CN100364621C

CN100364621C - 人造血管丝素蛋白预凝涂层

Info

Publication number: CN100364621C
Application number: CNB2006101122143A
Authority: CN
Inventors: 黄福华; 郑军; 孙立忠
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-08-30
Filing date: 2006-08-30
Publication date: 2008-01-30
Anticipated expiration: 2026-08-30
Also published as: CN1919356A

Abstract

本发明提供一种人造血管丝素蛋白浸渍涂层的方法，由一机织或编织弹性多孔隙管型结构的合成血管假体，通过至少使用丝素蛋白混合液涂层5遍而成。丝素蛋白液涂层血管假体前需混合增塑剂，通过倾注并使其均匀涂布于血管假体的基底层内，干燥后通过暴露于甲醛蒸汽中交联固定。

Description

人造血管丝素蛋白预凝涂层

所属技术领域

本发明涉及一种可用来置换、旁路移植或分流人体血管系统任一部分的人造血管假体的预凝涂层方法，尤其是使用混有增塑剂的丝素蛋白溶液涂层人造血管假体，使其不漏血从而免除手术过程中预凝血操作的方法。

背景技术

使用人造血管假体置换人体病变血管是一项成熟的外科技术。人造血管有许多不同的类型，并可由不同的材料构成。可以植入人体的人造血管假体通常是由生物相容性材料构成，同时血管假体植入后能保持开放的管形结构并允许血流通畅无阻运行其中。血管假体可以由生物相容性纤维材料构成，如涤纶或聚四氟乙烯，通过针织或机织而成，可以是单层或双层结构。

人造血管的基底层是由多孔的纤维壁构成，多孔的结构非常重要，因为这能使人造血管对血液保持足够的密封性避免在手术过程中失血过多，同时保持足够的孔隙允许成纤维细胞和平滑肌细胞侵入生长，使得受体组织包裹愈合血管假体。合成的人造血管假体在U.S.Pat.Nos.3,805,301 and No.4,047,252描述为涤纶编织的可延伸的弹性管状结构体。这些血管假体具备足够的孔隙允许受体组织侵入生长。但此类型人造血管在植入体内时需预凝血操作。预凝后的血管植入体内后便不再漏血同时也不妨碍自身组织的侵入生长。然而，外科手术尤其是急诊手术时希望能在植入人造血管时省缺预凝步骤从而节省宝贵的手术时间。

为了免除人造血管假体手术过程中预凝血操作，又保持足够的孔隙便于受体组织的侵入生长并包裹愈合人造血管。许多实验在研究提高人造血管植入时对血液的密封性，通常的办法使用可降解的生物材料(如纤维蛋白，白蛋白，明胶或胶原(R.A.Jonas，F.J.Schoen，R.J.Levy and A.R.Castaneda，“Biologicalsealants and knitted Dacron：Porosity and histological comparisons ofvascular graft materials with and without collagen and fibrin gluepretreatments，”Ann.Thorac.Surg.，41，657-663(1986)；K.Kottke-Marchant，J.M.Anderson，Y.Umemura，and R.E.Marchant，“Effectof albumin coating on the in vitro blood compatibility of Dacron arterialprostheses，”Biomaterials，10，147-155，(1989)；R.Guidoin，D.Marceau，and J.Couture，“Collagen coating as biological sealants for textilearterial prostheses，”Biomaterials，10，156-165，(1989)))涂层浸渍多孔隙人造血管假体，涂层浸渍的人造血管在植入人体时不再漏血(United StatesPatent 4，747，848，United States Patent 5108424)。但上述涂层材料不稳定，且获得困难，价格昂贵(J.H.Lee，W.G.Kim，and S.S.Kim，“Development andcharacterization of an alginate impregnated polyester vascular graft，”J Biomed Mater Res 36，200-208，(1997))，同时运用牛胶原，明胶为涂层材料研制的人造血管不能植入对牛猪布鲁氏杆菌抗原过敏的病人体内。

发明内容

为克服上述困难，本发明采用可降解的生物材料丝素蛋白溶液涂层人造血管假体，同样达到免除手术过程中预凝血操作，节省手术时间的目的。该人造血管由具生物相容性的纤维材料构成的多孔隙管状合成血管假体与混有增塑剂的丝素蛋白液交联而成，使得人造血管假体不漏血从而免除手术过程中的预凝血操作。这管状血管假体的多孔隙基底层可以是由涤纶构成，可以是针织或机织而成。

从柞蚕丝提炼并通过透析的方法得到高纯度的丝素蛋白纤维分散液。将高纯度的丝素蛋白溶液均匀覆盖于合成血管假体基底层的内面，使人造血管结构充满弹性而具备较好的操控性和纵向伸展能力。至少运用丝素蛋白液涂层5遍，干燥后将其暴露于甲醛蒸汽中交联。

为了保持人造血管假体在干燥的状态下保持足够柔软而具弹性，在使用丝素蛋白溶液涂层人造血管假体前须混合甘油、山梨醇或其它具生物相容性的增塑剂。混合涂层材料中丝素蛋白5-50％，增塑剂浓度6-15％(重量比)。同时加入10-25％的乙醇促进水分的蒸发。

合成针织或机织型的人造血管依照本发明的方法使用丝素蛋白和增塑剂的混合液涂层后获得最重要的特征是使得原先多孔隙结构的血管基质的渗水率约降至零。作为对照实验，随机取未涂层的20根合成机织型的涤纶血管，平均渗水率为：379.3±11.8ml/min*cm²，按照本发明涂层后渗水率降至零。

由此，本发明一个目的是提供一种制备不漏血人造血管假体的方法。

本发明的进一步的目的是提供一种制备丝素蛋白溶液涂层合成血管假体并使其不漏血的方法。

本发明其它的目的和益处将在以下的实例说明中得到清晰的显现。

本发明包含的特征、性质以及相关原理和操作步骤和各步骤之间的关系将在以下具体实例中的细节逐一阐述，而本发明的范围将在权利要求中说明。

附图说明

为更好的理解本发明，须参考说明书附图及说明：

图1是按照本发明的方法制备的丝素蛋白溶液涂层的直线型人造血管假体部分的横断面；

图2是按照本发明的方法制备的丝素蛋白溶液涂层的分叉型人造血管假体的部分横断面；

图3表示人造血管假体的渗水率随着按照本发明的方法运用丝素蛋白溶液涂层次数增多逐步降低。

具体实施方式

按照本发明制备的合成人造血管假体如图1所示：包括管状结构主体01，它是由具生物相容性的纤维合成材料，尤其是聚对苯二甲酸乙酯(如涤纶)针织或机织而成的基质02构成的多孔隙结构体。基质02具内外侧两层绒面04。除涤纶外，管状结构主体01也可以由其它具生物相容性纤维材料针织或机织而成，只要使其具备多孔隙的结构允许受体的组织侵入生长同时保持开放的管腔结构允许血流顺畅通过。在绒面04内侧面覆有丝素蛋白溶液涂层06，丝素蛋白溶液涂层06需至少运用丝素蛋白和增塑剂的混合液体材料涂层5遍并通过暴露于甲醛蒸汽中交联而成。

图2演示一分叉形丝素蛋白溶液涂层的人造血管假体12，血管假体12包括主管状结构体14和两个分枝管状体16。主管状结构体14和分枝管状体16由涤纶针织或机织而成的基质18构成，基质18内侧绒面覆有丝素蛋白溶液涂层20，至少运用丝素蛋白溶液涂层5遍。

依据本发明多孔隙结构的人造血管假体基质由涤纶通过针织或机织而成最优。通常通过涤纶基质编织而成的人造血管假体渗水率范围在2000到3000ml/min*cm²(清洁过滤的水，120mmHg条件下)之间，而由涤纶机织而成的渗水率在300到400ml/min*cm²(清洁过滤的水，120mmHg条件下)之间。交联丝素蛋白溶液的方法是将丝素蛋白和增塑剂的混合液均匀涂布人造血管假体基质内，去除多余的涂层材料并放置干燥后暴露于甲醛蒸汽中交联，置入真空干燥箱中去除多余的湿气和甲醛。按照本发明制备的丝素蛋白溶液涂层的人造血管的渗水率(单位ml/min*cm²)接近于零。

以下实例将说明丝素蛋白从柞蚕丝中提取和纯化以及依据发明制备丝素蛋白溶液涂层人造血管假体的过程。列举实例的目的是阐述专利而不是来限制它的范围。

实例1：丝素蛋白提取方法

柞蚕蚕丝在0.5％(重量比)Na₂CO₃溶液中煮1-1.5h以脱去丝胶蛋白(蚕丝重量(g)与Na₂CO₃溶液体积(ml)比在1/80-1/67之间)，使用蒸馏水反复清洗脱去丝胶蛋白的蚕丝直至完全洁净。将脱去丝胶的洁净蚕丝置入CaCl₂/H₂O/C₂H₅OH＝1∶8∶2(摩尔比)溶剂中(脱去丝胶的蚕丝重量(g)与H₂O、C₂H₅OH体积(ml)和之比在1/10-1/15之间，然后推算出CaCl₂的质量)，于70-80℃下溶解30-45分钟后冷却装入透析袋，用蒸馏水透析3天后过滤得到高纯度丝素蛋白水溶液，然后通过加温磁力搅拌的办法浓缩丝素蛋白溶液达到制备涂层材料的浓度(磁力搅拌仪的温度控制在45-55℃)。

实例2：丝素蛋白液涂层人造血管

将含有丝素蛋白(按照实例1从柞蚕丝提纯)浓度为12％的丝素蛋白混合液注满50ml的注射器内，该丝素蛋白混合液同时含有10％的甘油，18％的乙醇和蒸馏水，粘度约28,000厘泊。注射器与合成的机织人造血管一端相连，丝素蛋白混合液被推注入人造血管管腔并使涂层液均匀涂布于管腔内壁，多余的丝素蛋白混合液从人造血管另一端去除。涂层后的人造血管室温下干燥1/2小时，涂层干燥至少反复操作5次。

第5次涂层后，使人造血管暴露于甲醛蒸汽中交联，交联后置于室温下干燥15分钟后置入真空箱中干燥24小时去除血管假体湿气和多余的甲醛。

实例3：涂层前后人造血管假体血液渗透率比较

按照实例2的方法制备不漏血的丝素蛋白溶液涂层的人造血管检测如下，随机抽取5根直径为8mm长度为12cm涂层后的合成机织人造血管并与储血器相连，在120mmHg的压力下，使肝素化的血液在血管内通过，收集渗漏的血液并计量(单位：ml/min*cm²)。检测结果5根人造血管的血液渗出率分别是：0.05，0.0，0.03，0.04和0.0，平均血液渗出率为0.023 ml/min*cm²，接近于零。

为与未涂层的机织人造血管比较，选取未涂层的人造血管重复上述实验，测得平均血液渗出率为27.6ml/min*cm²。

实例4：涂层前后人造血管假体渗水率比较

人造血管经丝素蛋白液涂层5次后渗水率降至1％以下。标准的渗水率实验(R.Guidoin，M.King，D.Marceau，and A.Cardou，“Textile arterial prostheses：Iswater permeability equivalent to porosity？”J.Biomed.Mater.Res.，21，65-87(1987))测定如下。相当于120mmHg的水柱压力通过2.44cm²面积的圆孔，将人造血管假体的样品固定于圆孔上1min，收集并测定渗漏水量。每个样品分别测定数次，测定结果如下表示：

渗水率(porosity)＝ml/min*cm²

合成的机织人造血管的渗水率是400ml/min*cm²经过不同次数涂层后的渗水率变化如下：

涂层次数	渗水率
涂层次数	渗水率	0123456	4001284214620

在上述实验的每一次涂层使用的丝素蛋白溶液均从柞蚕丝按照实例1描述提纯，涂层方法均按照实例2描述操作。结果如附图3所示。基于此，制备一丝素蛋白溶液涂层人造血管至少需5次涂层丝素蛋白混合液，甚至6次。并且在每次涂层之间需待其干燥，最后交联固定丝素蛋白于人造血管基质内。

与未涂层的人造血管相比，丝素蛋白溶液涂层的人造血管不仅降低了渗水率，而且减少了血栓生成。以下的实例证明与对照组相比丝素蛋白溶液涂层人造血管假体显著的减少了血栓的生成。

实例5：涂层前后人造血管血栓生成比较实验(体外)

采用体外实验(Imai Y，Nose Y.“A new method for evaluation ofantithrombogenicity of materials.”J Biomed Mater Res 6(3)：165-72，(1972))来评价涂层前后人造血管假体的抗血栓生成能力。将0.25ml的枸橼酸血混合0.1mmol/L的CaCl₂25μl注入按照实例2制备的丝素蛋白溶液涂层的人造血管假体管腔内壁，同样体积的上述血液注入未涂层的人造血管假体管腔内壁作为对照。分别在5，10和15分钟时点将5ml蒸馏水倾倒在实验样本上终止凝血反应，并观测各血管假体标本血栓形成情况。结果显示两组样本血栓形成有显著差异。以下表格中数据是实验得到的半定量参数结果。

		丝素蛋白涂层组	空白组
		丝素蛋白涂层组	空白组	血液浸泡血管假体基质的速率各时点血栓形成	5min10min15min	快0+++	慢+++++++++

如表格所示，丝素蛋白溶液涂层组在5min时点无纤维蛋白凝块形成，在15min时点丝素蛋白涂层组纤维蛋白凝块形成同样显著少于对照组。在与血液接触时未涂层的人造血管假体几乎是疏水的，需12到16秒血液才浸湿机织的人造血管的纤维，而血液浸湿丝素蛋白涂层的人造血管基质平衡而迅速。

基于上述实验结果，在体外无血流的情况下，丝素蛋白涂层的涤纶血管假体血液浸湿迅速，在5分钟内无血栓形成。在同一时点对照组血管假体显示血栓形成。在10和15分钟时点丝素蛋白涂层组血管假体形成的血栓数量明显少于空白对照组。

实例6：涂层前后人造血管血栓生成比较实验(体内)

丝素蛋白涂层人造血管假体体内(杂种犬)实验如下。全麻下在犬股动静脉之间植入分流管(使用5cm长两短为圆锥形的穿刺管，便于插入连接人造血管假体)。血管假体连接完成后，先缓慢松开静脉端的血管阻断钳，然后再缓慢松开动脉端的阻断钳。使血流在血管假体中运行10分钟和30分钟后阻断分流管两端，取下血管假体。将血管假体腔内多余的血液流出后称重，肉眼观测管腔内壁形成的血栓，然后使用足够的蒸馏水冲洗血管假体(3次)并再次称重。

对照组使用的标准的8mm直径的涤纶血管，在与股动静脉分流管连接前行预凝血操作。如此可提供血管假体体内实验血栓形成的视觉证据和客观重量数据。实验过程中从血管假体壁泄漏的血液同样被收集并称重进行比较。

丝素蛋白涂层的人造血管无血液渗漏。而预凝组血管与股动静脉分流管连接后，第一个5分钟内，每5cm血管假体平均渗漏28ml血液。第二个5分钟约3-6ml。在对照组一例预凝血管连续测试30分钟，平均每5cm人造血管每分钟渗漏约1.5ml血液。

丝素涂层人造血管假体植入分流管10和30分钟肉眼观测均无血栓形成。在实验组血管假体丝素涂层表面覆盖一光滑白色有光泽薄纤维蛋白层，经蒸馏水反复冲洗和后在多数血管假体内壁能观察到一连续的纤维蛋白薄膜，无典型的血凝块发现。

在预凝血操作组5例血管假体内壁中，有4例观测到明显的典型血凝块形成，血凝块多位于血流方向的横断面，约占血管假体管周的1/3到1/2。另1例假体内壁形成类似纤维蛋白膜结构。可能由于血管壁持续的血液渗漏，在对照组每例血管假体外壁均有大的血凝块形成。

基于上述实验结果，丝素蛋白涂层的涤纶人造血管血栓生成显著少于预凝组，这可能与丝素蛋白抗凝减少血栓生成有关，同时可能是预凝血操作目的即是需要血凝来防止血管壁漏血的缘故。但血凝块参与细胞过度反应增生并将被纤维细胞替代，所以减少涤纶人造血管基质血凝块形成对降低血管血栓和栓塞的发生是有益的。

对于植入人体替代病变血管的人造血管假体，按照本发明的方法运用丝素蛋白和增塑剂的混合液涂层合成针织或机织具多孔隙结构的人造血管假体至少5次，可使血管假体特征获得明显的改善。预期的益处不仅是免除了手术过程中的预凝血操作。尽管许多实验证实多孔隙结构对保持人造血管植入人体后长期通畅是必要的，但同时在手术过程中必须使用患者的血液行预凝血操作来防止术中和术后大量的血液渗漏丢失。事实上，预凝血操作比较耗时并需要一定的技巧和实践经验。另外如患者需急诊手术或有凝血疾患则使得预凝血变得困难或无法操作。

综上所述，丝素蛋白和增塑剂的混合液涂层合成机织具多孔隙结构的人造血管假体免除了手术过程中的预凝血操作同时提供了理想的基质便于受体组织的侵入和包裹生长，另外，丝素蛋白溶液涂层后的血管假体血栓生成明显减少从而降低了人造血管植入后栓塞发生的危险。合成的针织或机织涤纶人造血管按照本发明使用丝素蛋白溶液涂层后使其柔软有弹性具备较好的操作性。

由此依据以上阐述的方法操作，本发明目的能客观有效实现。但在不背离本发明精神和范围情况下，上述的操作具体步骤和某些条款可以有一定改变，因此上述实例描述和附图描绘所涉及的方法和使用的某些物质材料是用来演示阐述发明，而不应理解为限制发明所涵盖的范围。

Claims

1.一种制备预凝涂层的人工血管假体的方法，所述具有涂层的人工血管假体包括人工血管假体和涂在人工血管假体上的涂层，涂层材料均匀涂覆在人工血管假体内壁，涂覆至少五次，然后干燥，随即加热交联而制成一种不漏血免除预凝操作的人工血管假体。其特征在于所述人工血管为涤纶织物，涂层材料含有丝素蛋白、增塑剂甘油和山梨醇和促蒸发剂乙醇。

2.根据权利要求7所述的制备人工血管假体的方法，特征在于将含有丝素蛋白、增塑剂和促蒸发剂的涂层溶液均匀涂覆于人工血管假体内壁，干燥，然后暴露于甲醛蒸汽进行交联，获得所述人工血管假体。

3.根据权利要求1或2所述的制备人工血管假体的方法，其特征在于增塑剂选自甘油和山梨醇，促蒸发剂选自乙醇。

4.根据权利要求1或2所述的制备人工血管假体的方法，其特征在于人工血管假体由生物相容性材料制成，其为具由弹性多孔隙管型结构的合成织物，为针织型或机织型。

5.根据权利要求1或2所述的制备人工血管假体的方法，其特征在于丝素蛋白的浓度为5-50％，增塑剂浓度为6-15％，促蒸发剂为10-25％，以上浓度均为重量百分比。

6.根据权利要求1或2所述的制备人工血管假体的方法，其中涂覆涂层溶液至少5次。