BRPI0613653A2 - composições e métodos para desagregação de proteìna - Google Patents

Abstract

COMPOSIçõES E MéTODOS PARA DESAGREGAçãO DE PROTEìNA Composições e métodos são providos para obtenção da desagregação das proteínas de ligação incluindo, porém não limitado aos ligantes de proteína, receptores solúveis anticorpos, fragmentos de anticorpos, anticorpos de cadeia simples de fragmento variável (scFv), e produtos imunofarmacêuticos modulares pequenos (produtos SMIPTM) As composições, que são apropriadas para a desagregação de soluções altamente concentradas de proteínas de ligação, contêm um ou mais caótropos, são tipícamente formuladas em um pH ácido e podem ser usadas para prover proteínas de ligação apropriadas para a preparação de composições farmacêuticas e administração in vivo a um paciente.

Description

"COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA DESAGREGAÇÃO DE PROTEÍNA"

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere aos campos da quími-ca da proteína e tecnologia de DNA recombinante. Mais espe-cificamente, a presente invenção provê composições e métodospara obtenção da desagregação das proteínas de ligação in-cluindo, porém não limitado aos ligantes de proteína, recep-tores solúveis, anticorpos, fragmentos de anticorpo, anti-corpos de cadeia simples de fragmento variável (scFv) e pro-dutos imunofarmacêuticos modulares pequenos (produtosSMIP™).

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

Metodologias de DNA recombinante permitem a produ-ção em grande escala de proteínas construídas geneticamente.Tais metodologias para produção de proteínas recombinantessão bem conhecidas na arte. Tipicamente, um segmento de DNAcodificando uma proteína específica é inserido no microorga-nismo hospedeiro e o microorganismo transformado cresce sobcondições que induzem a expressão heteróloga da proteína.

De modo geral, contudo, as proteínas heterólogasexpressas nas bactérias, tipicamente E.coli, não são biolo-gicamente ativas porque elas não se multiplicam na estruturaterciária apropriada, ao invés disso, formam agregados gran-des de proteína inativa referidos como corpos de inclusão.Os corpos de inclusão também podem ser causados pela forma-ção de ligações de dissulfeto intermoleculares covalentesque ligam várias moléculas de proteína para formar complexosinsolúveis. As etapas devem ser realizadas para desnaturar eredobrar as proteínas para restaurar a atividade biológica.

Além da expressão nos microorganismos, existemtambém metodologias para expressão de proteínas recombinan-tes nas células eucarióticas, incluindo levedura, células deinsetos e uma grande variedade de células de mamíferos. In-dependente das células usadas para expressão gênica, contu-do, as proteínas recombinantes sintetizadas devem ser envol-vidas e conjugar em uma estrutura terciária, a fim de possu-ir atividade biológica.

É bem entendido que uma família de proteínas refe-ridas como proteínas auxiliares de dobramento molecularessão necessárias para mediar o processo de dobramento. Na au-sência da proteína auxiliar de dobramento molecular apropri-ada, proteínas recombinantes expressas recentemente se agre-gam, pelo que, prevenindo a formação de proteínas funcio-nais. Goloubinoff e outros, Nature 342:884-889 (1989) eWelch, Scientific American 56-64 (Maio de 1993) . A despeitoda existência das proteínas auxiliares de dobramento, a a-gregação da proteína ainda ocorre in vivo e pode, de fato,contribuir para ou causar vários estados de doença, tais co-mo, síndrome de Down, doença de Alzheimer, diabetes e cata-ratas. De Young e outros., Accounts of Chemical Research26:614-620 (1993); Wetzelf TIBTECH 12:193-198 (1994); eHaass and Selkoe, Cell 75:1039-1042 (1993).

Uma ampla faixa de proteínas recombinantes inclu-indo enzimas e proteínas de ligação, tais como, anticorpos,fragmentos de anticorpos, scFv e produtos de SMIP™ são sus-cetíveis a perda da atividade e/ou à formação de agregadossolúveis ou insolúveis, tais como, trimeros e polímeros su-periores, nas soluções aquosas, quando armazenados em tempe-raturas baixas (isto é, abaixo de 0°C), e quanto submetidosa ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. A a-gregação da proteína é de importância maior para a indús-tria de biotecnologia, em razão da importância da produçãoin vitro de proteínas recombinantes. As proteínas na solu-ção, mesmo as proteínas altamente purificadas, podem formaragregados no armazenamento, ou durante os processos de pro-dução. A agregação in vitro limita a estabilidade da proteí-na, solubilidade e rendimento de produção das proteínas re-combinantes. De Young e outros, Accounts of Chemical Re-search 2_6: 614-620 (1993); Wetzel, TIBTECH 12: 193-198(1994); e Vandenbroeck e outros, Eur. J. Biochem. 215:481-486 (1993).

Além de contribuir para a perda da atividade bio-lógica, a agregação da proteína pode ser prejudicial aos u-sos terapêuticos. Em alguns casos, a formação de agregadosconduz aos complexos possuindo imunogenicidade aumentadaquando administrados in vivo. Assim, a fim de administraruma solução de proteína reçombinante a um paciente, é neces-sário primeiro remover esses agregados para evitar uma res-posta tóxica ao paciente. Consequentemente, a formação deagregados de proteínas recombinantes é inaceitável para apreparação das composições farmacêuticas.

Várias metodologias e aditivos foram descritos natécnica para estabilização das soluções de proteína, peloque prevenindo e/ou minimizando a formação dos agregados deproteína. Processos de filtração convencional foram descri-tos, contudo, agregados, mesmo em concentrações tão baixasquanto 0,1-0,2% - rapidamente entupindo tais filtros e Iimi-tando sua utilidade para os processos de fabricação. As me-todologias de cromatografia de filtração de gel e cromato-grafia de exclusão por tamanho são freqüentemente eficazes,porém muito caras e, portanto, impraticáveis.

A estabilização das proteínas por adição de prote-ínas de choque térmico, tal como, HSP25 é descrita na EP-A0599344. O uso de polímeros de bloco compostos de polióxi-propileno e polióxi-etileno e fosfolipídeos foram descritospara a estabilização de solução de anticorpo. EP-A0318081. Aestabilização das imunoglobulinas por adição de um sal deuma substância básica contendo nitrogênio, tal como, argini-na, guanina ou imidazol é descrita na EP-A0025275. Outrosaditivos para estabilização foram descritos, incluindo poli-éteres (EP-A0018609); glicerina, albumina, e sulfato de dex-trano (Patente US número 4.808.705); detergentes, tais como,Tween<R)20 (DE 2652636 e GB 8514349); proteínas auxiliares dodobramento, tais como, GroEL (Mendoza, Biotechnol. Tech.10:535-540- (1991)) e B23 (Patente US número 6.358.718);tampão de citrato (WO 93/22335); e agentes quelantes (WO91/15509).

As metodologias existentes para obtenção da desa-gregação de proteína geralmente empregam a etapa de solubi-lização da proteína em concentrações altas de proteínas au-xiliares de dobramento fortes, tais como, 8M cloridrato deguanidina e/ou uréia, ou agente tensoativo, o que resulta emdesdobramento de proteína quase completo. Mitraki e outros,Eur. J. Biochem. 163:29-34 (1987); Vandenbroeck e outros,Eur. J. Biochem. 215:481-486 (1993); DeLoskey e outros, Ar-ch. Biochem. Biophys. 311:72-78 (1994); e Rudolph and Lilie,FASEB J. 10:49-56 (1996). Uma vez solúveis e não dobradas,as proteínas são diluídas em proteínas auxiliares do dobra-mento adicional e redobradas por remoção da proteína auxili-ar do dobramento, por exemplo, por diálise. Tal redobramentodas proteínas é imprevisível e dependente de condição. Valaxand Georgiou, Biotech. Prog. _9:539-547 (1993). As condiçõesredox, pH, taxas de diálise e concentrações de proteína de-vem ser empiricamente otimizadas em uma base de proteína-a-proteína. E, a reagregação é geralmente favorecida por redo-bramento apropriado. Como resultado, os rendimentos aceitá-veis da proteína redobrada freqüentemente requerem que aproteína seja redobrada em concentrações muito baixas (porexemplo, 10-100 μg/mL). Rudolph, Modern Methods in Proteinand Nucleic Acid Research 149-172 (Tschesche ed., 1990);Goldberg e outros, Biochem. 30:2790-2797 (1991); e Maachu-palli-Reddy e outros, Biotech. Prog. 13:144-150 (1997). Umavez redobrada, a proteína deve, portanto, ser concentrada em100-1000 vezes para obter uma concentração apropriada paraadministração in vivo - a um processo que tipicamente resul-ta na perda substancial da proteína nativa. Adicionalmente,grandes volumes necessários para redrobramento da proteínaresultam no desperdício de quantidades substanciais de rea-gentes caros, tais como, caótropos.A Patente US número 5.077.392 revela um método pa-ra ativação das proteínas recombinantes produzidas nas célu-las procarióticas, onde as proteínas agregadas são dissolvi-das em 4-8M cloridrato de guanidina ou 6-10M uréia. As so-luções de proteína resultantes são dializadas a um pH entre1 e 4 antes de serem submetidas a um ambiente não desnatu-rante e oxidante para permitir redobramento da proteína.

A Patente US número 5.593.8 65 revela um método pa-ra ativar as proteínas eucarióticas contendo ligação de dis-sulfeto recombinante expressas nas células hospedeiras pro-carióticas. Os corpos de inclusão são dissolvidos em agentesde redução contendo cloridrato de 6M guanidina. Em uma etapade redobramento, as proteínas são introduzidas em um ambien-te de oxidação e não desnaturação.

A Patente US número 4.659.568 revela um método pa-ra solubilização, purificação e caracterizar a proteína dosagregados de proteína insolúveis ou complexos. Os agregadosde proteína insolúveis são colocados em cada em um gradientede etapa de uréia (3 M a 7 M uréia) . Conforme as amostrassão centrifugadas, os agregados passam através do gradienteaté serem dissolvidos.

As Patente US número 5.728.804 revela um métodoonde proteínas desnaturadas ou agregadas estão suspensas emum meio aquoso isente de detergente contendo cloridrato de5-7 M de guanidina e submetido a incubação por toda a noite.

A amostra suspensa é contatada com ciclodextrina para promo-ver dobramento da proteína.A Patente US número 4.652.630 revela um método pa-ra produzir somatrotropina ativa por solubilização dos agre-gados ou corpos de inclusão em um caótropo (3 M a 5 M uréi-a). 0 pH é ajustado para obter solubilização completa segui-do por modificação das condições para permitir oxidação, napresença das concentrações não desnaturantes do caótropo.

A Patente US número 5.064.943 revela um método pa-ra solubilização e renaturação sem o uso de um caótropo. Poresse método, o pH é ajustado entre 11,5 e 12,5 e mantido por5 a 12 horas, pelo que, obtendo solubilização e renaturaçãode somatotropina.

A Patente US número 5.023.323 revela, um métodopara desagregação de agregados de somatotropina, onde os a-gregados são dissolvidos em um caótropo desnaturante (IM a8M uréia). Seguindo-se a solubilização, a amostra é expostaa um ambiente não desnaturante, oxidante.

A Patente US número 5.109.117 revela um método pa-ra desagregação de agregados de somatotropina por dissoluçãona presença de um álcool orgânico e caótropo (1M a 8M uréi-a), seguido por renaturação da proteína solubilizada em umambiente não desnaturante, oxidante.

A Patente US número 5.714.371 revela um método pa-ra redobramento dos agregados de vírus da hepatite C protea-se, por solubilização em cloridrato de 5M guanidina. Um a-gente de redução é adicionado à solução e o pH ajustado paraum pH ácido. 0 agente desnaturante é removido por diálise eo pH elevado.A Patente US número 4.923.967 revela um método pa-ra desagregação de interleucina-2 humana (IL-2) onde os a-gregados da proteína são dissolvidos em 4-8 M cloridrato deguanidina com um agente de sulfitolização. 0 agente de sul-fitolização é subseqüentemente removido pela troca do sol-vente e a temperatura é elevada para precipitar IL-2 pura. Aproteína é redobrada por dissolução do precipitado de clori-drato de guanidina mais um agente de redução, seguido pordiluição para permitir redobramento da proteína.

Patente US número 5.410.026 revela um método pararedobrar fator-1 de crescimento semelhante à insulina (IGF-1), não dobrado, insolúvel, em uma conformação ativa. A pro-teína isolada é incubada com 1-3 M uréia ou 1 M cloridratode guanidina até os agregados serem solubilizados e redobrados.

Anticorpos de cadeia simples de fragmento variável(scFv) são proteínas propensas à agregação possuindo aplica-ções em diagnóstico de medicinas terapêuticas importantesincluindo imageamento de tumor e liberação de medicamentoalvejado. Embora tais sistemas de expressão complexos tenhamsido desenvolvidos os quais fornecem scFv solúvel e funcio-nal, o rendimento e a concentração obtidos são freqüentemen-te inferiores aos desejados. A expressão bacteriana afunilagrandes quantidades de scFv nos corpos de inclusão, preve-nindo o scFv de dobrar na forma ativa. Métodos para recupe-rar scFv funcional dos corpos de inclusão sofrem de desvan-tagens, tais como, formação de agregado e necessidade de u-tilização de grandes quantidades de desnaturantes, tais co-mo, cloridrato de guanidina.

As similaridades estruturais do scFv com as prote-ínas implicadas nas doenças humanas acionadas por agregaçãoe a necessidade de um método de recuperação isento de agre-gado, barato, rápido e altamente eficaz para scFv de siste-mas bacterianos garantem pesquisa no comportamento de agre-gação dessas proteínas. A incapacidade das técnicas químicascorrentes de impedir suficientemente a agregação focou aten-ção nos tratamentos físicos que apresentam uma promessa dereversão da agregação. Estudos anteriores mostraram que osagregados de proteínas multiméricas se rompem e subseqüente-mente reconquistam atividade seguindo exposição à pressãoalta. Tratamentos de alta pressão, em conjunto com métodosquímicos atuais podem prover a solução para o problema deagregação na produção de scFv.

Produtos imunofarmacêuticos modulares pequenos(produtos SMIP™) são uma classe de composto à base de anti-corpo, altamente modular, possuindo propriedades de medica-mento melhoradas em relação aos anticorpos monoclonais e re-combinantes. Os produtos SMIP™ compreendem uma cadeia de po-lipeptídeo simples incluindo um domínio de ligação especifi-co para alvo, com base, por exemplo, em um domínio variávelde anticorpo, em combinação com uma região FC variável, quepermite recrutamento específico de uma classe desejada decélulas efetoras (tais como, por exemplo, macrófagos e célu-las exterminadoras naturais (NK)) e/ou recrutamento de mortemediado por complemento. Dependendo da escolha das regiõesalvo e de impedimento, produtos SMIP™ podem sinalizar oubloquear a sinalização através dos receptores de superfícieda célula.

De modo semelhante ao scFv, produtos SMIP™ são al-tamente suscetíveis à formação de agregados de proteína me-diante expressão in vitro em uma célula hospedeira heterólo-ga. Estudos preliminares com relação à desagregação dos pro-dutos SMIP™ demonstraram que altas concentrações de uréia(por exemplo, 6M) em pH neutro (isto é, salmoura tamponadade fosfato, pH 7,0) são eficazes na desagregação de produtosSMIP™ nas soluções compreendendo concentrações baixas deproteína (isto é, inferior a 1 mg/mL). Infelizmente, contu-do, as concentrações de proteína mais altas resultaram noacúmulo dos agregados de peso molecular muito alto e perdada proteína total. Adicionalmente, foi verificado que o pe-ríodo de tempo de incubação com 6M uréia foi limitado a 5horas ou menos; tempos de incubação estendidos resultaram naformação de agregados de peso molecular muito altos (HMW).

Permanece uma necessidade não satisfeita na técni-ca para composições e métodos para obter a desagregação deproteínas de ligação em concentrações altas apropriadas paraa preparação de composições farmacêuticas e para a adminis-tração in vivo aos pacientes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere à essas e outras ne-cessidades correlatas pela provisão, entre outros, das com-posições e métodos para recuperação das proteínas de ligaçãobiologicamente ativas de misturas contendo agregados. Os mé-todos apresentados aqui fornecem a desagregação dos agrega-dos presentes nas misturas de proteína agregada e desagrega-da (isto é, nativa). As composições e métodos apresentadosaqui são eficazes na obtenção da desagregação das proteínasde ligação incluindo porém não limitado aos ligantes de pro-teína, receptores solúveis, anticorpos, fragmentos de anti-corpo, anticorpos de cadeias simples de fragmento variável(scFv) e produtos imunofarmacêuticos modulares pequenos(produtos SMIP™).

As composições e métodos revelados aqui podem serapropriadamente empregados com soluções de proteína de liga-ção na faixa entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 50 mg/mL,mais tipicamente entre cerca de 1 mg/mL e cerca de 50 mg/mL,ainda mais tipicamente entre 1 mg/mL e cerca de 50 mg/mL,ainda mais tipicamente entre cerca de 1 mg/mL e cerca de 25mg/mL ou entre cerca de 1 mg/mL e cerca de 10 mg/mL. São e-xemplifiçadas aqui as composições e métodos para desagrega-ção das proteínas de ligação nas soluções compreendendo cer-ca de 1 mg/mL, cerca de 2 mg/mL, cerca de 5 mg/mL, cerca de8 mg/ml, ou cerca de 10 mg/mL de proteína de ligação total.

As composições e métodos revelados aqui compreen-dem, de modo geral, sistemas tampão que são compatíveis comprocessos de fabricação de GMP. Por exemplo, sistemas tampãoapropriados podem incluir um ou mais sais incluindo, porémnão limitado ao acetato de sódio (NaOAc) e/ou cloreto de só-dio (NaCl). Faixas de concentração apropriadas para cada umdesses sais são de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM, mais ti-picamente de cerca de 5 mM a cerca de 50 mM ou de cerca de10 mM a cerca de 25 mM. É exemplificado aqui ura sistema tam-pão compreendendo 25 mM NaOAc e 25 mM NaCl.

As composições e métodos para desagregação de pro-teínas de ligação apresentados aqui compreendem, adicional-mente, um ou mais agentes caotrópicos incluindo, porém nãolimitado a um ou mais dentre cloridrato de guanidina, argi-nina e uréia. Será entendido que a concentração precisa deagente caotrópico dependerá da natureza da proteína de liga-ção e sua sensibilidade em relação ao agente caotrópico, po-rém será limitada às concentrações que permitem retenção daatividade biológica da proteína em sua forma nativa. Tipica-mente, cada um ou os agentes caotrópicos estão presentes nascomposições em uma faixa de concentração de cerca de 0,1M acerca de 8M. Mais tipicamente, cada um ou os agentes caotró-picos estão presentes em uma faixa de concentração de cercade 0,5 M a cerca de 6 M, mesmo mais tipicamente de cerca deIMa cerca de 5 M ou de cerca de 3 M a cerca de 5 M. Sãoexemplificadas aqui composições compreendendo um ou mais ca-ótropo(s) em concentrações de cerca de 3 M, 3,5 M, 4 M, 4,5M e 5 M.

Dentro dos aspectos correlatos, será apreciado queos efeitos sinergísticos entre combinações de dois ou maiscaótropos podem ser vantajosamente obtidos. Por exemplo, apresente invenção contempla composições e métodos empregandouréia em combinação com cloridrato de guanidina, uréia emcombinação com arginina e cloridrato de guanidina em combi-nação com arginina. Independente da combinação de caótroposempregada, cada um ou os agentes caotrópicos estão presentesnas composições em uma faixa de concentração de cerca de 0,1M a cerca de 8 M. Mais tipicamente, cada um ou os agentescaotrópicos estão presentes em uma faixa de concentração decerca de 0,5 M a cerca de 6 M, mesmo mais tipicamente decerca de 1 M a cerca de 5 M ou de cerca de 3 M a cerca de 5 M.

Independente da identidade precisa de sal e caó-tropo e concentração, as composições providas aqui são tipi-camente ajustadas para um pH levemente ácido, tipicamente nafaixa de cerca de pH 4 a cerca de pH 7, mais tipicamente nafaixa de cerca de pH 5 a cerca de pH 6. São exemplificadasaqui composições tamponadas a cerca de pH 5, cerca de pH5,5, e cerca de pH 6. Será entendido que, como uma regra ge-ral, composições compreendendo concentrações maiores de a-gente(s) caotrópico(s) são tipicamente tamponadas a um pHmaior, considerando-se que composições compreendendo concen-trações menores de agente(s) caotrópico(s) são tipicamentetamponadas a um pH inferior. Assim, por exemplo, composiçõescompreendendo um agente caotrópico a cerca de 3 M são tipi-camente tamponadas a cerca de pH 5, considerando-se que com-posições compreendendo um agente caotrópico a cerca de 4 Msão tamponadas a cerca de pH 6. Outras composições apropria-das compreendem um agente caotrópico a cerca de 3,5 M, quesão tamponadas a cerca de pH 5,5. Outros sistemas tampão po-dem ser empregados apropriadamente.

Utilizando os sistemas tampão conforme descritosacima, altos níveis de desagregação são obtidos dentro de umou mais caótropos, em concentrações entre cerca de 3 M ecerca de 4 M uréia por um período de tempo de até cerca de 5horas a cerca de 24 horas. Conforme descrito em detalhes a-qui, a atividade da proteína de ligação é insensível à con-centração da proteína e o acúmulo de agregados de peso mole-cular maior (HMW) é substancialmente reduzido.

Dentro de determinados aspectos da presente inven-ção, as composições e métodos compreendem, adicionalmente,um ou mais agentes de redução, tais como, por exemplo, clo-ridrato de tris (2-carboxietil)fosfina, beta-mercaptoetanol(BME), ditiotreitol (DTT) e gutationa (GSH). Será apreciadopelos versados na técnica que a adição de agentes de reduçãoé especificamente vantajosa para uso com proteínas de liga-ção onde ligações de dissulfeto intra e/ou intermolecularesnão são necessárias para prover estabilização da estruturade proteína terciária e/ou quaternária. DTT está presentetipicamente nas composições entre cerca de 1 mM e cerca de50 mM. GSH está presente tipicamente nas composições entrecerca de 1 μΜ e cerca de 100 μΜ, mais tipicamente entre cer-ca de 5 μΜ e cerca de 20 μΜ.

Ainda nos aspectos adicionais, as composições emétodos podem compreender adicional ou alternativamente, umou mais agentes quelantes exemplificados por DTPA (ácido di-etilenotriamina pentacético; ácido dietilenotriamina-N,Ν,N1,N',N11-pentacético; ácido pentacético; N,N-bis(2-(bis, -(carboximetil)amino)etil)-glicina; ácido dietilenotri-amina pentaacético, [ [(ácido carboxime-til) imino] bis (etilenonitrilo) ]-tetracético) ; EDTA (ácido e-dético; ácido etilenodinitrilo tetracético; EDTA, base li-vre; ácido livre EDTA; ácido etilenodiamina-N,Ν,N1,N'-tetracético; Hampeno; Verseno; Ν,N'-1,2-Etano diilbis-(N-(carboximetil)glicina); ácido etileno diamina tetracético);e NTA (N,N-bis(carboximetil)glicina; ácido triglicolâmico;trilona A; ácido alfa,alfaalfa"-trimetilamina tricarboxí-lico; tri(carboximetil)amina; ácido aminotriacético; ácidoHampshire nta; ácido nitrilo-2,2',2"-triacético; Titriplexi; ácido nitrilotriacético). Outros agentes quelantes podemser empregados apropriadamente.

A desagregação de uma grande variedade de proteí-nas de ligação pode ser obtida, satisfatoriamente, com ascomposições e métodos apresentados aqui. São exemplificadasproteínas de ligação possuindo afinidade de ligação especí-fica para CD20, VEGF, Her2, EGFR ou CD37. Por exemplo, apresente invenção é exemplificada pelas composições e méto-dos para desagregação de um produto SMIP™ possuindo afinida-de de ligação específica para CD20.

As proteínas de ligação desagregadas pelas compo-sições e métodos da presente invenção exibem níveis substan-ciais de atividade in vitro conforme evidenciado pelos en-saios de ligação e funcionais, bem como níveis substanciaisde atividade in vivo. Por exemplo, o produto SMIP™ específi-co de CD20 apresentado aqui exibe níveis substanciais de li-gação específica ao antígeno CD20 expresso na superfície dalinhagem de células WIL-2S, bem como níveis substanciais deatividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC)em um ensaio de fixação de complemento in vitro.Esses e outros aspectos da presente invenção fica-rão aparentes com referência à descrição detalhada que sesegue. Todas as citações reveladas são incorporadas como re-ferência em sua totalidade, como se tivessem sido incorpora-das individualmente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 apresenta um traço cromatográfico mos-trando a eluição dependente do tempo dos agregados de prote-ína e POI para um produto SMIP™ específico para CD20 de umacoluna de cromatografia de Proteína A eluída com uma etapasimples da Proteína A em pH 5. Os dados apresentados na Fi-gura IA foram obtidos com uma proteína de ligação aplicada àcoluna em um tampão de controle compreendendo 25 mM de NaCl,25 mM de NaOAc em pH 5, considerando-se que os dados apre-sentados na Figura IB foram obtidos com a mesma proteína deligação aplicada à coluna seguindo-se um tratamento de 20horas com uma solução compreendendo 25 mM NaCl, 25 mM NaOAc,3 M uréia em pH 5. A porcentagem de "proteína de interesse",ou % POI, obtida na Figura IA foi de 46,8% considerando-seque a % POI obtida na Figura IB foi de 80,1%.

A Figura 2 é um gráfico de barras demonstrandorendimentos aperfeiçoados (expressos como % POI) para umproduto SMIP™ específico para CD20 exemplar (5 mg/mL e 10mg/mL) empregando composições e métodos da presente invenção(isto é, 25 mM de NaOAc, 25 mM de NaCl, 3 M uréia, pH 5 e 25mM de NaOAc, 25 mM de NaCl, 4 M uréia, pH 5) em contrastecom a % POI para a mesma proteína de ligação em salmouratamponada com fosfato (PBS) , pH 7 era combinação com 3 M u-réia ou 4 M uréia.

A Figura 3 é um gráfico ilustrando a concentraçãodependente do tempo da POI (expressa como "área sob a curva"ou AUC) para um produto SMIP™ especifico para CD20 exemplarnas composições indicadas compreendendo 2 M, 3 M, ou 4 M u-réia cada, em pH 4, pH 5, e pH 6.

A Figura 4 apresenta um gráfico de barras demons-trando rendimentos aperfeiçoados (% POI, a Figura 4A e POI-AUC, a Figura 4B) para um produto SMIP™ especifico para CD20exemplar empregando composições e métodos exemplares da pre-sente invenção (isto é, 25 mM de NaOAc, 25 mM de NaCl, 3Muréia, pH 5 e 25 mM de NaOAc, 25 mM de NaCl, 4M uréia, pH 6).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Conforme indicado acima, a presente invenção esrefere às composições e métodos para a desagregação das pro-teínas de ligação incluindo, porém não limitada aos ligantesde proteína, receptores solúveis, anticorpos, fragmentos deanticorpo, anticorpos de cadeia simples de fragmento variá-vel (scFv), e produtos imunofarmacêuticos modulares pequenos(produtos SMIP™). As composições e métodos revelados aquisão eficazes para obtenção da desagregação das proteínas deligação, enquanto mantém um nível alto de atividade funcional.

Conforme usado nesse relatório descritivo e nasreivindicações apensas, as formas singulares "um(a)" e (o,a)incluem referências ao plural, a menos que o contexto indi-que claramente o contrário.

A prática da presente invenção empregará, a menosque especificamente indicado ao contrário, os métodos con-vencionais de imunologia, microbiologia, biologia molecular,química da proteína e técnicas de DNA recombinante dentro doconhecimento da técnica, muitos sendo descritos abaixo parafins de ilustração. Tais técnicas são plenamente explicadasna literatura. Vide, por exemplo, Sambrook, e outros, "Mole-cular Cloning: A Laboratory Manual" (segunda edição, 1989);Maniatis e outros, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(1982); "DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II" (D.Glover, ed) ; "Oligonucleotide Synthesis" (N. Gait, ed.,1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B. Hames & S. Higgins,eds. , 1985); "Transcription and Translation" (B. Hames & S.Higgins, eds., 1984); "Animal Cell Culture" (R. Freshney,ed, 1986); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning"(1984); Ausubel e outros, "Current protocols in MolecularBiology" (New York, John Wiley and Sons, 1987); Bonifacino eoutros, "Current Protocols in Cell Biology" (New York, JohnWiley & Sons, 1999); Coligan e outros, "Current Protocols inImmunology" (New York, John Wiley & Sons, 1999); e Harlowand Lane Antibodies: a Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory (1988).

Todas publicações, patentes, e pedidos de patentecitados aqui, se acima ou a seguir, são incorporados comoreferência em sua totalidade. A presente invenção será me-lhor entendida através da descrição detalhada das modalida-des específicas, dada uma das quais sendo descrita a seguirem maiores detalhes.

Definições

Conforme empregado aqui, o termo "proteína de Ii-gação" se refere, de modo geral, a todas as classes de Ii-gantes de proteína, receptores solúveis, anticorpos, frag-mentos de anticorpo, anticorpos de cadeia simples de frag-mento variável (scFv), e produtos imunofarmacêuticos modula-res pequenos (produtos SMIP™). São exemplificadas aqui asproteínas de ligação possuindo afinidade de ligação especí-fica para proteínas alvo e outras moléculas, incluindo re-ceptores de superfície de célula associados às doenças, taiscomo, câncer e doenças inflamatórias. Em determinadas moda-lidades, proteínas de ligação possuem afinidade de ligaçãoespecífica às proteínas alvo CD20, VEGF, Her2, EGFR, e CD37.Mais especificamente, são apresentados aqui os produtosSMIP™ que se ligam especificamente às proteínas alvo CD20,VEGF, Her2, EGFR e CD37.

Conforme empregado aqui, o termo "anticorpo" in-clui anticorpos monoclonais, quiméricos, humanizados, e com-pletamente humanos, bem como fragmentos de ligação de antí-geno ou biológica e/ou porções dos mesmos. Referências aquia um "anticorpo" incluem referências às' partes, fragmentos,formas precursoras, derivados, variantes e formas construí-das geneticamente ou mutadas naturalmente e incluem substi-tuições de aminoácido e marcação com substâncias químicase/ou radioisótopos e semelhantes, à medida que o derivadoe/ou variante mantenha uma quantidade pelo menos substancialde especificidade de ligação ao alvo e/ou afinidade. O termo"anticorpo" inclui amplamente ambas as cadeias de anticorpoleve e pesada, bem como todos os isótopos de anticorpos, in-cluindo IgM, IgD, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgAi e IgA2,e também engloba, fragmentos de ligação de antigeno dos mes-mos, incluindo, porém não limitado a Fab, F(ab')2, Fe, e scFv.

O termo "anticorpo monoclonal, " conforme empregadoaqui, se refere a um anticorpo obtido de uma população deanticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticor-pos individuais compreendendo a população são idênticos, ex-ceto pelas mutações ocorrendo naturalmente que substancial-mente não afetam a especificidade, afinidade e/ou atividadede ligação do anticorpo.

Conforme empregado aqui, o termo "anticorpos qui-méricos" se refere às moléculas de anticorpo compreendendocadeias pesada e leve onde os domínios variáveis de anticor-po não humanos são fundidos operavelmente aos domínios deconstante humana. Os anticorpos quiméricos exibem, de modogeral, imunogenicidade reduzida, quando comparados ao anti-corpo completamente não humano de origem.

Conforme empregado aqui, o termo "anticorpos huma-nizados" se refere aos anticorpos compreendendo uma ou maisregião de determinação de complementaridade não humana(CDR) , uma região de estrutura de domínio variável humana(FR) e um domínio constante de cadeia pesada humano, tal co-mo, o domínio constante de cadeia pesada IgG2 e o domínioconstante de cadeia leve humano, tal como, o domínio cons-tante de cadeia leve Igcapa. Conforme empregado aqui, o ter-mo "anticorpo humanizado" significa a inclusão de anticorposhumanos (anticorpo receptor) onde os resíduos da região dedeterminação de complementaridade (CDR) do receptor sãosubstituídos pelos resíduos de uma CDR das espécies não hu-manas (anticorpo doador), tais como, camundongo, rato ou co-elho possuindo especificidade, afinidade e capacidade dese-jadas. Em alguns exemplos, os resíduos de estrutura de domí-nio variável do corpo humano são substituídos pelos resíduosnão humanos correspondentes. Anticorpos humanizados podemtambém compreender resíduos que não são encontrados nem noanticorpo do receptor nem na CDR importada ou seqüências deestrutura. Os métodos para humanização dos anticorpos nãohumanos são bem conhecidos na arte. De modo geral, um anti-corpo humanizado possui um ou mais resíduos de aminoácidointroduzidos no mesmo a partir de uma fonte que não é huma-na. A humanização pode ser obtida por enxerto de CDRs em umaFR de suporte humana antes da fusão com o domínio constantede anticorpo humano apropriado. Vide, Jones e outros, Nature321:522-525 (1986); Riechmann e outros, Nature 332:323.-327(1988); Verhoeyen e outros, Science 239:1534-1536 (1988).

Conforme empregado aqui, o termo "anticorpo de ca-deia simples de fragmento variável" ou "scFv" se refere a umheterodímero VH::VL ligado covalentemente que é expresso deuma fusão gênica incluindo genes codificando Vh- e Vl- liga-dos por um ligante codificando peptídeo. Huston e outros,Proc. Nat. Acad. Sei. USA 85(16):5879-5883 (1988). Váriosmétodos foram descritos relacionados às estruturas químicaspara conversão das cadeias de polipeptideo leve e pesada na-turalmente agregadas, porém quimicamente separadas de umaregião V de anticorpo em uma molécula scFv que redobrarão emuma estrutura tridimensional substancialmente semelhante àestrutura de um sitio de ligação de antigeno. Vide, por e-xemplo, as Patentes US números 5.091.513, 5.132.405, e4.946.778.

Conforme empregado aqui, as proteínas de fusão fa-bricadas, denominadas "produtos imunofarmacêuticos modularespequenos" ou produtos "SMIP™", são conforme descritas nasPublicações de Patente US de co-propriedade 2003/133939,2003/0118592 e 2005/0136049 e Publicações de Patente Inter-nacionais de co-propriedade W002/056910, W02005/037989 eW02005/017148, que são incorporados aqui como referência.

Uma proteína de ligação específica alvo, tal comoum anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno do mesmo,"se liga especificamente", "liga imunologicamente" e/ou é"imunologicamente reativo" a um alvo, se ele reage em um ní-vel detectável (em, por exemplo, um ensaio ELISA) com o alvoe não reage detectavelmente com os polipeptídeos não rela-cionados sob condições semelhantes.

"Ligação imunológica", de acordo com o contexto,se refere de modo geral, às interações não covalentes do ti-po que ocorrem enter um anticorpo e um antigeno para o qualo anticorpo é específico. A resistência ou afinidade das in-terações de ligação de anticorpo-alvo podem ser expressas emtermos da constante de dissociação (Kd) da interação, ondeum Kd menor representa uma afinidade maior. Propriedades deligação imunológicas dos anticorpos específicos alvos podemser quantificadas usando métodos bem conhecidos na arte. Talmétodo acarreta medição das taxas de anticorpos específicosalvo/formação de complexo de antígeno e dissociação, ondeessas taxas dependem das concentrações dos parceiros de com-plexo, a afinidade da interação e os parâmetros geométricosque igualmente influenciam a taxa em ambas direções. Assim,ambas a "constante dentro da taxa" (Kon) e "constante forada taxa" (Koff) podem ser determinadas por cálculo das con-centrações e das taxas reais de associação e dissociação. Ataxa de Koff/Kon permite o cancelamento de todos os parâme-tros não relacionados à afinidade, e é assim igual à cons-tante de dissociação Kd. Vide, de modo geral, Davies e ou-tros, Annual Rev. Biochem. 59:439-473 (1990). "Se liga espe-cificamente" aqui significa que as proteínas de ligação seligam aos polipeptídeos alvo, proteínas e/ou outras molécu-las com uma constante de dissociação na faixa de pelo menosIO"6 -IO"9 M, mais geralmente pelo menos IO"7 - IO"9 M.

Um "sítio de ligação de antígeno" ou "porção deligação" de um anticorpo específico alvo se refere à partedaquela molécula de anticorpo que participa na ligação alvo.

O sítio de ligação de antígeno é formado por resíduos de a-minoácido das regiões variáveis (V) de término N das cadeiaspesada ("H") e leve ("L"). Três estiramentos altamente di-vergentes dentro das regiões V das cadeias pesada e leve sãoreferidos como "regiões hipervariáveis" ou "regiões determi-nando complementaridade (CDRs)" que são interpostas entreestiramentos de flanqueamento mais conservados conhecidoscomo "regiões de estrutura", ou "FRs".

Conforme usado aqui, o termo "agregado de proteí-na" se refere a associação não específica e não nativa entreduas ou mais proteínas de ligação. Os agregados de proteínapodem incluir dímeros, trímeros, tetrâmetros e multímeros deordem mais alta das proteínas de ligação. A presença dos a-gregados de proteína na composição farmacêutica, especial-mente composições farmacêuticas formuladas para liberaçãoparenteral está associada aos as reações in vivo adversasincluindo choque analiftálico. Vide, por exemplo, Moore andLeppart, J. Clin. Enodcrin. and Metab. 51:691-697 (1980);Rattier e outros, Diabetes 39:728-733 (1990); e Thornton andBallow, Arch. Neurology 50: 135-136 (1993).

Conforme empregado aqui, o termo "atividade bioló-gica" se refere à ambas a capacidade da proteína de ligaçãopara ligação ao alvo específico, bem como a capacidade demediar suas funcionalidades biológicas nativas.

Conforme empregado aqui, o termo "caótropo" ou "a-gente caotrópico" se refere aos compostos incluindo, porémnão limitados ao cloridrato de guanidina (aka, cloridrato deguanidina, GdmHCl), tiocianato de sódio, uréia, argininae/ou um detergente. Caótropos têm em comum a capacidade deinterromper ligação intermolecular não covalente entre monô-meros de proteína ou dímeros, onde os monômeros ou dímerosrepresentam o estado nativo da proteína de ligação.

Conforme empregado aqui, o termo "tampão" ou "a-gente de tamponamento" se refere a um composto ou combinaçãode compostos que são adicionados a uma composição para obterum valor de pH desejado ou faixa de pH. Os tampões são ge-ralmente classificados como tampões inorgânicos (exemplifi-cados pelos tampões fosfato e carbonato) e tampões orgânicos(exemplificados por tampões citrato, Tris, MOPS, MES eHEPES). Outros tampões e agentes de tamponamento podem tam-bém ser empregados nas composições e métodos apresentadosaqui.

Conforme empregado aqui, o termo "célula hospedei-ra" se refere a uma célula procariótica ou eucariótica, talcomo, célula bacteriana, de levedura, de inseto, mamífero,ou de planta que seja transformada ou transfectada, tal queela expresse uma proteína de ligação heteróloga de interes-se. Células hospedeiras exemplares incluem, porém não estãolimitadas ao Escherichia coli, Sarccharomyces cerevisia, Pi-chia pastoris, SF9, COS e células CHO.

Composições para a Desagregação das Proteínas de

Ligação

Conforme indicado acima, a presente invenção for-nece composições que são apropriadas para obtenção da desa-gregação de proteínas de ligação. As composições reveladasaqui podem ser empregadas apropriadamente para a desagrega-ção de soluções compreendendo altas concentrações da proteí-na de ligação, tipicamente na faixa entre cerca de 0,1 mg/mLa cerca de 50 mg/mL, mais tipicamente entre cerca de 0:5 ecerca de 20 mg/mL ou entre cerca de 1 mg/mL e cerca de 10mg/mL. São exemplificadas aqui as soluções de proteína deligação de cerca de 1 mg/mL, cerca de 2 mg/mL, cerca de 5mg/mL, cerca de 8 mg/ml, e cerca de 10 mg/mL.

Composições da presente invenção de modo geralcompreendem sistemas tampão que são compatíveis com proces-sos de fabricação GMP. Por exemplo, sistemas tampão apropri-ados podem englobar um ou mais sais incluindo, porém não li-mitado ao Acetato de Sódio e/ou Cloreto de Sódio. Outrossais podem ser vantajosamente empregados. Faixas de concen-tração apropriadas para cada um desses sais são de cerca de1 mM a cerca de 100 mM, mais tipicamente de cerca de 5 mM acerca de 50 mM ou de cerca de 10 mM a cerca de 25mM. É exem-plificado aqui um sistema tampão compreendendo 25 mM Acetatode Sódio e 25 mM Cloreto de Sódio.

As composições para desagregação das proteínas deligação apresentadas aqui compreendem adicionalmente, um oumais agentes caotrópicos incluindo, porém não limitado a, umou mais de cloridrato de guanidina, arginina e uréia. Seráentendido que a concentração precisa do agente caotrópicodependerá da natureza da proteína de ligação e sua sensibi-lidade ao agente caotrópico, porém não está limitada às con-centrações que permitem retenção da atividade biológica daproteína em sua forma nativa. Tipicamente, cada um ou os a-gentes caotrópicos estão presentes nas composições em umafaixa de concentração de cerca de 0,1 M a cerca de 8 M. Maistipicamente, cada um ou os agentes caotrópicos estão presen-tes em uma faixa de concentração de cerca de 0,5 M a cercade 6 M, mesmo mais tipicamente de cerca de 1 M a cerca de 5M ou de cerca de 3 M a cerca de 5 M. São exemplificadas aquicomposições compreendendo um ou mais caótropo(s) em concen-trações de cerca de 3 M, 3,5 M, 4 M, 4,5 M e 5 M.

Dentro de aspectos correlatos, será apreciado queos efeitos sinergisticos entre as combinações de dois oumais caótropos podem ser obtidos de modo vantajoso. Por e-xemplo, a presente invenção contempla composições e métodosempregando uréia em combinação com cloridrato de guanidina,uréia em combinação com arginina e cloridrato de guanidinaem combinação com arginina. Independente da combinação decaótropos empregada, cada um ou os agentes caotrópicos estãopresentes nas composições em uma faixa de concentração decerca de 0,1 M a cerca de 8 M. Mais tipicamente, cada agen-te (s) caotrópico(s) está presente em uma faixa de concentra-ção de cerca de 0:5 M a cerca de 6M, mesmo mais tipicamentede cerca de IM a cerca de 5M ou de cerca de 3M a cerca de 5M.

Independente do teor de sal e concentração preci-sos, as composições providas aqui são tipicamente ajustadasa um pH ligeiramente ácido, tipicamente na faixa de cerca depH 4 a cerca de pH 7, mais tipicamente na faixa de cerca depH 5 a cerca de pH 6. São exemplificadas aqui composiçõestamponadas a cerca de pH 5, cerca de pH 5,5, e cerca de pH6. Será entendido que, como uma regra geral, composiçõescompreendendo concentrações maiores de agente(s) caotrópi-co(s) são tipicamente tamponadas a um pH maior, consideran-do-se que composições compreendendo concentrações menores deagente(s) caotrópico(s) são tipicamente tamponadas a m pHmenor. Assim, por exemplo, composições compreendendo um a-gente caotrópico de cerca de 3M são tipicamente tamponadas aum pH de cerca de 5, considerando-se que composições compre-endendo um agente caotrópico de cerca de 4 M são tamponadasa cerca de pH 6. Outras composições apropriadas compreenden-do um agente caotrópico de cerca de 3,5 M, são tamponadas acerca de pH 5,5. Outros sistemas tampão podem ser apropria-damente empregados.

Em razão do emprego de tais sistemas tampão con-forme descrito acima, níveis maiores de desagregação são ob-tidos com um ou mais caótropo em concentrações entre cercade 3 M e cerca de 4 M de uréia, por um período de tempo decerca de 24 horas. Conforme descrito aqui adicionalmente emdetalhes, a atividade da proteína de ligação é insensível àconcentração de proteína e o acúmulo de agregados de pesomolecular alto (HMW) não ocorre.

Dentro de determinados aspectos da presente inven-ção, as composições podem compreender, adicionalmente, um oumais agente (s) de oxidação e/ou um ou mais agente (s) de re-dução, tais como, por exemplo, cloridrato de tris (2-carboxietil)fosfina (TCEP), beta-mercaptoetanol (BME), diti-otreitol (DTT) e glutationa (GSH). Será apreciado pelos ver-sados na técnica que a adição de agentes de redução é espe-cificamente vantajosa para uso com proteínas de ligação, on-de ligações dissulfeto intra e/ou intermoleculares não sãonecessárias para prover estabilização da estrutura de prote-ína terciária e/ou quaternária. DTT tipicamente está presen-te nas composições entre cerca de 1 mM e cerca de 50 mM. GSHestá presente, tipicamente, nas composições entre cerca de 1mM e cerca de 50 mM. GSH está presente tipicamente nas com-posições entre cerca de 1 μΜ e cerca de 100 μΜ, mais tipica-mente entre cerca de 5 μΜ e cerca de 20 μΜ.

Ainda nos aspectos adicionais, as composições emétodos podem compreender adicional ou alternativamente, umou mais agentes quelantes exemplificados por DTPA (ácido di-etilenotriamina pentacético; ácido dietilenotriamina-N,Ν,N',N',N'1-pentaacético; ácido pentacético; N,N-bis(2-(bis,-(carboximetil)amino)etil)-glicina; ácido dietilenotri-amina pentacético, [[(ácido carboxime-til) imino] bis (etilenonitrilo) ] -tetracético) ; EDTA (ácido a-cético; ácido etilenodinitrilo tetracético; EDTA, base li-vre; ácido livre EDTA; ácido etilenodiamina-N, Ν, N1 , N '-tetracético; Hampeno; Verseno; Ν,N'-1,2-Etano diilbis-(N-(carboximetil)glicina); ácido etileno diamina tetracético);e NTA (Ν,Ν-bis(carboximetil)glicina; ácido triglicolâmico;trilona A; ácido alfa,alfaalfa"-trimetilamina tricarboxí-lico; tri(carboximetil)amina; ácido aminotriacético; ácidoHampshire nta; ácido nitrilo-2,21,2"-triacético; Titriplexi; ácido nitrilotriacético). Outros agentes quelantes podemser empregados apropriadamente.

As composições da presente invenção podem ser em-pregadas, apropriadamente, em uma ampla faixa de temperatu-ras entre o ponto de congelamento da composição especifica ea temperatura na qual a proteína de ligação exibe um grausubstancial de desnaturação térmica. Assim, por exemplo,composições e métodos podem ser empregados entre cerca de -10°C e cerca de 50°C. Mais tipicamente, contudo, composiçõese métodos são empregados entre cerca de -IO0C e cerca de37 °C; ainda mais tipicamente entre cerca de 0°C e cerca de30°C ou entre cerca de IO0C e cerca de 25°C. Será entendido,contudo, que a temperatura ótima para uma dada composição eprocesso dependerá substancialmente em parte das proprieda-des de biofísicas da proteína de ligação específica empregada.

A desagregação de uma grande variedade de proteí-nas de ligação pode ser obtida, satisfatoriamente, com ascomposições e métodos apresentados aqui. São exemplificadasaqui as proteínas de ligação possuindo afinidade de ligaçãoespecífica para CD20, VEGF, Her2, EGFR e CD37. Por exemplo,a presente invenção é exemplificada pelas composições e mé-todos para desagregação de um produto SMIP™ possuindo afini-dade de ligação específica para CD20.

As proteínas de ligação desagregadas pelas compo-sições da presente invenção exibem níveis substanciais deatividade in vitro conforme evidenciado por ensaios de liga-ção e funcionais, bem como níveis substanciais de atividadein vivo. Por exemplo, o produto SMIP™ específico de CD20 a-presentado aqui exibe níveis substanciais de ligação especí-fica ao antígeno CD20 expressos na superfície da linhagem decélula WIL-2S, bem como níveis substanciais de atividade decitotoxicidade dependente de complemento (CDC) em um ensaiode fixação in vitro, quando comparado ao produto SMIP™ nãotratado.

Métodos para Desagregação das Proteínas de LigaçãoConforme indicado acima, a presente invenção tam-bém provê métodos para a desagregação de uma ampla variedadede proteínas de ligação incluindo, porém não limitado aosligantes de proteína, receptores solúveis, anticorpos, anti-corpo de cadeia simples de fragmento variável (scFv) e pro-dutos imunofarmacêuticos modulares pequenos (produtosSHIP™).

Os métodos da invenção revelados aqui são emprega-dos apropriadamente com concentrações altas de proteínas deligação, conforme indicado acima, de modo geral na faixa decerca de 0,1 mg/mL a cerca de 50 mg/mL. São exemplificadosaqui os métodos para obtenção da desagregação das proteínasde ligação em concentrações de 5 mg/mL, 8 mg/mL e 10 mg/mL.Será entendido, contudo, que os presentes métodos podem seraplicados a uma ampla variedade de soluções de proteína deligação concentradas.

Em resumo, uma célula ou linhagem de célula apro-priada é selecionada para a expressão de uma proteína de li-gação de interesse e é transformada ou transfectada com umvetor plasmídeo ou outro sistema de expressão apropriado,transportando um gene a ser expresso. Uma suspensão compre-endendo uma mistura de proteína de ligação agregada e desa-gregada é isolada da célula ou sobrenadante da cultura, con-centrada conforme apropriado e submetida a uma ou mais eta-pas de isolamento de proteína e inativação viral. A proteínade ligação concentrada é trocada no sistema tampão apropria-do, exemplificado aqui por um sistema tampão compreendendo25 mM de NaOAc e 25 mM de NaCl. Será entendido, contudo, queos sais precisos e concentrações podem ser modificados con-siderando-se as propriedades biofísicas da proteína de liga-ção de interesse.

Tipicamente, um ou mais caótropos, tais como, porexemplo, cloridrato de guanidina, arginina e/ou uréia, é a-dicionado à proteína de ligação tamponada a uma concentraçãoentre cerca de 2 M e cerca de 5 M. Mais tipicamente, um oumais caótropos são adicionados à proteína de ligação tampo-nada a uma concentração entre cerca de 3 M e cerca de 4 M.Por exemplo um ou mais caótropos podem ser adicionados àproteína de ligação tamponada a uma concentração de cerca de3 M, cerca de 3,2 M, cerca de 3,4 M, cerca de 3,6 M, cercade 3,8 M ou cerca de 4 M.

Dependendo da proteína de ligação precisa, do caó-tropo e/ou do sistema tampão empregado, e considerando-se aconcentração do caótropo, a solução é tipicamente ajustadapara um pH entre cerca de pH 4 a cerca de pH 7. Mais tipica-mente, o pH da proteína de ligação, do caótropo e da soluçãode sistema tampão é um pH entre cerca de pH 5 e cerca de pH6. Conforme descrito acima, foi determinado para a proteínade ligação exemplar revelada aqui que para soluções compre-endendo um ou mais caótropos a 3 M, um pH de cerca de pH 5 éapropriado para obtenção da desagregação da proteína. Alter-nativamente, para soluções compreendendo um ou mais caótro-pos a 4 M, um pH de cerca de 6 pode ser apropriado. A combi-nação precisa de caótropos e pH dependerá, em parte, daspropriedades biofísicas da proteína de. ligação que necessi-tem de desagregação, a combinação podendo ser obtida por umversado na técnica através de experimentação de rotina, emvista da diretriz provida aqui.

Será apreciado, adicionalmente, que os presentesmétodos podem empregar, adicionalmente, a adição de um oumais agentes de redução, tais como, por exemplo, cloridratode tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), beta-mercaptoetanol(BME), ditiotreitol (DTT), e glutationa (GSH) e/ou um oumais agentes quelantes, tais como, por exemplo, DTPA, EDTA,e/ou NTA.

Os presentes métodos são apropriados para a desa-gregação de uma grande variedade de proteínas de ligação e-xemplificada aqui por proteínas de ligação possuindo afini-dade de ligação específica para CD20, VEGF, Her2, EGFR eCD37. Por exemplo, a presente invenção é exemplificada pormétodos para a desagregação de um produto de SMIP™ possuindoafinidade de ligação específica para CD20.

Para obtenção de um alto grau de desagregação daproteína, é vantajoso manter a proteína de ligação, o caó-tropo, a solução do sistema de tampão a uma temperatura en-tre cerca de 0°C e cerca de 100°C por um período entre cercade 5 horas a cerca de 24 horas. Por exemplo, de modo a obtera desagregação da proteína de ligação apresentada aqui, asolução foi mantida a uma temperatura de cerca de 25°C (istoé, temperatura ambiente) por um período entre cerca de 5 ho-ras e cerca de 20 horas.

Seguindo-se o período de manutenção, as proteínasdesagregadas são tipicamente trocadas dentro do sistema tam-pão, tal como, um sistema tampão de 25 mM de NaOAc, 25 mM deNaCl em pH 5. Sob essas condições, as proteínas desagregadassão estáveis e não sofrem reagregação substancial. As etapassubsequentes de purificação da proteína e filtração viralpodem ser, opcionalmente, realizadas a fim de obter uma so-lução altamente purificada compreendendo a proteína de liga-ção desagregada de interesse.

Sistemas de Ensaio para Avaliar a Atividade bioló-gica Das Proteínas de Ligação Desagregadas

As proteínas de ligação que são desagregadas poremprego das composições e métodos revelados aqui podem sertestadas quanto a atividade biológica por várias metodologi-as apropriadas na arte incluindo, de modo geral, sistemas deensaio para avaliar a atividade de ligação específica e afi-nidade, bem como sistemas de ensaio para avaliar outras ati-vidades funcionais. Conforme usado aqui, os termos "funcio-nalmente ativo" e "atividade funcional" se referem às ativi-dades biológicas e/ou imunológicas específicas, alvo da pro-teína de ligação não agregada, nativa.

Por exemplo, o produto SMIP™ específico de CD20desagregado pelos métodos exemplares apresentados aqui exibeníveis substanciais de ligação específica ao antígeno CD20aexpressos na superfície da linhagem de célula WIL-2S, bemcomo, níveis substanciais de atividade de citotoxicidade de-pendente de complemento (CDC) , em um ensaio de fixação decomplemento in vitro, como comparado ao produto SMIP nãotratado.

Os sistemas de ensaio que se seguem para avaliara funcionalidade das proteínas de ligação desagregadas iso-ladas por emprego das composições e métodos apresentados a-qui são providos como exemplo e não como limitação.

Sistemas de Ensaio para Medir Morte Celular Necrótica

A necrose é um processo passivo onde a parada dahemostase interna conduz ã dissolução celular envolvendo umaperda de integridade da membrana do plasma e intumescimentosubsequente, seguido por Iise da célula, Schwartz e outros,1993. A morte celular necrótica é caracterizada pela perdada integridade da membrana celular e permeabilidade aos co-rantes, tais como, iodeto de propidio (PI) que é conhecidopelos versados na técnica por se ligar ao DNA das célulassofrendo necrose primária e secundária. Vitale e outros,Histochemistry 100:223-229 (1993) e Swat e outros, J. Immu-nol. Methods 137:79-87 (1991). A necrose pode ser distingui-da da apoptose pelo que, as membranas celulares permanecemintactas nos estágios anteriores da apoptose. Como uma con-seqüência, ensaios de exclusão de corante usando PI podemser usados em paralelo um ensaio para apoptose, conformedescrito a seguir, a fim de distinguir a morte celular apop-tótica da necrótica. Ensaios de citometria de fluxo com baseem um separador de células ativado por fluorescência (FACS)usando PI permite a avaliação rápida e quantificação da por-centagem das células necróticas.

Sistemas de Ensaio para Medir a Morte Celular A-poptótica

A detecção da morte celular programada ou apoptosepode ser realizada conforme será apreciado por um versado natécnica. A porcentagem de células sofrendo apoptose pode sermedida em vários períodos de tempo após estímulo da apoptosecom ou sem administração de uma proteína de ligação desa-gregada por emprego das composições e métodos revelados a-qui. A morfologia das células sofrendo morte de célula apop-tótica é geralmente caracterizada por uma contração do cito-plasma da célula, além de núcleo, condensação e fragmentaçãoda cromatina. Wyllie e outros, J. Pathol. 142:67-77 (1984);

Sistemas de Ensaio para Medição da Afinidade deLigação Específica com o Alvo e Especificidade

As proteínas de ligação desagregadas por empregodas composições e métodos revelados aqui podem também sertestas quanto a afinidade de ligação específica com o alvo eespecificidade e comparadas à afinidade de ligação e ativi-dade da proteína nativa.

Proteínas de ligação podem ser testadas quanto aafinidade de ligação ao antígeno exemplar e/ou especificida-de por qualquer uma das metodologias que se encontram atual-mente disponíveis na arte. Por exemplo, superfícies revesti-das com antígeno e anticorpo de células convencionais, Wes-tern blotting e procedimentos ELISA podem ser empregados pa-ra realizar a etapa de classificação quanto às proteínas deligação que possuem uma especificidade particular. Uma amplafaixa de técnicas de imunoensaio apropriadas está disponívelconforme pode ser visto com referência às Patentes US núme-ros 4.016.043, 4.424.279, e 4.018.653, cada uma das quaissendo incorporada aqui como referência.Em um tipo de ensaio, um anticorpo de proteína an-tiligação não marcado é imobilizado sobre um suporte sólidoe a proteína de ligação desagregada a ser testada é colocadaem contato com o anticorpo imobilizado. Após um período detempo apropriado suficiente para permitir a formação de umprimeiro complexo, uma molécula alvo marcada com uma molécu-la repórter capaz de produzir um sinal detectável é entãoadicionada e incubada, permitindo tempo suficiente para aformação de um segundo complexo de anticorpo imobiliza-do/proteína de ligação/molécula alvo. 0 material não comple-xado é lavado e a presença da molécula alvo é determinadapor observação de um sinal produzido pela molécula repórter.

Os resultados podem tanto ser qualitativos, por observaçãosimples do sinal visível, quanto podem ser quantitativos,por comparação com uma amostra de controle contendo quanti-dades conhecidas de proteína de ligação nativa.

Em um segundo tipo de ensaio, uma molécula alvo aqual a proteína de ligação especificamente se liga é unida aum suporte sólido. Os processos de ligação são bem conheci-dos na arte e geralmente consistem em reticulação, ligaçãocovalente ou adsorção física da molécula alvo em relação aosuporte sólido. A amostra contendo proteína de ligação desa-gregada a ser testada é então adicionada ao complexo de fasesólida e incubada por um período de tempo suficiente (porexemplo, 2-40 minutos ou por toda a noite, se for mais con-veniente) e sob condições apropriadas (por exemplo, de cercada temperatura ambiente para cerca de 38 °C, tal como 25°C)para permitir ligação da proteína de ligação à molécula al-νο. Seguindo-se o período de incubação, o suporte sólido élavado e seco e incubado com a proteína de ligação-anticorpoespecífico ao qual uma molécula repórter pode ser anexada,pelo que, permitindo a detecção da ligação da proteína deligação-anticorpo específico à proteína de ligação desagre-gada complexada com relação à molécula alvo imobilizada.

O termo "suporte sólido" conforme usado aqui, serefere, por exemplo, às placas de microtitulação, membranase microesferas, etc. Por exemplo, tais suportes sólidos po-dem ser fabricados de vidro, plástico (por exemplo, polies-tireno), polissacarídeos, náilon, nitrocelulose ou teflon,etc. A superfície de tais suportes pode ser sólida ou porosae de qualquer forma conveniente. Suportes sólidos apropria-dos incluem vidro ou um polímero, os polímeros mais comumen-te usados sendo celulose, poliacrilamida, náilon, poliesti-reno, cloreto de polivinila ou polipropileno. Os suportessólidos podem estar na forma de tubos, microesferas, discosou microplacas ou qualquer outra superfície para condução deum imunoensaio.

Um sistema de ensaio alternativo envolve a imobi-lização da proteína de ligação desagregada e exposição daproteína de ligação imobilizada a uma molécula alvo que podeou não ser marcada com uma molécula repórter. Conforme usadoaqui, o termo "molécula repórter" se refere a uma moléculaque, por sua natureza química, bioquímica e/ou física, provêum sinal analiticamente identificável que permite a classi-ficação das proteínas de ligação complexas com moléculas al-vo ou com segundos anticorpos. A detecção pode ser qualita-tiva ou quantitativa. As moléculas repórter empregadas demodo geral nos ensaios do tipo revelado aqui são enzimas,fluorforos, radioisótopos e/ou moléculas quimioluminecentes.

No caso de um imunoensaio de enzima (EIA), uma en-zima é conjugada no anticorpo de detecção ou molécula alvo,de modo geral por meio de glutaraldeido ou periodato. Con-forme será prontamente reconhecido, contudo, existe uma am-pla variedade de diferentes técnicas de conjugação que sãoprontamente disponíveis aos versados na técnica. As enzimasgeralmente empregadas incluem peroxidase de rábano silves-tre, glicose oxidase, β-galactosidase e fosfatase alcalina.Em geral, o anticorpo marcado com enzima é adicionado a umcomplexo em potencial entre uma molécula alvo e uma proteínade ligação, deixado se ligar e então lavado para remover oexcesso de reagente. A solução contendo o substrato apropri-ado é então adicionada ao complexo de antígeno alvo/proteínade ligação desagregada/anticorpo marcado. O substrato reagecom a enzima ligada ao anticorpo marcado, fornecendo um si-nal visual qualitativo que pode ser adicionalmente quantifi-cado, geralmente espectrofotometricamente, para indicar aatividade da proteína de ligação desagregada presente na amostra.

Alternativamente, os compostos fluorescentes,tais como, fluoresceína e rodamina ou proteínas fluorescen-tes, tais como, ficoeritrina, podem ser quimicamente acopla-dos aos anticorpos, sem alterar sua capacidade de ligação.Quando ativados por iluminação com luz de um comprimento deonda específico, o anticorpo marcado com fluorcromo absorvea energia da luz, induzindo um estado de excitabilidade namolécula, seguido por emissão da luz em uma cor caracterís-tica, visualmente detectável com um microscópio de luz ououtros instrumentos ópticos. Como no EIA, o anticorpo mar-cado fluorescente é deixado se ligar ao complexo de antíge-no-anticorpo. Após remoção do reagente não ligado, o comple-xo terciário remanescente é exposto à luz de comprimento deonda apropriado. A fluorescência observada indica a presençada proteína de ligação unida de interesse.

Técnicas de imunofluorescência e EIA são ambas bemestabelecidas na técnica. Será entendido que as outras molé-culas repórter, tais como, radioisótopos e moléculas quimi-luminescentes e/ou bioluminescentes podem também ser apro-priadamente empregadas nos métodos de classificação revela-dos aqui.

Os exemplos que se seguem servem para descrevermais completamente a maneira de uso da invenção descrita a-cima, bem como estabelece os melhores modos contemplados pa-ra realizar vários aspectos da invenção. Esses exemplos, demodo algum, devem limitar o escopo verdadeiro dessa inven-ção, porém ao invés disso, são apresentados para fins ilustrativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Sistema de Cromatografia de Líquido de Alto Desem-penho de Exclusão por Tamanho (SEC-HPLC) para a Separação deAgregados de Proteína e Proteína Não AgregadaEsse Exemplo demonstra um sistema de cromatografiade liquido de alto desempenho de exclusão por tamanho (SEC-HPLC) para separar agregados multiméricos de proteína daproteína de interesse não agregada, ativa (POI) para um pro-duto SMIP™ específico para CD20 exemplar.

As amostras de um produto SMIP™ específico paraCD20 foram analisadas por cromatografia de líquido de altodesempenho de exclusão por tamanho (SEC-HPLC; coluna Progel-TSK G3000 SWXL HPLC; Tosoh Bioscience LLC, Montgomeryville,PA) e áreas máximas integradas. Vide Tabela 1 quanto aos pa-râmetros operacionais de SEC-HPLC.

Tabela 1

<table>table see original document page 42</column></row><table>A faixa linear para o produto a granel do produtoSMIP™ especifico para CD20 empregando a coluna TSK G30OOSWXLfoi determinada como 10 μg para 500 μg (r2 ^ 0,99), com ca-pacidade de repetição aceitável da pureza relativa atravésda faixa de 50 μg a 500 μg (sd ^ 0,1 %). As interações entreo produto e a matriz da coluna foram observadas como resul-tando em uma subestimativa do peso molecular para a POI doproduto SMI™ especifico para CD20 (81 kDa em comparação aopeso teórico de 107 kDa para o produto SMIP™ especifico paraCD20 dimérico) e leve diminuição da máxima da proteína deinteresse.

A inspeção visual dos gráficos de linearidade mos-trou que a resposta de área máxima foi linear até uma cargade 500 μg (dados não mostrados) . Um resumo dos resultadosgerados pela análise de reagreção é mostrado na Tabela 2. Aanálise de regressão realizada nos dados de área máxima daPOI para cargas de 9 μg a 4 91 μg forneceu um quadrado do co-eficiente de correlação (r2) de 0, 997 e um valor de inter-ceptação de 41,65 de unidades de área máxima. A resposta a-través da faixa de carga de 9 a 491 μg forneceu lineari-dade aceitável (r2 > 0,99).

Tabela 2

Análise de Regressão da Carga de 9 μς a 491 μς eÁrea Máxima para 130 L de Produto a Granel "Proteína de In-teresse" para um Produto SMIP™ específico para CD-20

<table>table see original document page 43</column></row><table>As Figuras IA e IB apresentam traços cromatográfi-cos mostrando a eluição dependente do tempo dos agregados deproteína e POI para um produto SMIP™ específico para CD20exemplar de uma coluna de cromatografia de Proteína A eluídacom uma etapa simples da Proteína A em pH 5. Os dados apre-sentados na Figura IB foram obtidos com a mesma proteína deligação aplicada à coluna seguindo-se um tratamento de 20horas com uma solução compreendendo 25 mM NaCl, 25 mM de Na-OAc, 3M uréia em pH 5. A %P0I obtida na Figura IA foi de46,8% (vide Tabela 3), considerando-se que a %P0I obtida naFigura IB foi de 80,1% (vide Tabela 4).

Tabela 3

Separação SEC-HPLC de Agregados de Produto SMIP™

específico para CD20 do Produto SMIP™ específico para CD20Não Agregado em 25 mM de NaCl/25 nM de NaOAc, pH 5

<table>table see original document page 44</column></row><table>Tabela 4

Separação SEC-HPLC de Agregados de Produto SMIP™específico para CD20 do Produto SMIP™ específico para CD20Não Agregado em 25 mM de NaCl/25 nM de NaOAc, 3 M Uréia

<table>table see original document page 45</column></row><table>

Exemplo 2

Aumento Dependente da Composição na Desagregaçãopara um Produto SMIP™ específico para CD20

Esse exemplo demonstra que composições compreen-dendo várias concentrações de caótropo nas soluções tampãoácido compreendendo NaOAc e NaCl são eficazes para o aumentodo rendimento de proteína de interesse desagregada, ativa(POI) para um produto de SMIP™ específico para CD20.

Em um primeiro experimento, uma amostra de 10 mLde um eluato de Proteína A de 16,3 mg/m de um produto SMIPespecífico para CD20 foi dialisada por toda a noite contra1 litro de salmoura de fosfato tamponada (PDS), pH 7,0. Emparalelo, uma segunda amostra de 10 mL do mesmo eluato deProteína A de 16,3 mg/mL do produto de SMIP™ especifico paraCD20 exemplar foi dialisado por toda a noite contra 1 litrode 25 mM de NaOAc/ 25 mM de NaCl, pH 5,0.

Cada amostra foi removida da diálise, diluída para5 ou 10 mg/mL no respectivo tampão de diálise e ajustada pa-ra uma concentração final de uréia de 0 M, 3 M, ou 4M paraum total de 12 amostras. Essas amostras foram incubadas atemperatura ambiente por 22 horas.

10 μΐ. de cada uma das 12 amostras foram analisadospor cromatografia de líquido de alto desempenho de exclusãopor tamanho (conforme descrito no Exemplo 1) e as áreas má-ximas foram integradas. A área máxima relativa da Máxima deInteresse (POI) de controle de uréia 0 M em tempo de reten-ção de ~8,8 minutos foi ajustada em 100% e aumento relativonas áreas do grupo experimental POI foi colocado em gráficopara cada amostra. Vide Figura 2.

No segundo experimento, o curso de tempo para de-sagregação de um produto SMIP™ específico para CD20 exemplarfoi determinado em pH 4,0, pH 5,0 e pH 6,0 com 3 M e 4 M deuréia. 8 mL de Eluato de Proteína A do Produto SMIP™ especí-fico para CD20 em 16,3 mg/mL foram dialisados por toda anoite contra 500 mL de 25 mM de NaOAc/25 mM de NaCl em pH4,0, 5,0, ou 6,0. As três amostras foram diluídas com o res-pectivo tampão de diálise e uréia a uma concentração finalde 8 mg/mL Produto SMIP™ específico para CD20 e 0 M, 2 M, 3M ou 4 M uréia. As amostras de 0 M uréia foram analisadaspor SEC HPLC e as áreas máximas de POI foram estabelecidascomo sendo o ponto de tempo t = 0. 12 μί de amostras de con-centração de uréia de 2 M, 3 M e 4 M em pH 4,0, 5,0, e 6,0foram injetados e analisados seqüencialmente por SEC HPLC,com toda a seqüência repetida no curso de ~24 horas. A áreamáxima total da POI foi colocada em gráfico contra o tempode injeção para criar um curso de tempo de desagregação nes-sas 9 condições. Os resultados desse experimento são resumi-dos na Figura 3.

Em um terceiro experimento, a desagregação depen-dente de uréia de um produto SMIP™ especifico para CD20 e-xemplar foi medida em pH 5, em 3 M de uréia e em pH 6 em 4 Mde uréia. Duas amostras de 2 mL do eluato de Proteína A doproduto SMIP™ específico para CD20 exemplar em 16,3 mg/mLforam dialisadas por toda a noite contra 300 mL de 25 mM deNaO Ac/25 mM de NaCl em pH 5,0 ou pH 6,0, respectivamente. Aamostra de pH 5,0 foi ajustada para 8 mg/mL de produto SMIP™específico para CD20 e 3 M de uréia em tampão contendo 25 mMde NaOAc/25 mM de NaCl em pH 5,0. A amostra de pH 6,0 foiajustada para 8 mg/mL de produto SMIP™ específico para CD20e 4 M de uréia em tampão contendo 25 mM de NaOAc/25 mM deNaCl em pH 6,0. Essas amostras foram incubadas a temperaturaambiente por ~20 horas. Ambas as amostras foram trocadas emPBS por diálise de 5 horas. Ambas as amostras foram analisa-das por SEC HPLC e as áreas de POI total e % POI do to-tal foram colocadas em gráfico de barra. Vide Figura 4.

Exemplo 3

Caracterização In vitro de um SMIP™ Específicopara CD20Esse exemplo demonstra a atividade in vitro de umproduto SMIP™ especifico para CD20 desagregado pelas compo-sições e métodos da presente invenção.

0 efeito citotóxico de um produto SMIPT(M) especí-fico para CD20, em combinação com complemento, nas célulascancerígenas, é medido com base na redução metabólica celu-lar do corante AlamarBlue™. Uma linhagem de célula de linfo-blastóide B humana, WIL-2-S, é empregada em combinação comum produto SMIP™ especifico para CD20, exemplar, e comple-mento de coelho em um formato de 96 poços. Os controles a-propriados e concentrações de amostra de produto são adicio-nados e deixados incubar a 370C, 5% de CO2. A solução de co-rante AlamarBlue™ é então adicionada. 0 corante é reduzidopor metabolismo celular em uma forma que é lida fluormetri-camente em um ponto de tempo ajustado. As unidades de fluo-rescência relativa (RFUs) são diretamente proporcionais aonúmero de células viáveis em cada amostra.

A afinidade alvo do produto SMIP™ especifico paraCD20 exemplar em uma linhagem de célula expressando CD20 émedida com base na fluorescência relativa de uma coloraçãoconjugada de isotiocianato de fluoresceína (FITC) que se li-ga ao produto SMIP™ especifico para CD20 em um modo depen-dente de dose. Uma linhagem celular de linfoblastódie B hu-mano, WIL2-S, é incubada com várias diluições do produtoSMIP™ especifico para CD20, que permitem ligação ao alvo ce-lular. As células são lavadas para remoção de qualquer pro-duto SMIP™ específico para CD20 não ligado e coloridas paradetecção da proteína de ligação. As células são lavadas pararemoção de qualquer coloração não ligada e analisadas porcitometria de fluxo (FACS) quanto a intensidade de fluores-cência média geométrica de FITTC (GMFI). Os dados são ajus-tados para curvas de 4 parâmetros e os valores ED50 calcula-dos. Os resultados são reportados como % de Potência Relati-va (padrão de amostra versus referência).

Exemplo 4

Caracterização In vivo de um Produto SMI™ especi-fico para CD20 Desagregado

Esse Exemplo revela um sistema de modelo animal decélula tumoral Ramos para avaliar a atividade in vivo de umproduto SMIP™ especifico para CD20, desagregado pelas compo-sições e métodos da presente invenção.

Células Ramos são cultivadas para confluência a-propriada e viabilidade superior a 90%, colhidas e lavadas 2χ com PBS estéril. As células colhidas são resuspensas a umnúmero apropriado de células para injeção (isto é, 100μL/camundongo; para 5 χ IO6 células/camundongo, as célulassão resuspensas para 5 χ IO7 células/mL) e mantidas em geloaté a injeção. Usando uma agulha 27G de 1,27 cm, 100 μΐϋ desuspensão de célula foram injetados subcutaneamente no flan-ço direito do camundongo, o que fornece tipicamente uma bo-lha visível. Os camundongos são observados diariamente quan-to ao crescimento do tumor. Os tumores são tipicamente esta-belecidos quando alcançam ~150-300 mm3.

No dia 0, os animais são classificados e agrupadosde acordo com o tamanho do tumor (usando software LabCat;Innovative Programming Associates, Inc., Princeton, NJ) e ospesos corpóreos são registrados Os tumores são medidos 2 a 3vezes por semana e os pesos corpóreos monitorados semanal-mente. Os animais são mantidos até os tumores alcançarem nãomais de 1.500 mm3. Os animais são sacrificados se ocorre ul-ceração do tumor, se existir perda extrema de peso corpóreo,se o tumor exceder a 1.500 mm3 e/ou se o tumor inibir a mo-bilidade do animal. Os estudos são tipicamente terminadosapós o 90° dia.

Claims (20)

1. Composição, para desagregação de uma proteínade ligação, a composição CARACTERIZADA pelo fato de que com-preende um sal a uma concentração entre cerca de 1 mM e cer-ca de 100 mM e um agente caotrópico a uma concentração entrecerca de 0,1 M e cerca de 8M, onde a composição possui um pHentre cerca de pH 4 e cerca de pH 7.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que o sal é uma concentração en-tre cerca de 10 mM e cerca de 25 mM.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que o sal é selecionado do grupoconsistindo em NaCl e NaOAc.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que o agente caotrópico é umaconcentração entre cerca de 3 M e cerca de 5 M.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que o agente caotrópico é sele-cionado do grupo consistindo em guanidina, arginina e uréia.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição possui um pH en-tre cerca de pH 5 e cerca de pH 6.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que compreende, adicionalmente,um agente de redução selecionado do grupo consistindo emcloridrato de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) , beta-mercaptoetanol (BME), ditiotreitol (DTT) e glutationa (GSH).

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que compreende, adicionalmente,um agente quelante selecionado do grupo consistindo em DTPA,EDTA e NTA.

9. Método, para a desagregação de uma proteína deligação, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreendeas etapas de:a) suspensão da mistura compreendendo uma proteínade ligação não agregada e uma proteína de ligação agregada auma concentração entre cerca de 0,1 mg/m e cerca de 50 mg/mLem uma composição compreendendo um sal em uma concentraçãoentre cerca de 1 mM e cerca de 100 mM e um agente caotrópicoa uma concentração entre cerca de 0,1 M e cerca de 8 M, peloque, provendo uma suspensão da proteína de ligação;b) ajuste do pH da suspensão da proteína de liga-ção para um pH entre cerca de pH 4 e cerca de pH 7; ec) mantendo a suspensão da proteína de ligação auma temperatura entre cerca de -IO0C e cerca de 500C porcerca de 5 horas e cerca de 24 horas, pelo que, aumentando aporcentagem da proteína de ligação não agregada e diminuindoa porcentagem da proteína de ligação agregada.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende, adicionalmente, aetapa de troca da suspensão da proteína · de ligação em umsistema tampão compreendendo um sal, onde o sistema tampãoestá em um pH de cerca 5.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende, adicionalmente, aetapa de separação da proteína de ligação não agregada daproteína de ligação agregada.

12. Método, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de ligação é sele-cionada do grupo consistindo em um ligante de proteína, umreceptor solúvel, um anticorpo, um fragmento de anticorpo,um anticorpo de cadeia simples de fragmento variável (scFv),e um produto imunofarmacêutico modular pequeno.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de ligação é sus-pensa a uma concentração entre cerca de 1 mg/mL e cerca de 50 mg/ml.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato de que a concentração de sal estáentre cerca de 10 mM e cerca de 25 mM.

15. Método, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato de que o sal é selecionado do grupoconsistindo em NaOAc e NaCl.

16. Método, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente caotrópico está emuma concentração entre cerca de 3 M e cerca de 5 M.

17. Método, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente caotrópico é sele-cionado do grupo consistindo em guanidina, arginina e uréia.

18. Método, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato de que a suspensão da proteína deligação é ajustada a um pH entre cerca de pH 5 e cerca de pH 6.

19. Método, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de ligação possuiafinidade de ligação específica com uma proteína alvo sele-cionada do grupo consistindo em CD20, VEGF, Her2, EGFR eCD37.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de ligação é umproduto imunofarmacêutico modular pequeno onde o produto i-munofarmacêutico modular pequeno se liga à proteína alvo comuma constante de dissociação na faixa de pelo menos 10~6-10~9 M.