况良好，可知实施例1制得的仿生改性瓣膜促进了内皮化过程。
5、仿生改性心脏瓣膜的体内抗钙化试验
所有动物实验程序均按照四川大学实验室动物管理和使用指南进行。每个实验组有六个平行样本。心脏瓣膜用75％乙醇隔夜消毒，然后用PBS(pH7.4)冲洗。采用戊巴比妥钠对SD大鼠进行麻醉。在SD大鼠背部做纵向手术切口。每组心脏瓣膜标本均皮下植入雄性SD大鼠(150±10g)，分别于7d、30d、60d、120d处死大鼠，提取周围含有心脏瓣膜标本的组织并固定。
利用茜素红染色观察钙沉积(图9)。将移植的心脏瓣膜样本(n＝6)进行冷冻干燥和称重。然后用6M HCl溶液在100℃下溶解12h，最后用ICP-OES法检测钙含量。实验结果(图10)显示，本发明的仿生改性瓣膜大大增强了抗钙化能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种仿生改性的瓣膜材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.合成装载药物的载药纳米颗粒；
B.制备细胞膜囊泡；
C.将步骤A的载药纳米颗粒与步骤B的细胞膜囊泡混合并多次挤出，制备细胞膜包裹的载药纳米颗粒；
D.将步骤C的细胞膜包裹的载药纳米颗粒交联到生物瓣膜表面，即得；
所述交联具体为：利用细胞膜表面的氨基和羧基基团与生物瓣膜表面的羧基和氨基基团在催化剂存在的条件下进行酰胺化反应。
2.根据权利要求1所述的仿生改性的瓣膜材料的制备方法，其特征在于，所述步骤A中载药纳米颗粒呈粒径均一的球形，且能够实现药物释放。
3.根据权利要求1所述的仿生改性的瓣膜材料的制备方法，其特征在于，所述步骤A中载药纳米颗粒由有机高分子聚合物或者无机纳米材料制备得到。
4.根据权利要求1所述的仿生改性的瓣膜材料的制备方法，其特征在于，所述步骤A中载药纳米颗粒中装载一种或两种不同药理活性的疏水性药物。
5.根据权利要求1所述的仿生改性的瓣膜材料的制备方法，其特征在于，所述步骤B中细胞膜为红细胞膜、血小板膜、巨噬细胞膜、中性粒细胞膜和T淋巴细胞膜中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的仿生改性的瓣膜材料的制备方法，其特征在于，所述交联具体为：将生物瓣膜和细胞膜包裹的载药纳米颗粒在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与N-N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中浸泡。
7.根据权利要求1所述的仿生改性的瓣膜材料的制备方法，其特征在于，所述步骤D中生物瓣膜包括猪心包瓣膜、牛心包瓣膜、羊心包瓣膜。
8.采用权利要求1-7中任一项所述的方法制备得到的仿生改性的瓣膜材料。
9.权利要求8所述的仿生改性的瓣膜材料在制备抗凝血、促内皮细胞生长以及抗钙化功能材料中的应用。
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