JPH03191791A - 生物活性タンパク質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、二量体の生物活性ＴＧＦ−β（形質転換増殖
因子β型）の製造方法、新規ＴＧＦ−β、およびそれを
含んで成る医薬組成物に関する。本発明の方法により製
造されたＴＧＦ−βは、創傷治癒および骨や組織の修復
の促進および加速のため、ガンの治療のため、骨髄保護
剤、心臓保護のメディエータ−１抗炎症剤もしくは免疫
抑制剤、または哺乳動物細胞における増殖調節剤として
、用いることができる。 〔従来の技術〕 ２種類の増殖調節タンパク質が、試験管内において哺乳
動物細胞の表現型形質転換を可逆的に誘導する能力によ
り特徴付けられており、従って形質転換増殖因子α型お
よびβ型と命名されている［Ａｎｚａｎｏ、　　Ｍ、八
、ら（１９８３）　　ＰＮＡＳ　　８０．　６２６４−
６２６８）　　。 それらの共通名称にもかかわらず、ＴＧＦ−αおよびＴ
ＧＦ−βは構造的にも機能的にも全く別個のタンパク質
であり、それぞれが独自のレセプター系を通して作用す
る。同じ細胞表面レセプターへの結合を目当てに表皮増
殖因子（ＥＧＦ）と競争し［Ｔｏｄａｒｏ、　　Ｇ、Ｊ
、　ら（１９８０）　　ＰＮＡＳ　　ヱヱ、　　５２５
Ｂ−５２６２）そしてＥＧＦと配列相同性および類似の
活性を分は持つ［Ｍａｒｑｕａｒｄｔ、　Ｈ，ら（１９
８４）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２３゜１０７９−１０８２
）　　ＴＧＦ−αは、１５９アミノ酸の膜透過性前駆体
として合成され、そして５０アミノ酸残基のペプチドに
タンパク質分解的にプロセシングされる（Ｄｅｒｙｎｃ
ｋ、　Ｒ，ら（１９８４）　Ｃｅ１ｌ　３Ｂ、　２Ｂ？
−２９７］。 間充繊細胞に対する潜在的分裂促進因子として、ＴＧＦ
−αは多数の形質転換細胞系およびヒトのガンにより生
産されそして放出されるが、活性マクロファージおよび
その他の正常組織においても発現され、従って新形成に
おけるそれの役割はまだ不明確なままである。 ＴＧＦ−βは、最初にヒト血小板（Ａｓｓｏｉａｎ、　
Ｒ，Ｋ。 ら（１９８３）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５８
．７１５５−７１６０）　、ヒト胎盤（Ｆｒｏｌｉｋ、
　Ｃ，Ａ、ら（１９８３）　ＰＮＡＳ　８０．３６７６
−３６８０３およびウシ腎臓（Ｒｏｂｅｒｔｓ、八、Ｂ
、ら（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２．５
６９２　５６９Ｂ）から均一に精製されており、そして
２５．０００ダルトン（Ｄ）の分子量を有する同種二量
体として同定されている。 ＥＧＦまなはＴＧＦ−αと相乗的に作用して未形質転換
ＮＲＫ細胞の足場非依性増殖を誘導するそれらの能力に
より最初に特徴付けられたＴＧＦ−βは、最近、広範な
正常細胞と新生物性細胞の両方において様々な調節作用
を示すことが判明し、細胞活性の多機能調節物質として
のこのタンパク質の重要性を指摘する。ＴＧＦ−βは、
細胞または組織のタイプおよび他の増殖因子の存否に依
存して、有糸分裂、細胞増殖および成長を刺激すること
ができ、あるいは前記過程を効果的に阻害することがで
き、あるいは例えば脂肪生成、筋形成、軟骨形成、骨形
成および免疫細胞機能の調節、走化性の刺激、または分
化の誘導もしくは阻害といった他の作用を示すことがで
きる。そのような作用の多くは、ストレスまたは損傷に
対する細胞または組織の応答、および生じた障害の修復
に関連する。 炎症後、ＴＧＦ−βは肉芽組織の形成において主な役割
を巣たし、フィブロネクチン、コラーゲンおよび幾つか
のプロテアーゼ阻害剤のような細胞外マトリックスの形
成に関連する遺伝子の発現を増加させ、そして繊維芽細
胞によるコラーゲン−マトリックス収縮を刺激し、結合
組織の収縮におけるそれの可能な役割を示唆する（Ｒｏ
ｂｅｒｔｓ、　Ａ、および５ｐｏｒｎ、　Ｍ、Ｂ、（１
９８８）八ｄｖ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、５１＋　１０
７１４５　　；　５ｐｏｒｎ＋　Ｍ、Ｂ、およびＲｏｂ
ｅｒｔｓ、　Ａ、（１９８９）Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｍｅｄ、
Ａｓ５ｏｃ、２６２．９３８−９４１）。 今までに、機能的に密接に関連し、高度のレセプター交
差反応性を共有する、ＴＧＦ−β１　、　　ＴＧＦβ２
およびＴＧＦ−β３と命名された３つの異なる型のＴＧ
Ｆ−βがクローニングされており、そして配列分析によ
り特徴付けられている。どのＴＧＦ−βも３９０〜４１
２アミノ酸前駆体として合成され、これがタンパク質分
解的開裂を受け、Ｃ末端の１１２アミノ酸から成る単量
体形を生成する。それらの成熟の生物活性形では、各々
１１２アミノ酸の２本のポリペプチド鎖から成る酸−お
よび熱−安定性ジスルフィド結合同種二量体である。ヒ
ト（Ｄｅｒｙｎｃｋ、　Ｒ，ら（１９８５）　Ｎａｔｕ
ｒｅ　３１６．７０１　７０５）、マウス［Ｄｅｒｙｎ
ｃｋ、　Ｒ，ら（１９８６）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、２６１゜４３７７−４３７９　）およびサル（Ｓｈａ
ｒｐｌｅｓ、　Ｋ、ら（１９８７）ＤＭＡ旦、　２３９
−２４４）　　ＴＧＦ−β１の完全アミノ酸配列は、単
一のアミノ酸残基のみが異なる顕著な配列保存を示す。 ヒ）　ＴＧＰ−β１、ヒ）　ＴＧＦ−β２（ｄｅ　Ｍａ
ｒｔｉｎ、　Ｒ，ら（１９８７）　ＥＭＢＯＪ、６．３
６７３３６７７　；　Ｍａｒｑｕａｒｄｔ、　Ｈ，ら（
１９８７）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２゜１２１
２７−１２１３１　）およびヒトＴＧＦ−β３　（Ｔｅ
ｎ　Ｄｉｊｋｅ。 Ｐ、ら（１９８８）　ＰＮＡＳ　８５．４７１５−４７
１９３のアミノ酸配列の比較は、それら３つタンパク質
が成熟形では約７０−８０％の配列一致を示すことを証
明している。 異種二量体ＴＧＦ−β１．２はブタ血小板から単離され
ており、これはＴＧＦ−β２の１サブユニツトにジスル
フィド結合したＴＧＦ−β１の１サブユニツトから成る
（Ｃｈｅｉｆｅｔｚ、　Ｓ、ら（１９８７）　Ｃｅ１ｌ
　４８゜４０９−４１５）。 最近、種々の療法形式においてテストするのに十分な量
を得るために、天然源（例えば血小板）からＴＧＦ−β
を単離するよりもむしろ組換え技術によりＴＧＦ−βを
製造する試みが行われている。 しかしながら、生物活性を保持しながら組換えＴＧＦ−
βを合成することは非常に困難であることが判っている
。配列番号１，２および３のもとに配列表に記載された
配列から理解できるように、１１２アミノ酸を含む成熟
形のＴＧＦ−β１　、　　ＴＧＦβ２およびＴＧＦ−β
３は、各々９個のシスティン残基を含み、該システィン
残基のうちの少なくとも数個は、生物活性二量体分子の
複雑な三次構造をもたらす鎖問および鎖内ジスルフィド
結合の形成に関与している。ＴＧＦ−βの不均一発現は
、正しい一次構造を有するが、適切に折りたたんで正し
い二次または三次構造を生じることができず、従って生
物活性を欠いた生成物を導き得る。現在まで、ＴＧＦ−
βの二次および三次構造は知られていない。 天然ＴＧＦ−β分子の複雑さを考慮に入れると、高等生
物由来の細胞中で各々のＴＧＦ−β遺伝子を発現せしめ
ることが一般的に好都合であると考えられている。ＳＶ
４０プロモーターの支配下におけるチャイニーズハムス
ター卵巣（ＣＩＯ）細胞中でのサルおよびヒ）　ＴＧＦ
−β１の発現が、それぞれヨーロッパ特許出願２９３．
７８５および２００．３４１に記載されている。ヨーロ
ッパ特許出願２６８．５６１および西ドイツ国出願公開
３８３３８９７において開示れたように同−細胞系にお
いて組換えＴＧＦ−β２を発現させることが可能である
。ＴＧＦ−β３の融合タンパク質（ＴＧＦ−β１との）
の真核生物発現は、ヨーロッパ特許出願２６７．４６３
に開示されている。 組換えＴＧＦ−βの発現は真核生物系において達成でき
るけれども、得られた正しく折りたたまれた生物活性物
質の収量は十分とは程遠い。他方、各々の遺伝子を微生
物宿主中で発現させた時には生物活性ＴＧＦ−βを得る
ことができないように思われる。というのは、例えば細
菌では、細胞内条件が活性にとって明らかに必須である
再生、ジスルフィド結合形成およびジスルフィドにより
安定化される三量化を行わないからである。このため、
ヨーロッパ特許出願２６８．５６１に記載されているよ
うにラムダプロモーターの支配下におけるＥ、コリ（Ｅ
、ｃｏｌｉ）中での各遺伝子の発現後、ごく少量の生物
活性ＴＧＦ−β２しか得られない。この活性の損失は、
細菌細胞内部の還元環境に暴露された時、単量体の一次
翻訳生成物から生物活性二量体ＴＧＦ−β２が自然に形
成することができないという事実のためであると考えら
れる。別の報告は、ｔｒｐプロモーターの支配下でのＥ
、コリ中でのＴＧＦ−β　ｃＤＮＡの発現が５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲルのオートラジオグラム中に１３，
０ＯＯＤの見かけ分子量を有する放射能標識タンパク質
バンドを生じることを記載しているが、活性は全（測定
されなかった（Ｕｒｕｓｈｉｚａｋｉ、　Ｙ、ら（１９
８７）　Ｔ’ｕｍｏｒＲｅｓ、２２．４１〜５５）。 組換えタンパク質が細菌（例えばＥ、コリ）発現系にお
いて高レベルで発現される時、それらは封入体または屈
折体（Ｂｒｅｍｓ、　Ｄ、Ｎ、　ら（１９８５）Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４．７６６２）と称する非常に
不溶性の細胞内沈澱物の形で出現する。これは、１００
０倍まで下げられた倍率において位相差顕微鏡下に細胞
の囲いの内部に見ることができる明るいスポットとして
識別することができる。可溶性の細菌タンパク質から容
易に分離することができるそれらの封入体は、それの天
然相当物の機能活性を示さず従って市販品として役に立
たない、はとんど変性され且つ還元された形で組換えタ
ンパク質を含む。 従って、組換え屈折性タンパク質は、それを変性形に維
持するのに適当な条件下で可溶化させなければならず、
次いで変性された未再生の形から適切な機能的に活性な
三次元構造、即ち水素結合、疎水的相互作用および電荷
相互作用のような比較的弱い原子間力により安定化され
ている立体配置、に再生しなければならない。システィ
ン含有タンパク質の場合、この過程はジスルフィド結合
の形成も含むことができる。ジスルフィド結合の形成が
化学的に促進される時、正しくない分子内結合および、
二量体または多量体タンパク質の場合には、分子間結合
の形成を防ぐかまたは少なくとも最小にしなければなら
ない。何故なら、不正確に折りたたまれた望ましくない
異性体の形成は、不均一材料を生成し、従って所望の構
成を有するタンパク質の更なる精製を複雑化し、または
減少された活性を有するタンパク質を生成し得るからで
ある。 細菌宿主中で生産された個々のタンパク質を再生する試
みを報告しているか、または変性形または非天然形であ
る多数の刊行物が存在している。 Ｅ、コリ中での発現後の二量体の生物活性ヒトコロニー
刺激因子−１（ＣＳＦ　−１）の形成は、ＰＣＴ出願Ｎ
ａ８８／８００３およびＨａｌｅｎｂｅｃｋ、　Ｒ，ら
（１９８９）Ｂｆｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７＋　７１
０−７１５により記載されている。記載された方法は、
尿素または塩酸グアニジンを含んで成るカオトロピック
環境中還元条件下における封入体から単離されたＣ３Ｐ
−１単量体の最初の可溶化、カオトロピック剤の段階的
希釈により達成される再生、および空気または酸化還元
系の存在下での再生分子の最終的酸化の段階を含んで成
る。ＰＣＴ出ＩＪＩＮα８８／８８４９では、組換えイ
ンターロイキン−２（ＩＬ−２）の回収方法が開示され
、該方法は、屈折体から単離されたＩＬ−２を還元条件
下で６Ｍ塩酸グアニジンにより変性させ、可溶性ＩＬ−
２をＣｕ”イオンの存在下で制御酸化により酸化し、そ
して溶液中の変性剤の濃度を減少させることにより酸化
されたＩＬ−２を再生せしめることを特徴とする。イン
ターロイキン−２およびインターフェロン−β（ＩＦＮ
−β）は、可溶化のためにＳＤＳそして十分に還元され
たタンパク質の酸化保進剤としてＣｕ”を使って再生さ
れている（米国特許Ｎα４，５７２．７９８）。米国特
許陽。 ４．６２０，９４８に記載された組換え屈折性タンパク
質の単離方法は、タンパク質を可溶化するための強力変
性剤、正確な折りたたみを促進するための還元条件、お
よびジスルフィド結合を再生するための空気または他の
酸化剤の存在下における変性剤置換を必要とする。前記
方法が適用できるタンパり質としては、ウロキナーゼ、
ヒト、ウシおよびブタ成長ホルモン、インターフェロン
、組織型プラスミノーゲン活性化因子、ＦＭＤコートタ
ンパク質、プロレニンおよびｓｒｃタンパク質が挙げら
れる。変性タンパク質を固体マトリックス上に可逆的に
結合させ、そして変性剤を希釈することによってそれを
段階的に再生させることによる、シトクロムＣ、オボア
ルプミンおよびトリプシンインヒビターを含む未再生タ
ンパク質の再生方法は、ＰＣＴ出願Ｎα８６１５８０９
に開示されている。Ｅ、コリ中で発現されたヒト血小板
由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の修飾された単量体形を精製
中チオール成分を保護するためにＳ−スルホン化し、そ
して酸化剤の存在下で三量化して活性タンパク質を製造
している（Ｈｏｐｐｅ、　Ｊ、　　ら（１９８９）　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２ＥＬ　２９５６］。 〔発明が解決しようとする課題〕 上述の参考文献は、異なる源に由来する非天然タンパク
質の再生を扱った真人な量の文献の単なる代表である。 当業者は、他方で、再生実験の成功が予想できないこと
を知っている。不成功の実験は通常は報告されない。報
告された再生条件のどれかが少しでもＴＣＰ−βのよう
な変性タンパク質を扱うであろうという確信は全くない
。ＴＧＦ−βが鎖あたり９個のシスティン残基並びに活
性に要求される多数の分子内および分子間ジスルフィド
結合を含む二量体タンパク質であるという事実を考慮す
ると、単量体の変性形または非天然形から生物活性ＴＧ
Ｆ−βを製造することは特に難しいチャレンジである。 非天然形からの生物活性二量体ＴＧＦ−βの調製につい
て記載された特定方法は文献中どこにもない。 〔課題を解決するための手段〕 本発明の目的は、変性された形または非天然形からの生
物活性二量体ＴＧＦ−β様タンパク質の製造方法を提供
することである。この目的は、単量体形の前記タンパク
質を再生条件にかけた時に相当量の所望の二量体生成物
を得ることができるという思いがけない発見により達成
される。驚くべきことに、活性二量体の製造は、様々な
条件下で一段階法において達成され、これは他のタンパ
ク質の再生について従来技術に報告されている多段階法
よりも優れている。 〔具体的記載〕 本発明は、変性された単量体形の形質転換増殖因子β型
（ＴＧＦ−β）様タンパク質を再生条件にかけることを
含んで成る、二量体の生物活性ＴＧＦ−β様タンパク質
の製造方法に関する。 ｒ　ＴＧＦ−β様タンパク質」なる用語は、哺乳動物、
例えばヒトまたは動物起源、例えばサル、マウス、ブタ
、ウマもしくはウシのＴＧＦ−β１゜ＴＧＦ−β２およ
びＴＧＦ−β３、並びに各々が１１２アミノ酸の２つの
異なるサブユニットから成る異種二量体ＴＧＦ−βを包
含することを意味する。更に定義内に含まれるのは、Ｔ
ＧＦ−β１　、　　ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３と
少なくとも２５％の配列相同性を有するＴＧＦ−β上科
の増殖調節タンパク質、例えばヒト神経膠細胞由来のＴ
細胞サプレッサー因子（Ｇ　−ＴｓＦ　　；Ｗｒａｎｎ
＋　Ｍ、ら（１９８７）　ＥＭＢＯＪ、６゜１６３３−
１６３６）、Ｂ５Ｃ−１サル腎臓細胞の順化培地から単
離された増殖阻害物質〔ポリエルギン；Ｈｏ１ｌｅｙ、
　Ｒ，Ｗ、ら（１９８０）　ＰＮＡＳ　７７、５９８９
−５９９２　：Ｒｉｓｔｏｗ、　Ｈ，Ｊ、（１９８６）
　ＰＮＡＳ　８３．５５３１−５５３３）　、ウシ骨か
ら単離された軟骨誘導ペプチド（ＣＩＦ−Ｂ；５ｅｙｅ
ｄｉｎ、　Ｓ、Ｍ、　　ら（１９８７）　Ｊ、Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｎ＋、２６２゜１９４６−１９４９）　、ニ
ワトリ胚軟骨細胞からのＴＧＦ−β４　（Ｊａｋｏｗｌ
ｅｗ、　ｓ、ａ、ら（１９８Ｂ）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　２．１１８６−１１９５
）およびアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ−Ｌａｅ
ｖｉｓ）由来のＴＧＦ−β５（Ｋｏｎｄａｉａｈ、　Ｐ
、ら（１９９０）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５．
１０８９−１０９３）　、並びに生物活性を保持してい
る上述タンパク質の断片および変異体である。ｒ　ＴＧ
Ｆ−β様タンパク質」の定義内に更に含まれるのは、２
つの形のインヒビンと３つの形のアクチビン（濾胞刺激
ホルモンの下垂体分泌を調節する卵巣タンパク質）、ミ
ュラー阻害物質（Ｍｉｓ　；哺乳動物雄胚子におけるミ
ュラー管の発達を阻害する）、骨形層形成タンパク質（
ＢＭＰ　；軟骨および骨形成の誘導に関与するポリペプ
チドのグループ）、ショウジヨウバエ（敗亜並牡圏）の
デカベンタプル遺伝子複合体からの転写物（ｄｐｐ　；
ハエの胚における形態形成を調節するために働＜）、Ｖ
ｇ−１（卵母細胞の植物極中に存在するアフリカッメガ
エル（初ｙ■眩）の転写産物〕、および関連の哺乳動物
遺伝子からのＶｇｒ−１である（Ｍａｓｏｎ、　Ａ、　
　ら（１９８６）　Ｂｉｏｃｈｅｍ。 Ｂ：ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１３５．９５
７−９６４　；Ｃａｔｅ、　Ｒ，ら（１９８６）　Ｃｅ
１ｌ　４５．６８５−６９８　；　Ｗｏｚｎｅｙ、　Ｊ
、Ｍ、ら（１９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４２．１５
２８−１５３４　；　Ｐａｄｇｅｔｔ、　Ｒ。 ら（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２５．８１−８４　
；　Ｗｅｅｋｓ、　Ｄ、Ｌ、およびＭｅｌｔｏｎ、　Ｄ
、Ａ、（１９８７）　Ｃｅ１ｌ　５１．８６１−８６８
　；Ｌｙｏｎｓ、　Ｋ、ら（１９８９）　ＰＮＡＳ　８
６．４５５４−４５５８）。 好ましいＴＧＦ−β様タンパク質は、それぞれ配列番号
１．２および３のもとに配列表に記載されたアミノ酸配
列を有するヒトＴＧＦ−β１　（Ｄｅｒｙｎｃｋ。 Ｒｏら（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ　３１６．７０１−
７０５）　、ヒトＴＧＦ−β２　（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ
、　Ｈ，ら（１９８７）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。 ２６２、１２１２７−１２１３１３およびヒトＴＧＦ−
β３（Ｔｅｎ　Ｄｉｊｋｅ、　Ｐ、　　ら（１９８８）
　ＰＮＡＳ　８５．４７１５−４７１９）である。 生物活性ＴＧＦ−β様タンパク質は、元来、非形質転換
細胞系の足場非依存性増殖を誘導することができる（Ｔ
ｕｃｋｅｒ、　Ｒ，Ｆ、ら（１９８３）　Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ４３、１５８１−１５８６）または
新生物性標的細胞の増殖を阻害することができる（Ｒｏ
ｂｅｒｔｓ、　Ａ、Ｂ、ら（１９８５）ＰＮＡＳ　８２
．１１９−１２３）ものとして定義される。本発明の目
的上、「生物活性」は、次のいずれかとして定義される
。 （ａ）ＴＧＦ−β様タンパク質の不在下で移動する細胞
の数に比較した時、ＴＧＦ−β様タンパク質を含む無血
清培地の存在下における細胞の「負傷した」単層培養物
中に移動する細胞の数により測定することができる、正
常Ｂａ１ｂ／ｃ　３Ｔ３繊維芽細胞における細胞移動促
進活性； （ｂ）細胞のＤＮＡ合成または細胞分裂におけるＴＧＦ
−β様タンパク質の刺激作用により測定される、Ｂａ１
ｂ／ｃ　３Ｔ３繊維芽細胞における増殖促進活性； （Ｃ）未処理の細胞の数に比較した時、与えられた培養
期間ＴＧＦ−β様タンパク質で処理された細胞の数を反
映する比色アッセイにより測定される、Ａ３７５黒色腫
細胞の増殖阻害； （ｄ）未処理の対照創傷に比較した時、ＴＧＦβ様タン
パク質の複数回局所適用後の老齢マウスにおける、再表
皮形成過程による部分的厚さの火傷の治癒の促進； （ｅ）未諸多の対照創傷に比較したこ時、ＴＧＦ−β様
タンパク質の一回局所適用後の成体マウスにおける、生
検材料の引張強さ測定と組織学的分析により測定される
、十分な厚さの切開創傷の治癒の促進；または （ｆ）未処理の対照チャンバーに比較した時、ＴＧＦ−
β様タンパク質のチャンバー中への複数回局所注射後の
成体マウスにおける、多孔性創傷チャンバー移植片の内
側と周囲の両方における繊維状肉芽組織の形成の増加、
それと共に前記組織の血管分布の顕著な増加。 単量体系のＴＧＦ−β様タンパク質は、組換え技術によ
り、または当業界で公知の方法により合成的に製造する
ことができる。二量体形は、ジスルフィド結合した２本
のポリペプチド鎖から成る成熟の生物活性分子である。 単量体は、生物活性二量体の回復を可能にする再生条件
にかけられる。この過程は、単量体の一次構造（即ちア
ミノ酸配列）の変化を伴わないが、生物活性に関係する
二量体生成物の三次元構造の形成に関する。この過程は
、ジスルフィド結合の形成および二量体構造への単量体
の会合を含む。 再生条件にかける前に、単量体ＴＧＦ−β様タンパク質
は、変性された（即ち折りたたまれていない）形で存在
しなければならない。タンパク質を効率的に変性させる
ことができるのは、当業界で公知のいわゆるカオトロピ
ック剤であり、これは、水溶液中で且つ適当な濃度にお
いて、水和の状態、溶媒環境または溶媒−表面相互作用
を変化させることを通して、その表面における変化によ
り各タンパク質の立体配置を変化させる。そのようなカ
オトロピック剤または変性剤の例としては、約４〜約９
Ｍの範囲内の濃度における尿素、塩酸グアニシン、チオ
シアン酸ナトリウム、および０．０１〜２％のオーダー
の濃度で供給されるＳＤＳのような洗剤が挙げられる。 また、ＴＧＦ−β様タンパク質を含む水溶液の約２〜約
４のｐ）ｌへの酸性化、並びに例えばｐＨ１０の塩基性
条件および温度上昇も、単量体の変性をもたらすであろ
う。 「再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）条件」なる用語は、変性
された単量体が生物活性に関連する立体配置をとるのを
可能にする緩衝液条件を言う。常用の緩衝液系、例えば
Ｔｒｉｓ、リン酸またはクエン酸緩衝液は、約６〜約１
０のｐＨで使用することができる。再生条件下では、鎖
内および鎖間ジスルフィド結合の形成が促進される。そ
のような条件は、チオール／ジスルフィドベアの連続的
な酸化と還元を可能にする酸化還元系および可溶化剤の
存在を含む。緩衝液系は、適当な塩を更に含むことがで
きる。 適当な可溶化剤は、洗剤、好ましくは穏和な洗剤、水混
和性有機溶媒もしくはリン脂質、またはそのような剤の
２以上の混合物である。 洗剤は、ＴＧＦ−β様タンパク質の折りたたみを可能に
する濃度で使用される界面活性化合物、例えばＳ　Ｄ　
Ｓ　、　ＴｒｉｔｏｎまたはＴｗｅｅｎである。好まし
いのは、三量化後の生物活性に関連する立体配置への単
量体ＴＧＦ−β様タンパク質の折りたたみを可能にする
一方、前記単量体を可溶形に維持する穏和な洗剤である
。ＴＧＦ−β様タンパク質を不活性化することなく可溶
化する穏和な洗剤は、非イオン性（例えばジギトニン）
、カチオン性（例えばＮ−（２，３−（ジオレイルオキ
シ）プロピル〕Ｎ、Ｎ、Ｎ−１−リメチルアンモニウム
；Ｄｄｚｇｉｉｎｅｓ、　Ｎら（１９８９）　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８．９１７９−９１８４）　、ア
ニオン性（例えばコール酸ナトリウム、デオキシコール
酸ナトリウム）または両性イオン〔例えばスルホベタイ
ン（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）　、３（３−クロラミド
プロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネ
ー）（Ｃｈａｐｓ）　、３　　（３クロラミドプロピル
）ジメチルアンモニオ−２ヒドロキシ−１−プロパンス
ルホネート（Ｃｈａｐｓｏ）　）洗剤である。それらは
、約１〜１００ｍ？ｌ　、特に３０〜６０ｍＭの範囲内
の濃度で再生緩衝液中に存在する。 好ましい洗剤は、両性イオン洗剤３−（３−クロラミド
プロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネ
ートおよび３−（３−クロラミドプロピル）ジメチルア
ンモニオ−２−ヒドロキシ１〜プロパンスルホネートで
ある。最も好ましいのは３−（３−クロラミドプロピル
）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネートであ
る。 水混和性有機溶媒を再生緩衝液中の洗剤と置き換えるこ
とができる。そのような溶媒は、例えば、アセトニトリ
ル、低級アルカノール、ＣｔＣａアルカノール、例えば
エタノールもしくはイソプロパツール、または低級アル
カンジオール、特にＣｔ　　Ｃａアルカンジオール、例
えばエチレンゲルコールであり、１０〜５０容量％の濃
度範囲で存在する。 あるいは、リン脂質を再生緩衝液中の洗剤または水混和
性有機溶媒と置き換えることができる。 そのようなリン脂質は、例えば０．１〜５■／戚の濃度
範囲におけるホスファチジルエタノールアミン、ホスフ
ァチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファ
チジルイノシトール、並びに同じ濃度範囲における合成
リン脂質誘導体または変異体、例えばジヘキサノイルホ
スファチジルコリンまたはジヘプタノイルホスファチジ
ルコリンである。 ジスルフィドの形成を促進する適当な酸化還元系は、例
えば低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド試薬組合せ
、例えば酸化型と還元型のグルタチオン、酸化型と還元
型のジチオトレイトール、酸化型と還元型のβ−メルカ
プトエタノールまたはβ−メルカプトメタノール、シス
チンとその還元型、およびシスタミンとその還元型であ
り、約１〜１００ｍＭの濃度で存在し、酸化型と還元型
のモル比は１００：１〜１　：　１００　、特に６：１
〜１：６である。 好ましいスルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系は、
酸化型と還元型のグルタチオンである。 あるいは、低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド試薬
組合せの代わりに、約１０〜１０００ｇ／ｄ、特に約５
０〜２００　ｘｒ／ｄの濃度範囲のチオレドキシンまた
はジスルフィドイソメラーゼを使用することもできる。 再生緩衝液中で用いることのできる塩としては、３Ｍま
での濃度におけるＮ　ａ”　ｇ　Ｌ　１”　Ｉ　Ｋ　”
　Ｉ　ＮＨａ”Ｍｇ”、Ｃａ”＋またはＭ　ｎ　”＋と
Ｃｆ１−、　Ｆ−、ＢｒＴ−、ＨＣＯ３，Ｓ０４”−、
ＰＯ４−、ＣＨ３ＣＯＯ−、ＣＮ−、または５ＣＮ−と
の塩、あるいは他のアルカリ金属またはアルカリ土類金
属−ハロゲンまたは疑似ハロゲン化合物が挙げられる。 好ましいのは、１〜２Ｍの濃度のＮａＣｌである。 本発明は特に、二量体の生物活性の形質転換増殖因子β
型様タンパク質の製造方法に関し、該方法は、変性され
た単量体形の前記ＴＧＦ＝β様タンパク質を、約６〜約
１０のｐＨおよび約０°Ｃ〜約３７°Ｃにおいて可溶化
剤の存在下で低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド酸
化還元系を含んで成る緩衝液条件にかけることを含んで
成る。好ましくは、ｐＨが約８．０であり、そして温度
が約４°Ｃである。 好ましい態様においては、スルフヒドリル／ジスルフィ
ド酸化還元系は、酸化型と還元型のモル比がｌ：ｌ〜１
：２である約１〜１０ｍＭの濃度の酸化型と還元型のグ
ルタチオンであり、そして弱性洗剤は約３０ｍＭ〜約６
０ｍＭの濃度の３−（３−クロラミドプロピル）ジメチ
ルアンモニオ−１−プロパンスルホネートである。 特に、二量体の生物活性ＴＧＦ−β様タンパク質の製造
は一段階法において行われる。この場合、単量体の前記
タンパク質を再生緩衝液中に溶解させ、そして反応混合
物を４℃で２〜４００時間インキュベートしながら、再
生と二量体を連続的に行う。再生反応液中のタンパク質
濃度は、高すぎると単量体が実質的な凝集を起こし、望
ましくない高次オリゴマーの形成をもたらし得るので、
考慮すべき重要な点である。タンパク質濃度が約２■／
−未満であるならば、二量体生成物の収率が増加し、０
．０１〜０．５ｍｇ／ｍｅの濃度範囲が好ましい。 所望により、ジスルフィド形成を更に促進するために、
Ｃｕ”イオン〔例えばＣｕＣ１ｚｒ　Ｃｕ（ＮＯ＋）ｚ
もしくはＯ−フェナントロリン／Ｃｕ”錯体〕またはＦ
ｅ”″イオン〔例えばＦｅＣＡ、もしくはＦｅｚ　（５
０４）　：ｌ　）を含む酸化促進剤の有効量を再生緩衝
液に添加してもよい。有効量とは、便利な時間内にスル
フヒドリル基の酸化を行うのに最小限必要であろう量で
あり、そして所望のジスルフィド結合の形成に関与する
ことが定められているＴＧＦ〜β様タンパク質中の遊離
スルフヒドリル基の濃度にほぼ等価である量である。好
ましい量は、０．０１〜１００　／／Ｍの範囲である。 更に、酸化促進剤の存在下または不在下において再生緩
衝液に所望により０□または空気をバブリングさせるこ
とができる。酸化は、Ｉ　ｚ　（Ｋａｍｂｅｒ。 Ｂ、ら１９８０．１ｌｅｌｖ、６３．８９９−９１５）
またはベンゾキノン誘導体（Ｋａｍｂｅｒ、　Ｂ、　　
Ｐ　ＣＴ出願Ｗ０８９１０１４８４）を使って行うこと
もできる。 タンパク質のスルホン化は、ジスルフィド結合を開裂さ
せるためと、生成するチオール基をブロックするために
使用することができる。単量体ＴＧＦ−β様タンパク質
を所望によりスルホン化し、それによって再生条件に暴
露される前に酸化されてしまうのを防ぐことができる。 Ｓ−スルホン化は、システィンのような還元剤の存在下
で亜硫酸ナトリウムを使って行うと、Ｓ−スルホネート
としてチオール残基の可逆的保護を生じる。再生条件下
において、過剰のスルフヒドリル／ジスルフィド酸化還
元系により保護基が除去され、そして二量体が自然に起
こる。 本発明は更に、二量体の生物活性ＴＧＦ−β様タンパク
質の製造方法に関し、ここで単量体形の前記ＴＧＦ−β
様タンパク質は次の段階により製造される： （ａ）前記タンパク質が発現されるような発現調節配列
に適切な読み枠において連結されたＴＧＦβ様タンパク
質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る微生物宿
主を培養し、 （ｂ）変性された可溶性単量体形においてＴＧＦβ様タ
ンパク質を回収する。 適当な微生物宿主は、酵母菌株、例えばサツカロミセス
・セレビシェ−（錘匹加シ１匹弦ｃｅｒｅｖｉｓｉａ’
ｅ）または細菌、例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒ　ｉｃｈ　ｉａ匹旦）もしくはバシラス・サブチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ５ｕｂｔｉｌｉｓ）である。 適切な読み枠において発現調節配列に連結されたＴＧＦ
−β様タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有
する微生物宿主は、当業界で公知でありそして次の段階
を含んで成る組換え技術により、調製することができる
。 一適当な発現調節配列の発現調節下にＴＧＦ−β様タン
パク質をコードするＤＮＡ配列を含んで成るハイブリッ
ドベクターを調製し、 −前記ハイブリッドベクターを用いて前記微生物宿主を
形質転換せしめ、そして 一非形質転換宿主細胞から形質転換微生物宿主細胞を選
択する。 成熟ヒトＴＧＰ−β１　、　　ＴＧＦ−β２またはＴＧ
Ｆβ３のようなＴＧＦ−β様タンパク質をコードするヌ
クレオチド配列は既知であり（Ｄｅｒｙｎｃｋ、　Ｒ，
ら（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ　３１６．７０１−７０
５　；　Ｍａｒｑｕａｒｄｔ　Ｈ，ら（１９８７）　Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２．１２１２７−１２１３
１　；Ｔｅｎ　Ｄｉｊｋｅ、　Ｐ、　　ら（１９８Ｂ）
　ＰＮＡＳ　８５．４７１５−４７１９）、そして例え
ば当業界で既知の方法により化学的に合成することがで
きる。あるいは、ＴＧＦ−β様タンパク質産生哺乳動物
細胞から各ｎ＋ＲＮＡを単離した後、ＴＣＰ−β様タン
パク質をコードするｃＤＮＡを調製することができる。 発現調節配列は、ＴＧＦ−β様タンパク質の効率的発現
を保証するプロモーター配列である。 適当なベクターの選択は、形質転換のために用意される
微生物宿主細胞によって決定される。 Ｅ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株中でのＴＧＰ−β様タン
パク質の発現に適当であるベクターの例は、バクテリオ
ファージ、例えばλバクテリオファージの誘導体、また
はプラスミド、例えばプラスミドｐＢＲ３２２およびそ
の誘導体ｐＰＬＭｕである。適当なベクターは、完全な
レプリコンおよびマーカー遺伝子を含有する。マーカー
遺伝子は、発現プラスミドにより形質転換された微生物
の表現型特徴による選択および同定を可能にする。適当
なマーカー遺伝子は、例えば、重金属、抗生物質、例え
ばアンピシリンまたはテトラサイクリン等に対する耐性
を微生物に付与する。 Ｅ、コリ中でのＴＧＦ−β様タンパク質の発現を調節す
るために幾つかのプロモーターを使用することができる
。特に、強力に発現される遺伝子のプロモーターが使わ
れる。適当なプロモーターは、Ｅ、コリのｊ！ａｃ　、
　　ｔａｃ　、　ｔｒｐおよびｆＰＧｌプロモーター、
更にファージλＮまたはファージλｐｔ、プロモーター
等である。 Ｓ、セレビシェ−（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で
の複製および発現に適当なベクターは、酵母複製開始点
および酵母のための選択的遺伝子マーカーを含有する。 酵母複製開始点、例えば染色体自己複製配列（ａｒｓ　
）を含むハイブリッドベクターは、形質転換後に酵母細
胞中に染色体外的に維持され、そして有糸分裂中に自律
的に複製される。また、酵母２μプラスミドＤＮＡに相
同の配列を含むハイブリッドベクターを使用することが
できる。そのようなハイブリッドベクターは、細胞内に
既に存在する２μプラスミド中に組換えにより組込まれ
るか、または自律的に複製する。酵母のための適当なマ
ーカー遺伝子は、特に宿主に抗生物質耐性を付与するも
の、または栄養素要求性酵母突然変異体の場合には、宿
主の障害を補完する遺伝子である。対応する遺伝子は、
例えば、抗生物質耐性を付与するか、または栄養素要求
性酵母突然変異体における原栄養性に備えるもの、例え
ばＵＲＡ３゜Ｕ見え、得１走または基ｌ上遺伝子である
。 酵母中での発現に適当なプロモーターは、例えば、ＡＤ
ＨＩ　、　ＡＤ）ｌ　ＩｔまたはＰＨ０５遺伝子のプロ
モーター、更にグリコリシスに関与するプロモーター例
えばＰＧＫまたはＧＡＰプロモーターである。 所望により、ＴＧＦ−β様タンパク質の分泌を可能にす
るシグナル配列を発現ベクター中に含めることができる
。適当なシグナル配列は、例えば酵母酸ホスファターゼ
（ＰＨ０５）または酵母インベルターゼ遺伝子由来のも
のである。 形質転換された微生物宿主は、同化できる炭素源、窒素
源および無機塩類を含有する液体培地中で、当業界で既
知の方法を適用して培養される。 様々な炭素源を用いることができる。好ましい炭素源の
例は、同化できる炭水化物、例えばグルコース、マルト
ース、マンニトール、フルクトースもしくはラクトース
、またはアセテート、例えば酢酸ナトリウムであり、こ
れらは単独でも適当な混合物においても使用できる。適
当な窒素源としては、例えば、カザミノ酸のようなアミ
ノ酸、ペプチドおよびタンパク質並びにそれらの分解生
成物、例えばトリプトン、ペプトンまたは肉エキス、更
には酵母エキス、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液、並
びにアンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸塩
または硝酸塩が挙げられ、これらは単独でも適当な混合
物においても使用することができる。使用できる無機塩
類としては、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシ
ウムおよびカルシウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩およ
び炭酸塩が挙げられる。更に、栄養培地は、増殖促進物
質を含んでもよい。増殖を促進する物質としては、例え
ば、微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等、または個
々のアミノ酸が挙げられる。 単量体ＴＧＦ−β様タンパク質は、当業界で公知の方法
により微生物宿主から回収される。それらの方法は、所
望のタンパク質を遊離させるための細胞の溶解または機
械的破壊に続き、例えば沈澱および／またはクロマトグ
ラフィー手段による宿主細胞タンパク質からのＴＧＦ−
β様タンパク質の分離を含んで成る。 単量体ＴＧＦ−β様タンパク質が不溶性凝集体（封入体
）として微生物宿主細胞中で生産される場合、再生条件
に暴露する前にそれを可溶化しなければならない。従っ
て、本発明は、単量体ＴＧＦ−β様タンパク質を次の段
階により製造する方法に関する： （ａ）ＴＧＦ−β様タンパク質を含む水不溶性タンパク
質画分を宿主細胞から単離し、そして（ｂ）ＴＧＦ−β
様タンパク質を可溶化せしめる。 単量体の可溶化および変性は、不溶形において単量体Ｔ
ＧＦ−β様タンパク質を含む粗タンパク質懸濁液を、所
望によりＤＴＴのような還元剤の存在下で、約１〜約４
のｐＨ１好ましくは約２．５のｐＨへ酸性化することに
より、または約４〜９Ｍの濃度におけるカオトロピック
剤、好ましくは塩酸グアニジン、または最も好ましくは
尿素の添加、上述したような塩基性ｐＨまたは温度上昇
により、達成される。可溶化された単量体は、透析によ
り、そして透析中に沈澱が起こる場合は、追加の遠心分
離により、カオトロピック剤から精製することができる
。可溶化された単量体はクロマトグラフィー精製され、
そして生物活性二量体生成物を与えるための再生に使用
される。 微生物宿主細胞中での組換えタンパク質の生産後の調製
物中に存在し得る不純物、特に発熱物質または他のエン
ドトキシンを除去するために、再生後に生物活性二量体
が精製される。二量体の分離は、クロマトグラフィー、
例えばサイズ排除ゲルクロマトグラフィー、疎水的相互
作用クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラ
フィー例えばＭｏｎｏ　Ｓカラム上でのクロマトグラフ
ィーおよび逆相ＨＰＬＣにより行われる。 本発明は更に、本発明の方法に従って製造された二量体
の生物活性ＴＧＦ−β様タンパク質に関する。それらの
ＴＧＦ−β様タンパク質は、様々な療方において使用す
ることができる。 本発明はまた、単量体ＴＧＦ−β様タンパク質をＳ−ス
ルホン化することにより製造できる単量体Ｓ−スルホン
化ＴＧＦ−β様タンパク質に関する。 単量体Ｓ−スルホン化ＴＧＦ−β様タンパク質は新規化
合物であり、生物活性二量体ＴＧＦ−β様タンパク質の
製造に用いることができる。 本発明は更に、本発明に従って製造された二量体の生物
活性ＴＧＦ−β様タンパク質または医薬上許容されるそ
れの塩の有効量を含んで成る、投薬単位形態の医薬組成
物に関する。 そのような組成物は、非経口、例えば筋肉内もしくは静
脈内、経口、または特に局所投与用の、注入溶液または
製剤の形態である。溶液は、好ましくは、例えば単独で
または医薬上許容される担体と一緒に活性成分を含む凍
結乾燥製剤から使用前に調製することができる、等張の
水溶液または懸濁液である。非経口投与用溶液は通常水
溶液である。それらは常法に従って調製され、そして活
性成分に加えて、生理的食塩水、安定剤、例えばヒト血
清アルブミン、アミノ酸、例えばアルギニンまたはグリ
シン、および炭水化物、例えばグルコース、マンノース
、デキストランまたはヒドロキシエチルスターチを含ん
でもよい。ｐＨは、緩衝剤、例えばリン酸、コハク酸ま
たはアミノ酸により約４．５〜７に調整され得る。通常
、溶液はバイアルに充填され、長期保存のために凍結乾
燥される。 組成物は、常用の添加剤、例えば防腐剤、安定剤、湿潤
剤および／または乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節する
ための塩および／または緩衝剤を含有する。本発明の組
成物（所望であれば、他の薬理的に価値ある物質を含ん
でもよい）は、それ自体既知の方法により、例えば常用
の混合、溶解、凍結乾燥および／または滅菌法により製
造され、そして約１　ｎｇ　−１００ｘ／　ｇ　、特に
約１０ｎｇ〜１０ｘ／ｇ製剤、凍結乾燥物の場合には１
００％まで、の活性成分を含有する。 ＴＧＦ−β様タンパク質は、それらが一方では成る細胞
タイプ、即ち繊維芽細胞の増殖を刺激し、他方では他の
細胞タイプ、即ち腫瘍細胞と免疫系の細胞の増殖を抑制
する点で二元性である。 本発明に従って製造された二量体の生物活性ＴＣＰ−β
様タンパク質、所望によりそれらの塩の形、例えば特に
非毒性の医薬上許容される酸付加塩の形、所望により医
薬製剤の形は、有効量において適用される。「有効量」
なる用語は、有意な治癒を与える量、例えば所望の細胞
の増殖を刺激しそして正常細胞に対して毒性でない量を
意味する。この量は、例えば試験管内増殖実験により決
定することができる。ＴＧＦ−β様タンパク質の二元性
のため、「有効量」は、腫瘍細胞と免疫系細胞の増殖お
よび繁殖を有意な程度阻害する量でもある。ヒトまたは
家畜に用いようとする場合、処置すべき特定の組織、適
用形式、病気の重さ、および処置すべき患者の年齢と一
般的状態に応じて量を調整しなければならない。一般に
、成人の一回量または一日量のいずれかが、増殖刺激作
用と阻害作用の両方に対して、約０．０１〜２０Ｉ！ｇ
の範囲内であろう。 本発明の医薬組成物は、動物、特に哺乳動物、より特定
的にはヒト、および創傷治癒の場合には、最も特定的に
は老人、の治療において臨床用途を有する。 本発明の組成物は細胞の移動と増殖を促進する。 創傷治癒は細胞の移動と増殖パターンを伴うので、それ
らは試験管内研究結果において生体内創傷治癒過程に直
接関連づけられる。 床ずれ（褥瘉性潰瘍）の予防または処置が好ましい用途
である。というのは、それらは入院患者、特に老人患者
および車いす患者において頻繁に発生するからである。 高齢者では治癒過程が遅く、このグループの患者は創傷
（褥艙性潰瘍および糖尿病性潰瘍だけでなく、外傷、火
傷等も含む）の高発生率を示し、ゆっくりと治癒するか
または全く治癒しない。 本発明の組成物の２つの適用形式が、獣医学および特に
ヒト医学のために提案される。 第一の好ましい適用は、特に治癒過程が著しく遅い老人
における、表面創傷の治癒の促進のための局所適用であ
る。処置できる創傷の種類に関する限定はなく、次のも
のが挙げられる（ただしそれに限定されない）：＃ｆ性
（床ずれ）、糖尿病性、口腔、静脈瘤性および出血性表
面潰瘍を含む表面潰瘍；火傷（特に第２度と第３度）；
外科的切開（口腔部外材と美容外科のものを含む）；事
故創傷（切開、穿通、裂傷および他の外傷を含む）；お
よび療法上誘発された創傷（放射線療法中に誘発される
ものを含む）。局所的に適用する時、組成物は他の成分
、例えば補助剤、担体、可溶化剤、および任意の他の既
知のまたはまだ未知の第二の増殖因子と組合せることが
できる。それらの成分の性質に関する制限はないが、た
だしそれらは投与のために医薬上および生理学上許容さ
れるものでなければならず、且つ組成物の活性成分の活
性を低下させたり有害な毒性にしてはならない。本発明
の組成物を表面潰瘍、火傷、外科的または事故創傷に適
用する事、該組成物は、好ましくは粉末、ゲル、軟膏、
潅注剤の形態であり、または好ましくは液体または半液
体において経皮パンチ、硬膏、包帯中に含浸させること
ができ、あるいは練り歯みがきまたはチューイング用ガ
ムもしくは樹脂中に含ませることができる。 第二の適用は、外科手術後、または手術が不可能である
かまたは必要でない内部器官の組織への障害後のいずれ
かの内部創傷の治癒のための全身適用である。同じく、
処置すべき組織または創傷のタイプに関する制限はなく
、内部器官または組織への深い外科的切開；骨および軟
骨（骨折後）；胃、十二指腸および他の腸の潰瘍が挙げ
られる（がそれらに限定されない）。全身的に適用する
時、本発明の組成物は、腸内投与用には液体、丸剤、錠
剤、砥削として、または非経口注射用には液体形におい
て製剤化することができる。手術後の内部切開の処置の
ためには、好ましくは生理的に許容される塩類溶液と組
合せて、潅注剤の形態であることができる。同じく、該
組成物の活性成分は他の成分、例えば補助剤、担体、可
溶化剤、および任意の他の既知のまたはまだ未知の第二
の増殖因子と組合せることができる。それらの成分の性
質についての制限はないが、ただし投与のために医薬上
または生理学上許容されるものでなければならず、且つ
組成物の活性成分の活性を低下させたり有害な毒性にし
たりしてはならない。 創傷を治癒せしめるために、適用すべき活性成分の量は
、創傷のタイプ、重度および場所、処置される患者の年
齢および一般的状態に応じて調整しなければならない。 一般に、創傷１　Ｃ４あたりＴＧＦ−β様タンパク質約
ＩＩＰｇ〜２０可の一回量または一日量が有意な治癒効
果を有する。内部適用には、体液中へのＴＧＦ−β様タ
ンパク質の希釈のために、投与形式に応じてより高い用
量を適用すべきであろう。 本発明に従って製造されたＴＧＦ−β様タンパク質の更
なる用途は、骨および組織の修復、哺乳動物におけるガ
ンの治療、抗炎症剤もしくは免疫抑制剤として、哺乳動
物細胞培養物における増殖調節剤として、または骨髄保
護剤もしくは心臓保護のメディエータ−としてである。 〔実施例〕 次の実施例は本発明を説明するものであり、限定を意味
するものではない。 Ａ１箱１ぴす１畏 Ｃ１〜２１５系由来のヒト神経膠腫細胞（ｄｅ　Ｍｕｒ
ａｌｔ。 Ｂ、ら（１９８５）　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｃ１
１ｎ、０ｎｃｏ１．２１．２０７）を、ダルベツコ改良
イーグル培地（ＤＭＥＭ、　Ｇｉｂｃｏ）および１０％
ウシ胎児血清を含む組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ　
Ｔ７５）中で培養する。 Ｂ、Ｒ凡人檎■ Ｃ１〜２１５ヒト神経膠腫細胞系由来の細胞ｌＸｌ０”
個を捕集し、そして０．２％（Ｗ／Ｖ）ＮＰ４０洗剤を
含む３０Ｉ１１の５％クエン酸中で４°ＣにてＤｏｕｎ
ｃｅホモジナイズする。５ｏｒｖａｌｌ　ＲＴ　６００
０−　Ｂ卓上遠心機中で４°Ｃにて２．５００ｒｐｍで
１０分間遠心することにより、核を細胞質と分離する。 ＳＳ　−３４０−ターを取付けた５ｏｒｖａｌｌ　ＨＣ
５−Ｂ遠心機中で４°Ｃにて１５、００Ｏｒｐｍで３０
分間、上清を遠心する。生じた上清を捨て、そしてペレ
ットを３０ｄの０．２　Ｍ　ＴＲｌ５／ＨＣＩ！、（ｐ
Ｈ７，５）　　、　５ｍＭ　ＥＤＴＡ　　、　２％ＳＤ
Ｓ、　　２５０００単位／ｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ）
中に再懸濁し、次いでフェノール／クロロホルム（１：
１、ｖ　／　ｖ　）で３回抽出する。ここでクロロホル
ムは２４部のクロロホルムと１部のイソアミルアルコー
ルから成る（Ｖ／Ｖ）。最後の水相に１容の３Ｍ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ５，０）と２．５容のエタノールを添加
する。エタノール沈澱物を７０％エタノールで２回洗浄
する。ＲＮＡペレットを２Ｊｄの１０ｍＭ　ＴＲｌ５／
　ＨＣ１（ｐＨ７，５）　　、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　
　、　０．０５％ＳＯＳ中に再懸濁する。Ｔ、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓにより、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）中に記載され
たようにして、オリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフ
ィーにより、ポリアデニル化ＲＮＡを単離する。 Ｃ０旦凡八■金威 ５０ｍＭ　ＴＲｌ５（ｐＨ８，３）　　、　５０＋＋＋
Ｍ　Ｋ（／！　、　１０ｍＭ’　ＭｇＣ／！　ｚ　。 １　ｍＭ　ＤＴＴ　、　３０ｔｔｇ／　ｍｌオリゴ−ｄ
Ｔ　１２−１８　、　Ｉ　ｎ＋Ｍ各ｄＡＴＰ　、　ｄＣ
ＴＰ　、　ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、　５０単位のＲＮ
アーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）並びに１０００単位の
モロニー白血病ウィルス逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ　　Ｂ
ＲＬ）を含む１００Ｉの溶液中の１０ｇのポリＡ″″Ｒ
ＮＡから第−鎖ｃＤＮＡを合成する０反応液を３７°Ｃ
で１時間インキュベートする０次いで２０ｍＭ　ＴＲｌ
５／ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）　　、　５ｍＭＭｇＣｊ
！　ｔ　、　、１００ａ＋Ｍ　ＫＣｌを含む第二鎖緩衝
液により４００ｄに希釈する。１２．５単位のＲＮアー
ゼＨ（Ｇ　１ｂｃｏ　−ＢＲＬ）を添加し、そして反応
混合物を３７°Ｃで１０分間インキュベートする。次い
で氷上で５分間冷却し、１２５単位のＥ、コリ（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　）　Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩ　（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）を添加し、反応混合物を１６℃で更に２時間イン
キュベートする。４０ｄの０、５　Ｍ　ＥＤＴＡを添加
した後、フェノール／クロロホルム（１：１、ｖ　／　
ｖ　）抽出を行う。水相にｌ／１０容の３Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ７，０）と４容のエタノールを添加した後、
反応混合物を一７０°Ｃで３０分間沈澱させる。 エタノール沈澱物を１７．０００ｇで１０分間遠心し、
ペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、そして５ｐ
ｅｅｄ　−Ｖａｃ中で乾燥する。二本鎖ｃＤＮＡを無菌
水に溶解し、Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩（ｐＨ８，８＞中でア
ガロースゲル上で電気泳動し、ｃＤＮＡのサイズと量を
評価する。 ５ｎのｃＤＮＡを１００Ｉ１１の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／
ＨＣｆ　（ｐＨ８、０）　、０．１ｔＭ　ＥＤＴＡ　、
　８０ＪＩＭアデノシルーメチオニンおよび４０単位の
ＥｃｏＲＩメチラーゼ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏ
ｌａｂｓ）中で３７℃にて１時間インキュベートするこ
とにより、ｆｉｃｏＲ１部位の所をメチル化する。上述
したように反応混合物をフェノール／クロロホルムで抽
出し、ｃＤＮＡをエタノール沈澱せしめ、そして無菌水
中に溶解する。 次に、５にのｃＤＮＡを、２００　ｄの３３１１Ｍ　丁
ｒｉｓ−酢酸塩（ｐＨ７，９）　、６６ｍＭ酢酸カリウ
ム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５−Ｍ　ＤＴＴ並
びに０．１ｔｓＭの各ｄＡＴＰ　。 ｄＧＴＰ　、　ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ中で、２０単位
の７４　ＤＮＡポリメラーゼと共に３７°Ｃにて１０分
間インキュベートすることにより、リンカ一連結のため
に用意する。 反応液を室温に冷却し、次いで２０単位のタレノウポリ
メラーゼ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を添加し、室温で５分
間および氷上で５分間インキュベートする。１０ｍの０
．５　Ｍ　ＥＤＴＡを添加した後、上述した様に、反応
混合物をフェノール／クロロホルム抽出し、ｃＤＮＡを
エタノール沈澱せしめ、そして無菌水に溶解する。 １２マーの混合５′−リン酸化リンカ−（Ｎ６ＩＩＥｎ
ｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ　Ｎｏ、１０７０）を、５０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｊ！　（ｐＨ７，８）。 １ＯａＭ　ＨｚＣｌ　ｚ　　、　２０ｍＭ　ＤＴＴ　、
　１　ｍＭ　ＡＴＰを含む１００ＩＪ！の溶液中で１６
°Ｃにて４０００単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを使って
、５ＲのｃＤＮＡに連結せしめる。リガーゼを７０°Ｃ
で１０分間不活性化し、反応液を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／
ＨＣｊ！　　（ｐＨ７，５）　　、　　６ｎＭ　　Ｍｇ
Ｃｊ！ｔ　　、　　１００ｍＭ　　ＮａＣ／！により５
００Ｉに希釈し、そして１０００単位のＥｃｏＲＩ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で３７°Ｃにて６時間消化する。 ５０ｍの０．５　Ｍ　ＥＤＴＡを添加し、そして反応混
合物を７０゛Ｃで１０分間加熱する。加熱した反応混合
物を直接Ｂｉｏ−ｇｅｌｌ　Ａ１５カラム（２００−４
００メツシユ、Ｂｉ。 −Ｒａｄ）に添加し、単量体リンカ−断片を除去する。 ３００ｂｐより大きいｃＤＮＡは排除体積において溶出
する。 Ｄ、−ム　ｔｌｌ　　へのクローニング供給者に従って
１００ｇのラムダベクターＤＮＡをＥｃｏＲＩ　（Ｎｅ
ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化すること
により、ラムダｇｔｌｌアームを調製する。上述したよ
うに１単位の子ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使って、消化し
たＤＮＡを脱リン酸する。Ｂｉｏ−ｇｅｌ　４１５カラ
ムからの２０−３ＯａｇのｃＤＮＡを１■のｇｔｌｌ脱
リン酸アームと共にエタノールで共沈させ、そして５０
ｗＭ　Ｔｒｉｓ／Ｈ（／！（ｐＨ７，８）　　　、１０
ｍＭ　　ＭｇＣｆｚ　　　、２０ｓ＋Ｍ　　ＤＴＴ、　
　１ｍＭ　　ＡＴＰ。 １５％ポリエチレングリコール（ＭＷ　６０００）　、
ｔｊよび２００単位のＴ４　ＤＮ＾リガーゼを含む１０
Ｊ１１の溶液中に再懸濁する。この連結混合物を１６℃
で２時間インキュベートする。反応混合物を１０分間遠
心し、ペレットを１０１１１の無菌水に再懸濁し、次い
で供給者（Ｐｒｏｓｅｇａ）に従って室温で３時間試験
管内パッケージングする。　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣ
ｊ！　（ｐＨ７，５）１００ｔｓＭ　ＮａＣ１、１００
ｍＭ　Ｍｇ５Ｏａおよび０．０１％ゼラチンを含む０．
５　ｄの３Ｍファージ希釈緩衝液を添加し、そして２５
ｍのクロロホルムにより安定化させる。記載のようにし
て（Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，およびＤａｖｉｓ＋Ｒ，（１９
８３）　ＰＮＡＳ　８０．１１９４）　、Ｅ、Ｄリ　Ｙ
１０９０細胞を含む０．７％アガロース−Ｙ　Ｔ　（Ｓ
ｉｇｍａ）を使ってｌ０ＹＴ−プレート上で全部で５０
０．０００フアージを増幅させる。 各々のｌ０ＹＴ−プレートから６枚の複製ナイロンフィ
ルター（Ｃｕｎｏ）を作り、フィルター上のファージを
０．５　Ｍ　ＮａＯＨ、１，ｍＭ　ＮａＣ１で変性させ
、そして”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：八
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”（Ｔ、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８
２）に記載のようにして中和する。 フィルターを０．２　Ｘ５ＳＣ，０，２％ＳＯＳ中に９
０°Ｃで１５分間浸し、次いで２ＸＳＳＣ，１％ＳＯＳ
、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン
、０．１％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭ　ＮａＰＯ，
（ｐＨ６，８）、５０ｊ！ｇ／ｒｎ１．の変性サケ精子
ＤＮＡ、０．１　ｔｔｇ／　ＩｄのオリゴＡ　１２−１
８および１００／／ｇ／−のポリＡ’　ｌ？ＮＡ中で４
５°Ｃにて４時間プレハイブリダイズさせる。６枚の複
製物の各りをプレハイブリダイゼーション緩衝液中で４
５°Ｃにて一晩ハイプリダイズさせる。 ６枚のうちの１枚は、異なる３ｔｐ−標識３９ｂｐオリ
ゴマー（下記参照）を２　Ｘ　１０’ｃｐｍ／　ｔｄの
濃度に添加されている。 ハイブリダイゼーションに使用する６つのオリゴマーを
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　ＤＮＡ合成装置
上で合成し、これらはＴＧＦ−β１（配列番号１を参照
）、ＴＧＦ−β２（配列番号２を参照）およびＴＧＦ−
３３（配列番号３を参照）の成熟形（１１２アミノ酸）
のそれぞれの最初のアミノ酸（オリゴマー１．３および
５）または最後のアミノ酸（オリゴマー２゜４および６
）のいずれかをコードするヌクレオチド配列に相当する
。 ＴＣＰ−β１配列の検出に用いられる２つのオリゴマー
は次のものである： １）　　５’　　ＧＣＣＣＴＧ　　ＧＡＣＡＣＣＡＡＣ
ＴＡＴ　　ＴＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧ　　ＧＡＧ
　　へへＧ３’２）　　５’　　ＴＣＡ　　ＧＣＴ　　
ＧＣＡ　　ＣＴＴ　　ＧＣＡ　　ＧＧＡ　　ＧＣＧ　　
ＣＡＣＧＡＴ　　ＣＡＴ　　ＧＴＴ　　ＧＧＡ　　ＣＡ
Ｇ　　３’ＴＧＦ−β２配列の検出に用いられる２つの
オリゴマーは次のものである： ３）　　５’　　ＧＣＴ　　ＴＴＧ　　ＧＡＴ　　ＧＣ
Ｇ　　ＧＣＣＴＡＴ　　ＴＧＣｍ　　ＡＧＡ　　＾へＴ
　　ＧＴＧ　　ＣＡＧ　　ＧＡＴ　　３’４）　　５’
　　ＴＴＡ　　ＧＣＴ　　ＧＣＡ　　ｍ　　ＧＣＡ　　
ＡＧＡ　　ＣＴＴ　　ＴＡＣＡＡＴ　　ＣＡＴ　　ＡＴ
’Ｔ　　ＡＧＡ　　ＡＡＧ　　３’ＴＧＦ−β３配列の
検出に用いられる２つのオリゴマーは次のものである： ５）　　５’　　ＧＣＴ　　ＴＴＧ　　ＧＡＣＡＣＣＡ
ＡＴ　　ＴＡＣＴＧＣＴＴＣＣＧＣへへＣＴＴＧ　　Ｇ
ＡＧ　　ＧＡＧ　　３’６）　　５’　　ＴＣＡ　　Ｇ
ＣＴ　　ＡＣＡ　　ＴＴＴ　　ＡＣＡ　　ＡＧＡ　　Ｃ
ＴＴ　　ＣＡＣＣＡＣＣＡＴ　　ＧＴＴ　　ＧＧＡ　　
ＧＡＧ　　３’４０ｎｇの各オリゴマーを、１００ｍＭ
カコジル酸カリウム（ｐＨ７，２）　、２ｍＭ　ＣｏＣ
ｌ２および０．２　ｍＷ　ＤＴＴを含む２０１１！の反
応緩衝液中で、”　Ｐ　−ｄＡＴＰおよび２０単位のタ
ーミナルトランスフェラーゼ（Ｇｉｂｃ。 ＢＲＬ）を使って３７°Ｃにて１時間、３′末端を標識
する。反応混合物をセファデックスＧ−５０カラム上で
ゲル濾過する。溶出した標識オリゴマーを９５°Ｃで５
分間加熱し、そして上述のプレハイブリダイゼーション
緩衝液に添加する。 複製１〜６をぞれぞれオリゴマー１〜６とハイブリダイ
ズさせる。ハイブリダイゼーション後、フィルターを２
　Ｘ５ＳＣ、Ｉ　Ｘ５ＳＣおよび０．　Ｉ　Ｘ５ＳＣに
より室温で１５分間各２回洗浄する。オートラジオグラ
フィーにより陽性プラークを同定し、そしてプレート上
の全てのプラークが陽性になるまで上記に示した操作を
繰り返すことにより、再スクリーニングする。単一プラ
ークをｌＩｄの３Ｍファージ希釈緩衝液（１，Ｄ項参照
）中に溶出させ、１００ｍをｌｌｄのＥ、コリ　Ｙ１０
９０細胞に添加し、そして混合物を室温で２０分間維持
する。Ｅ、コリＹ１０９０細胞とファージを、０．２％
マルトースを含むＹＴ培地１００Ｗ１１に添加し、そし
て３７℃で７時間インキュベートする。溶解した細胞に
ｌｄのクロロホルムを添加した後、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ
ａｎｕａｌ’　（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｃｏ１ｄ　
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋
　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　１９８２）に記載の方法に従っ
てファージＤＮＡを精製する。精製ＤＮＡを１ｄの１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｆ　（ｐＨ７，５）、ＩｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ中に溶かし、そして供給者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ）の指示に従ってＩＭｌの全容量中で１００１１１を
ＥｃｏＲ１で完全に消化する。酵素反応液をフェノール
／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させる。ＮＡ−
４５　０ＥＡＥ紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５
ｃｈｕｅｌｌ）を使ったゲル電気泳動（Ｕｌｔｒａｐｕ
ｒｅ　ＢＰＬ）により、ＥｃｏＲＩ　ｃＤＮＡ挿入断片
を精製する。該ＤＮＡを５０ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｊ
２（ｐＨ７，５）　　、　５ｍＭ　ＥＤＴＡ　　、　Ｉ
Ｍ　　ＮａＣ１中に溶出させ、そしてエタノール沈澱さ
せる。得られたペレットを７０％エタノールで２回洗浄
し、１０ａ＋Ｍ　　↑ｒｉｓ／ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）
　　、　ｌ　ｍＭ　　ＥＤＴＡ中に再懸濁する。 Ｆ、ｃＤＮＡ　　　　　のスクリーニングＥｃｏＲＩ　
　ｃＤＮＡ挿入断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋ベ
クター（Ｓ　ｔｒａ　ｔａｇｅｎｅ）中にサブクローニ
ングする。上記オリゴマー（１，Ｅ項参照）および５ｅ
ｑｕｅｎａｓｅキツト（Ｕ、Ｓ、Ｂｉｏｃｈｅｓ＋１ｃ
ａｌｓ）を使って、Ｆ、Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）　
ＰＮＡＳ　７４．５４６３により記載された方法に従っ
た二本鎖シーフェンシングにより、ｃＤＮＡの正体を確
かめる。成熟ＴＧＦ−β１　、　　ＴＧＦ−β２および
ＴＧＦ−β３の１１２アミノ酸をカバーするヌクレオチ
ド配列は、それぞれ配列表の配列番号１，２および３の
もとに描写する。 Ｇ、ｃＤＮＡ　　　　　の　−およびブースミドＰＧｅ
ｍＴＧＦ−β１　、　　ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β
３配列を同定するための上記オリゴマー（１，ｆｊＪｔ
参照）を用いて成熟１１２アミノ酸形をコードするｃＤ
ＮＡ挿入断片（終結コドンを含む）を増幅させる。 Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ”プラスミドのＥｃｏＲＩ
　　ｃＤＮＡ挿入断片（１，Ｆ項参照）を上述のように
してゲル精製する（１．Ｅ項参照）　、　１０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ／Ｈ（、ｉ、（ｐＨ８，３５）　、　５０ｍＭ　
ＫＣｊ！　、　１．５ｓＭ　ＭｇＣｊ！　ｚ　　、　０
．０５％（ｗ　／　ｖ　）　ＮＰ−４０、０，０５％（
ｗ　／　ｖ　）　Ｔｗｅｅｎ　２０並びに２００−の各
ｄＡＴＰ　、　ｄＧＴＰ　、　ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ
を含む１００１１１の反応混合物中で、５単位のＴａｑ
ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−ＢｉＩＩｅｒ　Ｃｅｔｕ
ｓ）を使ったポリメラーゼチェーン反応により、２×２
ｎの２つのオリゴマーの存在下で、５０ｎｇの各ｃＤＮ
Ａ挿入断片を増幅させる。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｓｅｒ　
Ｃｅｔｕｓ　　Ｈｅａｔｉｎｇ　Ｂｌｏｃｋを使って次
の温度下で３０ラウンドの増幅を行なう：９３”Ｃ１０
，１分、５５℃１０．２分、７１℃／１．５分。それぞ
れＴＧＦ−β１　、　ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３
のコード配列をカバーしている得られた３３９ｂｐの断
片をゲル精製し、そしてＮｃｏＲＩで消化され、子ウシ
腸アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で
脱リン酸されそしてタレノウポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ
−ＢＲＬ）でフィルインされたプラスミドＰＧｅｓ−５
２Ｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にサブクローニングす
る。得られた構成物をｐＧＫＭ　１２５（ＴＧＦ−β１
　）　、　ｐＧＫＭ　７４０（ＴＧＦ　−β２）および
ｐＧＫ？１１２６（ＴＧＦ−β３）と命名し、これを用
いてコンピテントＥ、コリＹ１０９０細胞（実施例２参
照）を形質転換せしめる。ＴＧＦ−β１゜ＴＧＦ−β２
およびＴＧＦ−β３をコードする正しい挿入断片を含む
クローンを、それぞれＥ、コリＹ１０９０／ｐＧＫＭ　
１２５（ＴＧＦ−β１）、Ｅ、　コリ　Ｙ１０９０／ｐ
ＧＫＭ　７４０（ＴＧＦ−β２）およびＥ、コリＹ１０
９０／ｐＧＫＭ　１２６（ＴＧＦ−β３）と命名する。 Ａ−二１■Ｌ１汰 Ｅ、コリに１２ ＬＣ１３７：　ｈｔｐＲａｓ＋　　ｌｏｎｌｌｇ、　　
１ａＣａ＋ｓ＋　　ｌｌａｌａｍ＋　　ｔｒｐａ＋＊　
　＋ｐ）ｌｏａａ＋　　ｒｓｐＬ、　　ｔｓｘ：：Ｔｎ
１０＋　　５ｕｐｃｔｓ　［Ｇｏｆｆ、　　Ｓ、Ａ。 ら（１９８４）　ＰＮＡＳ旦、　６６４７−６６５１３
゜プｊ」（虹Ｌ ｐＰＬＭｕ　：　　（Ｂｕｅｌｌ、　Ｇ、　　ら（１９
８５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、１３．１
９２３−１９３８３　、このプラスミドは、ファージＭ
ｕ±遺伝子リポソーム結合部位（ＶａｎＬｅｅｒｄａｓ
、　Ｂ、　ら（１９８２）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ号！３．
１９−２８３を有するλバクテリオファージＰｔプロモ
ーターを担持している。 ｐｃＬｓｔ：熱不安定性λＣ１□、リプレッサーをコー
ドし、そしてカナマイシンに対する耐性を付与するプラ
スミド（Ｒｅｓａｕｌｔ、　Ｅ、ら（１９８３）　Ｇｅ
ｎｅη、　１０３−１１３）。 ＳＯＳ゛ル　パ ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯＳ−Ｐ
ＡＧｆｉ　）とタンパク質染色は、Ｍｉｎｉｐｒｏｔｅ
ａｎ　Ｉｆセル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と１閣の厚さの１８
％ポリアクリルアミドゲルを使って、Ｌａｅｍｓｌｉ、
　Ｕ、に、の方法（Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０　６
８５　（１９７０））に従って行う。 ｐＨ１ ２０ｄの培養管中各４０ｊｒｇのアンピシリンとカナマ
イシンを含む７−のＬＢ培地（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１
９８２）　。 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋｌ　（ＬＢ／ａｍｐ／ｋａｎ）に単一
コロニを接種し、そして３０℃で一晩振盪培養する。こ
の−晩培養物５ｄを１００ｄのアーレンマイヤーフラス
コ中の１５ｍ１のＬＢ　／　ａｍｐ　／　ｋａｎに添加
する。このフラスコを４２°Ｃ湯浴振盪器に移す。移動
前に２７の試料を取り（非誘導条件）、そして移動後に
１時間間隔でＩｄの試料を取る（誘導条件）。遠心（エ
ッペンドルフ遠心機中１０．００Ｏｒｐｍで５分間）に
より細胞をペレット化し、上清を捨てる。ペレットをＳ
Ｏ５−ＰＡＧＥ用の試料緩衝液１００ｉ１！中に再懸濁
し、９５°Ｃで１０分間加熱する。５Ｉのアリコートを
ＳＯＳ　−ＰＡＧＥにかける。 コンピテント　　の３袈 コンピテントＥ、コリ細胞は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１
９８２）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、　Ｎｃｖ　Ｙｏｒｋ中に記載の塩化カルシウム法
により調製する。プラスミド匹■８１．を含む細胞を３
０°Ｃで増殖させる。 Ｅ、コリ　Ｙ１０９０／　ｐＧＫＭ　１２５、Ｅ、コリ
　Ｙ１０９０／ｐＧＫＭ　７４０およびＥ、コリＹ１０
９０／ｐＧＫＭ　１２６　（実施例１．０参照）をＬＢ
培地中で増殖させ、そしてＢｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ
，およびＤｏｌｙｔ　Ｈ，（１９７９）　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　’Ｌ　１５１３の方
法により、プラスミドＤＮＡを調製する。 ５鱈のプラスミドＤＮＡを、供給者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ）の指示に従って、５０ｄの制限緩衝液中でＮｅｏ
　ＩとＳａ　Ｅ　Ｉ　（ｐＧＫＭ　１２５）、　Ｎｃｏ
　ＴとＥｃｏＲＶ（ｐＧＫＭ　７４０）、またはＮｃｏ
　Ｉのみ（ｐＧＫＭ　１２６）のいずれかで完全消化す
る。５Ｉの３Ｍ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ
２　ｚ、５ｍＭＥＤＴＡと１５０Ｉｌｌのエタノールの
添加によりＤＮＡを沈澱させる。−７０℃で１５分間イ
ンキュベートした後、５ｏｒｖａｌｌ遠心機中５５３４
０−ター中でペレット化する。上清を捨て、０．２５％
ブロモフエ１３、０００　ｇで１５分間遠心することに
より、ＤＮＡをノールブルーと０．２５％キシレンシア
ツールを含む０．０８９Ｍ　Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩、０．
０８９Ｍホウ酸および０．００２Ｍ　ＥＤＴ八（ＴＢＥ
緩衝液）８０１１１中にペレットを再懸濁させる。ブロ
モフェノールブルーマーカーが長さ１０ｃｍ厚さ０．８
　ｃｍのゲルの底に達するまで、０．５■／Ｉｄの臭化
エチジウムを含むＴＢＥ緩衝液中で１％アガロースゲル
上で５０ボルトにて２０Ｊｌ！試料を４回電気泳動する
。成熟ＴＧＦ−βＩ　、　　ＴＧＰ−β２およびＴＧＦ
−β３それぞれをコードするＤＮＡ断片を短波長ＵＶ光
で視覚化し、レーザーブレードで切り出し、そして２０
０ｍＭを１．５時間適用して５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆
　５ｃｈｉｌｌｌ　Ｂｉｏｔｒａｐ装置においてゲル切
片からＤＮＡ断片を電気溶出させる。溶出したＤＮＡ断
片を沈澱させ（上記参照）、２０１１１ＯＴＥ中に再懸
濁させる。 ５１１ｇのプラスミドｐＰＬＭｕをＮｃｏ　Ｉと５ａｊ
２Ｉ。 Ｎｃｏ　ＩとＥｃｏＲＶ　、またはＮｃｏ　Ｉのみでの
消化により線状化し、そしてＤＮＡ断片について上述し
たようにしてゲル精製する。線状化され精製されたｐ　
Ｐ　Ｌ、Ｍ　ＵベクターＤＮＡ　１１００ｎと３倍モル
当量の各精製ＤＮＡ断片を、１単位のＤＮＡリガーゼ（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を含む連結緩衝液（７０ｎＭ　
Ｔｒｉｓ／　ＩＣｌ　。 ｐＨ７，５，１０ｍＭ　Ｍｇ（／！ｚ　、５ｍＭ　ＤＴ
Ｔ、　０．１ｍＭアデノシン三リン酸）２０Ｉ中で４°
Ｃにて１５分間インキュベートする。 １０Ｊの連結混合物を、プラスミドｐＣＩ　ｓｓｒを含
む冷（４°Ｃ）コンピテントＥ、コリＬＣ１３７２００
ｍに添加する。３０分後、４２°Ｃの湯浴中での１．５
分間のインキュベーションにより、細胞を熱ショックさ
せる。２ｄのＬＢ培地を添加し、そして培養物を３０°
Ｃで６０分間振盪する。アンピシリンとカナマイシンを
含むＬＢプレート上に２００ｄアリコートを塗布し、３
０°Ｃで２２時間インキュベートする。単一コロニーを
培養し、そしてプラスミドＤＮＡを分析する。ｐＰＬＭ
ｕ中のＴＧＦ−β１　、　　ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ
−β３をコードするＤＮＡ断片のサブクローニングによ
り、プラスミドｐＰＬＭｕ、ｈＴＧＦ−β１゜ｐＰＬＭ
ｕ、ｈＴＧＦ−β２およびｐＰＬＭｕ、ｈＴＧＦ−β３
をそれぞれ得る。上記構成物を含むクローンを、Ｅ、コ
リＬＣ１３７／　ｐＰＬＭｕ　、　ｈＴＧＦ−β１．Ｅ
、コリ　ＬＣ１３７／ｐＰＬＭｕ、ｈＴＧＦ−β２およ
びＥ、コリＬＣ１３７／　ｐＰＬＭｕ。 ｈＴＧＦ−β３とそれぞれ命名する。 Ｅ、コリＬＣ１３７／ｐＰＬＭｕ、ｈＴＧＦ−β１．Ｅ
、コリＬＣ１３７／　ＰＰＬＭｕ、　ｈＴＧＦ−β２お
よびＥ、コリＬＣ１３７／ｐＰＬＭｕ、ｈＴＧＦ−β３
細胞を熱誘導しく実施例２．Ａ参照）、そして発現され
たタンパク質をＳＯ５−ＰＡＧＥにより分析する。ＴＧ
Ｆ−β１　、　　ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３は全
て、熱誘導後２時間目に熱誘導タンパク質として出現し
、約１２．０００　Ｄの見かけ分子量と共に移動する。 Ｃ０星ｉ転隻生図光Ｍ ４０■／ｌのアンピシリンとカナマイシンを有する７５
０ｄのＬＢ培地を含む２１のアーレンマイヤーフラスコ
中でＥ、コリ　ＬＣ１３７／　ｐＰＬＭｕ、ｈＴＧＦ　
−β１．Ｅ、コリｔｃ１３７／　ｐＰＬＭｕ、ｈＴＧＦ
−β２およびＥ、コリＬＣ１３７／　ｐＰＬＭｕ、　ｈ
ＴＧＦ−β３の一晩培養物を３０℃で増殖させる。３０
０ｄの一晩培養物を２２のアーレンマイヤーフラスコ中
の上記抗生物質を含む７５０ａｄのＬＢ培地に添加し、
そして６５℃の湯浴中で約３．５分間振盪することによ
り４２°Ｃに加熱する０次いでフラスコを４２°Ｃの振
盪器に移し、３時間インキエベートする。フラスコを水
浴中で１２°Ｃに冷却し、そしてＧＳＡローター（Ｓｏ
ｒｖａ　ｌ　１　）中で８．ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠
心することにより、細胞を捕集する。 成熟ＴＧＦ−β１　、　　ＴＧＦ−β２およびＴＧＰ−
β３のコード配列を、酵母酸ホスファターゼの誘導プロ
モーター（ＰＩ（０５）の支配下でサツカロミセス・セ
レビシェ−（伽ぢ加耶児匹競ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　
中で発現させる。 発現ベクターを次の２段階で作製する：Ａ、プラスミド
ｐＪＤＢ　２０７／ＰＨ０５−ＲＩＴ　１２の作製、Ｂ
、プラスミドｐＪＤＢ　２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＴＧＦ−
β１゜ｐＪＤＢ　２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＴＧＦ−β２お
よびｐＪＤＢ　２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＴＧＦ−β３の作
製、 ここでＡ）は酵母ベクターとＰＲｏ　５転写ターミネー
タ−を提供し、そしてＢ）はＰＨ０５プロモーターの支
配下に成熟ＴＧＦ−β１　、　　ＴＧＦ−β２およびＴ
ＧＦ−β３をコードする挿入断片をぞれぞれ有する発現
カセットを提供する。 Ａ、ブースミ　　ＪＯＢ　２０？　　ＰＨ０５−ＲＩＴ
　１２のプラスミドｐ３１ＲＩＴ　１２（ヨーロッパ特
許出願ＢＰ２７７．３１３）をエンドヌクレアーゼＳａ
ｊ！Ｉでの制限により線状化する。臭化エチジウムの存
在下での部分的旧ｎｄｌ［Ｉ消化は２７６ｂｂのＳａｆ
　Ｉ　／ＢａｍＨ１ｐＢＲ３２２配列、５３４ｂｂの酵
母酸ホスファターゼＰＨ０５プロモーター、酵母インベ
ルターゼシグナル配列（１９アミノ酸をコードする）お
よびＰＨ０５転写ターミネータ−を含んで成るＩＫｂの
Ｓａ　ｉ、　Ｉ　／　Ｈｉｎｄ　ｍ断片を生じる。ｐ３
１ＲＩＴ　１２の１ｋｂＳａｆｌ／旧ｎｄｌＩ［断片を
、５ａｌｌｌと旧ｎｄｌｌｌで切断された酵母−Ｅ、コ
リシャトルベクターｐＪＤＢ２０７（Ｂｅｇｇｓ、　Ｊ
、Ｄ、ＪｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ　　ｉｎ　
　ｙｅａｓｔ、　　Ａｌｆｒｅｄ　　Ｂｅｎｚｏｎ　　
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ１６、　Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、　
１９８１．　ｐｌ）、３８３−３８９）中にクローニン
グする。このｌｋｂ断片を含む生じたプラスミドをｐＪ
ＤＢ２０？／ＰＨ０５−ＲＩＴ　１２と命名する。 プラスミドｐＧＫＭ　７４０（ＴＧＦ−β２）（実施例
１．０参照）をＮｅｏ　Ｉで切断する。クルつＤＮＡポ
リメラーゼとの反応において粘着末端をフィルインする
。ＥｃｏＲＩリンカ−（５’　−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣ
ＧＧ　；　Ｂｉｏｌａｂｓ）を付加し、そして混合物を
連結せしめる。生じた環状プラスミドをｐＧＫＭＡ６６
８　（ＴＧＦ−β２）と命名し、これをＥｃｏＲＩと５
ａｆｌで切断する。０．４ｋｂのＥｃｏＲＩ　／Ｓａ　
ｊ！　Ｉ断片をアガロースゲルから単離し、精製し、そ
して無菌水に２５ａｒ／ｄの濃度で再懸濁する。前記断
片は、成熟ＴＧＦ−β２のアミノ酸Ａｆａ１を定義する
ＧＣＴコドンまでのフレーム内にＡＴＧを有するＴＧＦ
−β２の成熟コード配列を含む。 プラスミドｐ３１ＲＩＴ　１２（上記参照）から５３４
ｂｐのＢａｍＨＩ　／　ＥｃｏＲＩ断片においてＰＨ０
５プロモーターを単離する。プラスミドｐＪＤＢ　２０
７／ＰＨ０５−ＲＩＴ　１２をＢａｗｌ　ＩとＸｈｏ　
Ｉで切断する。大きい方の６．８ｋｂのＢａｍＨＩ　／
　Ｘｈｏ　Ｉ断片を単離する。Ｐ）１０５転写ターミネ
ータ−が該断片上に残る。ＢａｍＨＩ　／　ＥｃｏＲｌ
ＰＨ０５プロモ一ター断片、ＴＧＦ−β２をコードする
ＥｃｏＲＩ　／　Ｓａ　ｌ　Ｔ断片、およびＢａｍＨＩ
　／　Ｘｈｏ　Ｉベクターを連結せしめる。ｐＪＤＢ　
２０７中に反時計方向にクローニングされたＰＨ０５プ
ロモーターの支配下にＴＧＦ−β２遺伝子を有する１つ
の正しいクローンを、ｐＪＤＢ　２０７Ｒ／ＰＨ０５−
ＴＧＦ−β２と命名する。 同様にして、成熟ＴＧＦ−β１とＴＧＦ−β３をＳ。 セレビシェ−（Ｓ、　ｃｅｒｅν１ｓｉａｅ）中で発現
させる。 ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３のコード配列を含有す
るプラスミドは、それぞれｐＧＫＭ　１２５およびｐＧ
ＫＭ１２６である（実施例１．Ｇ参照）。それらのプラ
スミドのＮｃｏ　Ｉでの消化、ＥｃｏＲＩリンカ−の付
加および連結後、生じた環状プラスミドをＥｃｏＲＩと
５ａｊ２１で切断する。ＥｃｏＲＩ　／　Ｓａ　ｌ　Ｉ
断片を上述のようにしてｐＪＤＢ　２０７中にクローニ
ングする。生じたプラスミドを、ｐＪＤＢ　２０７Ｒ／
　ＰＨ０５−ＴＧＦ−β１およびｐＪＤＢ　２０７Ｒ／
　ＰＨ０５−ＴＧＦ−β３と命名する。 Ｃ，Ｓ、セレビシェ−ＧＲＦ１８　　のサツカロミセス
・セレビシェ−（錘昼畑μ県匹腔Ｈｉｎｎｅｎ＋　八、
ら（１９７８）　ＰＮＡＳ　７５．１９２９により記載
された形質転換プロトコルを使って、プラスミド：ｐＪ
ＤＢ　２７０Ｒ／　ＰＨ０５−ＴＣＰ−β１ｐＪＤＢ　
２７０Ｒ／ＰＨ０５−ＴＣＰ−β２およびｐＪＤＢ　２
７０Ｒ／ＰＨ０５−ＴＧＦ−β３により形質転換せしめ
る。形質転換された酵母細胞をロイシン欠損の酵母最少
培地プレート上で選択する。単一形質転換酵母を単離し
、そしてサツカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１８／ｐ
ＪＤＢ　２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＴＧＦ−β１、 サツカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１Ｂ／　ｐＪＤＢ
　２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＴＧＦ−β２および サツカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１Ｂ／　ｐＪＤＢ
　２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＴＧＦ−β３と命名する。 Ｄ、　　Ｓ、セレビシェ−の　　および上述の酵母形質
転換体は、ＰＨ０５プロモーター支配の発現カセットを
有するプラスミドを含み、従ってＴＧＦ−β１　、　Ｔ
ＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３の発現のために該プロモ
ーターの抑制を必要とする。形質転換体を、アミノ酸を
含まないが（ＮＨ４）２ＳＯ４の代わりの１０ｇ／ｌの
し一アスパラギン、１　ｇ／ｌのＬ−ヒスチジンおよび
２０　ｇ　／　ｆのグルコースを含むＤｉｆｃｏ　Ｙｅ
ａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅの調製法に従って
調製された酵母高Ｐ、最少培地中で２つの好結果の予備
培養物（１０ｄと５０戚）を増殖させる。第二の予備培
養物の細胞を０．９％ＮａＣ１中で洗浄し、そして全細
胞を使って、０．０３ｇ／ｆのＫＨｚＰＯａ、１０ｇ／
ｌのＬ−アスパラギン、Ｉｇ／ｌのＬ−ヒスチジンおよ
び２０　ｇ　／　ｆのグルコースを含むＤｉｆｃｏ　Ｙ
ｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ培地（アミノ酸
を含まない）の調製法に従って調製された低Ｐ、最少培
地１００ｄに接種する。培養物を３０°Ｃにて１８０ｒ
ρｍで撹拌する。 ５時間目、２４時間目および４８時間目に３０００ｒｐ
ｏ＋での遠心により１０−の培養物から細胞を捕集し、
そして０．９％ＮａＣ１２中で１回洗浄する。細胞ペレ
ットを溶解緩衝液（６６ｍＭリン酸カリウムｐＨ７，４
，４ｍＭ　Ｚｗｉ　ｔｔｅｒｇｅｎｔ（Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ）　）中に再懸濁させる。８ｇのガラスピース（
直径０．５−０．７５ｍｍ）を添加し、そして冷却下で
Ｖｏｌｔｅｘ　Ｍｉｘｅｒ上で各２分間４〜５回激しく
懸濁液を振盪する。細胞抽出物をデカンテーションし、
ガラスピースを除去する。 ４°Ｃにて３０００ｒｐｍで５分間遠心することにより
、抽出物中の細胞破片を沈降させる。上清とベレットを
分離し、そして−２０゛Ｃで保存する。 二量体の生物活性ＴＧＦ−β２の生産について下記に示
す方法は、二量体の生物活性ＴＧＦ−β１゜ＴＧＦ−β
３および他のｒ　ＴＧＦ−β様タンパク質」の回収にも
同様に適用することができる。 Ａ、　Ｅ　　コリか°の　　　　　ＴＧＦ−２の双 実施例２．　Ｃに記載のようにして、Ｅ、コリＬＣ１３
７／ｐＰＬＭｕ、ｈＴＧＦ−β２細胞を培養する。細胞
破裂および不溶性ＴＧＦ−β２の回収は４℃で行う。 約１８ｇの湿潤細胞を６０１１ｄｌの０．　Ｉ　Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ／　ＨＣｆ　、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　　１
　ｍＭ　ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオリ
ド）、ｐＨ８，３（破裂緩衝液）中に懸濁させる。製造
業者の指示に従って、細胞を２回Ｆｒｅｎｃｈｐｒｅｓ
ｓ（ＳＬＭ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ＋　Ｉｎｃ、）に
通し、そして破裂緩衝液で体積を２００ｄに調整する。 懸濁液を１５，０００ｇで２０分間遠心する。得られた
ペレットを、ＩＭＮａＣｆｆｉを含む破裂緩衝液１００
ｄに懸濁し、そして上記と同様に１０分間遠心する。１
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｐｉｅｒｃｅ）を含む破裂
緩衝液１００ｄにペレットを懸濁し、そして上記と同様
に再び１０分間遠心する。次いで洗浄した細胞を５０ｄ
の２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｊ２　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　
　、　１ｎ＋Ｍ　ＰＭＳＦ　　、　１％ＤＴＴ中に懸濁
し、そしてテフロン製組織粉砕機中でホモジナイズする
。生じた懸濁液は不溶形の粗二量体ＴＧＦ−β２を含有
する。 Ｂ、　　　　　ＴＧＦ−２の可　　と 実施例４．Ａまたは４．Ｃに従って得られたＴＧＦ−β
２懸濁液１０ｄを１０％酢酸でｐＨ２，５に酸性化し、
そして室温で１０分間エッペンドルフ遠心機中で遠心す
る。上清を１０％酢酸中の５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−１
００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　２．６　Ｘ７８ｃ
ｍ）上で１．４ｄ／分の流速でクロマトグラフィー分離
する。１９０分〜２２０分に溶出する単量体の変性ＴＧ
Ｆ−β２を含む画分をプールする。この材料を、生物活
性二量体ＴＧＦ−β２を与えるための再生（実施例４．
Ｇ、Ｊ。 Ｋ、Ｌ参照）、または構造分析用の更なる精製（実施例
４．Ｄ参照）に使用する。 実施例３．Ｄに記載のようにして行った５００Ｉ１１の
発酵から得られた破壊細胞のペレットを、２０ａｆｆｌ
の４Ｍ尿素、０．　ＬＭ　Ｔｒｉｓ　、　１％ＤＴＴＳ
ｐＨ８，０中に懸濁する。５分ごとに間欠渦動撹拌しな
がら３０分間室温に混合物を維持する。４°Ｃにて３０
．０００　ｇで３０分間遠心することにより、不溶物を
除去し、そして上清を酢酸でｐＨ２，５に調整し、４°
Ｃで５％酢酸に対して一晩徹底的に透析する。この溶液
を上記のように遠心し、そして透明な上清を１１０膜（
Ａｓｉｃｏｎ）上での限外濾過により４ｄの最終容量に
濃縮する。次いでこの試料を実施例４．８に記載のよう
にして５％酢酸中で５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−１００
１１Ｒ（Ｐｈａｒｎ＋ａｃｉａ）上でクロマトグラフィ
ー分離し、単量体ＴＧＦ−β２を得る。 Ｄ、ＲＰ−ＨＰＬＣによる　　　ＴＧＰ−２の　なる製 ５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−１００カラムからのプール画
分（実施例４．８）のアリコートをＶｙｄａｃ２１４Ｔ
Ｐ５４１５　ＨＰＬＣ逆相カラム（４，６Ｘ　１５０ｍ
ｍ　、　Ｔｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓＧｒｏｕｐ、
　Ｈｅ５ｐｅｒｉａ、　Ｃ＾、　ＵＳＡ）上で精製する
。カラムを７０％の水中０．１％ＴＦＡと３０％のアセ
トニトリル中０．０８％ＴＦＡの混合物で平衡化し、そ
して５５％の水中０．１％ＴＦＡと４５％の水中０．０
８％ＴＦＡの混合物で終わる３０分間に渡る直接グラジ
ェントにより、１Ｍ１７分の流速にて生成物を溶出させ
る。溶出液を２１６膜ｍでの吸光度についてモニタリン
グし、そしてＵＶ吸光度に従って手動で個々のピークを
集める。変性した単量体ＴＧＦ−β２は２１．５分に溶
出する。分離に使った個々の逆相カラムに応じて、ＴＧ
Ｆ−β２の同一調製物はそれぞれ１６分と１８分付近に
溶出する。 上記と同じカラムと溶媒系を使ったＲＰ　−ＨＰＬＣに
よりＴＧＦ−β２画分を分析する。１００％の水中０、
１％ＴＦＡで始まりそして３０％の水中０．１％ＴＦＡ
と７０％のアセトニトリル中０．０８％ＴＦＡの混合物
で終わる４２分間に渡る直接勾配により、ＴＧＦ−β２
を溶出させる。使用した個々のカラムに応じて、それぞ
れ２９分と２９．９分の保持時間が得られる。 ヒトＴＧＦ−β２　（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ、　Ｈ，ら（
１９８７）　Ｊ。 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６２．１２１２７−１２１３
１）と同じ一次構造を有する化学的に還元された天然ブ
タＴＧＦ−β２（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ　Ｌｉｗ＋１ｔｅｄ、　０ｘｆｏｒｄ、　ＯＫ
）と混合した後、ＴＧＦ−β２を分析する。この混合物
は単一ピークとして溶出し、材料の同一性を確証する。 Ｅ、５Ｏ５−ＰＡＧＥによる　　　ＴＧＦ−２の５ｅｐ
ｈａｃｒｙｌ　Ｓ−１００カラム（実施例４．８）また
は逆相カラム（実施例４．Ｄ）の個々のアリコートを真
空乾燥し、そして１５％ポリアクリルアミドスラブゲル
上での５Ｏ５−ＰＡＧＥ　［Ｌ＃ｍｍ１ｉ、υ、に、　
（１９７０）Ｎａ　ｔｕｒｅ％ぼ、　６８０）により分
析し、クーマシーブルーで染色する。約１２．０００　
Ｄの見かけ分子量の単一バンドが得られ、これは還元さ
れた天然ブタＴＣＰ−β２と識別不可能である。 Ｆ、　　　　　ＴＧＦ−２のＮ　″″アミノ配実施例４
．ＢからのＴＧＦ−β２を真空乾燥し、２５μｌの酢酸
に溶かし、そして気相タンパク質シーケンサー４７０Ａ
型（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でのア
ミノ酸配列決定にかける。 Ｎ末端アミノ酸配列は次のようである：５１〇 へＩａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−へ１ａ−Ｔｙｒ−Ｘ
−Ｐｈｅ−八ｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａ１Ｇｌｎ−へｓｐ−へ
ｓｎ−Ｘ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒ。 配列中Ｘは明確に同定されないアミノ酸を示す。 同様にして、Ｍａｒｑｕａｒｄｔ、　Ｈ，ら（１９Ｂ？
）　Ｊ、Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、２６２．１２１２７　１２１３１により記載
のようにして調製されたＴＧＦ−β２の４−ビニルピリ
ジン誘導体について、Ｎ末端アミノ酸配列を決定する。 Ｎ末端アミノ酸配列は次のようである：ｂ Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｘ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ配列中、
Ｘは明確に同定されないアミノ酸を示す。 システィンはＳ−ピリジルエチルシスティンとして決定
された。 Ｇ、二　　の生　　　ＴＧＦ−２の 実施例４．Ｂからの単量体変性ＴＧＦ−β２３■を１、
４０１＋１ｉ！の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｆｐＨ８，
Ｏ、ＬＭ　ＮａＣ１。 ５ｍＭ　ＥＤＴＡ　　、　２ｍＭ還元型グルタチオン、
１ｍＭ酸化型グルタチオンおよび３３ｄ　Ｃｈａｐｓ（
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中に溶解する。４°Ｃで７２時
間後、溶液のｐＨをＨｉでｐＨ２，５に調整し、そして
Ａｍ１ｃｏｎ撹拌セル中のＹＭＩＯ膜（八ｍ１ｃｏｎ、
　Ｄａｎｖｅｒｓ＋　ＭＡ、　ＵＳＡ）上での限外濾過
により、混合物を１０倍濃縮する。濃縮溶液を１０ｍＭ
ＨＣｊ２で元の容量に希釈し、そして同じ方法により１
０ＩＩｄｌの最終容量に濃縮する。生成した沈澱物を５
０００　ｇでの３０分間の遠心により除去する。上清は
、非還元条件下でのＳＯＳ　−ＰＡＧＥにより評価する
と、ジスルフィド結合した二量体ＴＧＦ−β２を含有す
る。調製物の生物活性を、細胞移動と増殖アッセイ（実
施例５．Ａ）および細胞増殖阻害アッセイ（実施例５．
８）により測定する。 あるいは、塩化ナトリウム濃度が２Ｍであることを除い
て、この実施例に記載の方法を本質的に用いることによ
り、単量体ＴＧＦ−β２を使う代わりに、Ｓ−スルホン
化ＴＧＦ−β２誘導体（実施例４、Ｍ）を二量体の活性
ＴＧＦ−β２の作製に用いる。 二量体ＴＧＦ−β２の精製と単離は、誘導体化されてい
ない単量体タンパク質（実施例４．Ｈと４．■）から作
製された二量体ＴＧＦ−β２と同じ方法で行う。 実施例４．Ｇからの濃縮溶液を、８５％の緩衝液Ａ（２
０ｍＭ酢酸ナトリウム、３０％イソプロパツール、ｐＨ
４，０）と１５％の緩衝液Ｂ　（１Ｍ塩化ナトリウムを
含む緩衝液Ａ）の混合物で平衡化されたＭｏｎｏ　５Ｆ
ＩＲ５１５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にＩｄ／分
の流速で適用する。次いで、２ＢＯｎ＋ｗで読む吸光度
がベースラインに達するまで、緩衝液組成を一定に維持
しながら同じ流速で洗浄し、次いで注入時に平衡条件で
始まりそして５０％緩衝液Ａ１５０％緩衝液Ｂの混合物
で終わる２０分間に渡る直線勾配で溶出させる。二量体
の生物活性ＴＣＰ−β２は、勾配の開始の９分後に溶出
し、そしてこれを手動で集める。 生物活性測定により評価すると、非還元条件下でのＳＯ
５−ＰＡＧＥおよびＲＰ　−ＨＰＬＣは、両分からの流
れの中に二量体ＴＧＦ−β２は全く検出されなかった。 更に、塩勾配によりカラムから溶出された二量体ＴＧＦ
−β２ピークにおけるＳＯＳ　−ＰＡＧＥにより、単量
体ＴＧＦ−β２は全く検出されなかった。 ■、二　　ＴＧＦ　−２の　なる 実施例４．Ｇからの二量体ＴＧＦ−β２を、同容量の水
中０．１％ＴＦＡで希釈し、そして８０％の水中０．１
％ＴＦＡと２０％のアセトニトリル中０．０８％ＴＦＡ
の混合物で平衡化されたＶｙｄａｃ２１４ＴＰ５４１５
カラム（４，６Ｘ１５０　Ｍ　、　Ｔｈｅ　５ｅｐａｒ
ａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ。 ＵＳＡ）上でのＲＰ　−ＨＰＬＣにかける。注入と同時
に平衡条件で始まりそして６０％の水中０．１％ＴＦＡ
と４０％のアセトニトリル中０．０８％ＴＦＡの混合物
で終わる直線勾配により、１Ｉ１１／分の流速でカラム
を溶出させる。溶出液を２１６ｎｍでの吸光度によりモ
ニタリングする。非還元条件下でのＳＯＳ　−ＰＡＧＥ
分析は、約２５ｋＤの見かけ分子量の単一の鋭いバンド
を示した。得られたＴＧＦ−β２は高純度であった。 実施例４．８からの単量体ＴＧＦ−β２を、５０ｍＭ　
’）ン酸ナトリウム（ｐＨ８，０）　、２Ｍ　ＮａＣｊ
！、５＋ｎＭＥＤＴＡ、　２．５　ｍＭシスティン、１
ｍＭシスチンおよび５０ｎ＋Ｍ　Ｃｈａｐｓ（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ）中に０．１ｍｇ／ｄの濃度で溶解させる
。４℃で３００時間後、１０％ＴＦＡでｐＨをｐＨ２，
５に調整する。次に、アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ
と水中０．１％ＴＦＡで順に前処理した３０■／ｄの５
ｅｐｒａｌｙｔｅ　Ｃ−１（分取用、４４０−２Ａｎａ
ｌｙｔｉｃｈｅ　　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｃ１ｔｙ、ＣＡ＋ＵＳＡ）を添加し、そして
混合物を室温で３０分分間中かに撹拌する。新しい前処
理済５ｅｐｒａｌｙｔｅ　Ｃ−１（再生溶液に添加した
量の２０％）で覆ったガラス濾過器上でゲルを濾過する
。ゲルをまず緩衝液Ａ（０，２Ｍ　Ｎａ（、ｅｌｏ、　
１％ＴＦＡ／水）（ゲル体積の５倍）で、次に８０％の
緩衝液Ａと２０％の緩衝液Ｂ（０，０８％ＴＦＡ／アセ
トニトリル）の混合物で洗浄する。７０％の緩衝液Ａと
３０％の緩衝液Ｂの混合物でＴＧＦ−β２を溶出させる
。溶出液を直接Ｍｏｎ。 ＳカラムＨＲ５／　５　（Ｐｈａｒ＋５ａｃｉａ）に適
用する。ＴＧＦ−β２の精製と単離は、それぞれ実施例
４．Ｈと４、１に従って行う。 あるいは、５ｅｐｒａｌｙｔｅ　Ｃ−１ゲルの洗浄とＴ
ＧＦβ２の溶出にそれぞれ使用した緩衝液Ａと緩衝１ｉ
Ｂの中のアセトニトリルをイソプロパツールに置き換え
る。次いで９０％の緩衝液Ａと１０％の緩衝液Ｂの混合
物を用いて洗浄を行い、そして８０％の緩衝液Ａと２０
％の緩衝液Ｂの混合物で始まりそして７０％の緩衝液Ａ
と３０％の緩衝液Ｂの混合物で終わる段階的勾配（２％
緩衝液Ｂの段階）により、ＴＧＦ−β２の溶出を行う。 その先の操作は実施例４、Ｈと４．１にそれぞれ従う。 実施例４．８からの単量体ＴＧＦ−β２を、１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ　　（ｐＨ８，５）　　、　　Ｉ　Ｍ
　　ＮａＣ１、５ｓ＋Ｍ　　ＥＤＴ＾。 １ｍＭ還元型グルタチオン、１ｗＭ酸化型グルタチオン
および５０＋ｍＭ　Ｃｈａｐｓ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｗ
）中に０．５ｍｇ／Ｉｄの濃度で溶解させる。４°Ｃで
４５０時間後、混合物を酢酸でｐＨ４，０に調整し、７
容の２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，０）の添加によ
り希釈し、そしてＭｏｎ。 ＳカラムＨＲ５／　５　（Ｐｈａｒｓａｃｉａ）上にポ
ンプで注入する。その先の操作は実施例４．Ｈと４．１
にそれぞれ従う。 実施例４．８からの単量体ＴＣＰ−β２を、１００ｓ＋
ＭＴｒｉｓ／）ｌｃｊ！　　（ｐＨ８，０）　　、５０
ｗＭ　　Ｃｈａｐｓ　　、０．０５　ｇ　／ｄｌチオレ
ドキシン中に０．０２５■／ｄの濃度で溶解させる。混
合物を４°Ｃで２４時間インキュベートする。 細胞移動および増殖アッセイ（実施例５．Ａ）により測
定した時、再生されたＴＧＦ−β２の収率は、実施例４
．Ｇに記載の方法のものと同様である。二量体ＴＧＦ−
β２の精製と単離は、実施例４．Ｈと４、１に従って行
う。ＴＧＦ−β２は実施例４．ＨのＭｏｎｏ　Ｓカラム
によりチオレドキシンと分離される。 実施例４．８からの単量体ＴＧＦ−β２を室温で６Ｍ尿
素、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣ／！　（ｐＨ８，０）
　、５０ｍＭ亜硫酸ナトリウムおよび０．２　Ｍシステ
ィン中に溶かす。実施例４．Ｄの条件を使ったＲＰ　−
ＨＰＬＣにより、Ｓ−スルホン化ＴＧＦ−β２の形成を
モニタリングする。反応の終了後、ＩＮＨ（１／！によ
り溶液のｐＨをｐＨ２，０に調整する。Ｓ−スルホン化
ＴＧＦ−β２を１０ａ＋Ｍ　ＨＣｌ１中のＦＰＬＣ“高
速脱塩カラム（Ｐａｓ　ｔＤｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏ１
ｕ＋ｍｎ）”　ＨＲＩＯ／　１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）上で脱塩する。二量体の活性ＴＧＦ−β２を与えるＳ
−スルホン化ＴＧＦ−β２の再生は、実施例４．Ｇの方
法に本質的に従って行う。 Ｎ、　　　に　　たたまれたＴＧＦ　−２の実施例４．
ＨのＭｏｎｏ　Ｓカラムに結合しなかった材料に固体の
塩酸グアニジンとＤＴＴをそれぞれ６Ｍと５ｍＭの濃度
になるように添加し、そして固体ＴｒｉｓでｐＨをｐＨ
８，５に調整する。室温で１時間後、実施例４．Ｄと同
じカラムと溶媒系を使ったＲＰＨＰＬＣにかける。還元
された単量体ＴＧＦ−β２を集め、真空中でアセトニト
リルを除去する。次いでこの調製物を直接に、または実
施例４．Ｂまたは４、Ｃから新しく単離された単量体Ｔ
ＧＦ−β２と一緒に、実施例４．Ｇの再生操作にかける
。こうして、再生された活性二量体ＴＧＦ−β２の全収
率を向上させる。 Ｑ、　　　二　　の生　　　　ＴＧＦ−の各々１１２ア
ミノ酸を有するジスルフィド結合した２本の異なるポリ
ペプチド鎖から成る異種二量体ＴＧＦ−βは、等モル量
の２つの各単量体を実施例４．０に記載の再生条件にか
けることにより調製することができる。二量体の精製と
単離は実施例４、Ｈと４．１に従って行い、同種二量体
からの異種二量体形の分離を行うことができる。 ＴＧＦ−β２　： 実施例４．Ｆに記載の９２ｎ　（６，７ナノモル）のＳ
−ピリジルエチル化組換えＴＧＦ−β２を、真空遠心分
離において乾燥し、そして２００ｉｔｌの５ｍＭＨ（／
！に再溶解する。１０ｎ＋Ｍ　Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ
　３−１２洗剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）を含む０、
２　Ｍ　Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ７，８）２００１
１１を添加し、そしてタンパク質溶液と混合する。２．
ｑ（５０μｌの水に溶解された）エンドプロティナーゼ
Ａｓｐ　−Ｎ（シュードモナス・フラギ変異体由来、５
ｅｑｕｅｎｃｅＧｒａｄｅ、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　
Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、　ＦＲＧ）
を用いて３７°Ｃにて開裂を行う。１３時間後、５０ｍ
の１０％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを添加し、そして３５分間に
渡る０、１％ＴＦＡ／水中の５〜４０％（Ｖ／Ｖ）アセ
トニトリルの直線勾配を用い、０．１ｄ／分の流速およ
び２１６ｎｍでのＵＶ検出を用いたＣ４細径カラム（ν
ｙｄａｃ２１４ＴＰ５２．２．１　ｘ　２５０ｍ）上で
のＲＰ−ＨＰＬＣにより、混合物を分離する。収集した
ピークを実施例４．３に記載のプラズマ脱着質量分析法
により分析する。 計算分子量とプロトン化された形のペプチドの測定分子
量（ダルトン、Ｄ）との比較は、次の同定を可能にする
。 １６．１ ２３．９ ２５．９ ２９．０ ３１．２ ３２．１ ３３．０ ５６６．１ １８３２．３ １２９２．５ １３０？、７ １３２０．０ １４２１．１ ３１３２．３ ３６．９ ３４２５．３ ５６４．６ １８３１．１ １２９１．５ １３０６．６ １３１Ｂ、５ １４１９．７ ３１３１．５ ３４２４．９ ４４．５　　　３７３９．５　　　　３７３９．５ＦＫ
Ｒ ＮＴＩＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶＳＱ ＤＡＡＹＣＦＲＮＶＱ ＤＮＣＣＬＲＰＬＹ ＤＴＱＨＳＲＶＬＳＬＹ ＤＮＣＣＬＲＰＬＹＩ ＤＴＱＨ５ＲＶＬＳＬＹＮＴＩＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶ
ＳＱ ＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＮＡＮＰＣＡＧＡＣＰＹＩ
ＪＳＳ ＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＩＧＫＴＰＫＩｆ！ＱＬＳＮＭＩ
ＶＫＳ（ＪＣＳ ＴＧＦ−β１　： ＴＧＦ−β２の消化と同じ方法を使って、３２ｊＩｇ（
２，５ナノモル）のＳ−ピリジルエチル化組換えＴＧＦ
−β１　（Ｓ−ピリジルエチル化組換えＴＧＦβ２と同
様にして調製したもの）を１．５９のエンドプロテイナ
ーゼＬｙｓ　−Ｃで開裂せしめる。ただし、インキュベ
ーション時間は９時間であり、そして９０分間に渡る１
２〜２７％アセトニトリルの直線勾配をＣＩ８カラム（
Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ５２０５．２．　Ｉ　Ｘ５０ｍ）
において使用する。 ９．４ １３．２ ２０．４ ３４．９ ５０．６ ７９．８ ８１０．６ ６１９．２ １５８４．６ １６１３．３ １８６９．８ ２８７５．２ ８７．１ ４１８９．１ ８０８．９ ６１７．７ １５Ｂ３．７ １６１１．９ １８６Ｂ、３ ２８７４．３ ４１８９．０ ８９．８　　　３９６５．０　　　３９６３．７賀ＩＨ
ＥＰＫ ＬＧＷＫ ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＢＫ ＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫ ＮＣＣＶＲＱＬＹＩＤＦＲＫ ＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷＳＬＤＴＱ５Ｋ ＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳＡＡＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰ
ＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫ ＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳＡＡＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰ
ＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫ ＴＧＦ−β３　： ＴＧＦ−β２について記載したのと同様にして、２０ｇ
　（１，４６ナノモル）のＳ−ピリジルエチル化組換え
ＴＧＦ−β３　（Ｓ−ピリジルエチル化組換えＴＧＦ−
β２と同様にして調製したもの）を０．４　ｔｒｙのエ
ンドプロティナーゼＡｓｐ　−Ｎで消化する。ただし、
インキュベーション時間は２２．５時間であり、そして
８０分間に渡る１６〜３２％アセトニトリルの直線勾配
を使ってＣＩ８カラム（Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ５２０５
　。 ２、　Ｉ　Ｘ５０＋＋ｍ）上で分離を行う。 ７．０ ８．８ １１．６ １９．４ ３６．５ １３０８．０ １３８１．０ １２０５．５ １２５２．４ １４２１．５ １５５１．２ ３０３０．４ ３９．８　　　２７Ｂ２，６ ４５．６　　　３４５７．３ ７７．９ ３７２６．５ ８２．６ ６７３６．９ １３０６．６ １３７９．５ １２０６．３ １２５０．４ １４２１．５ １５５１．９ ３０２９．４ ２７８１．２ ３４５６．０ ３７２５．５ ６７３６．９ ＥＮＣＣＶＲＰＩＪ ＤＴＮＹＣＦＲＮＬｆ！ ＤＴＴＨＳＴＶＬＧＬＹ ＤＴＮＹＣＦＲＮＬ ＤＴＴＨ５ＴＶＬＧＬＹＮＴ ＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＶＧＲ ＤＴＴＨＳＴＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶ
ＰＱ ＤＴＮＹＣＦＲＮＬＥＥＮＣＣＶＲＰＬＹＩＤＬＧＷＫ
ＷＶＨＨＰＫＧＹＹＡＮＦＣＳＧＰＣＰＹＬＲ５＾ ＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＱＬＳＮＭＶＶ
ＫＳＣＸＣＳ ＤＴＴＨＳＴＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶ
ＰＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＱＬＳＮＭ
ＶＶＫＳＣＫＣ５実施例４．Ｃからの材料のアリコート
を実施例４．０に記載のようにしてＲＰ　−ＨＰＬＣに
より更に精製し、そして実施例４．Ｆに記載のよ・うに
してＮ末端アミノ酸配列を決定する。 アミノ酸配列は次の通りである： Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ配列
中、Ｘは明確に同定されないアミノ酸を示す。 サツカロミセス・セレビシェ−（釦匹加耶遍匹競ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）中で発現された単量体ＴＧＦ−β２の
再生並びに二量体の生物活性ＴＧＦ−β２の単離は、実
施例４．Ｇ、４．Ｈおよび４．１に記載したように行う
。 Ｓ、二　　ＴＧＦ−２の 実施例４．Ｄおよび４．１において得られた６ｎの単量
体ＴＧＦ−β２のアリコートと２０＃ｇの二量体生物活
性ＴＧＦ−β２のアリコートをそれぞれ２５％酢酸に溶
かし、ニトロセルロースに吸着させ、そしてＢＩＯｌ０
Ｎ２０プラズマ脱着質量分析機（Ａｐｐｌ　ｉｅｄＢｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ
）上で分析する。測定された分子量は次のようであった
。 二量体の生物活性ＴＧＦ−β３を、実施例４．Ａ。 ４、Ｂ　、　４．Ｇ　、　４．Ｈおよび４．１に記載の
ＴＧＦ−β２と同様にして調製する。実施例４．３に記
載したようにして二量体の生物活性ＴＧＦ−β３の分子
量を決定する。測定された分子量は、Ｍ　＝　２５．４
３４．０（全システィンをジスルフィドと仮定した計算
分子量Ｍ　＝２５，４２７．２）である。 このアッセイは、繊維芽細胞におけるＴＧＦ−βの走化
性活性（Ｐｏｓｔｌｅｔｈｗａｉｔｅ、八、Ｅ、ら（１
９Ｂ？）　Ｊ。 Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６５．２５１３に基づいており、Ｂ
ｕｒｋ、　Ｒ。 （１９７３）　ＰＮＡＳ刊、３６９に記載のようにして
行なわれる。 ＴＧＦ−β１　、　ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３の
細胞移動促進活性は、２２時間の培養期間に渡り無血清
培地（ダルベツコ改良イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ）中の
傷ついた単層培養物中に移動する正常Ｂａｊ２ｂ／ｃ　
３Ｔ３繊維芽細胞の数を、ＴＧＦ−β２の不在下で傷つ
いた単層培養物中に移動する繊維芽細胞の数と比較して
測定することにより、アッセイされる。 ＴＧＦ−β１　、　　ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３
の増殖促進活性は、細胞のＤＮＡ合成および細胞分裂に
おける刺激作用により決定される。この活性は、４４時
間の培養期間後に光学顕微鏡下で観察された前記単層培
養物中では明白であり、下記のいずれかにより定量され
る。 （ａ）ＴＧＦ−βの不在下で増殖された培養物中の任意
の与えられた視野においてカウントされた細胞核の数に
比較して、ＴＧＦ−β１．ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−
β３を含む無血清培地中で増殖された前記細胞培養物中
の任意の与えられた視野における細胞核の数をカウント
する； （ｂ）　　ＴＧＦ−βの不在下で増殖された培養物中の
３Ｈ−チミジン取込みの量に比較して、ＴＧＦβ１　、
　　ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３を含む無血清培地
中で増殖された前記細胞培養物中の放射能標識３Ｈ−チ
ミジン取込みの量を測定する。 それらの用量応答実験において、培地１１ｄあたり０．
１〜１１０００ｐの範囲内の完全精製ＴＧＦ−βｌ。 ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３タンパク質（実施例４
、Ｋ）の濃度は、最大の移動および増殖促進応答の５０
％を惹起せしめるのに十分である。 Ｂ、　　　　　　　アッセイ この比色アッセイは、ヒトＡ３７５黒色腫細胞（Ｂｒｏ
ｗｎ＋　Ｔ、Ｊ、　　ら（１９８７）　Ｊ、ｌ＋ｎ＋ｕ
ｎｏ１．１３９．２９７７）の増殖におけるＴＧＦ−β
の阻害作用に基づく。 ＲＰＭ１１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）と５％ウシ胎児血
清を含む平底の９６ウ工ル組織培養プレー１−　（Ｆａ
ｌｃｏｎ）中に、ＴＧＦ−β１　、　ＴＧＦ−β２およ
びＴＧＦ−β３試料を逐次希釈（１：３）する。対照ウ
ェルには培地のみを入れる。各ウェルに１．５Ｘ１０’
個のＡ３７５黒色腫細胞を添加する。５％ＣＯｚ中３７
°Ｃで７２時間のインキュベーション期間後、Ａ３７５
細胞の単層を１回洗浄し、固定し、そしてクリスタルバ
イオレットで１５分間染色する。未結合の色素を徹底的
に洗い流す。染色細胞を３３％酢酸で溶解せしめ、色素
（細胞核に限定されている）を遊離させ、そして０１ｉ
ｖｅｔｔｉ　Ｍ２４ＰＣを備えたＭｕｌｔｉｓｋａｎ−
８ＣｈａｎｎｅｌＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて５９０
ｎｍでＯＤを測定し、テスト化合物の活性を計算する。 各ウェル中の染色強度は核の数（従って細胞の数）に比
例するので、この方法は、ＴＧＦ−β１　、　　ＴＧＦ
−β２およびＴＧＦ−β３の抗増殖作用を測定するため
の比色ア・ンセイを提供する。 ０．００Ｌ〜１０ｎＨの濃度範囲に渡る精製ＴＧＦ−β
１゜ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３での処理は、Ａ３
７５黒色腫細胞の増殖を阻害する。 裏施去ｌ：　　　れたＴＧＦ−１、７ＧＦ−２お創傷治
癒過程は、年齢の増加と共にそこなわれるようになり（
Ｇｒｏｖｅ、　Ｇ、Ｌ、（１９８２）　Ａｒｃｈ、Ｄｅ
ｒｓ＋ａｔｏｌ。 Ｒｅｓ、２７２　：　３８１）　、従って老人医学の分
野における主な課題を示す。よって、再生された活性二
量体ＴＧＦ−βの部分的厚さの創傷（第２度の火傷から
生じる）における生体内生物学的効果を、５ｃｈｕｌｔ
ｚ。 Ｇ、Ｓ、ら（１９８７）　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３５　
：　３５０により記載されたものと同様な下記のプロト
コルを使って、部分的に欠損したまたは損われた創傷回
復状況において、即ち老齢動物において調べた。 前もって背中をそり、市販のクリーム型脱毛剤によって
脱毛した麻酔された老齢のＣ５７／ＢＬ　６マウス（４
５０日齢以上）の背側の胸郭に、水浴中で８０°Ｃに平
衡化されている真ちゅう型板（ｌｘｌｃｍ、８ｇ）の１
回の１０秒適用により、単一の背中火傷を作る。生じた
水剤を外科的に除去し、そして様々な量（５００ｎｇ、
　　１１００ｎまたは１０ｎｇ）の再生された活性二量
体ＴＧＦ−β形を含む２５Ｊの無菌賦形剤緩衝液（１（
１ｗＭヒスチジン、１４０ｄ　Ｎａ１ｌ、ｐＨ７，４の
溶液中に０．８％（Ｗ／Ｖ）のヒドロキシプロピルセル
ロースを含む〕の局所適用により、または緩衝液のみの
局所適用により、５日間毎日火傷を処置するか、あるい
は処置しないでおく。局所適用される材料は全て無菌で
あり、エンドトキシン不含であり、且つ発熱物質不合で
ある。全てのマウスは実験期間中側々にカゴに入れられ
る。各実験グループは５匹の動物から成る。 ＴＧＦ−βでの処理の５日後、マウスを麻酔し、水剤（
もしあれば）を火傷から外科的に除去し、そして火傷を
撮影する０表皮を再生している火傷の領域を一定の厚さ
の透明な頭上投影機用フィルム上に輪郭を描き、そして
治癒したもとの火傷領域の割合を面積計により計算する
。実験期間の間未処理のままにしておいた同等の背中火
傷を有する若齢（５６−８４日齢）のＣ５７／ＢＬ　６
マウスにおける表皮再生過程とも結果を比較する。 再生された二量体活性ＴＧＦ−β２を使ったそのような
実験の例を下表に示す０表中の数値は、グループ評価の
平均と範囲を表わす。 ■　　　老齢　　　５００　　　　　５９±８２　　　
老齢　　　１００　　　　　５５±６３　　　老齢　　
　１０４６±７ ４　　　老齢　　緩衝液のみ　　　１０±９５　　　老
齢　　未処理　　　　　１６±６６　　　若齢　　未処
理　　　　　６６±９上の表に示される面積分析の結果
は、適当な賦形剤緩衝液中の再生された活性二量体ＴＧ
Ｆ−β２の５日間の毎日の局所適用が、賦形剤緩衝液の
みまたは未処理の創傷（それぞれグループ４と５）と比
較した時、用量依存形式において（グループ１〜３）、
老齢マウスの部分的厚さの創傷における表皮再生を促進
することを示す、若齢マウスは、ＴＧＦ−βの局所適用
なしでも創傷を好結果に再表皮形成するのに十分な能力
があるらしい（グループ６、）、ＴＧＦ−βで処理され
た創傷における６日目の組織学的分析は、再生表皮の角
化と共に再表皮形成過程の増大の程度を明らかにする。 Ｂ、　軌−ットにおける　　な　さの　　の。 第二に、再生された活性二量体ＴＧＦ−βの生物学的効
果を、Ｍｕｓｔｏｅ、　Ｔ、＾、ら（１９Ｂ？）　５ｃ
ｉｅｎｃｅ　２３７　：１３３３に記載されたものと同
様な下記プロトコルを使って、創傷修復の生体内モデル
において、即ち成体ラットの十分な厚さの創傷（外科的
切開により形成される）の治癒において調べる。 背中を前もってそり、そして市販のクリーム型の脱毛剤
により脱毛し、ベンドパルビトン麻酔した雄Ｗｉｓｔａ
ｒラット（３００−３５０ｇ　）の背側正中線の両側に
１．５Ｃ■の手術用ハサミを用いて単一の十分な厚さの
長さ５ｃｍの直線切開部を作る。実験グループにおいて
、左側切開部の縁（背側で見ると一番上）に、様々な量
Ｃ２ｎ、１ｇ、０．１ｇまたは０．０１ｇ）の再生され
た活性二量体ＴＧＦ−β形を含む無菌賦形剤緩衝液（１
０ｍＭヒスチジン、１４０ｄＮａＣｊ！、　ｐＨ７，４
の溶液中に０．８％（Ｗ／Ｖ）（７）ヒドロキシプロピ
ルセルロースを含ム）　　１００ｍ（７）　−回局所適
用を与える。対何の右側切開部の縁に前記賦形剤緩衝液
中の対応する等量のプラシーボ対照（ウシ血清アルブミ
ン）を与え、そして対照動物の切開部の縁には左側切開
部に賦形剤緩衝液のみを与え、右側切開部には外科切開
後全く処置を与えない。局所適用される材料は全て無菌
で、エンドトキシン不合で且つ発熱物質不合である。各
創傷の縁を、５等分された、中断された５−ＯＥｔｈｉ
ｌｏｎの水平さし縫い縫合で縫合する。全動物を別々に
カゴに入れ、そして処置後２１日以内の様りな期間に渡
り創傷を治癒せしめる。犠牲後、各動物から全ての背側
皮膚を除去し、そして手術用メスを使って各々の皮膚の
下側から全皮下脂肪を注意深く切開する。２枚の平行手
術用ブレード（ブレード間間隔８ｍ［Ｉｌ）から成る型
板を用いて、引張強さの測定のために皮膚のストリップ
（各切開上の縫合の間）を切除する。組織学的分析のた
めに各切開部の一端から試料を得る。切除された各皮膚
試料により許容される最大荷重を、万能引張強さ測定装
置１４４５０１型（Ｚｗｉｃｋ、　Ｕｌｍ、　ＦＲＧ）
で測定する。油圧型締装置間に固定され、次いで１０ｍ
ｍ／分の速度で破断点まで引張られる３０ｍｍｘ８ｇの
ストリップにおいて測定を行い、チャートレコーダー上
で最大荷重を記録する。測定は各創傷からの３重反復試
料において行い、そして実験グループは４匹の動物から
成る。破断強さは、感染の証拠または過度の出血を示す
創傷（全創傷の３％未満）においては測定しない。再生
された二量体活性ＴＧＦ−β２を使ったそのような実験
の例を下表に示す。表中示された数値は、２１日間に渡
る等間隔の３つの時点における、ＴＧＦ−β２で処理さ
れた創傷とプラシーボで処理された創傷との引張強さの
平均比を表わす。 １　　　　　　　２．００　　　　１．９：１　　１．
７：１２　　　　　　　１．００　　　　１．８：１　
　１．４：１３　　　　　　　０．１０　　　　１．４
：１　　１．３：１４　　　　　　　０．０１　　　　
１．２：１　　１．１：１１．４　＝ １．３　： １．２　＝ １．０　： （＊賦形剤緩衝液のみの処理対未処理の比）上の表に示
される引張強さの測定結果は、対照グループ（グループ
５）と比較した時、適当な賦形剤緩衝液中の再生された
活性二量体ＴＧＦ−β２の一回局所適用が、２１日間に
渡り用量依存形式（グループ１〜４）において成熟ラッ
トの十分な厚さの切開創傷の破断強さを２倍まで増加さ
せ、そして該創傷の治癒を促進することを証明する。 組織学的分析は、対照の創傷と比較して、ＴＧＦ−β処
理された創傷において、２１日間に渡り単核細胞の流入
、繊維芽細胞およびコラーゲンの生産の顕著な増加を明
らかに示す。−時的な角質増殖も、ＴＧＦ−βで処理さ
れた創傷において処理後１４日目止で明白である。 Ｃ０ラットにおける　　チャンバー　　　モヱ水 第三に、再生された活性二量体ＴＧＦ−βの生物学的効
果を、創傷修復の生体内モデルにおいて、即ち、５ｐｏ
ｒｎ＋　Ｍ、Ｂ、　　ら（１９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ
　２１９　：　１３２９により記載されたのと同様なプ
ロトコルに基づいて、成体マウスにおける多孔性チャン
バー移植片の中および周囲の繊維状肉芽組織の形成、細
胞成長および血管新生に関して調べる。 規則的な間隔において約２５０個の穴（直径１ｍｍ）が
あけられそして各端が同材料の着脱可能な蓋で閉じられ
た中空硬質ポリテトラフルオロエチレンチューブ（内径
１０Ｍ外径１２ＩＩＩＩＩｌ；長さ３２ｍ）をガス滅菌
し、そしてベンドパルビトン麻酔された成体Ｗｉｓｔａ
ｒラット（３５０−４００ｇ　）の背面側腹部中への小
さな切開により、左右対称方式において、外科的に皮下
挿入する。１つのガス滅菌済組織ケージを各側腹部に移
植し、１つの手術用クリップ（Ｃ１ａｙ−Ａｄａｍｓ　
Ａｕｔｏ−Ｃ１ｉｐｓ、　９　ｆｆＩｍ）で切開部を閉
じ、手術後５日目にこれを除去する。外科的切開後、チ
ャンバー自体の内部には細胞が比較的不足しているけれ
ども、チャンバーは繊維状肉芽組織で取り囲まれるよう
になる。このモデルは、各チャンバー内部の無菌の限定
された閉鎖空間を提供し、創傷治癒応答の様々なパラメ
ーターを定量することができる。動物はチャンバーの移
植後１４４日目、外科的切開の十分な治癒後に実験に用
いられる。 この時点で、様々な量（１ｐｇ　、　０．１　ｔｔｇま
たは０．０１Ｊｒｇ）の再生された活性二量体ＴＧＦ−
β形を含有する１００１１１の無菌賦形剤緩衝液（１０
ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ７，４（
７）溶液中ニ０．５％Ｗ／■のヒドロキシプロピルセル
ロースを含む）を左側のチャンバー（背側から見て上）
に直接毎日注射する。右側のチャンバーには、対応する
等量の前記賦形剤緩衝液中のプラシーボ対照（ウシ血清
アルブミン）を与える。対照動物には左側のチャンバー
に賦形剤緩衝液のみを与え、一方布側のチャンバーは実
験期間中未処理のままにする。実験グループは５匹の動
物から成る。注射は５日間１日１回行われ、そして全て
の注射材料は無菌であり、エンドトキシン不含であり且
つ発熱物質不合である。動物は全て実験期間中漬々にカ
ゴに入れ、最後の注射の２４時間後に犠牲にする。次い
で無菌法により各動物からチャンバーを取り出し、そし
て各チャンバーの内側からの繊維状肉芽組織の「湿潤」
重量をはかる。チャンバー液中の全血清タンパク質は、
Ｌｏｗｙら（１９５１）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１
９３　：２６５の方法を使って評価する。組織学的分析
のために、各チャンバーの内側と外側の繊維状組織の試
料を調製する。チャンバー内容物の無菌状態は、チャン
バー液試料を脳／心臓注入プレート上で３７°Ｃにて７
２時間インキュベートすることによりチエツクする。感
染または拒絶の証拠を示すチャンバーにおいては測定を
行わない（全チャンバーの３％未満）。 再生された二量体活性ＴＧＦ−β２を使ったそのような
実験の例を下表に示す。表中与えられている数値は、各
動物グループからの５つの左右チャンバーペアにおいて
得られたタンパク質測定の平均比（左対右）を示す。 １　　　　　　　１．００　　　　　　　　３．０　　
：　　１２　　　　　　　０．１０　　　　　　　　２
．５　　：　　１３　　　　　　　０．０１　　　　　
　　　２．１　　：　　１４　　　　　　なし”　　　
　　　１．０：１１．５　： １．４　： １．３　： １、Ｏ＝ ＊賦形剤緩衝液のみの処理対未処理の比上表に示された
タンパク質測定の結果は、適当な賦形剤緩衝液中での５
日間に渡る毎日の再生された活性二量体ＴＧＦ−β２の
局所注射が、対応する等量のブラシーボタンバク質を与
えられた右側の対側性チャンバーに比較した時、左側の
チャンバーにおいて、用量依存形式において、全繊維状
組織の蓄積を３倍まで増加させることを証明している。 ＴＧＦ−β２での複数回注射後、左側のチャンバーにお
いて血清タンパク質の量の小さい用量依存性増加も観察
される（グループ１〜３）。対照グループでは左側と右
側のチャンバー間に明白な相違はない。 グループ１〜３の動物の死後の生検において、左側のＴ
ＧＦ−β処理チャンバーが、プラシーボ注射のみを受け
た右側の対側性チャンバーよりも、体壁の周囲結合組織
に堅固に付着していることが一貫して観察される。更に
、組織学的分析は、ＴＧＦ−β処理チャンバーを取り囲
む繊維状組織の厚さと血管分布が、プラシーボ処理チャ
ンバーを取り囲む組織のそれよりも著しく大きいことを
示す。ＴＣＰ−β処理チャンバーの内側の繊維状組織内
には、移動している繊維芽細胞と単核細胞のシートがは
っきり見える。対照グループ（グループ４）においては
、チャンバーを取り囲む繊維状組織の厚さと血管分布、
および体壁の結合組織へのチャンバーの付着の程度のい
ずれにおいても、全く明らかな相違は観察されない、そ
れらの結果は、チャンバーからのＴＧＦ−βの拡散が観
察される効果の差の原因であることを示唆する。　　Ｔ
ＧＦ−β処環チャンバーの血清液中には、優勢的にマク
ロファージから成る炎症細胞の無菌浸潤が認められ、−
力対側性のプラシーボ処理チャンバー液は多形核白血球
の優勢を示す。実施例中に示したグループ１〜４におけ
る全４０個のチャンバーの内容物は、チャンバー内容物
の試料を脳／心臓注入プレート上で３７°Ｃにて７２時
間インキュベートした後、無菌であることが判った。 実Ｊ１１Ｌ：医１１■良覚 Ａ、クリーム 成分 ソルビタンモノステアレート ％（Ｖ／Ｖ） ２．０ セチルアルコール　　　　　　　　５．０軽流動パラフ
イン　　　　　　　　８，０イソプロピルミリステート
２．０ 活性成分（ＴＧＦ−β様タンパク質＞　　　１．０ＸＩ
Ｏ−’プロピレングリコール　　　　　　２．０グリセ
リン　　　　　　　　　　２．０脱イオン水　　　　　
　　　　　　７６．０防腐剤および他の安定剤　　　　
　通　量水相を５５−６０°Ｃに加熱し、その中に活性
物質を溶解させ、そして激しい撹拌により融解脂質相を
その中に分散させる。室温に冷却し、そしてホモジナイ
ズする。 同様にして、ｏ、ｏｉ〜２０ｔｔｇ／ｌｄを含むクリー
ムをそれぞれ製造することができる。 二のクリーム１００Ｊ１１／ＣＴＡ創傷を適用する。 Ｂ、軟−Ｉ 成分　　　　　　％（Ｖ／Ｖ） ソルビタントリオレエート５．０ 微結晶ワックス　　　　　　　　　３．０軽流動パラフ
イン　　　　　　　　９．０イソプロピルミリステート
　　　　１０．０ラノリンアルコール　　　　　　　　
３．０活性物質（ＴＧＦ−β様タンパク質）　　　ｌ０
ＸＩＯ−’プロピレングリコール　　　　　　２．０グ
リセリン　　　　　　　　　　２．０含水硫酸マグネシ
ウム　　　　　　０．７脱イオン水　　　　　　　　　
　６５．３防腐剤　　　　　　　　　　　　　適　量中
やかに加熱しながら、活性物質を水相に溶解させ、そし
て融解した脂質相中にこの溶液を分散させる。室温に冷
却し、そしてホモジナイズする。 同様にして、０．０１〜２０ｎ／ｄを含む軟膏を製造す
ることができる。この軟膏１００ｍ／ｄ創傷を適用する
。 Ｃ６非径旦産撒 成分 活性物質（ＴＧＦ−β様タンパク質）　　０．０５■／
ｄ±ヒト血清アルブミン　　　　　　１　■／ｄアルギ
ニンまたはグリシン　　　　２０　　■／ｄ±炭水化物
　　　　　　　　　５−２０　■／　ｍ１ｐＨ７ 炭水化物はグルコース、マンノース、デキストラン、ヒ
ドロキシエチルスターチまたはそれらの混合物である。 ｐＨはリン酸、コハク酸、アミノ酸またはそれらの混合
物で調整される。 ０．０５■のＴＧＦ−β様タンパク質１０．５ｄを有す
るバイアルを作り、そして凍結乾燥する。 遊生■■寄升 次の微生物をＤｅｕｔｃｈｅ　Ｓａ＋ｕａｕｌｕｎｇ　
ｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ　；　
Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　ｌｂ。 Ｄ−３３００Ｂｒａｕｎｓｃｈｌｌｅｉｇ、　ＦＲＧ）
に寄託した。 微生物 Ｅ、ｃｏｉｌ　ＬＣＩ３７／ｐＰＬＭｕ、ｈＴＧＦ−β
ＩＥ、ｃｏｉｌ　ＬＣ１３７／ｐＰＬＭｕ、ｈτｃｐ−
β２Ｅ、ｃｏｉｌ　ＬＣ１３７／ｌｌＰＬＭｕ、ｈＴＧ
Ｆ−β３Ｓａｃｃｈａｒｏｓ　　ｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ　　ＧＲＦ１８寄託日 １寄託臼年１１月２８日 １９８９年１１月２８日 １９８９年１１月２８日 １９８６年３月４日 登録番号 ＤＳＭ　５６５６ ＤＳＭ　５６５７ ＤＳＭ　５６５８ ＤＳＭ　３６６５

【配列表】

配列番号＝１ 配列の長さ：３３９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起　源：ヒトｃＤＮＡ 直接の起源 クローン名：Ｅ、コリ　ＬＣ１３７／　ｐＰＬＭｕ、ｈ
ＴＧＦ−β１　（ＤＳＭ５６５６）配列の特徴 特徴を表す記号：　ＣＤＳ 存在位置：１．．３３６ 特徴を決定した方法二Ｅ 配列 配列番号：２ 配列の長さ：３３９ 配列の型：核酸 鎖の数二二本鎖 トポロジー：直鎖状 起　源：ヒトｃＤＮＡ 直接の起源 クローン名：Ｅ、コリ　ＬＣ１３７／　ｐＰＬＭｕ、ｈ
ＴＧＦ−β２　（ＤＳＭ５６５７）配列の特徴 特徴を表す記号：　ＣＤＳ 存在位置：　１．．３３６ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列番号：３ 配列の長さ：３３９ 配列の型：核酸 鎖の数二二本鎖 トポロジー：直鎖状 起　源：　ヒ　トｃＤＮへ 直接の起源 クローン名：Ｅ、コリ　ＬＣ１３７／　ｐＰＬＭｕ　、
　ｈＴＧＦ−β３　（０ｍＭ５６５８）配列の特徴 特徴を表す記号：　ＣＤＳ 存在位置：１．．３３６ 特徴を決定した方法：Ｅ ｏ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　　ＴＧ
Ａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生物学的に活性な二量体の形質転換増殖因子β型（
   ＴＧＦ−β）様タンパク質またはその塩の製造方法であ
   って、変性した単量体形の前記ＴＧＦ−β様タンパク質
   を再生条件にかけることを含んで成る方法。 ２、前記再生条件が可溶化剤を含んで成る、請求項１に
   記載の方法。 ３、前記可溶化剤が、穏和な洗剤、水混和性有機溶媒も
   しくはリン脂質、またはそのような剤の２種以上の混合
   物から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。 ４、単量体形の前記ＴＧＦ−β様タンパク質が、次の段
   階： （ａ）前記タンパク質が発現されるような発現調節配列
   に適切な読み枠において連結されたＴＧＦ−β様タンパ
   ク質をコードするヌクレオチド配列を含む微生物宿主を
   培養し、そして （ｂ）変性された可溶性単量体形において前記ＴＧＦ−
   β様タンパク質を回収する、 により製造される、請求項１に記載の方法。 ５、前記単量体ＴＧＦ−β様タンパク質が微生物宿主中
   に不溶性凝集体として存在し、そして前記方法が次の段
   階： （ａ）ＴＧＦ−β様タンパク質を含有する水不溶性タン
   パク質画分を宿主細胞から単離し、そして（ｂ）ＴＧＦ
   −β様タンパク質を可溶化させる、を更に含んで成る、
   請求項４に記載の方法。 ６、前記微生物宿主が酵母または細菌である、請求項４
   に記載の方法。 ７、前記ヌクレオチド配列が、ヒトＴＧＦ−β１，ＴＧ
   Ｆ−β２およびＴＧＦ−β３から成る群から選択された
   タンパク質をコードする、請求項４に記載の方法。 ８、前記不溶性凝集体が約１〜約４のｐＨにおいて可溶
   化され、そして生成した単量体ＴＧＦ−β様タンパク質
   がクロマトグラフィーにより精製される、請求項５に記
   載の方法。 ９、前記不溶形のＴＧＦ−β様タンパク質が約２．５の
   ｐＨにおいて可溶化される、請求項８に記載の方法。 １０、前記不溶性凝集体がカオトロピック剤により可溶
   化される、請求項５に記載の方法。 １１、前記カオトロピック剤として尿素または塩酸グア
   ニジンが用いられる、請求項１０に記載の方法。 １２、前記カオトロピック剤が約４〜約９Ｍの濃度を有
   する、請求項１１に記載の方法。 １３、前記カオトロピック剤として洗剤が用いられる、
   請求項１０に記載の方法。 １４、前記単量体が、約６〜約１０のｐＨおよび約０℃
   〜約３７℃の温度における可溶化剤の存在下での低分子
   量スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系を含んで成
   る再生条件にかけられる、請求項２に記載の方法。 １５、前記スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系が
   、約１〜１００ｍＭの濃度における酸化型と還元型のグ
   ルタチオン、酸化型と還元型のジチオトレイトール、酸
   化型と還元型のβ−メルカプトエタノール、シスチンと
   その還元型、およびシスタミンとその還元型から成る群
   から選択され、酸化型と還元型のモル比が１００：１〜
   １：１００である、請求項１４に記載の方法。 １６、前記スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系が
   約１〜１０ｍＭの濃度における酸化型と還元型のグルタ
   チオンであり、酸化型と還元型のモル比が６：１〜１：
   ６である、請求項１４に記載の方法。 １７、前記低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド酸化
   還元系が約１０〜１０００μｇ／ｍｌの濃度におけるチ
   オレドキシンまたはジスルフィドイソメラーゼにより置
   き換えられる、請求項１４に記載の方法。 １８、前記低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド酸化
   還元系が約５０〜２００ｎ／ｍｌの濃度におけるチオレ
   ドキシンにより置き換えられる、請求項１７に記載の方
   法。 １９、前記可溶化剤が穏和な洗剤である、請求項３に記
   載の方法。 ２０、前記穏和な洗剤が非イオン性、イオン性または両
   性イオン洗剤である、請求項１９に記載の方法。 ２１、前記洗剤が、約１〜１００ｍＭの濃度におけるス
   ルホベタイン、３−（３−クロラミドプロピル）ジメチ
   ルアンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−
   クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロ
   キシ−１−プロパンスルホネート、ジギトニン、コール
   酸塩およびデオキシコール酸塩から成る群から選択され
   る、請求項１９に記載の方法。 ２２、前記洗剤が、約３０ｍＭ〜約６０ｍＭの濃度にお
   ける３−（３−クロラミドプロピル）ジメチルアンモニ
   オ−１−プロパンスルホネートである、請求項１９に記
   載の方法。 ２３、前記可溶化剤が水混和性有機溶媒である、請求項
   ３に記載の方法。 ２４、前記水混和性有機溶媒が、約１０〜５０容量％の
   濃度におけるアセトニトリル、低級アルカノールまたは
   低級アルカンジオールである、請求項２３に記載の方法
   。 ２５、前記可溶化剤がリン脂質である、請求項３に記載
   の方法。 ２６、前記リン脂質が、０．１〜５ｍｇ／ｍｌの濃度に
   おけるホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジ
   ルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジル
   イノシトールから成る群から選択される、請求項２５に
   記載の方法。 ２７、前記ｐＨが約８．０でありそして前記温度が約４
   ℃である、請求項１４に記載の方法。 ２８、前記再生条件が約０．０１〜１００μＭの濃度の
   金属イオンを更に含んで成る、請求項１４に記載の方法
   。 ２９、前記金属イオンがＣｕ＾２＾＋またはＦｅ＾３＾
   ＋である、請求項２８に記載の方法。 ３０、前記緩衝液系に更にＯ＿２がバブリングされる、
   請求項１４に記載の方法。 ３１、前記スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系が
   約１〜１０ｍＭの濃度の酸化型と還元型のグルタチオン
   であり、ここで酸化型と還元型のモル比が１：１〜１：
   ２であり、そして前記可溶化剤が約３０ｍＭ〜約６０ｍ
   Ｍの濃度の３−（３−クロラミドプロピル）ジメチルア
   ンモニオ−１−プロパンスルホネートである、請求項１
   ４に記載の方法。 ３２、得られた前記二量体タンパク質がクロマトグラフ
   ィーにより精製される、請求項１に記載の方法。 ３３、請求項１の方法により製造された生物学的に活性
   な二量体ＴＧＦ−β様タンパク質。 ３４、単量体のＳ−スルホン化ＴＧＦ−β様タンパク質
   。 ３５、生物学的に活性な二量体ＴＧＦ−β様タンパク質
   の製造に用いられる単量体のＳ−スルホン化ＴＧＦ−β
   様タンパク質。 ３６、請求項１の方法により製造された生物学的に活性
   な二量体ＴＧＦ−β様タンパク質の有効量を含んで成る
   医薬組成物。 ３７、創傷の治療、骨および組織修復において、骨髄保
   護剤もしくは心臓保護のメディエーターとして、または
   哺乳動物におけるガンの治療のための医薬製剤の製造の
   ために、あるいは抗炎症または免疫抑制製剤の製造のた
   めに、適当量においておよび適当な医薬製剤において使
   用される、請求項１の方法により製造された生物学的に
   活性な二量体ＴＧＦ−β様タンパク質。