CN109836507B - 一种提高生物心脏瓣膜糖胺多糖稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高生物心脏瓣膜糖胺多糖稳定性的方法，所述方法包括采用对羟基苯丙酸、对羟基苯乙胺修饰猪或牛的心包膜，采用对羟基苯丙酸修饰硫酸新霉素，然后在辣根过氧化物酶和过氧化氢的条件下引发酶交联。对羟基苯丙酸修饰的硫酸新霉素可以引入酚羟基，辣根过氧化物酶和过氧化氢将实现酚羟基的化学交联。本发明提供的方法能够提升生物心脏瓣膜糖胺多糖稳定性及抗钙化性能，潜在地延长其使用寿命。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物医学材料以及医疗器械技术领域，特别是一种提高生物心脏瓣膜糖胺多糖稳定性的方法。
背景技术
生物瓣膜通常采用猪或牛的心包膜制备而成，用于替换功能受损的人体心脏瓣膜。目前应用于临床的生物瓣膜通常采用戊二醛交联制备而成。戊二醛制备的生物瓣膜仍然存在一些缺点。戊二醛制备的生物瓣膜可以有效地交联胶原蛋白但是无法交联糖胺多糖。
糖胺多糖，为杂多糖的一种，主要存在于高等动物结缔组织中。人体心脏瓣膜以及心包膜当中都还有糖胺多糖，其主要作用是作为缓冲层减少瓣膜应力带来的损伤。未经交联的糖胺多糖会导致降解，会导致钙化、机械损伤，进而加速生物瓣膜的失效。
为了有效交联和稳定生物瓣膜当中的糖胺多糖，有研究采用了硫酸新霉素实现糖胺多糖的稳定(Biomaterials.2007.28(18):2861-8；Biomaterials.2015.66:83-91)。硫酸新霉素是一种透明质酸酶抑制剂。但是之前报道的添加硫酸新霉素的方法因为采用碳二亚胺交联，存在效率较低的局限性。
因此，通过优化生物心脏瓣膜的化学交联方法，特别是开发能够提高糖胺多糖结构稳定性的新型材料处理方法，将提升生物心脏瓣膜的整体结构稳定性以及抗钙化性能，对于科学研究以及相关产业领域的发展具有重大意义，而目前并没有很好的方法，因此需要改进。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足而提供一种能够提升生物心脏瓣膜糖胺多糖稳定性及抗钙化性能，潜在地延长其使用寿命的提高生物心脏瓣膜糖胺多糖稳定性的方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
一种提高生物心脏瓣膜糖胺多糖稳定性的方法，具体包括以下步骤：
S1、获取新鲜的生物材料，并于4℃下低温保存；
S2、对S1获取生物材料采用柔和摩擦和流体压力在4℃、100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，直至没有可见的粘附的非心包或非胶原组织，同时通过渗压休克实现对心包组织有效脱细胞；
S3、然后将步骤S2清洗后的生物材料进行对羟基苯丙酸、对羟基苯乙胺修饰，使用的对羟基苯丙酸摩尔浓度为10mM-100mM的水溶液，使用的对羟基苯乙胺摩尔浓度为50mM-500mM的水溶液，使用的碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔溶度为0.01-1M；
S4、将等摩尔浓度的对羟基苯丙酸和硫酸新霉素水溶液混合，加入的碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔溶度为0.01-1M，使得硫酸新霉素引入酚羟基；
S5、将步骤S3,S4处理后的生物材料以及对羟基苯丙酸修饰的硫酸新霉素进行辣根过氧化物酶/过氧化氢引发的酶交联，使用的辣根过氧化物酶质量浓度为0.1％-5％，使用的过氧化氢质量浓度为0.1％-5％，在辣根过氧化物酶在氧化剂的作用下，能够催化酚羟基实现化学交联；
S6、最后用蒸馏水浸泡清洗，清除没有反应的硫酸新霉素、辣根过氧化物酶以及过氧化氢。
进一步的，所述生物材料为动物组织，包括心包膜、瓣膜、肠膜、脑膜、肺膜、血管、皮肤或韧带的一种或多种。
进一步的，所述生物材料不限于经皮介入生物心脏瓣膜，也适用于开胸瓣膜置换手术所用的生物材料。
本发明的有益效果是：本发明提供的方法能够提升生物材料的糖胺多糖稳定性及抗钙化性能，潜在地延长其使用寿命。
附图说明
图1为对羟基苯丙酸、对羟基苯乙胺修饰心包膜化学原理示意图；
图2为对羟基苯丙酸修饰硫酸新霉素化学原理示意图；
图3为辣根过氧化物酶/过氧化氢酶交联化学原理示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实例对本发明进一步详细说明，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，全部实例中，新鲜的动物组织材料来自于当地屠宰场。
实施例1
在本实施例中，新鲜采集的猪心包于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时。然后浸泡在50mM对羟基苯丙酸以及0.2M对羟基苯乙胺水溶液在室温当中4小时。然后采用20mM碳二亚胺和10mMN-羟基琥珀酰亚胺在室温浸泡24小时。同时制备对羟基苯丙酸修饰的硫酸新霉素。加入等摩尔比的对羟基苯丙酸和硫酸新霉素，加入20mM碳二亚胺和10mMN-羟基琥珀酰亚胺在室温下反应24小时，之后加入乙醇沉淀并透析清洗，制备得到羟基苯丙酸修饰的硫酸新霉素。加入0.4mM对羟基苯丙酸修饰的硫酸新霉素到上述羟基苯丙酸以及对羟基苯乙胺修饰的心包膜，然后采用1％辣根过氧化物酶和1％过氧化氢于37摄氏度150RPM转速振荡条件之下浸泡24小时，最后蒸馏水清洗。
实施例2
在本实施例中，新鲜采集的猪心包于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时。然后浸泡在50mM对羟基苯丙酸以及0.2M对羟基苯乙胺水溶液在室温当中4小时。然后采用20mM碳二亚胺和10mMN-羟基琥珀酰亚胺在室温浸泡24小时。同时制备对羟基苯丙酸修饰的硫酸新霉素。加入等摩尔比的对羟基苯丙酸和硫酸新霉素，加入20mM碳二亚胺和10mMN-羟基琥珀酰亚胺在室温下反应24小时，之后加入乙醇沉淀并透析清洗，制备得到羟基苯丙酸修饰的硫酸新霉素。加入2mM对羟基苯丙酸修饰的硫酸新霉素到上述羟基苯丙酸以及对羟基苯乙胺修饰的心包膜，然后采用1％辣根过氧化物酶和1％过氧化氢于37摄氏度150RPM转速振荡条件之下浸泡24小时，最后蒸馏水清洗。
实施例3
在本实施例中，新鲜采集的猪心包于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时。然后浸泡在50mM对羟基苯丙酸以及0.2M对羟基苯乙胺水溶液在室温当中4小时。然后采用20mM碳二亚胺和10mMN-羟基琥珀酰亚胺在室温浸泡24小时。同时制备对羟基苯丙酸修饰的硫酸新霉素。加入等摩尔比的对羟基苯丙酸和硫酸新霉素，加入20mM碳二亚胺和10mMN-羟基琥珀酰亚胺在室温下反应24小时，之后加入乙醇沉淀并透析清洗，制备得到羟基苯丙酸修饰的硫酸新霉素。加入10mM对羟基苯丙酸修饰的硫酸新霉素到上述羟基苯丙酸以及对羟基苯乙胺修饰的心包膜，然后采用1％辣根过氧化物酶和1％过氧化氢于37摄氏度150RPM转速振荡条件之下浸泡24小时，最后蒸馏水清洗。
如图1所示，图为对羟基苯丙酸、对羟基苯乙胺修饰心包膜化学原理示意图。如图2所示，图为对羟基苯丙酸修饰硫酸新霉素化学原理示意图。如图3所示，图为辣根过氧化物酶/过氧化氢酶交联化学原理示意图。
实验例
在实施例1、实施例2以及实施例3的制备处理过程当中，还设置了一个对照组：戊二醛处理组。戊二醛处理组即将心包膜浸泡于0.625％的戊二醛当中24小时。三组实施例以及戊二醛对照组最终的总糖胺多糖的含量分析结果如表1所示，挂钙量如表2所示。
| μg总糖胺多糖/10mg组织 | |
| 戊二醛对照组 | 49.3±0.7 |
| 实施例1 | 63.7±1.5 |
| 实施例2 | 149.7±1.5 |
| 实施例3 | 150.8±1.1 |
表1
| 挂钙量μg/mg | |
| 戊二醛对照组 | 2.26±0.07 |
| 实施例2 | 0.43±0.02 |
表2
评估时发现实验组糖胺多糖含量提高，优选出的实施例2相比于戊二醛对照组大鼠皮下植入30天的挂钙量减少。
本发明的有益效果是：本发明提供的方法能够提升生物材料的糖胺多糖含量及抗钙化性能，潜在地延长其使用寿命。
当然，以上只是本发明的典型实例，除此之外，本发明还可以有其它多种具体实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。
Claims (3)
1.一种提高生物心脏瓣膜糖胺多糖稳定性的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、获取新鲜的生物材料，并于4℃下低温保存；
S2、对S1的生物材料采用柔和摩擦和流体压力在4℃、100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，直至没有可见的粘附的非心包或非胶原组织，同时通过渗压休克实现对心包组织有效脱细胞；
S3、然后使用对羟基苯丙酸、对羟基苯乙胺、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺对步骤S2制备的生物材料进行修饰，使用的对羟基苯丙酸是摩尔浓度为10mM-100mM的水溶液，使用的对羟基苯乙胺是摩尔浓度为50mM-500mM的水溶液，使用的碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度为0.01-1M；
S4、将等摩尔浓度的对羟基苯丙酸和硫酸新霉素水溶液混合，加入摩尔浓度为0.01-1M的碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，使得硫酸新霉素引入酚羟基；
S5、将步骤S3处理后的生物材料以及步骤S4处理后的对羟基苯丙酸修饰的硫酸新霉素进行辣根过氧化物酶/过氧化氢引发的酶交联，使用的辣根过氧化物酶质量浓度为0.1%-5%，使用的过氧化氢质量浓度为0.1%-5%，辣根过氧化物酶在氧化剂的作用下，能够催化酚羟基实现化学交联；
S6、最后用蒸馏水浸泡清洗，清除没有反应的硫酸新霉素、辣根过氧化物酶以及过氧化氢。
2.根据权利要求1所述的一种提高生物心脏瓣膜糖胺多糖稳定性的方法，其特征在于：所述生物材料为心包膜。
3.根据权利要求1所述的一种提高生物心脏瓣膜糖胺多糖稳定性的方法，其特征在于：所述生物材料为经皮介入生物心脏瓣膜或开胸瓣膜置换手术所用的生物材料。
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