CN104524632B - 一种具有良好顺应性的抗凝血复合管状支架的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有良好顺应性的抗凝血复合管状支架的制备方法。该复合管状支架采用编织物可提高管状支架的拉伸性能,采用聚乙二醇二缩水甘油醚对丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白改性可制备出具有海绵层的管状支架,提高管状支架的顺应性,具有双层海绵层的丝素和硫酸化丝素管状支架可提高管状支架的抗渗透性能,同时本发明采用硫酸化丝素可提高管状支架的抗凝血性能,本发明将以上结合可制备出具有良好的拉伸性能、顺应性、抗渗透性和血液相容性的复合管状支架,且管径可控,可用于小口径血管的修复重建以及血液透析通路的建立。该制备方法操作简单,成本低,可实现商业化生产。
Description
(一)技术领域
本发明属于生物医用材料领域,特别是涉及一种具有良好的拉伸性能、顺应性、抗渗透性和血液相容性的具有双层海绵层的丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白复合管状支架。
(二)背景技术
现今社会,心血管类疾病严重危害人类身体健康,血管重建在临床外科中占有十分重要的地位,全球每年大约超过60万人需要接受各种血管外科手术,其中大多数都需要合适的血管移植物。目前,临床上应用的血管移植物主要包括自体血管、异体血管和人工合成血管,由于自体血管的来源有限以及异体血管的排异反应,使得人工血管移植术备受重视。目前,直径大于6毫米的大口径人工血管已经实现了商品化,而直径小于6毫米的小口径人工血管的临床应用非常令人失望。
小口径人工血管存在的主要问题就是其植入人体后易发生急性血栓,而血管支架材料具有良好的生物相容性、优良的力学性能和长期稳定的血液相容性是其技术突破的关键。对支架材料进行抗凝血改性以提高小口径组织工程血管的长期抗血栓性已经成为当前国内外学者的研究重点。在材料表面结合抗凝血蛋白和种植血管内皮细胞都是改善支架材料抗凝血性能的有效途径。肝素是常见的抗凝血蛋白,肝素单纯涂层后可改善血液流变学性能,但结合的强度不够,易脱落导致过快释放。近年来,一些学者采用等离子体照射来改变材料表面结构,使材料表面生成具有反应活性的基团,将肝素以共价键形式固定在材料表面,但是其抗凝血效果并不令人满意。处于体内环境中的支架材料由于要接触到体液、有机大分子、酶、自由基、细胞等多种因素,其生物学环境极为复杂,采用表面改性的方法对材料长期抗凝血性能的改善较为有限,随着支架材料的降解和表面修饰层的脱落,其抗凝血性能虽然可以满足高血流量、低阻力的大口径血管的需要,但还是无法满足对抗凝血性能要求较高的小口径血管的需要。另一方面,在支架材料的内表面种植血管内皮细胞可以形成抗栓表层,能够降低组织工程血管内表面的凝血酶原的活性,从而提高材料的血液相容性特别是提高小口径组织工程血管的通畅率,然而内皮细胞在受到血流冲刷后保存率不足一直是困扰国内外学者的一大难题。研究表明,当植有内皮细胞的组织工程血管植入人体后,受到血流冲击最初的4~24小时内,会有30%~60%的内皮细胞脱落,而血管内皮层的修复需要一定的时间,在这段时间内血管形成血栓的可能性会极大增加,因此提高组织工程血管内皮层的保存率非常重要,而此时支架材料的抗凝血性能也显得尤为关键,这就要求小口径组织工程血管的支架材料既要具有良好的生物相容性,又要具有长期稳定的抗凝血性能。
近年来,丝素蛋白以其良好的细胞相容性和力学性能引起越来越多的关注。研究人员已经公布了很多采用编织物增强的方法制备丝素蛋白管状支架的技术(中国专利申请号201010249479.4、201110135353.9),该方法所制备的丝素蛋白管状支架的力学性能大幅提高,但其血液相容性较差,由此限制了其进一步应用。为了提高丝素蛋白的血液相容性,我们对丝素蛋白进行改性,制备了硫酸化丝素蛋白。研究结果表明,硫酸化丝素蛋白不但具有良好的血液相容性,而且可以促进血管内皮细胞的黏附、增殖并维持其功能。
顺应性,是指在血压或者力的作用下,血管的容积可以增大或者缩小但不破裂的一种特性。血压变化时,人体的动脉血管也会随之发生周期性的变化,因而血管的顺应性对于维持血流的稳定性具有非常重要的作用。植入人造血管需要承担天然血管相同的功能,因而人造血管必须具备良好的顺应性。人造血管与天然血管在顺应性上存在一定的差异,这种差异在血管重建手术中容易导致血管移植的失败,这是小口径人造血管移植失败的一个主要原因,也是目前小口径人造血管普遍存在的一个严重问题。因此,提高人造血管的顺应性是人造血管研究方面的重点,这样有助于保证人造血管移植后的长期通畅率。
水渗透性是判断人造血管在植入体内前是否需要预凝血的依据,如果水渗透量比较大,在支架移植入体内后大分子的细胞及蛋白就能渗透到管壁外面,从而导致大量血液渗漏,易于在人造血管周围形成血肿或是假性动脉瘤。如果渗透量不够,表面血液弥散无法提供给新内膜足够的营养,继而会导致蛋白变性,最终引起成纤维细胞和平滑肌细胞移行增生,最终导致血管狭窄闭塞。因此,人造血管应具有良好的抗渗透性能。
(三)发明内容
为了制备理想的小口径血管支架材料,本发明采用编织物可提高管状支架的拉伸性能,采用聚乙二醇二缩水甘油醚对丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白改性可制备出具有海绵层的管状支架,提高管状支架的顺应性,具有双层海绵层的丝素和硫酸化丝素管状支架可提高管状支架的抗渗透性能,同时本发明采用硫酸化丝素可提高管状支架的抗凝血性能,本发明将以上结合可制备出具有良好的拉伸性能、顺应性、抗渗透性和血液相容性的复合管状支架,本发明的目的是制备一种具有良好的拉伸性能、顺应性、抗渗透性和血液相容性的复合管状支架,且管径可控,可用于小口径血管的修复重建以及血液透析通路的建立。
为达到上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
a)编织物的制备:
用编织机将家蚕丝编织成管状,置于0.1%的Na2CO3溶液中,于98~100℃处理30分钟,重复三次,以脱去蚕丝纤维表面的丝胶蛋白,在室温空气中晾干,然后套入相应直径的模具中。
b)丝素蛋白的制备:
将家蚕丝置于0.1%的Na2CO3溶液中,于98~100℃处理30分钟,重复三次,以脱去蚕丝纤维表面的丝胶蛋白,在室温空气中晾干,将蚕丝纤维放入CaCl2-CH3CH2OH-H2O(摩尔比为1:2:8)溶液中溶解,保持温度在78±2℃并不断搅拌,得到丝素蛋白溶液,随后用透析管在蒸馏水中透析。最后,将丝素蛋白溶液浓缩到质量体积浓度为8%~15%;
c)硫酸化丝素蛋白的制备:
将10mL的氯磺酸缓慢均匀地加入到60mL的吡啶中,然后将步骤b)制得的丝素蛋白海绵加入氯磺酸的吡啶溶液中,把体系温度逐步提高到80℃并保持一定时间。反应结束后,将200mL水加入到体系中,并用适量的氢氧化钠溶液中和反应溶液,将体系中的不溶物滤掉,加入500mL乙醇使可溶的硫酸化丝素蛋白析出,离心收集硫酸化丝素蛋白,并使其复溶于少量双蒸水中,随后用透析管在蒸馏水中透析,最后将硫酸化丝素蛋白溶液浓缩到质量体积浓度为8%;
d)改性溶液的制备:
将丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白的共混溶液与聚乙二醇二缩水甘油醚按照所需比例混合均匀,共混后,丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白的共混溶液中硫酸化丝素蛋白的质量分数范围为10%~40%,共混溶液与聚乙二醇二缩水甘油醚的比例为1:1~1:2。
e)具有单层海绵层的复合管状支架的制备:
将带有编织物的模具放入相应直径的模具中,底端用石蜡密封,将d)中所述溶液缓慢加入到两个模具的夹层中,冷冻24h后取出室温化冻,将两侧的模具取出可得到单层的海绵层,
f)具有双层海绵层的复合管状支架的制备:
在上述获得的具有单层海绵层的复合管状支架中间插入相应直径的模具,重复e)上述过程,获得具有双层海绵层的复合管状支架。
g)聚乙二醇二缩水甘油醚的去除:
最后将以上制备的具有双层海绵层的丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白复合管状支架置于超纯水中72小时浸洗复合管状支架以除去聚乙二醇二缩水甘油醚,每3小时换水一次。
最后制备出具有双层海绵层的丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白的复合管状支架。
本发明的优点是:
(1)本发明的具有双层海绵层的丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白复合管状支架具有出色的血液相容性。
(2)本发明的具有双层海绵层的丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白复合管状支架具有良好的顺应性。
(3)本发明的具有双层海绵层的丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白复合管状支架具有良好的拉伸性能。
(4)本发明的具有双层海绵层的丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白复合管状支架具有良好的抗渗透性。
(5)本发明直接制备出了具有双层海绵层的丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白复合管状支架,避免了粘合剂和交联剂的使用。
(6)本发明工艺简单,耗量少,耗时短,易实现商业生产。
(7)根据需要可调节具有双层海绵层的丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白复合管状支架的直径、长度和厚度。
(8)本发明所制备的具有双层海绵层的丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白复合管状支架可用于小口径血管的修复重建以及血液透析通路的建立。
(四)具体实施方式
具体结合实施例,对本发明做进一步的阐述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容后,本领域技术人员可以对发明做各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
上述的具有良好顺应性的抗凝血复合管状支架的制备方法如下:
a)编织物的制备:
用编织机将家蚕丝编织成内径为3mm,壁厚为0.5mm管状编织物,置于0.1%的Na2CO3溶液中,于98~100℃处理30分钟,重复三次,在室温空气中晾干之后套入直径为3mm的模具中。
b)丝素蛋白的制备:
将家蚕丝置于0.1%的Na2CO3溶液中,于98℃处理30分钟,重复三次,在室温空气中晾干。将蚕丝纤维放入CaCl2-CH3CH2OH-H2O(摩尔比为1:2:8)溶液中溶解,保持温度在78℃并不断搅拌,得到丝素蛋白溶液,随后用透析管在蒸馏水中透析。最后,将丝素蛋白溶液用聚乙二醇溶液浓缩到质量体积浓度为8%~15%;
c)硫酸化丝素蛋白的制备:
将10mL的氯磺酸缓慢均匀地加入到60mL的吡啶中,然后将步骤b)制得的丝素蛋白海绵加入氯磺酸的吡啶溶液中,把体系温度逐步提高到80℃并保持一定时间。反应结束后,将200mL水加入到体系中,并用适量的氢氧化钠溶液中和反应溶液,将体系中的不溶物滤掉,加入500mL乙醇使可溶的硫酸化丝素蛋白析出,离心收集硫酸化丝素蛋白,并使其复溶于少量双蒸水中,随后用透析管在蒸馏水中透析,最后将硫酸化丝素蛋白溶液浓缩到质量体积浓度为8%;
d)改性溶液的制备:
将丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白的共混溶液与聚乙二醇二缩水甘油醚按照1:1的比例混合均匀。
e)具有单层海绵层的复合管状支架的制备:
将带有编织物的模具放入4mm的模具中,底端用石蜡密封。将d)中所述溶液缓慢加入到两个模具的夹层中,冷冻24h后取出室温化冻,将两侧的模具取出可得到单层的海绵层,f)具有双层海绵层的复合管状支架的制备:
在上述获得的具有单层海绵层的复合管状支架中间插入2.5mm的模具,重复e)上述过程,获得具有双层海绵层的复合管状支架。
g)聚乙二醇二缩水甘油醚的去除:
最后将以上制备的具有双层海绵层的丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白复合管状支架置于超纯水中72小时浸洗以去除聚乙二醇二缩水甘油醚,每3小时换水一次。
所述具有良好顺应性的抗凝血复合管状支架的内径为2.5mm,壁厚为0.5mm。实施例2
上述的具有良好顺应性的抗凝血复合管状支架的制备方法如下:
a)编织物的制备:
用编织机将家蚕丝编织成内径为4mm,壁厚为0.5mm管状编织物,置于0.1%的Na2CO3溶液中,于98~100℃处理30分钟,重复三次,在室温空气中晾干之后套入直径为4mm的模具中。
b)丝素蛋白的制备:
将家蚕丝置于0.1%的Na2CO3溶液中,于98℃处理30分钟,重复三次,在室温空气中晾干。将蚕丝纤维放入CaCl2-CH3CH2OH-H2O(摩尔比为1:2:8)溶液中溶解,保持温度在78℃并不断搅拌,得到丝素蛋白溶液,随后用透析管在蒸馏水中透析。最后,将丝素蛋白溶液用聚乙二醇溶液浓缩到质量体积浓度为8%~15%;
c)硫酸化丝素蛋白的制备:
将10mL的氯磺酸缓慢均匀地加入到60mL的吡啶中,然后将步骤b)制得的丝素蛋白海绵加入氯磺酸的吡啶溶液中,把体系温度逐步提高到80℃并保持一定时间。反应结束后,将200mL水加入到体系中,并用适量的氢氧化钠溶液中和反应溶液,将体系中的不溶物滤掉,加入500mL乙醇使可溶的硫酸化丝素蛋白析出,离心收集硫酸化丝素蛋白,并使其复溶于少量双蒸水中,随后用透析管在蒸馏水中透析,最后将硫酸化丝素蛋白溶液浓缩到质量体积浓度为8%;
d)改性溶液的制备:
将丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白的共混溶液与聚乙二醇二缩水甘油醚按照1:1的比例混合均匀。
e)具有单层海绵层的复合管状支架的制备:
将带有编织物的模具放入5mm的模具中,底端用石蜡密封。将d)中所述溶液缓慢加入到两个模具的夹层中,冷冻24h后取出室温化冻,将两侧的模具取出可得到单层的海绵层,
f)具有双层海绵层的复合管状支架的制备:
在上述获得的具有单层海绵层的复合管状支架中间插入3.5mm的模具,重复e)上述过程,获得具有双层海绵层的复合管状支架。
g)聚乙二醇二缩水甘油醚的去除:
最后将以上制备的具有双层海绵层的丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白复合管状支架置于超纯水中72小时浸洗以去除聚乙二醇二缩水甘油醚,每3小时换水一次。
所述具有良好顺应性的抗凝血复合管状支架的内径为3.5mm,壁厚为0.6mm。实施例3
上述的具有良好顺应性的抗凝血复合管状支架的制备方法如下:
a)编织物的制备:
用编织机将家蚕丝编织成内径为5mm,壁厚为0.5mm管状编织物,置于0.1%的Na2CO3溶液中,于98~100℃处理30分钟,重复三次,在室温空气中晾干之后套入直径为5mm的模具中。
b)丝素蛋白的制备:
将家蚕丝置于0.1%的Na2CO3溶液中,于98℃处理30分钟,重复三次,在室温空气中晾干。将蚕丝纤维放入CaCl2-CH3CH2OH-H2O(摩尔比为1:2:8)溶液中溶解,保持温度在78℃并不断搅拌,得到丝素蛋白溶液,随后用透析管在蒸馏水中透析。最后,将丝素蛋白溶液用聚乙二醇溶液浓缩到质量体积浓度为8%~15%;
c)硫酸化丝素蛋白的制备:
将10mL的氯磺酸缓慢均匀地加入到60mL的吡啶中,然后将步骤b)制得的丝素蛋白海绵加入氯磺酸的吡啶溶液中,把体系温度逐步提高到80℃并保持一定时间。反应结束后,将200mL水加入到体系中,并用适量的氢氧化钠溶液中和反应溶液,将体系中的不溶物滤掉,加入500mL乙醇使可溶的硫酸化丝素蛋白析出,离心收集硫酸化丝素蛋白,并使其复溶于少量双蒸水中,随后用透析管在蒸馏水中透析,最后将硫酸化丝素蛋白溶液浓缩到质量体积浓度为8%;
d)改性溶液的制备:
将丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白的共混溶液与聚乙二醇二缩水甘油醚按照1:1的比例混合均匀。
e)具有单层海绵层的复合管状支架的制备:
将带有编织物的模具放入6mm的模具中,底端用石蜡密封。将d)中所述溶液缓慢加入到两个模具的夹层中,冷冻24h后取出室温化冻,将两侧的模具取出可得到单层的海绵层,
f)具有双层海绵层的复合管状支架的制备:
在上述获得的具有单层海绵层的复合管状支架中间插入4.5mm的模具,重复e)上述过程,获得具有双层海绵层的复合管状支架。
g)聚乙二醇二缩水甘油醚的去除:
最后将以上制备的具有双层海绵层的丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白复合管状支架置于超纯水中72小时浸洗以去除聚乙二醇二缩水甘油醚,每3小时换水一次。
所述具有良好顺应性的抗凝血复合管状支架的内径为4.5mm,壁厚为0.8mm。
Claims (4)
1.一种具有良好顺应性的抗凝血复合管状支架的制备方法,其特征在于该方法按如下步骤进行:
1)以家蚕熟丝线为原料,用编织机编织成管状编织物;
2)将编织物脱胶处理,晾干后套入相应直径的金属棒模具中;
3)将丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白的共混溶液与聚乙二醇二缩水甘油醚按比例混合均匀,将带有编织物的金属棒模具放入相应直径的聚乙烯塑料管模具中,聚乙烯塑料管模具的底端用石蜡密封,再将所述共混溶液与聚乙二醇二缩水甘油醚混合均匀后的溶液缓慢加入到两个模具的夹层中,冷冻24h后取出室温化冻,将两侧的模具取出得到具有单层海绵层的管状支架;
4)在所述具有单层海绵层的管状支架中间再插入相应直径的金属棒模具,再将丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白的共混溶液与聚乙二醇二缩水甘油醚混合均匀后的溶液缓慢加入到所述具有单层海绵层的管状支架和金属棒模具的夹层中,冷冻24h后取出室温化冻,将金属棒模具取出得到具有双层海绵层的管状支架;
5)最后置于超纯水中浸洗72小时以去除聚乙二醇二缩水甘油醚,在浸洗的过程中每3小时换水一次;
其中,所述丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白的共混溶液由质量体积浓度为8%~15%的丝素蛋白溶液和质量体积浓度为8%的硫酸化丝素蛋白溶液混合制成;混合后,所述丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白的共混溶液中硫酸化丝素蛋白的质量分数范围为10%~40%。
2.如权利要求1所述的具有良好顺应性的抗凝血复合管状支架的制备方法,其特征在于:所述共混溶液与聚乙二醇二缩水甘油醚的比例为1:1~1:2。
3.如权利要求1所述的具有良好顺应性的抗凝血复合管状支架的制备方法,其特征在于:所制备的具有良好顺应性的抗凝血复合管状支架的管壁厚度范围为0.5mm~0.8mm。
4.如权利要求1所述的具有良好顺应性的抗凝血复合管状支架的制备方法,其特征在于:所制备的具有良好顺应性的抗凝血复合管状支架用于小口径血管的修复重建以及血液透析通路的建立。
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