HU218144B - Eljárás dimer, biológiailag aktív TGF-béta-szerű fehérje előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás dimer, biológiailag aktív transzformálónövekedési faktor ?-típusszerű (TGF–?szerű) fehérje vagy sójaelőállítására. A találmány értelmében úgy járnak el, hogy a TGF–?-szerű fehérje denaturált monomer formáját újrahajtogatják egyredoxrendszer és a következő szolubilizálószerek valamelyikénekjelenlétében: enyhe detergens, mely lehetővé teszi a monomer TGF–?-szerű fehérje dimerizálás után biológiai aktivitást biztosító térbelikonformációba való hajtogatását a monomer oldható formában valótartása mellett; rövid szénláncú alkanol; rövid szénláncú alkándiolfoszfolipid; és két vagy több felsorolt szolubilizálószer keveréke. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás biológiailag aktív dimer TGF-β és TGF-β faktorok előállítására és ezt tartalmazó gyógyszerészeti készítmény előállítására.

A találmány szerinti eljárással előállított TGF-β különféle terápiás célokra alkalmazható. A találmány tárgya eljárás biológiailag aktív dimer TGF-β (transzformáló növekedési faktor, β típus) új TGF-p-k előállítására és ezeket tartalmazó gyógyszerészeti készítmény előállítására. A találmány szerinti eljárással előállított TGF-β alkalmazható sebgyógyulás segítésére és gyorsítására, csont- és szövetgyógyulás javítására, rákos megbetegedés kezelésére, csontvelővédő anyagként, szívvédelemben mediátoranyagként, gyulladásgátló szerként vagy immunszuppressziós szerként, illetve emlős sejtkultúrák növekedésének szabályozóanyagaként.

Két, növekedést módosító fehérjét jellemeztek eredetileg annak alapján, hogy ezek képesek reverzibilis módon emlőssejtek feneotipikus transzformációját indukálni in vitro, és ennélfogva a és β típusú átalakító növekedési faktornak nevezték őket [Anzano, M. A. és munkatársai (1983), PNAS, 80, 6264-6268]. Annak ellenére, hogy közös nevezéktanhoz tartoznak, a TGF-a és a TGF-β mind szerkezetileg, mind funkciójában teljesen különböző fehérje, és mindegyik a saját speciális receptorrendszerén keresztül hat. A TGF-α az epidermális növekedési faktorral (EGF) kompetitív anyag és ugyanahhoz a sejtfelületi receptorhoz kötődik [Todaro, G. J. és munkatársai (1980), PNAS, 77, 5258-5262], a TGF-α szekvenciájában homológ és hasonló aktivitású az EGF-faktorral [Marquardt, H. és munkatársai (1984), Science, 223, 1079-1082], és az anyagot 159 aminosavból álló transzmembrán prekurzorként szintetizálták, majd ezt fehérjebontó eljárással feldolgozták és egy 50 aminosavmaradékból álló peptiddé alakították [Dérynék, R. és munkatársai (1984), Cell, 38, 287-297], Mint mitosist okozó anyag embrionális kötőszövetsejtekben, a TGF-α számos átalakult sejtvonalban keletkezik, illetve emberi rákos megbetegedés esetében keletkezik, illetve felszabadul. Továbbá jelen van aktivált falósejtekben és más normál szövetekben is, és így szerepe a kóros szövetképződésben még nem tisztázott.

A TGF-β anyagot eredetileg homogén formában emberi vérlemezekből [Assoian, R. K. és munkatársai (1983), J. Bioi. Chem., 258, 7155-7160], emberi méhlepényből [Frolik, C. A. és munkatársai (1983), PNAS, 80, 3676-3680] és marhaveséből [Roberts, A. B. és munkatársai (1983), Biochemistry, 22,5692-5698] állították elő tisztítással. Meghatározták, hogy ez egy homodimer fehérje, amelynek molekulatömege 25 000 D. Eleinte azzal jellemezték, hogy az EGF vagy TGF-β faktorokkal szinergetikusan indukálja rögzítéstől független növekedését a nem transzformált NRK sejteknek. Újabban kimutatták, hogy a TGF-β számos szabályozó hatást fejt ki igen széles körben normál és daganatos sejtek esetében, amely jelzi, hogy ez a fehérje multifunkciós szabályozója a sejtaktivitásnak. A TGF-β stimulálhatja a mitogenezist, a sejtburjánzást és -növekedést, vagy hatásosan inhibiálhatja ezeket a folyamatokat. Továbbá más hatásokat is kifejthet, és például szabályozhatja a zsírképződést, az izomfehérjeképződést, a porcképződést, a csontképződést és az immunsejt funkcióit. Stimulálhatja a chemotaxist, a sejt vagy szövet típusától függően indukálhatja vagy inhibiálhatja a sejtdifferenciációt, illetve az egyéb növekedési faktorok jelenlétének vagy hiányának függvényében. A TGF-β számos hatása a sejtek stressz vagy sérülés hatására kifejtett válaszára kifejtett válaszával kapcsolatos, illetve azon törekvésével kapcsolatos, hogy ezeket a sérüléseket kijavítsa. Gyulladás után a TGF-β fő szerepet játszik a sarjadzásos szövet képződésében, megnöveli a gének szerepét, amelyek kapcsolatosak extracelluláris mátrixképzéssel, mint például fibronektin-, kollagén-, valamint számos proteázinhibitor-képzéssel és stimulálja fibroblaszt segítségével a kollagénmátrix kontrakcióját, ami azt a feltételezést eredményezi, hogy bizonyos szerepet játszik a kötőszövet-kontrakcióban [Roberts, A. és Spom, Μ. B. (1988), Adv. Cancer Rés., 51, 107-145; Spom, Μ. B. és Roberts, A. (1989), J. Amer. Med. Assoc., 262, 938-941].

Mostanáig három eltérő típusú TGF-β anyagot klónoztak és szekvenciaanalízissel szerkezetüket meghatározták. Ezek a TGF-βΙ, a ΤΰΡ-β2 és a ΤΰΡ-β3, amelyek funkcionalitásban igen közeli jellemzőjűek és nagyfokú keresztreaktivitást mutatnak receptoraikon. Valamennyi TGF-β anyagot mint 390-412 aminosavat tartalmazó prekurzort szintetizálták, majd ez fehérjebontó hasításnak vetették alá, és így monomer formákat állítottak elő. A monomer formák C-terminális 112 aminosavból állnak. Érett, biológiailag aktív formában a TGF-β vegyületek sav- és hőstabil diszulfidhíddal összekötött homodimerek, amelyek a két 112 aminosav ból álló polipeptidláncból keletkeznek. Az emberi [Dérynék, R. és munkatársai (1985), Natúré, 316, 701-705] az egér [Dérynék, R. és munkatársai (1986), J. Bioi. Chem., 261, 4377-4379] és emberszabású majom [Sharples, K. és munkatársai (1987), DNA, 6, 239-244] eredetű TGF-β 1 figyelemre méltó szekvenciamegőrzést mutat és csak egyetlen aminosavmaradékban különböznek egymástól. Az emberi TGF-βΙ és emberi TGF^2 [deMarin, R. és munkatársai (1987), EMBO J., 6, 3673-3677; Marquardt, H. és munkatársai (1987), J. Bioi. Chem., 262, 12 127-12 131] és emberi TGF^3 [Ten Dijke, P. és munkatársai (1988), PNAS, 85. 4715-4719] összehasonlítása kimutatta, hogy a három fehérje érett formában körülbelül 70-80% aminosavszekvencia-azonosságot mutat. A heterodimer TGF-β 1.2 anyagot disznóvérlemezből izolálták, és ez egy TGF-β 1 alegységet tartalmaz, amely diszulfidhíddal kötött egy másik ΤΟΡ-β2 alegységhez [Cheifetz, S. és munkatársai (1987), Cell, 48,409-415],

Az utóbbi időben kísérletet tettek, hogy a TGF anyagokat rekombinációs technika alkalmazásával állítsák elő ahelyett, hogy ezeket természetes forrásokból izolálnák (például vérlemezkékből), abból a célból, hogy kellő mennyiségű anyagot nyeljenek ahhoz, hogy különböző terápiás vizsgálatokban vizsgálhassák azokat. Azonban kiderült, hogy igen nehéz rekombinációs TGF-β anyagot szintetizálni úgy, hogy biológiai affinitását megőrizze. Mint az kitűnik a szekvencialistából, a SEQ ID No.

HU 218 144 Β

1, 2 és 3 esetben a TGF-βΙ, a TGF^2 és TGF^3 érett formájában található 112 aminosav közül 9 tisztein. Ezek közül legalább néhány lánc közti vagy láncon belüli diszulfidkötés-képzésben reagál, és így az anyag komplex térbeni szerkezetét határozza meg, amely szükséges a biológiailag aktív dimer molekulák létrejöttéhez. Az idegen fajból származó TGF^-előállítás olyan termékhez vezetett, amely ugyan az elsődleges szerkezetben korrekt, azonban másodlagos és harmadlagos szerkezete nem megfelelő és így nem rendelkezik biológiai aktivitással. A mai napig a TGF-β anyagok másodlagos és harmadlagos szerkezete nem ismert.

Tekintettel a TGF-β molekulák komplex szerkezetére, általában az a vélemény, hogy az adott TGF-β géneket magasabb rendű szervezetekben kell létrehozni. Az emberszabású majom és ember TGF-β 1 géneket kínaihörcsögpetefészek-sejtekben (CHO), SV40 promotor szabályozásával állították elő, amelyet a 292.785 számú, illetve a 200.341 számú európai szabadalmi bejelentésben írtak le. Ugyanilyen sejtkészítményben rekombinációs TGF-32 is előállítható, amint ezt a 268.561 számú európai szabadalmi bejelentésben és a 38.33897 számú németországi szabadalomban leírták. Eukarióta rendszerben fúziós ΤΟΕ-β3 (TGF-β 1 fehérjével) fehérjét állítottak elő, amelyet a 267.463 számú európai szabadalmi bejelentésben írtak le.

Habár eukarióta sejtek segítségével rekombinációs TGF-β anyagok állíthatók elő, a biológiailag aktív és megfelelően térben hajtogatott anyag termelése messze van a kielégítő értéktől. Másrészt nem tűnik valószínűnek, hogy biológiailag aktív TGF-β anyagot lehet nyerni úgy, hogy a megfelelő gént mikrobiális gazdasejtbe ültetjük, mivel például a baktériumban a sejten belüli körülmények nem megfelelőek ahhoz, hogy a keletkezett fehérje megfelelő térbeli szerkezetű legyen, hogy diszulfidkötés keletkezzen és diszulfidstabilizált dimerizáció történjen, amely nyilvánvalóan a biológiai aktivitás alapvető feltétele. így például csak igen kis mennyiségű biológiailag aktív TGF-32 nyerhető úgy, hogy a megfelelő gént E. coli baktériumba ültetik lambdapromotorszabályozással, amint ezt a 268.561 számú európai szabadalmi bejelentésben leírták. Ezt az aktivitáshiányt annak tulajdonítják, hogy a biológiailag aktív dimer ΤΟΡ-β2 forma nem keletkezik spontán módon a monomer elsődleges másolatformából, amikor a baktérium sejten belüli redukáló környezetbe kerül. Egy más közleményben leírták, hogy amennyiben a TGF-β cDNS génjét E. coli baktériumba ültetik trp promotorszabályozással, ezzel radioaktívan jelzett fehérjecsíkot tudnak előállítani, amelynek látszólagos molekulasúlya 13 000 D, SDS-poliakrilamidgél autoradiogram szerint. De nem mérték biológiai aktivitását [Urushizaki, Y. és munkatársai (1987), Tumor Rés., 22,41-55].

Baktériumrendszerekben (mint például E. coli) nagy koncentrációjú rekombinációs fehérjék keletkeznek ugyan, de ezek igen gyakran nagyon oldhatatlan sejten belüli csapadékot képeznek, amelyet zárványtestekként vagy refrakciós testekként adnak meg [Brems, D. N. és munkatársai (1985), Biochemistry, 24, 7662], amely anyagokat láthatóan fényes foltként érzékelhetünk a sejtekben bezárva fáziskontraszt-mikroszkóp segítségével, egészen ezerszeres nagyításig. A zárványtestek, amelyeket könnyen elválaszthatunk az oldható baktériumfehérjéktől, a rekombinációs fehérjét tartalmazzák zömében denaturált és redukált formában, amely nem fejt ki biológiai aktivitást, amelyet a természetes forma kifejt, és ennélfogva nem alkalmas kereskedelmi termékként.

Ennélfogva általában úgy vélik, hogy a rekombináns refrakciós fehérjét oldani kell olyan körülmények között, amelyek alkalmasak arra, hogy fenntartsák ennek denaturált formáját, majd ezt követően megfelelően térben hajtogatni kell, és így biológiailag aktív háromdimenziós szerkezetet kell létrehozni. Olyan konformációt, amely viszonylag gyenge atomok közötti erőkkel, mint például hidrogénkötésekkel, hidrofób kölcsönhatásokkal és töltéskölcsönhatásokkal stabilizált. A ciszteint tartalmazó fehérjék esetében ez az eljárás továbbá diszulfídkötések képzését is tartalmazhatja. Amennyiben a diszulfidhidak képzését kémiailag elősegítik, a nem megfelelő intramolekuláris és dimer vagy multimer proteinek esetében intermolekuláris hidak képződését meg kell akadályozni vagy legalábbis minimálisra kell csökkenteni, mivel a nem kívánt, nem megfelelően térben hajtogatott izomerek keletkezése nem homogén anyagot eredményehet, amely bonyolítja a további fehérjetisztítást és a megfelelő szerkezetű fehérjekinyerést, vagy olyan fehérjét eredményez, amely csökkent biológiai aktivitású.

Számos közleményt publikáltak, amelyben leírták egyes baktérium gazdasejtek által termelt fehérjék térbeli hajtogatási eljárásait, illetve ezekre tett kísérleteket, illetve olyan fehérjékre vonatkozó kísérleteket, amelyek denaturált vagy nem aktív formájúak. A 88/8003 számú PCT bejelentésben, valamint Halenbeck R. és munkatársai (1989), Biotechnology, 7, 710-715 közleményében leírták az E. coli-6'άτι kifejezett biológiailag aktív humán kolóniastimuláló faktor-1-(CSF-1) képzést, amely dimer formájú. A leírt eljárás első lépésében leírták a zárványtestekből izolált CSF-1 monomerek redukáló körülmények között kaotróp környezetben, amely karbamidot vagy guanidin-hidrokloridot tartalmaz, történő kezdeti oldását, majd térbeli hajtogatását, amelyet a kaotróp hatóanyagok lépésenkénti hígításával értek el, majd végül a hajtogatott molekulák végső oxidációját levegő vagy redoxrendszer jelenlétében. A 88/8849 számú PCT bejelentésben leírtak egy eljárást rekombinációs interleukin-2-re (IL-2). Az eljárásban leírták, hogy a refrakciós testekből nyert IL-2-t denaturálták redukáló körülmények között 6 M guanidin-hidroklorid segítségével. Az oldható IL-2 anyagot szabályozott oxidáció segítségével Cu²⁺-ionok jelenlétében oxidálták, majd az oxidált IL-2 anyagot az oldatban a denaturálószer koncentrációjának csökkenésével hajtogatták. Az interleukin-2 és intgerferon-β (IFN-β) oldásra SDS és a teljesen redukált fehérjék oxidációs promotoraként Cu²⁺-ionok alkalmazásával újrahajtogatták (4.572.798 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom). A 4.620.948 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban leírtak rekombinációs refrakciós

HU 218 144 Β proteinek izolálására eljárást, amelyben a proteinek oldására erős denaturálószereket alkalmaztak, a megfelelő hajtogatás elősegítésére redukáló körülményeket alkalmaztak és levegő vagy más oxidálószerek jelenlétében a denaturálószert kicserélték, és így a diszulfidkötéseket újraképezték. A fenti eljárás alkalmazható például az alábbi fehérjékre: urokináz, emberi, marha és disznó növekedési hormon, interferon, szövet típusú plazminogén aktivátor, FMD burokfehérje, prorennin és src fehérje. A 86/5809 számú PCT bejelentésben eljárást írtak le nem hajtogatott fehérjék, amelyek lehetnek citochrom c, ovalbumin és trypsininhibitor naturálására, amelynek során a denaturált fehérjét reverzibilisen szilárd hordozóhoz kötik, majd lépésenként naturálják úgy, hogy a denaturálószert hígítják. Egy E. coli által termelt módosított monomer emberi vérlemezből származó növekedési faktort (PDGF) S-szulfonáltak tisztítás során abból a célból, hogy a tiolegységeket védjék, majd oxidálószerek jelenlétében dimerizálták, és így aktív fehérjét kaptak [Hoppé, J. és munkatársai (1989), Biochemistry, 28, 2956].

A fent idézett referenciák csak szűk körű reprezentatív példái a szakirodalomban megjelent nagyszámú közleménynek, amelyek különböző forrásból származó nem természetes fehérjék újrahajtogatásával foglalkoznak. A szakember másrészt felismeri, hogy az újrahajtogatási kísérletek sikeressége előzetesen nem jósolható. A sikertelen kísérleteket általában nem írják le. Egyáltalán nem vehető biztosra az, hogy a leírt újrahajtogatási körülmények bármelyike egy adott denaturált fehérje, mint például TGF-β esetében működik. Figyelembe véve azt a tényt, hogy a TGF-β dimer protein, amely 9 ciszteinegységet tartalmaz lánconként és ennélfogva számos intramolekuláris, valamint intermolekuláris diszulfidkötéssel rendelkezik, amelyek jelenléte az aktivitáshoz szükséges, különösen nehéz feladat, hogy biológiailag aktív TGF-β formát állítsunk elő monomer, denaturált vagy más módon nem aktív formából. Az irodalomban eddig nem írtak le semmilyen eljárást biológiailag aktív dimer TGF-β előállítására nem aktív formájából.

A találmány tárgya eljárás biológiailag aktív dimer TGF-β-szerű fehétje előállítására denaturált vagy más módon nem aktív formából. A találmány szerinti eljárást azon a meglepő tapasztalaton alapulva dolgoztuk ki, hogy jelentős mennyiségű kívánt dimer termék állítható elő, amennyiben a monomer fehérjeformát újrahajtogatási körülmények közé visszük. Meglepően azt tapasztaltuk, hogy az aktív dimer előállítását különböző körülmények között egylépéses eljárásban érhetjük el, amely sokkal jobbnak bizonyul, mint a korábban más fehérjék esetében leírt többlépéses újrahajtogatási eljárások.

A találmány tárgya eljárás dimer biológiailag aktív β típusú Átalakító Növekedési Faktor-(TGF^) szerű fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy a fenti TGF^-szerű fehérje denaturált monomer formáját újrahajtogatási körülmények közé visszük.

A „TGF^-szerű fehérje” elnevezés alatt TGF-βΙ, ΤΰΕ-β2 és ΤΰΡ-β3 emlős, mint például emberi vagy állati eredetű, például emberszabású majom-, egér-, disznó-, ló- vagy marhafehérjét értünk, valamint heterodimer TGF-β fehérjéket értünk, amelyek két különböző, egyenként 112 aminosavból álló alegységet tartalmaznak. Továbbá a meghatározásba beleértjük a TGF-β befoglaló családba tartozó, növekedést szabályozó fehérjéket, amelyek legalább 25%-ban megegyező szekvenciával rendelkeznek a TGF-βΙ, TGF-32 vagy TGF-[13 fehérjékkel összehasonlítva, mint például az emberi glioblastomasejtekből származó T-sejt szupressziós faktor [G-TsF; Wrann, M. és munkatársai (1987), EMBO J., 6, 1633-1636], BSC-1 majomvese sejt kondicionált közegből izolált növekedési inhibitor [polyegerin; Holley, R. W. és munkatársai (1980), PNAS, 77, 5989-5992; Ristow, H. J. (1986), PNAS, 83, 5531-5533], a marhacsontból izolált porcosodást indukáló fehérje [CIF-8; Seyedin, S. M. és munkatársai (1987), J. Bioi. Chem., 262, 1946-1949], csirkeembrió porcsejtből izolált ΤΟΕ-β4 [Jakowlew, S. B. és munkatársai (1988), Molecular Endocrinology, 2, 1186-1195] és Xenopus-Laevisből izolált TGF-βό [Kondaiah, P. és munkatársai (1990), J. Bioi. Chem., 265, 1089-1093], továbbá hasonló biológiai aktivitású fragmenseit és mutánsait a fenti fehérjéknek. Továbbá a „TGF^-szerű fehérje” elnevezésbe beleértjük az inhibin két formáját és az aktivin három formáját (ivarmirigy-fehérjét, amelyek szabályozzák a tüszőstimuláló hormontermelést a hypophysisben), a Mullerian-inhibiáló anyagot (MIS, amely inhibiálja emlős hím embriókban a Mullerian-csatoma kifejlődését), a csontmorfológiai fehérjéket (BMP, egy polipeptidcsoport, amely a porc- és csontképződés indukálásában játszik szerepet), a Drosophila decapentaplegic génkomplex másolatát (dpp, amely a légyembrió morphogenesisét szabályozza), a Vg-1 anyagot (a Xenopus transzkripció terméke, amely oocyták vegetatív anyagában van jelen) és a Vgr-1 anyagot, egy hasonló emlősgént [Mason, A. és munkatársai (1986), Biochem. Biohpys. Rés. Commun., 135, 957-964; Cate, R. és munkatársai (1986), Cell, 45, 685-698; Wozney, J. M. és munkatársai (1988), Science, 242, 1528-1534; Padgett, R. és munkatársai (1986), Natúré, 325, 81-84; Weeks, D. L. és Méltón, D. A. (1987), Cell, 51, 861-868; Lyons, K. és munkatársai (1989), PNAS, 86, 4554-4558],

Előnyös TGF^-szerű fehérjék az emberi TGF-βΙ [Dérynék, R. és munkatársai (1985), Natúré, 316, 701-705], az emberi ΤΰΡ-β2 [Marquardt, H. és munkatársai (1987), J. Bioi. Chem., 262, 12 127-12 131] és az emberi TGF^3 [Ten Dijke, P. és munkatársai (1988), PNAS, 85, 4715-4719], amelyek aminosavszekvenciáját a SEQ ID 1,2 és 3 alatt adjuk meg.

A TGF-3-szem fehérjéket eredetileg úgy határozták meg, hogy ezek a fehéijék képesek rögzítésmentes növekedését indukálni nem transzformált sejtvonalaknak [Tucker, R. F. és munkatársai (1983), Cancer Research, 43, 1581-1886] vagy képesek inhibiálni a daganatos sejtek növekedését [Roberts, A. B. és munkatársai (1985), PNAS, 82, 119-123]. A találmány szerinti leírásban „biológiai aktivitás” alatt az alábbiakat értjük:

HU 218 144 Β (a) normál Balb/c 3T3 fíbroblasztsejt-migrációra kifejtett promóciós aktivitás, amelyet úgy mérhetünk, hogy számláljuk a sejtek számát, amelyek „sérült” egyrétegű fenti sejtkultúrába vándorolnak szérummentes közegben, amely TGF-P-szerű fehérjét tartalmaz, összehasonlítva a bevándorló sejtek számával, amelyek a TGF-p-szerű fehérje jelenléte nélkül vándorolnak, vagy (b) normál Balb/c 3T3 fibroblasztsejtek növekedésére kifejtett promóciós hatás, amelyet úgy határozhatunk meg, hogy méljük a TGF-p-szerű fehéqe stimuláló hatását a sejt DNS-szintézisre és sejtosztódásra, (c) A375 melanomasejtek növekedésére kifejtett inhibiciós hatás, amelyet kolorimetrikusan határozhatunk meg, és amely meghatározza egy adott tenyésztési idő alatt TGF-p-szerű proteinnel kezelt sejtek számát, összehasonlítva a nem kezelt sejtek számával, (d) részleges vastagságú égett sebek gyógyulásának elősegítése hámképződés segítségével, idős egereken, amelyeket többször helyileg TGF-p-szerű fehéijével kezeltünk, a nem kezelt sebesülések gyógyulásával összehasonlítva, (e) teljes vastagságú vágott sebesülések gyorsított gyógyulásának vizsgálata, amelyet a bevágások húzási szilárdságával és szövettani analízisével határozunk meg felnőtt patkány állatokban, egyszeri TGF-P-szerű fehétje helyi kezelés alkalmazásával, összehasonlítva a nem kezelt sebesülések gyógyulásával, vagy (f) fibrózus sebszövet keletkezésének növekedése, amely a szövet jelentős erezettségének növekedésével jár együtt, felnőtt patkányokban végzett beültetések sebesülési kamráiban és ezek körül, miután többször lokálisan TGF-p-szerű fehérjét injektáltunk a kamrába, összehasonlítva a nem kezelt kontrollkamrákkal.

A monomer TGF-P-szerű proteinforma előállítható rekombinációs DNS-technológiával vagy szintetikusan, a szakirodalomban ismert eljárásokkal. A dimer forma az érett, biológiailag aktív molekula, amely két diszulfidkötéssel kötött polipeptidláncból áll.

A monomert újrahajtogatási eljárásnak vetjük alá, amely lehetővé teszi a biológiailag aktív dimer kinyerését. Ez az eljárás nem foglalja magában semmilyen változtatását az elsődleges szerkezetnek (azaz az aminosavszekvenciának) a monomerben, hanem háromdimenziós konformációs dimer termék képzése, amely a biológiai aktivitást hordozza. Az eljárásba beletartozik a diszulfidkötés képzése és a monomerek dimer szerkezetté való alakítása.

Mielőtt a monomer TGF-P-szerű fehérjét újrahajtogatási körülmények közé visszük, ennek denaturált (azaz nem hajtogatott) formában kell jelen lennie. A szakirodalomban jól ismert fehérjék denaturálásában hatásos úgynevezett kaotrop szerek vizes oldatban megfelelő koncentrációban megváltoztatják az adott fehérje térbeni konfigurációját úgy, hogy a felületét változtatják meg a fehérjének vagy a hidratálás fokának megváltoztatásával vagy az oldószer-környezet megváltoztatásával vagy az oldószer-felület kölcsönhatás megváltoztatásával. Ilyen kaotrop szerek vagy denaturálószerek például körülbelül 4-körülbelül 9 M koncentrációjú karbamid, guanidin-hidroklorid, nátrium-tiocianát, valamint detergensek, mint például SDS, amely utóbbit körülbelül 0,01-2% koncentrációban alkalmazunk. Ezen túlmenően a TGF-P-szerű fehérje vizes oldatának körülbelül 2-körülbelül 4 pH-értékre történő savanyítása, valamint például 10 pH-értékre történő lúgosítása magas hőmérsékleten a monomer denaturálását eredményezi.

Az „újrahajtogatás körülményei” alatt azt értjük, hogy olyan pufferkörülményeket biztosítunk, amelyben a denaturált monomer a biológiai aktivitásnak megfelelő konformációt veheti fel. Szokásos pufferrendszerek, mint például Tris-, foszfát- vagy citrátpufferek alkalmazhatók körülbelül 6-körülbelül 10 pH-érték mellett. Az újrahajtogatás körülményei között az intra- és interlánc közötti diszulfidkötés-képzést elősegítjük. Ezt a kötésképzést elősegíti oldást segítő szerek jelenléte és redoxirendszer jelenléte, amely segíti a folyamatos oxidációját és redukcióját a tiol/diszulfid rendszernek. Az alkalmazott pufferrendszer továbbá tartalmazhat alkalmas sókat is.

Alkalmas oldhatóságot segítő szerek lehetnek detergensek, előnyösen enyhe hatású detergensek, szerves, vízzel elegyedő oldószerek vagy foszfolipidek vagy bármely fenti anyagok keverékei.

A detergensek felületaktív vegyületek, mint például SDS, Triton vagy Tween, amelyeket a TGF-p-szerű fehérje hajtogatásához elegendő koncentrációban alkalmazunk. Előnyösen alkalmazható enyhe detergensek azok, amelyek lehetővé teszik a monomer TGF-βszerű fehérje hajtogatását megfelelő térbeni konformációvá, amely dimerizáció után a biológiai aktivitást biztosítja, miközben a monomert oldott formában tartják. Enyhe detergensek, amelyek a TGF-p-szerű fehérjéket oldatba viszik anélkül, hogy ezeket inhibiálnák, lehetnek nemionos detergensek (például digitonin), kationos detergensek {például N-[2,3-(dioleil-oxi)-propil]Ν,Ν,Ν-trimetil-ammónium; Düzgünes, N. és munkatársai (1989), Biochemistry, 28, 9179-9184} vagy anionos detergensek (például nátrium-kólát, nátrium-deoxikolát) vagy zwitterionos detergensek [például szulfobetainok (Zwittergent), 3-(3-klolamido-propil)-dimetilammonio-l-propánszulfonát (Chaps), 3-(3-klolamidopropil)-dimetil-ammonio-2-hidroxi-1 -propánszulfonát (Chapso)]. Ezek a detergensek az újrahajtogatásra alkalmazott pufferben körülbelül 1 -körülbelül 100 mM koncentrációban, előnyösen 30-60 mM koncentrációban vannak jelen. Előnyösen alkalmazható detergensek a zwitterionos detergensek, mint például a 3-(3-klolamido-propil)-dimetil-ammonio-l-propánszulfonát és a 3(3-klolamido-propil)-dimetil-ammonio-2-hidroxi-lpropánszulfonát. Legelőnyösebben alkalmazható detergens a 3-(3-klolamido-propil)-dimetil-ammonio1 -propánszulfonát.

Az újrahajtogatásra alkalmazott pufferben a detergenst szerves, vízzel elegyedő oldószerekkel helyettesít5

HU218 144 Β hetjük. Ilyen oldószerek például az acetonitril, a kis szénatomszámú alkanolok, mint például az etanol vagy izopropanol vagy kis szénatomszámú alkándiolok, előnyösen 2-4 szénatomszámú alkándiolok, mint például az etilénglikol, amelyeket 10-50 térfogat% mennyiségben alkalmazunk.

Más eljárásban a detergenst vagy a szerves, vízzel elegyedő oldószert foszfolipidekkel helyettesíthetjük. Ilyen alkalmazható foszfolipidek például a foszfatidiletanol-amin, a foszfatidil-kolin, a foszfatidil-szerin és a foszfatidil-inozitol, amelyeket 0,1-5 mg/ml koncentrációban alkalmazunk, valamint szintetikus foszfolipidszármazékok vagy -variánsok, mint például a dihexanoil-foszfatidil-kolin vagy a diheptanoil-foszfatidil-kolin, amelyeket azonos koncentrációban alkalmazunk.

Alkalmas redoxrendszerek, amelyek a diszulfidképződést elősegítik, például a kis molekulasúlyú szulfhidril/diszulfíd reagenskombinációk, mint például a glutation oxidált és redukált formája, a ditiotreitol oxidált és redukált formája, a β-merkapto-etanol vagy βmerkapto-metanol oxidált és redukált formája, a cisztin oxidált és redukált formája, amelyeket körülbelül 1-10 mM, különösen előnyösen körülbelül 1-10 mM koncentrációban alkalmazunk, és amelyekben az oxidált és redukált forma aránya 100:1 és 1:100 közötti, előnyösen 6:1 és 1:6 közötti.

Előnyösen alkalmazható szulfhidril/diszulfid redoxirendszer a glutation oxidált és redukált formája.

Más eljárásban a tioredoxin vagy diszulfid-izomeráz alkalmazható körülbelül 10-1000 mikrogramm/ml, előnyösen körülbelül 50-200 mikrogramm/ml koncentrációban az alacsony molekulasúlyú szulfhidril/diszulfid reagensek helyett.

Az újrahajtogatási pufferben alkalmazható sók például az Na⁺, Li⁺, K⁺, NH4⁺, Mg²+, Ca²⁺ vagy Mn²' és Cl^-, F , Br , J , HCOj ,SO4² , foszfát-, acetát-, cianát- vagy rodanidionokból képzett sók vagy más, alkálifém-vagy alkáliföldfém-halogén-vagy pszeudohalogénvegyületek, amelyeket maximum 3 M koncentrációban alkalmazhatunk. Előnyösen alkalmazható só a nátrium-klorid, amelyet 1-2 M koncentrációban alkalmazunk.

A találmány tárgya részletesebben eljárás dimer, biológiailag aktív β típusú átalakító növekedési faktorfehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy a denaturált monomer forma TGF^-szerű fehérjét pufferkörülmények közé visszük, amely puffer kis molekulasúlyú szulfhidril/diszulfid redoxirendszert tartalmaz oldódást segítő szer jelenlétében, körülbelül 6-körülbelül 10 pH-értéken, és a reakciót körülbelül 0 °C-körülbelül 37 °C hőmérsékleten végezzük. Előnyösen az alkalmazott pH értéke körülbelül 8,0, és a hőmérséklet értéke körülbelül 4 °C.

Előnyös találmány szerinti eljárásban az alkalmazott szulfhidril/diszulfid redoxirendszer glutation redukált és oxidált formája, amelyet körülbelül 1-10 mmol koncentrációban alkalmazunk, és amelyben az oxidált és redukált forma mólaránya 1:1 -1:2, és az alkalmazott gyenge detergens 3-(3-klolamido-propil)-dimetil-ammonio-l-propánszulfonát, amelyet körülbelül mM-körülbelül 60 mM mennyiségben alkalmazunk.

Részletesebben, a dimer biológiailag aktív TGF-βszerű fehérjét egylépéses eljárásban állítjuk elő, amelyben a fehéije monomer formáját újrahajtogató pufferben oldjuk, és a reakcióelegyet 4 °C hőmérsékleten 2-400 óráig inkubáljuk, amely reakció során az újrahajtogatás és a dimerizáció folyamatosan megtörténik. Az újrahajtogatási reakcióban a protein koncentrációja jelentős, mivel amennyiben ez túl magas, a monomerek aggregációt szenvedhetnek, amely nem kívánt nagyobb mértékű oligomereket eredményez. A dimer tennék végső termelése megnövelhető, amennyiben a fehéijekoncentráció kevesebb, mint körülbelül 2 mg/ml, előnyösen körülbelül 0,01-0,5 mg/ml.

Kívánt esetben a diszulfidképződés további elősegítése céljából hatásos mennyiségű oxidációt segítő szert, amely Cu²⁺-ionokat [mint például CuCl2, Cu(NO3)2 vagy o-fenantrolin/Cu²⁺ komplex] vagy Fe³⁺-ionokat [például FeCl3 vagy Fe₂(SO₄)₃] tartalmaz, adhatunk az újrahajtogatási reakcióelegy-pufferhez. Hatásos menynyiség alatt azt a mennyiséget értjük, amely minimálisan szükséges ahhoz, hogy a szulfhidrilcsoportokat oxidálja megfelelő időtartamon belül, és amely körülbelül ekvivalens a TGF-P-szerű fehérjékben jelen lévő szabad szulfhidrilcsoportokkal, amelyeket diszulfid-híd képzésében kívánunk reagáltatni. Előnyösen ez a menynyiség körülbelül 0,01-100 mikroM.

Továbbá oxigén vagy levegő buborékoltatható kívánt esetben az újrahajtogatási puffer reakcióelegybe oxidációt segítő szerek jelenlétében vagy ezek jelenléte nélkül. Az oxidációt ugyancsak elvégezhetjük I₂ alkalmazásával [Kamber, B. és munkatársai (1980), Helv., 63, 899-915] vagy benzokinonszármazékok (Kamber, B„ 89/01484 számú PCT közzétételi irat) alkalmazásával.

A fehérjék szulfonálását alkalmazhatjuk diszulfidhidak bontására és a kapott tiolcsoportok blokkolására. A monomer TGF^-szerű fehérjék kívánt esetben Sszulfonált formájúak lehetnek, és így védőcsoporttal ellátottak azzal szemben, hogy az újrahajtogatási körülmények alkalmazása előtt oxidálódjanak. Az S-szulfonálást nátrium-szulfit, redukálószer, mint például cisztein jelenlétében való alkalmazásával végezhetjük, amely reverzibilis védését eredményezi a tiolcsoportoknak, Sszulfonát formában. Az újrahajtogatási reakciókörülményei között a védőcsoportokat felesleg szulfhidril/diszulfid redoxirendszer alkalmazásával eltávolítjuk, és így spontán dimerizáció történik.

A találmány tárgya továbbá eljárás dimer, biológiailag aktív TGF-P-szerű fehérje előállítására, amelyben a monomer formájú TGF-p-szerű fehérjét az alábbi lépésekkel állítjuk elő:

(a) mikrobiális gazdaegyedet tenyésztünk, amely a

TGF-β-szerű fehérjekódoló nukleotidszekvenciát tartalmazza a megfelelő leolvasási keretben ahhoz, hogy ennek segítségével a fenti fehérje szekvenciáját leolvashassuk, (b) a TGF-p-szerű fehérjét denaturált monomer oldható formában kinyerjük.

HU 218 144 Β

Alkalmas mikrobiális gazdaegyedek lehetnek élesztőtörzsek, mint például Saccharomyces cerevisiae vagy baktériumok, mint például Escherichia coli vagy Bacillus subtilis.

A mikrobiális gazdaegyedek, amelyek a TGF-βszerű proteinkódoló nukleotidszekvenciát megfelelő leolvasási vázhoz kapcsolva tartalmazzák, a szakirodalomban ismert rekombinációs DNS-eljárással állíthatók elő, amely az alábbi lépésekből áll:

- hibrid vektor előállítása, amely a TGF-p-szerű fehérjekódoló DNS-szekvenciát tartalmazza, alkalmas szekvenciát kifejező szabályozás kifejezési kontrollja mellett,

- a fenti mikrobiális gazdaegyedet a hibrid vektorral transzformáljuk, és

- a transzformált mikrobiális gazdasejteket elválasztjuk a nem átalakult gazdasejtektől.

A TGF-p-szerű fehérjék, mint például az érett emberi TGF-βΙ, ΤΟΡ-β2 vagy TGF-ββ nukleotidszekvencia-kódolása ismert [Derynck, R. és munkatársai (1985), Natúré, 316, 701-705; Marquardt, H. és munkatársai (1987), J. Bioi. Chem., 262, 12 127-12 131; Ten Dijke, P. és munkatársai (1988), PNAS, 85, 4715-4719], és ez például kémiailag szakirodalomban ismert eljárással szintetizálható. Más eljárás szerint a TGF^-szerű fehérjéket kódoló cDNS-molekulák előállíthatók a TGF-βszerű fehérjéket termelő emlőssejtekből a megfelelő mRNS-molekulák izolálása után. A kifejezést szabályozó szekvenciák promotor szekvenciák, amelyek biztosítják, hogy a TGF-P-szerű fehérjék leképezése hatásos.

A transzformálás céljára alkalmazott mikrobiológiai gazdasejt határozza meg az alkalmas vektor kiválasztását.

Valamely E. coli törzsben alkalmazható TGF-βszerű fehérjék kifejezésére alkalmas vektorok például bakteriofágok, mint például bakteriofág λ-származékok vagy plazmidok, mint például pBR322 plazmid és ennek származéka, a pPLMu. Az alkalmas vektorok tartalmazzák a teljes kópia- és jelzőgént, amely lehetővé teszi, hogy a kifejező plazmidok által átalakított mikroorganizmusokat kiválasszuk és meghatározzuk fenotípusos jellemzők alapján. Alkalmas jelzőgének azok, amelyek a mikroorganizmusnak például olyan tulajdonságot kölcsönöznek, mint nehézfémekkel szembeni ellenállás, antibiotikumokkal, mint például ampicillinnel vagy tetracyclinnel szembeni ellenállás.

Az E. coli baktériumban a TGF-β-szerű fehérjék kifejezésének szabályozására számos promotor alkalmazható. Különösen az erős génkifejezésű promotorok alkalmazhatók. Alkalmas promotorok az E. coli lac, tac, trp és lpp promotorok, továbbá a λΝ bakteriofág vagy XpL bakteriofág promotor és mások.

Az S. cerevisiae mikroorganizmusban történő kifejezésre és replikációra alkalmazható vektorok egy élesztő eredetű replikációs faktor és egy élesztőszelektív genetikai jelzőt tartalmaznak. A hibrid vektorok, amelyek élesztőreplikációs eredetű részt tartalmaznak, például a kromoszómás autonóm módon replikálódó szegmensek (ars), amelyek extrakromoszomálisan maradnak vissza az élesztősejtben az átalakítás után és mitosis során autonóm módon replikálódnak. Ugyancsak alkalmazhatók hibrid vektorok, amelyek az élesztő 2 μ plazmidDNS-sel homológ szekvenciát tartalmaznak. Ezeket a hibrid vektorokat rekombinációval építhetjük be a 2 μ plazmidokba, amelyek már a sejtben találhatók vagy autonóm módon replikálódnak. Alkalmas élesztőmarker gének különösen azok, amelyek antibiotikummal szembeni rezisztenciát kölcsönöznek a gazdasejtnek, vagy auxotróf élesztőmutánsok esetében gének, amelyek a gazdasejt sérüléseit kiegészítik. A fenti gének például rezisztenciát kölcsönöznek az antibiotikus hatású cikloheximiddel szemben, vagy pro totófiát eredményeznek auxotróf élesztőmutánsokban, és ezek például az URA3, a LEU2, a HIS3 vagy a TRPI gének.

Az élesztőben való kifejezés során alkalmazható promotorok például az ADHI, az ADHII vagy a PEIO5 gén, valamint a glikolízisben szereplő promotorok, például a PGK vagy a GAP promotor.

Kívánt esetben a kifejezési vektorba jelszekvenciák építhetők, amelyek lehetővé teszik a TGF^-szerű fehérje szekrécióját. Alkalmas jelzőszekvenciák például az élesztősav-foszfatázból (PHO5) vagy az élesztő invertáz génből leszármaztatott szekvenciák.

Az átalakított mikrobiális gazdaegyedeket folyékony táptalajon tenyésztjük, amely felvehető szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sóforrást tartalmaz, a szakirodalomban ismert eljárás szerint.

Különféle szénforrásokat alkalmazhatunk. Előnyösen alkalmazható szénforrás például lehet felvehető szénhidrát, mint például glükóz, maltóz, mannitol, ffuktóz vagy laktóz vagy valamely acetát, mint például nátrium-acetát, amelyek önmagukban vagy alkalmas keverék formában is alkalmazhatók. Alkalmas nitrogénforrások lehetnek például aminosavak, mint például kazein aminosavak, peptidek és fehérjék, valamint ezek lebomlási termékei, mint például tripton, pepton vagy húsextraktumok, továbbá élesztőextraktumok, malátaextraktumok, kukoricaáztató levek, továbbá ammóniumsók, mint például ammónium-klorid, ammónium-szulfát vagy ammónium-nitrát, amelyek alkalmazhatók egymagáikban vagy alkalmas keverék formában. Alkalmazható szervetlen sók például nátrium-, kálium-, magnézium- és kalcium-szulfátok, -kloridok, -foszfátok és -karbonátok. Ezen túlmenően a táptalaj továbbá tartalmazhat növekedést elősegítő anyagokat. A növekedést elősegítő anyagok lehetnek például nyomelemek, mint például vas, cink, mangán és hasonlók vagy egyes aminosavak.

A monomer TGF^-szerű fehérjét a mikrobiális gazdasejtekből ismert eljárással nyerjük ki. Ez lehet a sejtek enzimes vagy mechanikai bontása abból a célból, hogy a kívánt fehérjét felszabadítsuk, amelyet a gazdasejtfehérjéktől a TGF^-szerű fehérje elválasztása követ, amely lehet például lecsapás és/vagy kromatográfiás eljárás.

Abban az esetben, amennyiben a mikrobiális gazdasejtekben a TGF-^-szerű fehérje monomer, oldhatatlan aggregátum (zárványtest) formában keletkezik, ezt az újrahajtogatási körülmények közötti reakció előtt oldhatóvá kell tenni. Ennek megfelelően a találmány

HU 218 144 Β szerint a monomer TGF-p-szerű fehérjét az alábbi eljárással állítjuk elő:

(a) a gazdasejtből izoláljuk a vízben oldhatatlan fehérjefrakciót, amely a TGF-p-szerű fehérjét tartalmazza, (b) a TGF-p-szerű fehérjét oldhatóvá tesszük.

A monomer oldhatóvá tételét és denaturálását megoldhatjuk a nyers proteinszuszpenzió, amely a monomer TGF-p-szerű fehérjét nem oldható formában tartalmazza, megsavanyításával körülbelül 1-körülbelül 4 pH, előnyösen körülbelül 2,5 pH-értékre, kívánt esetben redukálószer, mint például DTT jelenlétében, vagy megoldhatjuk kaotróp szerek, előnyösen guanidinhidroklorid, különösen előnyösen karbamid körülbelül 4-9 M koncentrációban történő bázikus pH vagy magas hőmérséklet mellett végzett adagolásával a korábban leírtaknak megfelelően. Az oldhatóvá tett monomert az oldódást segítő kaotrop anyagoktól dialízissel tisztíthatjuk meg, és amennyiben a dialízis során kicsapódás történik, centrifugálással tisztítjuk. Az oldhatóvá tett monomert kromatográfiásan tisztítjuk, és ezt használjuk fel az újrahajtogatási eljárásban, amelyben biológiailag aktív dimer terméket állítunk elő.

Az újrahajtogatási reakció után a biológiailag aktív dimert megtisztítjuk abból a célból, hogy eltávolítsuk a szennyező anyagokat, különösen a pirogén és más endotoxin anyagokat, amelyek jelen lehetnek a készítményben a mikrobiális gazdasejtben történő rekombinációsfehérjeelőállítás után. A dimer elválasztását kromatográfia, mint például méret szerint elválasztó gélkromatográfía, hidrofób kölcsönhatású kromatográfia vagy ioncserélő kromatográfia segítségével, például Mono S oszlopon vagy reverz fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfia segítségével választjuk el.

A találmány tárgya továbbá dimer biológiailag aktív TGF-p-szerű fehérje, amelyet a találmány szerinti eljárással állítunk elő. Ezek a TGF-p-szerű fehérjék számos terápiás célra alkalmazhatók.

A találmány tárgya továbbá monomer S-szulfonált TGF-p-szerű fehérje, amelyet a monomer TGF-βszerű fehérje S-szulfonálásával állíthatunk elő. A monomer S-szulfonált TGF^-szerű fehérjék új vegyületek, amelyek alkalmazhatók a biológiailag aktív dimer TGF^-szerű fehérjék előállítására.

A találmány tárgya továbbá eljárás gyógyszerkompozíció alak előállítására, amely hatásos mennyiségű dimer biológiailag aktív TGF^-szerű fehérjeterméket tartalmaz, amelyet a találmány szerinti eljárással állítunk elő, vagy ennek gyógyszerészetileg elfogadható só formáját tartalmazza dózisegység formában.

A formált alak lehet infúziós oldat forma vagy parenterális, például intramuszkuláris vagy intravénás adagolásra alkalmas forma vagy orális adagolásra alkalmas forma vagy különösen helyi, azaz felületi adagolásra alkalmas forma. Az oldat forma előnyösen izotóniás vizes oldat vagy szuszpenzió, amelyet felhasználás előtt készíthetünk, például liofilizált készítményből, amely az aktív hatóanyagot önmagában vagy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal együtt tartalmazza. A parenterális adagolásra alkalmas oldat formák általában vizes oldatok. Ezeket szokásos eljárással állíthatjuk elő, és az aktív hatóanyagon túlmenően tartalmazhat fiziológiás sóoldatot, stabilizálószert, mint például emberi szérumalbumint, aminosavakat, mint például arginint vagy glicint, és szénhidrátokat, mint például glükózt, mannózt, dextránt vagy hidroxi-etilkeményítőt. A készítmény pH-értékét pufferrel, mint például foszfát-, szukcinát- vagy aminosav-pufferrel körülbelül 4,5-7 értékre állíthatjuk be. Általában ampullákat töltünk meg az oldattal és hosszabb tárolás céljából liofilizáljuk.

A formált alakok tartalmazhatnak szokásos adalékanyagokat, mint például tartósítóanyagokat, stabilizálószereket, nedvesítőszereket és/vagy emulzifikálószereket, oldódást elősegítő szereket, az ozmózisnyomás szabályozásához szükséges sókat és/vagy pufferanyagokat. A találmány szerinti gyógyszer-kompozíciókat, amelyek kívánt esetben további gyógyszerészetileg értékes hatóanyagokat tartalmazhatnak, szokásos eljárással állítjuk elő, amely például lehet szokásos keverés, oldás, liofilizálás és sterilizálási eljárás, és a formált alak körülbelül 1 ng-10 mikrogramm/gramm, különösen előnyösen 10 ng—10 mikrogramm/gramm preparátumhatóanyagot tartalmazhat, a liofilizátum esetében egészen 100% mennyiségű hatóanyagot tartalmazhat.

A TGF^-szerű fehérjék kétféle jellemzővel rendelkeznek, ugyanis egyrészt stimulálják bizonyos típusú sejtek, név szerint a fibroblasztok burjánzását, másrészt inhibiálják bizonyos más típusú sejtek, nevezetesen a rákos sejtek és az immunrendszer sejtjei burjánzását.

A találmány szerinti eljárással előállított dimer biológiailag aktív TGF^-szerű fehéqéket kívánt esetben só formában, mint például nemtoxikus, gyógyszerészetileg elfogadható savaddíciós só formában, kívánt esetben gyógyszerészeti formált alak formában hatásos mennyiségben alkalmazzuk. A hatásos mennyiség elnevezés alatt olyan mennyiséget értünk, amely jelentős gyógyító hatást fejt ki, például olyan mennyiséget, amely stimulálja a kívánt sejtek növekedését, és amely a normál sejtekre nem toxikus. Ezt a mennyiséget például in vitro növekedési kísérletekkel határozhatjuk meg. A TGF-p-szerű fehéqék kettős karaktere miatt „hatásos mennyiség” ugyancsak az a mennyiség, amely jelentős mértékben inhibiálja a rákos sejtek és az immunrendszer sejtjeinek növekedését és szaporodását. Amennyiben emberi vagy állatgyógyászati alkalmazásra kívánjuk használni, a hatásos mennyiséget a kezelendő adott szövet, az alkalmazás módja, a betegség súlyossága, a beteg kora és általános állapota szerint kell beállítani. Általában az egyszeres vagy napi dózis felnőtt ember esetében körülbelül 0,01-20 mikrogramm mind növekedést stimuláló, mind inhibiáló hatás céljából.

A találmány szerinti gyógyszerészeti formált alakot klinikailag állatok, különösen emlősök, különösen emberek kezelésére alkalmazzák, és azokban az esetekben, amikor sebesülés gyógyításának kezelése szükséges, különösen idős emberek esetében.

A találmány szerinti formált alakok javítják a sejtmigrálást és -szaporodást. Mivel a sérülés gyógyulása mind sejtmigrálást, mind sejtburjánzást magában fog8

HU 218 144 Β lal, ezek az in vitro eredmények közvetlenül vonatkoznak az in vivő sebgyógyító eljárásra.

Különösen előnyösen alkalmazhatók felfekvési fekélyek (decubitus ulcer) kezelésére vagy megelőzésére, amelyek gyakran előfordulnak kórházi betegeknél, különösen idős és tolószékes betegeknél. Az idősebb emberek esetében a sebesülés gyógyulási folyamata lassabb, és az ilyen betegek gyakrabban sérülnek meg (nemcsak decubitus és diabeticus fekélyek formájában, hanem trauma, égések és hasonló formában), amely sebek vagy lassan gyógyulnak vagy egyáltalán nem gyógyulnak.

A találmány szerinti formált alak két típusú alkalmazását javasoljuk állatgyógyászati és különösen emberi gyógyszerként.

Az első és előnyös alkalmazási forma helyi alkalmazás felületi sérülések gyógyításának elősegítésére, különösen idős emberek esetében, akiknél a seb gyógyulási folyamata jelentősen lassabb. A kezelhető sérülések nem limitáltak, és ezek lehetnek például (de nem limitáltan): felületi fekélyek, beleértve a decubital (felfekvési), diabeticus, fog-, száj-, visszér- és vérzékeny felületi fekélyeket; égések (különösen másodfokú és harmadfokú égések); sebészeti vágások (beleértve a fogászati és kozmetikai sebészeti vágásokat); baleseti sérülések (beleértve a vágásokat, behatolásokat, szakításokat és más traumákat) és terápiásán előidézett sérülések (beleértve a radioterápia során előálló sérüléseket). Amennyiben helyileg alkalmazzuk, a formált alakok más alkotóelemekkel kombinálhatok, például adalékanyagokkal, hordozóanyagokkal, oldhatóvá tevő anyagokkal és bármely más, ismert vagy ismeretlen hatóanyaggal, másodlagos növekedési faktorokkal. Ezek az alkotóelemek nem limitáltak, kivéve, hogy gyógyszerészetileg és fiziológiásán elfogadhatóak kell legyenek adagolás céljára és nem szabad csökkenteniük a hatóanyag aktivitását, illetve nem szabad, hogy azt károsan toxikussá alakítsák. A találmány szerinti formált alakot, amelyeket fekélyek, égések, sebészeti vagy baleseti sérülések felületére alkalmazunk, előnyösen por, gél, kenőcs, kenet vagy öblítőszer formájúak, illetve beültethetők bőr alatti beültetésként, bőrre alkalmazott tapaszként vagy kötésként és előnyösen folyékony vagy félfolyékony formájúak vagy alkalmazhatók fogkrémben vagy rágógumiban is.

A második alkalmazási forma a teljes szervezetre való alkalmazás, amelynek célja belső sebesülések gyógyítása, amelyek vagy sebészeti beavatkozás következtében keletkeztek vagy belső szervek szöveteinek sérülései olyan helyzetben, ahol sebészeti beavatkozás vagy lehetetlen, vagy nemkívánatos. Ismét a szövet- vagy sebesülésfajta, ami kezelhető, nem limitált, és ez lehet például (de nem limitáltan) belső szervek vagy szövetek mély sebészeti vágása; csont- vagy porcsebesülés (törés után); gyomor-, nyombél- vagy más bélfekély. A szervezetre alkalmazott formában a formált alak lehet folyadék, pirula, tabletta, pasztilla, amelyeket bélen keresztül alkalmazhatunk, vagy lehet folyékony forma parenterális injektálás céljára. Belső sebészeti beavatkozást követő vágások kezelésére a formált alak lehet öblítőszer, előnyösen fiziológiásán elfogadható sóoldattal kombinálva. A formált alak aktív hatóanyagait ismét kombinálhatjuk más alkotóelemekkel, mint például adalékanyagokkal, hordozóanyagokkal, oldhatóvá tevő szerekkel és más ismert vagy ismeretlen szekunder növekedési faktorokkal. Az alkalmazott egyéb alkotóelemek nem limitáltak, kivéve, hogy ezek gyógyszerészetileg és fiziológiásán elfogadhatók kell legyenek adagolásra és az aktív hatóanyagot nem bontják le, ennek aktivitását nem csökkenthetik vagy nem tehetik károsan toxikussá.

A sebek gyógyítására alkalmazott aktív hatóanyag mennyisége aszerint állítandó be, hogy milyen a seb típusa, súlyossága és helyzete, valamint hogy milyen a kezelendő beteg kora és általános állapota. Általában az egyszeri vagy napi adagolt dózis körülbelül 1 -20 mikrogramm TGF-3-szerű fehérje 1 cm² sebesülésre vonatkoztatva, amely mennyiség már jelentős gyógyító hatást fejt ki. Belső alkalmazás esetében nagyobb mennyiséget kell alkalmazni, amely függ az adagolás módjától, mivel a TGF-P-szerű fehérje a testnedvekben hígul.

A találmány szerinti TGF-P-szerű fehérjék további alkalmazási területe csont- és szövetújraképzés emlősökben rákos megbetegedés kezelése, gyulladásellenes vagy immunoszupreszív szer, emberi sejtkultúrák növekedési szabályozója vagy csontvelővédő szer vagy szívvédelmi mediátorszer.

A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon részletesen bemutatjuk.

1. példa

TGF—fii, TGF-fi2 és TGF-fi3 cDNS klónozása és szekvencia kialakítása

A. Sejtek tenyésztése

CI-215 vonal emberi gliómasejteket [deMuralt, B. és munkatársai (1985), Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 21, 207] tenyésztünk szövettenyésztő edényben (Falcon T75), amely Dulbecco-féle Modified Eagle Médium (DMEM, Gibco) közeget és 10%-os fotálís borjúsavót tartalmaz.

B. RNS-extrakciö

A CI-215 emberi gliómasejtvonalból lxlO⁸ sejtet gyűjtünk, majd Dounce-homogenizálunk 30 ml 5% citromsav és 0,2% (tömeg/térfogat) NP40 detergens elegyben 4 °C hőmérsékleten. A sejtmagokat a cytoplazmától 2500 fordulat/perc centrifugálással 10 percig 4 °C hőmérsékleten Sorvall Rt. 6000-B asztali centrifugával elválasztjuk. A felülúszót 15 000 fordulat/perc mellett 30 percig 4 °C hőmérsékleten centrifugáljuk SS-34 rotorral ellátott Sorvall RC-5-B centrifuga segítségével. A kapott felülúszót kiöntjük, és a szilárd csapadékot 30 ml 0,2 M Tris/HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 2% SDS, 25 000 egységű Heparin (Sigma) elegyben, majd háromszor fenol/kloroform (1:1, térfogat/térfogat) eleggyel extraháljuk, amelyben a kloroform 24 rész kloroformot és 1 rész izoamil-alkoholt (térfogat/térfogat) tartalmaz. A végső vizes fázishoz 1 térfogatnyi 3 M nátrium-acetátot (pH 5,0) és 2,5 térfogatnyi etanolt adunk. Az etanol hatására kivált csapadékot kétszer 70%-os etanollal mossuk. Az RNScsapadékot újraszuszpendáljuk 2 ml 10 mM Tris/HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,05% SDS elegyben. A poliadenilezett RNS-t oligo-dT cellulózkromatográfia segítsé9

HU218 144 Β gével izoláljuk T. Maniatis „Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)” eljárása szerint.

C. CDNS előállítása

Az első cDNS-láncot 10 mikrogramm poliA⁺RNS-ből 100 mikroliter oldatban állítjuk elő, amely oldat 50 mM Tris-t (pH 8,3), 50 mM KCl-t, 10 mmol MgCl₂-t, 1 mM DTT-t, 30 mikrogramm/ml oligo-dT 12-18-at, 1 mM dATP, dCTP, dGTP és dTTT vegyületet, 50 egység RNase inhibitort (Promega) és 1000 egység Moloney leukémiavírus reverz transzkriptázt (Gibco-BRL) tartalmaz. A reakcióelegyet egy óráig 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután az elegyet 400 mikroliter második lánc pufferrel hígítjuk, amely 20 mM Tris/HCl-t (pH 7,5), 5 mM MgCl₂-t, 100 mmol KCl-t, 12,5 egység RNase H (Gibco-BRL) tartalmaz, és a kapott elegyet 37 °C hőmérsékleten 10 percig inkubáljuk. A reakcióelegyet 5 percig jéggel hűtjük, majd 125 egység E. coli DNS-polimeráz I vegyületet (Promega) adunk hozzá. Ezután a reakcióelegyet 16 °C hőmérsékleten további két óráig inkubáljuk. Az elegyhez ezt követően 40 mikroliter 0,5 M EDTA-oldatot adunk, majd fenol/kloroform (1:1, térfogat/térfogat) eleggyel extraháljuk. A vizes fázishoz 1/10 térfogat 3 M nátrium-acetátot (pH 6,0) és 4 térfogat etanolt adunk, ami után a reakcióelegyet hagyjuk 30 percig -70 °C hőmérsékleten kicsapódni.

Az etanolos csapadékot 10 percig 17 000 g alkalmazásával centrifugáljuk, a csapadékot kétszer 70%-os etanollal mossuk és Speed-Vac-készülékben szárítjuk. A kétláncú cDNS-t steril vízben oldjuk és agarózgélen Tris-borát pufferben (pH 8,8) elektroforézisnek vetjük alá. Ezzel a cDNS méretét és mennyiségét határozzuk meg.

mikrogramm cDNS-t ezután metilezünk az EcoRI helyzetekben úgy, hogy egy óráig 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 100 mikroliter 50 mM Tris/HCl-t (pH 8,0) 0,1 mM EDTA-t, 80 mikroM adenozil-metionint és 40 egység EcoRI metilázt (New England Biolabs) tartalmazó oldatban. A reakcióelegyet fenol/kloroform elegygyel extraháljuk, és a cDNS-t etanollal lecsapjuk, majd steril vízben a fenti eljárásnak megfelelően oldjuk.

Ezután 5 mikrogramm cDNS-t állítunk elő kapcsoló lekötéshez úgy, hogy 20 egység T4 DNS-polimerázzal 10 percig 37 °C-on 200 mikroliter elegyben inkubáljuk, amely elegy 33 mM Tris-acetátot (pH 7,9), 66 mM kálium-acetátot, 10 mM magnézium-acetátot, 0,5 mmol DTT-t és 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP és dTTP anyagot tartalmaz, a reakcióelegyet szobahőmérsékletre hűtjük, majd 20 egység Klenow-polimerázt (Gibco-BRL) adunk hozzá, és 5 percig szobahőmérsékleten, majd 5 percig jégen inkubáljuk. Ezután a reakcióelegyhez 10 mikroliter 0,5 M EDTA-oldatot adunk és fenol/kloroform eleggyel extraháljuk. Ezt követően a cDNS-t etanollal leválasztjuk és steril vízben a fent leírt eljárásnak megfelelően oldjuk.

Ezután 5 mikrogramm cDNS-vegyülethez 12-mer szintetikus 5’-foszforilezett kapcsolót (New England Biolabs, No. 1070) kapcsolunk, 100 mikroliter oldatban, amely 10 mikrogramm kapcsolót tartalmaz, 50 mM

Tris/HCl-t (pH 7,8), 10 mM MgCl₂-ot, 20 mM DTT-t, 1 mM AT-t tartalmaz, és a reakciót 16 °C hőmérsékleten végezzük, 4000 egység T4 DNS-ligáz alkalmazásával (New England Biolabs). A ligázt ezután 70 °C hőmérsékleten 10 percig hővel inaktiváljuk, majd az elegyet 500 mikroliter térfogatra hígítjuk, 100 mM Tris/HCl (pH 7,5), 6 mM MgC’k , 100 mM NaCl-tartalmú oldattal és 1000 egység EcoRI (Boehringer) segítségével 6 óráig 37 °C hőmérsékleten feltárjuk. Az elegyhez 50 ml 0,5 mólos EDTA-oldatot adunk, majd 10 percig 70 °C hőmérsékletre melegítjük. A melegített reakcióelegyet közvetlenül Bio-gel A15M oszlopra visszük (200-400 mesh, Bio-Rad), hogy a monomerkötő ffagmenseket eltávolítsuk. A kijövő térfogatban több, mint 300 bp cDNS eluálódik.

D Lambda gtll-be való klónozás

Lambda gtll karokat állítunk elő 100 mikrogramm lambda-vektor-DNS feltárásával, amelyet a gyártó által leírt eljárással EcoRI segítségével végzünk (New England Biolabs). A feltárt DNS-t 1 egység marhabéi alkálikus foszfatáz alkalmazásával defoszforilezzük, amely foszfatáz a Boehringer Mannheim terméke, és a defoszforilezést a gyártó szerinti eljárással végezzük. 20-30 ng cDNS-t, amelyet a Bio-gel A15M oszlopról nyertünk, etanolban lecsapunk 1 mikrogramm gtll defoszforilezett karokkal együttesen. Ezután a csapadékot újraszuszpendáljuk 10 mikroliter oldatban, amely 50 mM Tris/HCl-t (pH 7,8), 10 mM MgCl₂-t, 20 mM DTT-t, 1 mM ATP-t, 15% polietilénglikolt (MS 6000) és 200 egység T4 DNS-ligázt tartalmaz. A kötési elegyet két óráig 16 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután a reakcióelegyet 10 percig centrifugáljuk, és a csapadékot 10 mikroliter steril vízben újraszuszpendáljuk. Ezután in vitro csomagoljuk három óráig szobahőmérsékleten a szállító eljárása szerint (Promega). 0,5 ml SM fág hígítópuffért, amely 50 mmol Tris/HCl-t (pH 7,5), 100 mM NaCl-t, 100 mM MgSO₄-et és 0,01% zselatint tartalmaz, adunk hozzá, majd 25 mikroliter kloroformmal stabilizáljuk. Összesen 500 000 fágot amplifikálunk 10 YT lemezeken (15 cm átmérő) 0,7% agaróz-YT (Sigma) és E. coli Y1090 sejteket alkalmazva a leírt eljárásnak megfelelően [Young, R. és Davis, R. (1983), PNAS, 80, 1194].

E. A TGF-fil, TGF-$2 és TGF-$3 betéteket tartalmazó klánok meghatározása és kiválasztása másolati nejlonszűrőt (Cuno) készítünk minden egyes 10 YT lemezből, és a szűrőn lévő fágokat denaturáljuk 0,05 m NaOH, 1,5 M NaCl segítségével, majd semlegesítjük a „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982) közleményben leírtak szerint. A szűrőket 0,2xSSC, 0,2% SDS elegybe helyezzük 90 °C hőmérsékleten 15 percig, majd 4 óráig 45 °C hőmérsékleten prehibridizáljuk 2xSSC, 1% SDS, 0,1% ficoll, 0,1% poli(vinil-pirrolidon), 0,1% marhaszérumalbumin, 50 mM NaPO₄ (pH 6,8), 50 mikrogramm/ml denaturált lazacsperma DNS, 0,1 mikrogramm/ml oligo A 12-18 és 100 mikrogramm/ml poliA+-RNS elegyben. Mind a hat replikációt éjjelen át 45 °C hőmérsékleten hibridizáljuk az előhibridizációs pufferben úgy, hogy a hat közül az egyikhez eltérő ³²P-jelzett 39 bp

HU 218 144 Β oligomereket (lásd alább) adagolunk 2 χ 10⁵ cpm/ml koncentrációban.

A hat oligomert, amelyet a hibridizációban alkalmazunk, Applied Biosystem DNS-szintetizátorban állítjuk elő, és ezek megfelelnek az érett forma (112 aminosav) TGF-βΙ (lásd SEQ ID No. 1), TGF-p2 (lásd SEQ ID No. 2), illetve TGF-P3 (lásd SEQ ID No. 3) első aminosavait kódoló nukleotidszekvenciának (1., 3., illetve

5. oligomerek) vagy utolsó aminosavait kódoló nukleotidszekvenciának (2., 4., illetve 6 oligomerek).

A TGF-βΙ-szekvencia detektálására alkalmazott két oligomer:

1.5’ GCC CTG GAC ACC AAC TAT TGC TTC AGC TCC ACG GAG AAG 3’

2. 5’ TCA GCT GCA CTT GCA GGA GCG CAC GAT CAT GTT GGA CAG3’

A TGF-^-szekvenciát detektáló két oligomer:

2. 5’ GCT TTG GAT GCG GCC TAT TGC TTT AGA AAT GTG GAG GAT 3’

4. 5’ TTA GCT GCA TTT GCA AGA CTT TAC AAT CAT ATT AGA AAT 3’

A TGF-33-szekvenciát detektáló két oligomer:

5. 5’ GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG 3’

6. 5’ TCA GCT ACA TTT ACA AGA CTT CAC CAC CAT GTT GGA GAG 3’

Minden egyes oligomer 40 mg mennyiségét 3’végén jelzéssel látjuk el ³²P-dATP és 20 egység terminális transzferáz (Gibco-BRL) alkalmazásával 20 ml reakciópufferben, amely 100 mM kálium-kakodilátot (pH 7,2), 2 mM CoCl₂-t és 0,2 mM DTT-t tartalmaz. A reakciót 37 °C hőmérsékleten egy óráig végezzük, majd a reakcióelegyet Sephadex G-50 oszlopon gélszűrjük. Az előállt jelzett oligomereket 5 percig 95 °C hőmérsékletre melegítjük, majd a fentiek szerint az előhibridizációs pufferhez adjuk.

Az 1-6. replikációkat sorrendben az 1-6. oligomerekkel hibridizáljuk. A hibridizáció után a szűrőket egyenként kétszer 2xSSC, 1 xSSC és 0,1 xSSC oldattal szobahőmérsékleten 15 percig mossuk. A pozitív foltokat autoradiográfiával meghatározzuk, majd a meghatározási szűrést ismételjük mindaddig a fenti eljárás szerint, amíg a lemezen valamennyi foltot pozitívnak találjuk. Egy egyetlen foltot 1 ml SM tág hígítópufferrel (lásd l.D. szekció) eluálunk, 100 mikroliter eluátumot 1 ml E. coli Y1090 sejtekhez adunk, és az elegyet 20 percig szobahőmérsékleten tartjuk. Az E. coli Y1090 sejteket és a fágokat 100 ml YT táptalajhoz adjuk, amely 0,2% maltózt tartalmaz, majd 7 óráig 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A roncsolt sejtekhez 1 ml kloroformot adunk, majd a tág DNS-t a „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982) közlemény szerinti eljárással tisztítjuk. A tisztított DNS-t 1 ml 10 mM Tris/HCl-t (pH 7,5), 1 mM EDTA-t tartalmazó elegyben oldjuk, majd az oldat 100 mikroliter részletét teljességig feltárjuk 1 ml teljes térfogatban EcoRI segítségével a forgalmazó előírásainak megfelelően (Boehringer). Az enzim-reakcióelegyet fenol/kloroform eleggyel extraháljuk, majd etanollal lecsapjuk.

Az EcoRI cDNS-beékelődéseket gélelektroforézis segítségével tisztítjuk (Ultrapure BRL) NA-45 DEAE-papír (Schelicher és Schuell) alkalmazásával. A DNS-t 50 mM Tris/HCl (pH 7,5), 5 mmol EDTA, 1 M NaCl eleggyel eluáljuk, majd fenol/kloroform eleggyel extraháljuk és etanollal lecsapjuk. A kapott csapadékot kétszer 70%-os etanollal mossuk, majd 10 mM Tris/HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA elegyben újraszuszpendáljuk.

F. cDNS-inzertdarabok szekvenciameghatározása

Az EcoRI cDNS-inzerteket Bluescript KS⁺ vektorba szubklónozzuk (Stratagene). A cDNS azonosságát kettős szálas szekvenciameghatározással igazoljuk F. Sanger és munkatársai (1977), PNAS, 74, 5463 közleménye szerinti eljárással a fenti oligomerek (lásd 1E. szekció) és Sequenase-készlet (U.S. Biochemicals) alkalmazásával. Az érett TGF—βΐ, TGF-βΣ és TGF~33 112 aminosavegységét kódoló nukleotidszekvenciát a SEQ ID No. 1,2 és 3 alatt megadjuk.

G. A cDNS-inzertek amplifikálása és plazmid pGEM-5-be való szubklónozása

A fent leírt (lásd 1E. szekció) oligomereket, amelyek a TGF-βΙ-, ΤΟΕ-β2- és TGF^3-szekvenciát határozzák meg, alkalmazzuk a cDNS-inzertek amplifikálására és az érett 112 aminosav kódolására (beleértve a stopkodont).

A Bluescript KS⁺ plazmid EcoRI cDNS-inzertjeit (lásd 1F. szekció) géltisztítjuk a fent leírt eljárással (lásd 1E. szekció). Minden egyes cDNS-inzertum 50 ng mennyiségét amplifikáljuk 2x2 mikrogramm megfelelő két oligomer jelenlétében polimeráz-láncreakció segítségével, amelyet 100 mikroliter reakcióelegyben végzünk, amely 10 mM Tris/HCl-t (pH 8,35), 50 mM HCl-t, 1,5 mM MgCl₂-t, 0,05% (tömeg/térfogat) ΝΡ-40-t, 0,05% (tömeg/térfogat) Tween 20-at és 200 mikroM dATP, dGTP, dCTP és dTTP anyagot tartalmaz, 5 egység Taq-polimeráz (Perkin-Elmer Cetus) alkalmazásával. 30 egymás utáni amplifikálást végzünk Perkin-Elmer Cetus fűtőblokkban az alábbi hőmérsékleteken: 93 °C/0,l perc, 55 °C/0,2 perc, 71 °C/1,5 perc. A kapott 339 bp ffagmenseket, amelyek a TGF-βΙ, TGF^2, illetve a TGF-33 szekvenciáját kódolják, géltisztítjuk és plazmid PGem-5ZF( + ) (Promega) anyagba szubklónozzuk, valamint Ncol segítségével feltárjuk, marhabéi alkálikus foszfatázzal (Boehringer) defoszforilezzük és Klenow-polimerázzal (Gibco-BRL) kezeljük. A kapott termékeket pGKM 125 (TGF-βΙ), pGKM 740 (TGF^2) és pGKM 126 (TGF-p3) névvel jelöljük és megfelelő E. coli Y1090 sejtek (lásd 2. példa) átalakítására alkalmazzuk. A megfelelő TGF-βΙ, TGF^2, illetve TGF-33 anyagokat kódoló korrekt inzerteket tartalmazó kiónokat E. coli Y1090/pGKM 125 (TGF-βΙ),E. coliNWWhpGKSA 740(TGF^2), illetve E. coli Y1090/pGKM 126 (ΤϋΡ-β3) névvel nevezzük.

2. példa

TGF-βΙ, TGF—$2 és TGF-$3 expresszálása E. coliban

A. Általános eljárások

HU 218 144 Β

Baktériumtörzs (E. coli KI2):

LC137: htpR_am, lon_R9, lac_am, mal_am, trp_am, pho_am, rspL, tsx: :TnlO, supC₁₅ [Goff, S. A. és munkatársai (1984), PNAS, 81, 6647-6651],

Plazmidok pPLMu: [Buell, G. és munkatársai (1985), Nucleic Acids Rés., 13, 1923-1938]. Ez a plazmid hordozza a λΡ_Ε bakteriofág promotort a tág Mu ner gén riboszóma kötési hellyel [Van Leerdam, E. és munkatársai (1982), Virology, 123, 19-28], pcl₈₅₇: Plazmid, amely a hőre labilis λθ₈₅₇ represszort kódolja és kanamycinnel szembeni rezisztenciát szolgáltat [Remault, E. és munkatársai (1983), Gene, 22, 103-113].

SDS-gélelektroforézis

Az SDS-poliakrilamidgél-elektroforézist (SDS-PAGE) és a fehérjefestést korábban leírt eljárással végezzük [Laemmli, U. K. (1970), Natúré, 227, 680-685] BIORAD Minoprotean II sejtet és 1 mm vastag 18 százalékos poliakrilamid géleket alkalmazva. Hőindukció ml LB táptalajt [Maniatis és munkatársai (1982),

Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York] 20 ml-es tenyésztőcsőben, amely 40 mikrogramm ampicillint és kanamycint (LB/amp/kan) tartalmaz, inokulálunk egyetlen kolóniával, és az elegyet éjjelen át 30 °C hőmérsékleten rázva inkubáljuk. Az éjjelen át kapott tenyészet 5 ml térfogatát 15 ml LB/amp/kan elegyhez adjuk 100 ml-es Erlenmeyerlombikban. A lombikot 42 °C hőmérsékletű vízfürdős rázóba helyezzük. A fürdőbe helyezés előtt 2 ml térfogatú mintát veszünk (nem indukáló körülmények között), és a fürdőbe helyezés után óránként 1 ml-es mintákat veszünk (indukciós körülmények). A sejteket centrifugáljuk (5 perc, 10 000 fordulat/perc, Eppendorf-centrifuga), és a felülúszót eldobjuk. A csapadékot 100 mikroliter SDS-PAGE mintapufferben újraszuszpendáljuk, és a szuszpenziót 10 percig 95 °C hőmérsékletre melegítjük. SDS-PAGE-vizsgálat céljára 5 mikroliter mintákat táplálunk be.

Kompetens sejtek előállítása

Kompetens E. coli sejteket állítunk elő kalcium-klorid-eljárással Maniatis és munkatársai (1982), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York közleménye szerint. A pcl₈₅₇ plazmidot hordozó sejteket 30 °C hőmérsékleten tenyésztjük.

B. pPLMu.hTGF-$J, pPLMu.hTGF-$2 és pPLMu.hTGF-$3 expressziós vektorok képzése és TGF-fil, TGF-(i2, valamint TGF-^3 expresszálása E. coli Y1090/pGKM 125, E. coli Y1090/pGKM

740, valamint E. coli Y1090/pGKM 126 (lásd az l.G. példát) sejteket tenyésztünk LB közegben, és plazmidDNS-t állítunk elő Bimbóim, H. C. és Doly, H. (1979), Nucleic Acids Research, 7, 1513 közleményében leírt eljárással.

mikroliter korlátozópufferben 5 mikrogramm

DNS-plazmidot teljes mértékig hasítunk vagy Ncol és Sáli (pGKM 125) vagy Ncol és EcoRV (pGKM740) vagy önmagában Ncol (pGKM126) segítségével a forgalomba hozó előírásainak megfelelően (Boehringer). A DNS-t 5 mikroliter 3 m nátrium-acetátot, 100 mmol MgCfj-t, 5 mmol EDTA-t és 150 mikroliter etanolt tartalmazó eleggyel lecsapjuk. A DNS-t -70 °C hőmérsékleten 15 percig inkubáljuk, majd 13 000 g erő alkalmazásával 15 percig Sorvall-centrifugában SS34 rotor alkalmazásával centrifugáljuk. A felülúszót eldobjuk, és a csapadékot 80 mikroliter 0,089 N Tris-borátot, 0,089 M bórsavat és 0,002 M EDTA-t (TBE-puffer) tartalmazó oldatban szuszpendáljuk, amely oldat 0,25% brómfenol-kéket, valamint 0,25% xilol-cianolt tartalmaz. 4szer 20 mikroliter mintákat elektroforézisnek vetünk alá TBE-pufferben készült 1 % agarózgélen, amely 0,5 mikrogramm/ml etidium-bromidot tartalmaz, 50 volt alkalmazásával, amíg a bróm-fenolkék jelzőanyag a 10 cm hosszú és 0,8 cm vastag gél alját el nem éri. A kifejltett TGF-βΙ, ΤΰΕ-β2 és ΤΰΕ-β3 anyagokat kódoló DNS-fragmenseket külön-külön rövid hullámhosszú UV-fénnyel láthatóvá tesszük. Ezután ezeket az anyagokat pengével kivágjuk, majd a géldarabból Schleicher és Schüll Biotrap berendezésben 200 mA alkalmazásával 1,5 óra alatt elektrolitikusan eluáljuk. Az eluált DNS-fragmenseket lecsapjuk (lásd fenn), majd 20 mikroliter TE-oldatban újraszuszpendáljuk.

mikroliter plazmid pPLMu anyagot linearizálunk vagy Ncol és Sáli, Ncol és EcoRV vagy önmagában Ncol alkalmazásával történő feltárással és ezután géltisztítjuk a DNS-fragmensekre fent leírt eljárás alkalmazásával. 100 ng linearizált és tisztított pPLMu DNSvektort és 3-szoros mólekvivalens megfelelően tisztított DNS-fragmenst 4 °C hőmérsékleten 15 óráig inkubálunk 20 mikroliter kötési pufferben (70 mmol Tris/HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mmol DTT, 0,1 mmol adenozin-trifoszfát), amely egy egység DNSligázt tartalmaz (Boehringer).

mikroliter kötési keveréket 200 mikroliter hideg (4 °C) megfelelő E. coli LC137 sejthez adunk, amelyek a pcl₈₅₇ plazmidot tartalmazzák. 30 perc múlva a sejteket hősokknak vetjük alá úgy, hogy 1,5 percig 42 °C hőmérsékleten vízfürdőben inkubáljuk őket. Az elegyhez 2 ml LB táptalajt adunk, és a tenyészetet 60 percig 30 °C hőmérsékleten rázzuk. Ampicillint és kanamycint tartalmazó LB lemezekre 200 mikroliter mintákat inokulálunk, majd a lemezeket 22 óráig 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Egyes kolóniákat tenyésztünk, és a plazmidDNS-t analizáljuk. A TGF-βΙ, ΤΟΡ-β2 és ΤΟΡ-β3 anyagokat pPLMu formában kódoló DNS-fragmensek szubklónozása sorrendben a pPLMu.hTGF-βΙ, pPLMu.hTGF^2, illetve pPLMu.hTGF~33 plazmidokban fejezhető ki. A fenti szerkezeteket tartalmazó kiónokat

E. coli LC137/pPLMu.hTGF-pl,

E. coli LC137/pPLMu.hTGF^2 és

E. coli LC137/pPLMu.hTGF^3 névvel nevezzük.

Az E. coli LC137pPLMu.hTGF-pl,

E. coli LC137/pPLMu.hTGF^2 és E. coli LC137/pPLMu.hTGF^3 sejteket hőindukciónak vetjük alá (lásd a 2A. példát), majd az expresszált fehérjéket SDS-PAGE segítségével analizáljuk. Az indukálás után két órával a TGF-βΙ, ΤΰΡ-β2, illetve a

HU 218 144 Β

TGF-ββ hővel indukált fehérjeként tűnik ki és migrál, amely migrálás során körülbelül 12 000 D névleges molekulasúlyt mutat.

C. A transzformánsok fermentációja

Éjjelen át 2 1 térfogatú Erlenmeyer-lombikban, amely 750 ml LB táptalajt és 40 mg/1 ampicillint és kanamycint tartalmaz,

E. coli LC137/pPLMu.hTGF-pl,

E. coli LC137/pPLMu.hTGF-p2 és

E. coli LC137/pPLMu.hTGF~p3 kultúrákat tenyésztünk 30 °C hőmérsékleten. 300 ml éjjelen át tenyésztett kultúramintát adagolunk 750 ml LB táptalajhoz, amely a fenti antibiotikumokat tartalmazza, egy 2 1 Erlenmeyer-lombikba, majd az elegyet 42 °C hőmérsékletre melegítjük úgy, hogy rázatjuk körülbelül 3,5 percig 65 °C hőmérsékletű vízfürdőben. Ezután a lombikokat 42 °C hőmérsékletű rázógépbe helyezzük és 3 óráig inkubáljuk. Az edényeket 12 °C hőmérsékletre hűtjük jeges vizes fürdővel, majd a sejteket 10 percig 8000 fordulat/perc centrifugálás segítségével GSA-rotorban (Sorvall) gyűjtjük.

3. példa

TGF-βΙ, TGF-^2 és TGF-fi3 expresszálása Saccharomyces cerevisiae mikroorganizmusban

Az érett TGF-βΙ, TGF-βΣ és TGF-fl3 anyagok kódolószekvenciáját Saccharomyces cerevisiae mikroorganizmusban expresszáljuk élesztősavas foszfatáz indukálható promotor (PHO5) szabályozásának alkalmazásával.

Az expresszálóvektorokat két lépésben állítjuk elő:

A. A pJDB207/PHO5-RIT 12 plazmid konstruálása,

B. A pJDB207R/PHO5-TGF^l, pJDB207R/PHO5-TGF-32 és pJDB207R/PHO5-TGF-33 plazmidok konstruálása, ahol A. szolgáltatja az élesztővektort és a PHO5 átírási terminátort, és B. szolgáltatja az expresszálási kazettákat, amelyekben inzertum kódolja az érett TGF-βΙ, TGF^2 és TGF-^3 anyagokat a PHO5 promotor szabályozása alatt.

A. A pJDB207/PHO5-RIT 12plazmid konstruálása

A p31RIT 12 plazmidot (EP 277.313 számú európai szabadalmi bejelentés) linearizáljuk restrikciós endonukleáz Sáli segítségével. HindlII segítségével végzett részleges feltárás etidium-bromid jelenlétében 1 kb Sall/HindlII fragmenst eredményez, amely 276 bp Sall/BamHI pBR322-szekvenciával jellemezhető, az élesztősav foszfatáz PH05 534 bp promotoqa élesztő invertált jelszekvenciával (19 aminosavkódolással) és PHO5 átírási terminátorral jellemezhető.

A p31RIT 12 1 kb Sall/Hind III fragmensét élesztő-£. coli vektorba, amely pJDB207 vektor, klónozzuk (Beggs, J. D.: Molecular genetics in yeast, Alfréd Benzon symposium 16, Copehangen, 1981, 383-389), amelyet ezután Sáli és HindlII segítségével vágunk. A kapott plazmidot, amely 1 kb inzertet tartalmaz, pJDB207/PHO5-RID 12 névvel nevezzük.

B. ApJDB207R/PHO5-TGF-$2plazmid konstrukciója

A pGKM740 (TGF-32) (lásd 1G. példa) plazmidot Ncol segítségével vágjuk. A tapadó végeket Klenow

DNS-polimeráz által történő reakcióval töltjük be. Az elegyhez EcoRI kapcsolót adunk (5’-CC GG A A TT CC GG; Biolabs), és az elegyet kapcsoljuk. A kapott cirkuláris plazmidot pGKMA668 (TGF-32) névvel jelöljük és EcoRI, valamint Sáli segítségével hasítjuk. Egy 0,4 kb EcoRI/Sall fragmenst izolálunk agarózgélből, amelyet tisztítunk és steril vízben 25 mikrogramm/ml koncentrációban újraszuszpendálunk. A fragmens a Τ(ίΡ-β2 kész kódolószekvenciáját tartalmazza egy ATG egységgel a vázban, a GCT kódban, amely meghatározza az Alal aminosavát a kész TGF-βΣ pepiidnek.

A PHO5 promotort a p31RIT 12 (lásd fent) plazmidból 534 bp BamHI/EcoRI fragmensen izoláljuk. A pJDB207/PHO5-RIT 12 plazmidot BamHI és Xhol segítségével hasítjuk. A nagy, 6,8 kb BamHI/XhoI fragmenst izoláljuk. A PHO5 átírási terminátor a fragmensen marad. A BamHI/EcoRI PHO5 promotorffagmenst az EcoRI/Sall TGF-32 kódolófragmenst és a BamHI/XhoI vektorfragmenst kapcsoljuk. Egy korrekt ki ónt, amelyet óramutató járásával ellenkező orientációval a pJDB207-be klónozunk, és amely a ΤΰΕ-β2 gén PH05 promotorral szabályozott egységét tartalmazza, pJDB207R/PHO5-TGF^2 névvel jelölünk.

Analóg eljárással érett TGF-βΙ és TGF-33 anyagot expresszálunk S. cerevisiae-ban. A TGF-βΙ és TGF-33 kódolószekvenciát tartalmazó plazmidok a pGKM125 és a pGKM126 (lásd 1G. példa). Ezeket a plazmidokat Ncol segítségével feltárjuk, majd EcoRI kapcsolókat adagolva és kötést végezve a kapott cirkuláris plazmidokat EcoRI és Sáli segítségével hasítjuk. Az EcoRI/Sall fragmenseket pJDB207-be klónozzuk a fenti eljárással. A kapott plazmidokat pJDB207R/PHO5-TGF^l és ρΙϋΒ207ΙΙ/ΡΗΟ5-ΤΟΕβ-3 névvel jelöljük.

C A GRFI18 S: cerevisiae törzs transzformálása GRF18 Saccharomyces cerevisiae törzset (MATa, his3-ll, his3-15, leu2-3,l 12,can* DSM 3665) a pJDB207R/PHO5-TGF^l, pJDB207R/PHO5 -TGF- β2, pJDB207R/PHO5-TGF^3 plazmidokkal átalakítjuk a Hűmen, A. és munkatársai (1978), PNAS, 75, 1929 közleményében leírt eljárás segítségével.

A transzformált élesztősejteket leucinmentes minimál élesztő táptalajt tartalmazó lemezeken szelektáljuk.

Egyes transzformált élesztőkolóniákat izolálunk, amelyeket az alábbiak szerint nevezünk el: Saccharomyces cerevisiae

G RFI18/pJDB207R/PHO5 -TGF - β 1,

Saccharomyces cerevisiae

GRF18/pJDB207R/PHO5-TGF^2 és

Saccharomyces cerevisiae

GRF18/pJDB207R/PHO5-TGF^3.

D. X cerevisiae átalakított sejtek fermentálása és sejtextraktumok előállítása

A fentiek szerint az élesztőtranszformátumok PHO5 promotor által szabályozott expressziós kazettákat tartalmaznak, és ennélfogva szükséges a TGF-βΙ, TGF-βΣ vagy TGF-fl3 promotor derepressziója. A transzformánsokat egyenként két egymást követő előtenyészet13

HU 218 144 Β ben növesztjük (10 ml és 50 ml) élesztőben magas P, minimális közegben, amelyet a Difco Yeast Nitrogén Base előírás szerint állítunk elő, és amely nem tartalmaz aminosavakat, de (NH₄)₂SO₄ helyett 10 g/1 L-aszparagint tartalmaz, továbbá 1 g/1 L-hisztidint és 20 g/1 glükózt tartalmaz. A második előtenyészet sejtjeit 0,9%-os NaCl-ban mossuk, és valamennyi sejtet 100 ml alacsony P_rértékű minimális közegbe inokuláljuk, amelyet a Difco Yeast Nitrogén Base eljárása szerint állítunk elő (aminosavak nélkül), de amely táptalaj 0,03 g/1 KH₂PO₄-et, 10 g/1 L-aszparagint, 1 g/1 L-hisztidint és 20 g/1 glükózt tartalmaz. A tenyészeteket 30 °C hőmérsékleten 180 fordulat/perc értékkel keverjük.

ml tenyészetmintából 5 óra, 24 óra és 48 óra elteltével a sejteket 3000 fordulat/perc centrifugálással gyűjtjük, majd 0,9%-os NaCl-oldattal mossuk. A sejteket lízispufferben újraszuszpendáljuk [66 mmol káliumfoszfát, pH 7,4, 4 mM Zwittergent (Calbiochem)]. Az elegyhez 8 g üveggyöngyöt adagolunk (0,5-0,75 mm átmérő), és a szuszpenziót 4-5 alkalommal 2-2 percig Vortex-keverőben hidegen rázzuk. A sejtextraktumot dekantáljuk, és az üveggyöngyöt eltávolítjuk. A roncsolt sejtmaradékot centrifugálással 5 percig 3000 fordulat/perc alkalmazásával 4 °C hőmérsékleten ülepítjük. A felülúszót és az üledéket elválasztjuk és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

4. példa

Dimer biológiailag aktív TGF-fil, TGF-$2 és TGF-$3 előállítása

Az alább leírt dimer biológiailag aktív TGF-p2-vegyület előállítására alkalmazott eljárást analóg módon alkalmazhatjuk dimer biológiailag aktív TGF-βΙ, TGF-βΣ és más, „TGF-P-szerű fehérjék” kinyerésére és előállítására.

A. Oldhatatlan monomer TGF-$2 kinyerése E. coliból

A 2C. példa szerinti eljárásnak megfelelően E. coli LC137/pPLMu.hTGF-P2 sejteket fermentálunk. A sejtfeltárást és a nem oldható TGF-P2-kinyerést 4 °C hőmérsékleten végezzük. Körülbelül 18 g nedves sejtet szuszpendálunk 60 ml elegyben, amely 0,1 M Tris/HCl-t, 10 mM EDTA-t, 1 mM PMSF-t (fenilmetánszulfonil-fluorid), pH 8,3 (feltárópuffer) tartalmaz. A sejteket a szállító előírásainak megfelelően kétszer Frenchpress (SLM Instruments, Inc.) berendezésen bocsátjuk keresztül, és a térfogatot feltárópufferrel 200 ml-re egészítjük ki. A szuszpenziót 20 percig 15 000 g alkalmazásával centrifugáljuk. A kapott csapadékot 100 ml feltárópufferben szuszpendáljuk, amely 1 m NaCl-t tartalmaz, majd 10 percig a fenti körülmények között centrifugáljuk. A csapadékot 100 ml feltárópufferben szuszpendáljuk, amely 1% Triton X-100 (Pierce) anyagot tartalmaz, majd ismét a fentiek szerint 10 percig centrifugáljuk. A mosott csapadékot ezután 50 ml oldatban szuszpendáljuk, amely 20 mM Tris/HCl-t, 1 mM EDTA-t, 1 mM PMSF-t, 1% DTT-t tartalmaz és ezután teflon szövetőrlőben homogenizáljuk. A kapott szuszpenzió nyers monomer TGF-P2 anyagot tartalmaz oldhatatlan formában.

B. Monomer TGF-fi2 oldása és tisztítása

A 4A. vagy 4C. példa szerinti eljárással kapott 10 ml TGF-P2 szuszpenziót 10%-os ecetsav segítségével 2,5 pH-értékre savanyítjuk, majd 10 percig szobahőmérsékleten Eppendorf-centrifuga segítségével centrifugáljuk. A felülúszót Sephacryl S -100 (Pharmacia, 2,6x78 cm) oszlopon 20%-os ecetsav alkalmazásával 1,4 ml/perc áramlási sebességgel kromatografáljuk. [Más eljárás szerint a kromatográfiát Sepharcryl S- 100 HR (Pharmacia) oszlopon hajthatjuk végre 1% ecetsav vagy 5 mM sósav alkalmazásával.] A monomer denaturált TGF-p2 anyagot tartalmazó frakciók 190 perc és 220 perc között eluálódnak, és ezeket gyűjtjük. Ezt az anyagot alkalmazzuk biológiailag aktív dimer TGF-P2 (4G., I, K., L. példák) előállítására újrahajtogatással, vagy további tisztítás céljából szerkezeti analízisre használjuk fel (4D. példa).

C. Monomer TGF-$2 kinyerése Saccharomyces cerevisiae sejtekből

A 3D. példa szerinti fermentációval nyert 500 ml elegyből kapott roncsolt sejtek üledékét 20 ml oldatban szuszpendáljuk, amely 4 M karbamidot, 0,1 M Trist-t, 1% DTT-t, pH 8,0 tartalmaz. Az elegyet szobahőmérsékleten tartjuk 30 percig és 5 percenként örvénylőén keverjük. Ezután az oldhatatlan anyagot centrifugálással 30 000 g alkalmazásával 30 percig 4 °C hőmérsékleten elválasztjuk. A felülúszó pH-értékét ecetsavval 2,5 értékre állítjuk be, majd 5%-os ecetsavval szemben éjjelen át 4 °C hőmérsékleten teljesen dializáljuk. Az oldatot ezután a fenti körülmények szerint centrifugáljuk, és a tiszta felülúszót YN 10 membránon (Amicon) ultraszűréssel koncentráljuk és 4 ml végső térfogatot állítunk be. A mintát ezután Sephacryl S-100 HR (Pharmacia) oszlopon kromatografáljuk 5%-os ecetsav alkalmazásával a 4B. példában leírt eljárásnak megfelelően, és így monomer TGF-P2 anyagot kapunk.

D. Monomer TGF-$2 további tisztítása RP nagynyomású folyadékkromatográfia segítségével

A Sepharcryl S-100 oszlopról (4B. példa) nyert frakciók mintáit Vydac 214TP5415 nagynyomású folyadékkromatográfiás reverz fázisú oszlopon (4,6x150 mm, The Separations Group, Hesperia, CA, USA) tisztítjuk. Az oszlopot 70% 0,1 %-os vizes TFA-oldat és 30% 0,08% acetonitrilben készült TFA-oldat elegyével egyensúlyba hozzuk, majd a terméket 30 perc alatt lineáris gradiens eluens alkalmazásával, amelynek végpontja 55% 0,1 %-os vizes TFA- és 45% 0,08%-os acetonitriles TFA-oldat, keverékkel eluáljuk 1 ml/perc áramlási sebesség alkalmazásával. Az eluátumot 216 nm abszorpcióméréssel vizsgáljuk, és az egyes csúcsokat kézzel gyűjtjük az UV-abszorpció alapján. A denaturált monomer TGF-P2 anyagot 21,5 perc retenciós idővel eluáljuk. Az adott reverz fázisú oszloptól függően ugyanilyen elválasztásban a TGF_P2 elúciós ideje körülbelül 16-18 perc lehet.

A TGF-P2 frakciókat RP nagynyomású folyadékkromatográfia segítségével analizáljuk a fent alkalmazott oszlop és oldószerrendszer alkalmazásával. A TGF-p2 anyagot lineáris gradiens eluens alkalmazásával 42 perc alatt eluáljuk, amely gradiens eluens

HU 218 144 Β

100% 0,1%-os vizes TFA-oldattal indult és végpontja 30% vizes TFA-oldat és 70% 0,08%-os acetonitriles TFA-oldat elegye. A TGF-p2 anyagot egyetlen csúcson 30,4 perc után eluáljuk. Az elválasztásban alkalmazott oszloptól függően a retenciós idő 29 és 29,9 perc lehet.

A TGF-P2 anyagot kémiailag redukált természetes disznó TGF-P2-vel való keverés után (British Biotechnology Limited, Oxford, UK) analizáljuk, amely azonos elsődleges szerkezettel rendelkezik, mint az emberi TGF-P2 [Marquardt, H. és munkatársai (1987), J. Bioi. Chem., 262, 12 127-12 131]. Az elegy egyetlen csúcsként eluálódik, amely bizonyítja az anyagok azonosságát.

E. Monomer TGF-$2 analízise SDS-PAGE segítségével

A Sephacryl S-100 oszlopról (4B. példa) vagy a reverz fázisú oszlopról (4D. példa) nyert mintákat vákuumban szárítunk és SDS-PAGE [Lámmli, U. K. (1970), Natúré, 227, 680] segítségével 15%-os poliak5 rilamid lapgélen, amelyet Coomassie Blue R-250 színezőanyaggal színeztünk, analizáljuk. Egyetlen, körülbelül 12 000 D molekulasúlynak megfelelő sávot nyerünk, amely nem tér el a redukált természetes disznó

TGF-P2 sávjától.

F. Monomer TGF-fi2 N-terminális aminosavszekvenciájának meghatározása

A 4B. példában kapott TGF-p2-oldatot vákuumban bepároljuk, majd az anyagot 25 mikroliter ecetsavban oldjuk és gázfázisú fehérjeszekvencia-meghatáro15 zón (470 A modell, Applied Biosystems) aminosavszekvenciáját meghatározzuk.

Az N-terminális aminosavszekvencia:

10 15

Ala-Leu-Asp-Ala-Ala-Ty r-X-Phe-Ar g-Asn-Va1-G1n-As p-Asn-X-X-Leu-Ar g-Pr o, ahol X jelentése olyan aminosav, amelyet nem sikerült pontosan meghatározni.

Hasonló eljárással a 4-vinil-piridin-TGF-p2-származék N-terminális aminosavszekvenciáját is meghatá- 25 roztuk, amely anyagot Marquardt, H. és munkatársai (1987), J. Bioi. Chem., 262, 12 127-12 131 közleménye szerinti eljárással állítottunk elő.

Az N-terminális aminosavszekvencia:

10 15

Ala-Leu-As p-Ala-Ala-Tyr-Cys-Phe-Arg-Asn-Va1-G1n-As p-As n-X-Cy s-Leu-ArgPr o-Leu-Tyr-I1e-As p-Phe-X-Ar g-As p-Le u-,

25 ahol X jelentése nem pontosan meghatározott aminosav. A ciszteint S-piridil-etil-ciszteinként határoztuk meg.

G. Dimer biológiailag aktív TGF-^2 képzése mg 4B. példában előállított monomer denaturált TGF-P2 anyagot oldunk 140 ml elegyben, amely 50 mmol Tris/HCl-t, pH 8,0,1 M NaCl-t, 5 mM EDTA-t, 2 mM redukált glutationt, 1 mM oxidált glutationt és 33 mM Chapst (Calbiochem) tartalmaz. Az elegyet 72 óráig 4 °C hőmérsékleten tartjuk, majd az oldat pHértékét sósavval 2,5 értékre állítjuk be, és az elegyet tízszer ultraszűréssel YM 10 membránon betöményítjük (Amicon, Danvers, MA, USA) Amicon kevert cellában. A koncentrált oldatot eredeti térfogatra hígítjuk 10 mM sósavval, amjd végső 10 ml térfogatra koncentráljuk ugyanilyen eljárással. A keletkezett csapadékot 5000 g alkalmazásával 30 percig végzett centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszó diszulfidhíddal kötött dimer TGF-P2 anyagot tartalmaz, amint ezt nem redukált körülmények között SDS-PAGE segítségével kimutattuk. A preparátum biológiai aktivitását sejtmigrációs és növekedési kísérletekben (5A. példa), valamint sejtnövekedést inhibiáló kísérletekben (5B. példa) határoztuk meg.

Más eljárásban monomer TGF-P2 helyett a dimer aktív TGF-P2 előállítására S-szulfonált TGF~p2-származékot alkalmazunk (4M. példa), és lényegében a fenti példa szerinti eljárást alkalmazzuk, azzal az eltéréssel, hogy a nátrium-klorid koncentrációja 2 M. A dimer TGF~P2 tisztítását és izolálását azonos eljárással végezzük, mint a nem származék monomer fehérjéből kiinduló dimer TGF-P2 esetében (4H. és 41. példák).

H Dimer TGF-$2 izolálása Mono S oszlopon végzett kationcserélő kromatográjia segítségével

85% A puffer (20 mM nátrium-acetát, 30% izopropanol, pH 4,0) és 15% B puffer (A puffer, amely 1 M nátrium-kloridot tartalmaz) segítségével kiegyenlített Mono S HR 5/5 oszlopra (Pharmacia) 1 ml/perc áramlá40 si sebesség alkalmazásával a 4G. példában nyert koncentrált oldatot betápláljuk. Az oszlopot ezután ugyanilyen áramlási sebesség fenntartásával a puffereleggyel mossuk, amíg a 280 nm mellett mért abszorpció az alapvonalszintet eléri. Ezután 20 percen keresztül lineáris gradiens elúciót alkalmazunk, amely a kiegyenlítési körülményektől indul és 50% A puffer/50% B puffer elegy alkalmazásával fejeződik be. A dimer biológiailag aktív TGF-P2 9 perccel a gradienselúció megkezdése után eluálódik, és ezt kézzel gyűjtjük. Amint ezt bi50 ológiaiaktivitás-meghatározással SDS-PAGE segítségével nem redukált körülmények között, valamint RP nagynyomású folyadékkromatográfia segítségével meghatároztuk, az átfolyó frakcióban nem volt dimer TGF-P2. Továbbá SDS-PAGE meghatározás szerint a dimer TGF-P2 csúcsban, amely a sógradiens segítségevei az oszlopról eluálódik, nem található monomer TGF-p2 anyag.

I. Dimer TGF-$2 további tisztítása

A 4G. példából nyert dimer TGF-p2-t ugyanolyan térfogatú 0,1%-os vizes TFA-oldattal hígítjuk. Ezután

HU 218 144 Β

80% 0,1%-os vizes TFA és 20% 0,08%-os acetonitriles TFA elegyével kiegyenlített Vydac 214TP5415 oszlopon (4,6 χ 150 mm, The Separations Group, USA) RP nagynyomású folyadékkromatográfíának vetjük alá. Az oszlopot 40 percig lineáris gradiens eluenssel eluáljuk, amely a kiegyenlítési körülményektől indul és 60% 0,1%-os vizes TFA és 40% 0,08%-os acetonitriles TFA elegynél fejeződik be. Az alkalmazott áramlási sebesség 1 ml/perc. Az eluátumot 216 nm abszorpciónál értékeljük. A TGF~p2 32,7 perc retenciós időnél eluálódik és kézzel gyűjtjük. Nem redukált körülmények között végzett SDS-PAGE-analízis egyetlen éles vonalat mutat a molekulasúlyra, amely körülbelül 25 kD. A kapott dimer TGF~32 nagy tisztaságú.

J. Más eljárás dimer biológiailag aktív TGF- β2 előállítására

A 4B. példában kapott monomer ΤϋΕ-β2-ί 0,1 mg/ml koncentrációban oldjuk 50 mM nátriumfoszfát, pH 8,0,2 M NaCl, 5 mM EDTA, 2,5 mmol risztéin, 1 mM cisztin és 50 mmol Chaps (Calbiochem) elegyben. Az elegyet 300 óráig 4 °C hőmérsékleten tartjuk, majd pH-értékét 10%-os TFA segítségével 2,5 értékre állítjuk be. Azután sorrendben 0,1%-os acetonitriles TFA, majd 0,1%-os vizes TFA segítségével előkezelt 30 mg/ml mennyiségű Sepralyte C-1 (preparatív fokozatú, 40 mikromól, Analytichem International, Harbor City, CA, USA) adunk az elegyhez, és a keveréket szobahőmérsékleten 30 percig gyengén keverjük. A gélt üvegszűrőn leszűrjük, és a leszűrt gélt friss, előmosott Sepralyte C-l (a hajtogatási oldathoz adott mennyiség 20%) fedjük. A gélt először (a gél térfogatának 5-szörös mennyiségével) A pufferrel (0,2 M NaCl/0,1% TFA/víz), majd 80% A puffer és 20% B puffer keverékkel (B puffer 0,08% acetonitriles TFA) mossuk. A ΤΟΡ-β2 anyagot 70% A puffer és 70% B puffer keverékkel eluáljuk. Az eluátumot közvetlenül Mono SHR 5/5 oszlopra visszük (Pharmacia).

A ΤΰΡ-β2 tisztítása, illetve izolálása a 4H., illetve 41. példák szerinti eljárással történik.

Más eljárásban az acetonitrilt az A pufferben, illetve a B pufferben, amelyet a Sepralyte C-1 gél mosására, illetve a TGF-^2 előállítására alkalmazunk, izopropanollal helyettesíthetjük. Ebben az esetben a mosást 90% A puffer és 10% B puffer eleggyel végezzük, és a TGF-b2-elúciót lépésenkénti gradienselúcióval végezzük (2% B puffer lépések) 80% A puffer és 20% B puffer keverékéből kiindulva, és 70% A puffer és 30% B puffer elegyhez eljutva. Az eljárás további lépéseit a 4H. és 41. példák szerint végezzük.

K. II. Más eljárás dimer biológiailag aktív TGF-fi2 előállítására

4B. példában kapott monomer ΤΰΡ-β2 anyagot 0,5 mg/ml koncentrációban oldjuk, 100 mM Tris/HCl, pH 8,5, 1 M NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM redukált glutation, 1 mmol oxidált glutation és 50 mmol Chaps (Calbiochem) elegyben. A keveréket 450 óráig 4 °C hőmérsékleten tartjuk, majd pH-értékét ecetsavval 4,0 értékre állítjuk be és ezután 7-szeres térfogat 20 mM nátrium-acetáttal, pH 4,0 hígítjuk és Mono S HR5/5 oszlopra (Pharmacia) visszük. A további eljárást a 4H., illetve a 41. eljárásnak megfelelően végezzük.

L. III. Más eljárás dimer biológiailag aktív

TGF-$2 előállítására tioredoxin diszulfidképző segédanyag alkalmazásával

A 4B. példában kapott monomer TGF-^2 anyagot 0,025 mg/ml koncentrációban oldjuk 100 mM Tris/HCl, pH 8,0, 50 mM Chaps, 0,05 mg/ml tioredoxin elegyben. Az elegyet 24 óráig 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Sejtmigrációs és növekedést kimutató kísérletek szerint (5A. példa) az újrahajtogatott dimer aktív TGF^2-termelése hasonló a 4G. példában alkalmazott eljárással nyert termeléshez. A dimer Τ(ίΕ-β2 tisztítását és izolálását a 4H. és 41. példák szerinti eljárással végezzük. A TGF^2-t a tioredoxintól Mono S oszlopon a 4H. példa szerint választjuk el.

M S-Szulfonált TGF-$2 előállítása és felhasználása dimer biológiailag aktív TGF- β2 generálásra

A 4B. példában nyert monomer TGF-^2 anyagot szobahőmérsékleten 6 M karbamid, 100 mmol Tris/HCl, pH 8,0, 50 mM nátrium-szulfit és 0,2 mmol risztéin elegyben oldjuk. Az S-szulfonált ΤΰΕ-β2 keletkezését a 4D. példa szerinti körülmények alkalmazásával RP nagynyomású folyadékkromatográfia segítségével mutatjuk ki. Az S-szulfonált TGF-32 retenciós ideje 31,8 perc. A reakció befejeződése után az oldat pH-értékét 1 N HC1 segítségével 2,0 értékre állítjuk be. Az S-szulfonált TGF-^2-t FPLC „gyors sómentesítő oszlop” HR10/10 (Pharmacia) oszlopon sómentesítjük 10 mM HCl-ben. Az S-szulfonált ΤΰΡ-β2 újrahajtogatását és dimer aktív ΤΟΡ-β2 előállítását a 4G. példa szerinti eljárással végezzük.

N. A nem megfelelően hajtogatott TGF-$2 recirkuláltatása

A 4H. példa szerinti Mono S oszlophoz nem kötött anyaghoz annyi szilárd guanidinium-hidrokloridot és DTT anyagot adunk, hogy koncentrációjúk 6 M, illetve 5 mM legyen. Ezután az elegy pH-értékét szilárd Tris segítségével 8,5 értékre állítjuk be. Az elegyet 1 óráig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd RP nagynyomású kromatográfiának vetjük alá ugyanolyan oszlopot és oldószerrendszert alkalmazva, mint a 4D. példában. A redukált monomer ΤΟΡ-β2 anyagot gyűjtjük, az acetonitrilt vákuumban elpárologtatjuk. A készítményt ezután a 4G. példa szerinti eljárással újrahajtogatási reakcióba visszük vagy közvetlenül, vagy újonnan, 4B. vagy 4C. példa szerinti eljárással izolált monomer ΤΰΕ-β2 anyaggal együttesen, amely módszerrel az aktív dimer újrahajtogatott ΤΟΡ-β2 hozamát javíthatjuk.

O. Heterodimer biológiailag aktív TGF-β képzése

Heterodimer TGF-β anyagokat állíthatunk elő, amelyek két 112 aminosavból álló, különböző díszül fid-hidakkal összekapcsolt polipeptidláncot tartalmaznak úgy, hogy a két reaktív monomer ekvimoláris mennyiségét a 4G. példa szerinti újrahajtogatási reakciókörülmények közé visszük. A kapott dimerek tisztítása és izolálása a 4H. és 41. példák szerinti eljárással történhet, ami lehetővé teszi a heterodimer formák elválasztását a homodimer formáktól.

HU 218 144 Β

P. A monomer TGF-βΙ, TGF—Q2 és TFG-$3 anyagok peptidszerkezetének meghatározása és szekvenciameghatározása

TGF-32:

mikrogramm (6,7 nmol) S-piridil-etilezett rekombinációs TGF-P2 anyagot, amelyet a 4F. példában írtunk le, vákuumcentrifugálással megszárítunk, majd 200 mikroliter 5 mM HCl-ban újraoldunk. Az oldathoz 200 mikroliter 0,2 m Tris-acetát puffért, pH 7,8, amely 10 mM Zwittergent 3-12 detergenst tartalmaz (Calbiochem Corporation, La Jolla, CA), majd azt a fehéijeoldattal elkeverjük. A hasítást 2 mikrogramm (50 mikroliter vízben oldott) endoproteináz Asp-N (Pseudomonas ftagi mutánsból nyert, Sequence Grade, Boehringer Mannheim Biochemica, FRG) segítségével 37 °C hőmérsékleten végezzük. 13 óra múlva az elegyhez 50 mikroliter 10%-os (térfogat/térfogat) TFA-oldatot adunk. A keveréket RP nagynyomású folyadékkromatográfía segítségével C4 szűkfúratú oszlopon (Vydac

214TP52, 2,1 χ 250 mm) oszlopon elválasztjuk. Lineáris gradiens eluenst alkalmazunk, amely 0,1% TFA/vízben 5- 40% (térfogat/térfogat) acetonitrilt tartalmaz; az alkalmazott áramlási sebesség 0,1 ml/perc, és az UV-detektálást 216 nm mellett végezzük. A gyűjtött csúcsokat plazmadeszorpciós tömegspektroszkópia segítségével a 4.S. példa szerinti eljárással analizáljuk.

A mért peptidmolekula-súlyok (Daltonban, D), amelyek a peptidek protonált formáit adják (M+H+), összehasonlítása a számított molekulatömegekkel az alábbi azonosítást teszi lehetővé:

Retenciós idő (perc)	M+H+ (D)	Számított tömeg, M (D)	Peptidszekvencia
16,1	566,1	564,6	DFKR
23,9	1832,3	1831,1	NTINPEASASPCCVSQ
25,9	1292,5	1291,5	DAAYCFRNVQ
29,0	1307,7	1306,6	DNCCLRPLY
31,2	1320,0	1308,5	DTQHSRVLSLY
32,1	1421,1	1419,7	DNCCLRPLYI
33,0	3132,3	3131,5	DTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQ
36,9	3425,3	3424,9	DLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSS
44,5	3739,5	3739,5	DLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS

TGF-βΙ:

mikrogramm (2,5 nM) S-piridil-etilezett rekombinációs TGF-βΙ anyagot (amelyet hasonló eljárással állítunk elő, mint az S-piridil-etilezett rekombinációs TGF-p2-t) hasítunk 1,5 mikrogramm endoproteináz Lys-C alkalmazásával azonos eljárással, mint amit a

TGF-P2 feltárására alkalmaztunk, azzal az eltéréssel, hogy az inkubálási idő 9 óra, és a lineáris gradiens az acetonitrilre vonatkoztatva 12-27%, amely 90 perc időtartam alatt történik. Az elválasztásban Cl8 oszlopot alkalmazunk (Vydac 218TP5205, 2,1 χ 50 mm).

Retenciós idő (perc)	M+H+ (D)	Számított tömeg, M (D)	Peptidszekvencia
9,4	810,6	808,9	WIHEPK
13,2	619,2	617,7	DLGWK
20,4	1584,6	1583,7	ALDTNYCFSSTEK
34,9	1613,3	1611,9	VEQLSNMIVRSCK
50,6	1869,8	1868,3	NCCVRQLYIDFRK
79,8	2875,2	2874,3	GYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSK
87,1	4189,1	4189,0	VLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPK
89,8	3965,0	3963,7	VLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRK

TGF-P3:

mikrogramm (1,46 nM) S-piridil-etilezett rekombinációs TGF-ββ anyagot (amelyet hasonló eljárással állítunk elő, mint az S-piridil-etoxilezett rekombinációs TGF^2-t) hasítunk 0,4 mikrogramm endoproteináz

Asp-N segítségével a TGF^2-re leírt eljárás szerint, azzal az eltéréssel, hogy az inkubálási idő 22,5 óra és az elválasztást Cl8 oszlopon végezzük (Vydac 218TP5205, 2,1x50 mm) lineáris gradiens 16-32% acetonitril 80 perc alatt történő alkalmazásával.

Retenciós idő (perc)	M+H+ (D)	Számított tömeg, M (D)	Peptidszekvencia
7,0	1308,0	1306,6	ENCCVRPLY
8,8	1381,0	1379,5	DTNYCFRNLE

HU 218 144 Β

Táblázat (folytatás)

Retenciós idő (perc)	M + H+ (D)	Számított tömeg, M (D)	Peptidszekvencia
11,6	1205,5	1206,3	DTTHSTVLGLY
1252,4	1250,4	DTNYCFRNL
19,4	1421,5	1421,5	DTTHSTVLGLYNT
1551,2	1551,9	DLEPLTILYYVGR
36,5	3030,4	3029,4	DTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQ
39,8	2782,6	2781,2	DTNYCFRNLEENCCVRPLYI
45,6	3457,3	3456,0	DLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSA
77,9	3726,5	3725,5	DLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS
82,6	6736,9	6736,9	DTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYV GRTPKVEQLSNMWKSCKCS

Q. A Saccharomyces cerevisiae-ban expresszált monomer TGF—$2-szerkezet jellemzése A 4C. példában kapott tennék alikvot részét RP nagynyomású folyadékkromatográfía segítségével tovább tisztítjuk a 4D. példa szerinti eljárással, és az Nterminális aminosavszekvenciát a 4F. példa szerinti el20 járással meghatározzuk.

Az aminosavszekvencia az alábbi:

10 15

Ala-Leu-Asp-Ala-Ala-Tyr-X-Phe-Arg-Asn-Va1-G1n-Asp-Asn-X20 25

X-Leu-Arg-Pr o-Leu-Ty r-11e-Asp-Phe-Ly s-Arg-As p-Le u-Gly, ahol X jelentése a nem pontosan meghatározott aminosav.

R. Saccharomyces cerevisiae-ban expresszált monomer TGF-fl2 újrahajtogatása és a dimer TGF-$2 izolálása és jellemzése

A Saccharomyces cerevisiae-ban expresszált monomer TGF-P2 újrahajtogatását és a dimer biológiailag aktív TGF-p2 izolálását a 4G., 4H., illetve a 41. példák szerinti eljárással végezzük.

S. A dimer TGF-$2 molekulatömege

A 4D. példában, illetve a 41. példában kapott 6 mikrogramm monomer TGF-p2, illetve 20 mikrogramm dimer biológiailag aktív TGF-P2 alikvot részét külön-külön 25%-os ecetsavban oldjuk, majd nitro-cellulózra adszorbeáljuk. Ezután BIO ION 20 plazmadeszorpciós tömegspektroszkópon analizáljuk (Applied Biosystems, Uppsala, Sweden). A meghatározott molekulatömegek az alábbiak.

M= 12’738,0 monomer TGF-P2 anyagra (számított tömeg M=12’719,7)

M=25’422,0 a dimer TGF-β anyagra (számított tömeg M = 25’421,2, feltéve, hogy valamennyi cisztein diszulfíd formájú)

T. TGF-$3 dimer molekulatömege

Dimer biológiailag aktív TGF-33 anyagot állítunk elő hasonlóan a 4A., 4B., 4G., 4H. és 41. példákban leírt TGF-32 előállítási eljárásokhoz. A dimer biológiailag aktív ΤΟΕ-β3 molekulatömegét a 4S. példa szerinti eljárással határozzuk meg. A talált molekulatömeg: M=25’434,0 (számított tömeg M=25’427,2, feltéve, hogy valamennyi cisztein diszulfíd formájú)

5. példa

TGF-βΙ, TGF—$2 és TGF-$3 in vitro aktivitás tesztvizsgálat

A. Sejtmigrációs és növekedési vizsgálat

A vizsgálat a TGF-β fibroblaszton kifejtett kemotaktikus aktivitásán alapul [Postlethwaite, A. E. és munkatársai (1987), J. Exp. Med., 165, 251] és azt Burk, R. (1973), PNAS, 70, 369 közleménye szerinti eljárásnak megfelelően hajtjuk végre.

A TGF-β 1, TGF-βΣ és ΤΟΕ-β3 sejtmigrálást elősegítő aktivitását úgy határozzuk meg, hogy mérjük és összehasonlítjuk normál Balb/c 3T3 fibroblasztsejtek számát, amelyek 22 óra tenyésztési idő alatt sérült egyréteges fenti sejttenyészetbe vándorolnak szérumtól mentes közegben (Dulbecco Modified Eagle Médium, Gibco), amely TGF-βΙ, TGF-32 vagy TGF-P3 anyagot tartalmaz, illetve azon fibroblasztszámot határozzuk meg, amely a sérült egyréteges tenyészetbe vándorolt a TGF-β jelenléte nélkül.

A TGF-βΙ, TGF^2 és ΤΰΕ-β3 növekedést elősegítő aktivitását sejt-DNS-szintézisre és sejtosztódásra kifejtett stimuláló hatásuk segítségével határozzuk meg. Az az aktivitás, mely a fenti egyréteges tenyészetben figyelhető meg, fénymikroszkóp segítségével 44 óra tenyésztési idő után az alábbiak szerint számszerűsíthető: (a) a fenti sejtek szérumtól mentes, TGF-βΙ,

ΤΟΡ-β2 vagy ΤΰΕ-β3 anyagot tartalmazó táptalajon történő tenyészetének bármely nézetében a sejtmagok számlálásával és ezek összehasonlításával azonos tenyészetek TGF-β jelenléte nélkül történő tenyésztésével nyert mintában azonos típusú területen a sejtmagok számával, vagy

HU 218 144 Β (b) a fenti sejtek szérummentes TGF-βΙ, TGF^2 vagy

TGF-^3 anyagot tartalmazó táptalajon történő tenyésztésének radioaktívan jelzett ³H-timidin-felvételének mérésével és ennek összehasonlításával az olyan sejttenyészetek ³H-timidin-felvételével, amelyet TGF-β jelenléte nélkül tenyésztettek.

Ezekben a dózis-válasz vizsgálatokban a teljesen tisztított TGF-βΙ, TGF-32 és TGF^3 fehérjék esetében (lásd 4K. példa) 0,1-1000 pg/ml tenyésztőközeg alkalmazása elegendő ahhoz, hogy 50% maximális migrációs és növekedést segítő választ eredményezzen.

B. Sejtnövekedés-inhibiálási vizsgálat

A kolorimetriás vizsgálat a TGF-β emberi A375 melanomasejtekre kifejtett inhibiálási hatásán alapul [Brown, T. J. és munkatársai (1987), J. Immunok, 139, 2977], A TGF-βΙ, ΤΟΡ-β2 és ΤΟΡ-β3 mintákat sorrendben hígítjuk (1:3) mértékben sík aljú, 96 üreges sejttenyésztő lemezen (Falcon), amely RPNI-1640 közeget (Gibco) és 5% fotális boíjúsavót tartalmaz. A kontroliüregekbe csak táptalajt helyezünk. Minden egyes üregbe 1,5 x1ο⁴ A375 melanomasejtet adagolunk. A mintákat 72 óráig 37 °C hőmérsékleten, 5% CO₂-tartalmú levegőn inkubáljuk, majd az A375 sejt-monorétegeket egyszer mossuk, fixáljuk és crystalviolet segítségével 15 percig színezzük. A nem kötött festéket erőteljesen kimossuk. A festett sejteket lízisnek vetjük alá, 33%-os ecetsav segítségével, hogy a festéket kibocsássák (amely a sejtmaghoz kötődik), és ezután 590 nm értéknél az OD-értéket mérjük többcsatornás 8 Channel Photometer segítségével, amely Olivetti M24 PC-vel ellátott, hogy a tesztvizsgálati anyagok aktivitását számíthassuk. Mivel minden egyes mintaüregben a festés intenzitása közvetlenül arányos a sejtmagok számával (és ennélfogva a sejtek számával), ez az eljárás lehetővé teszi, hogy kolorimetriásan mérjük a TGF-βΙ, ΤΰΡ-β2 és ΤΟΡ-β3 molekulák burjánzásellenes hatását.

0,001-10 nM tisztított TGF-βΙ, TGF-P2 és ΤΟΡ-β3 molekulákkal történő kezelés inhibiálja az A375 melanomasejtek növekedését.

6. példa

Újrahajtogatott TGF-βΙ, TGF-β2 és TGF-β3 molekulák in vivő aktivitás tesztvizsgálata A. Idős egerekben részleges vastagságú sebesülések gyógyítása

Felismerték, hogy a sebgyógyulási folyamatok az életkor előrehaladásával egyre kevésbé tökéletessé válnak [Grove, G. L. (1982), Arch. Dermatol. Rés., 272:381] és ennélfogva jelentős problémát okoznak az időskori gyógyászatban. Ennélfogva az újrahajtogatott aktív dimer TGF-β vegyületek részleges vastagságú sebek gyógyításában in vivő kifejtett biológiai hatását vizsgáltuk (amely másodfokú égési sérülés formában keletkezett) idős állatokban a Schultz, G. S. és munkatársai (1987), Science, 235:350 közleményében leírt eljáráshoz hasonló eljárásban.

Érzéstelenített, idős C57/BL6 egereken (amelyek 450 naposak vagy idősebbek) hővel egyetlen középbőr sebesülést hozunk létre a hát közepén. Az állatok hátát előzetesen leborotváltuk és szőrtelenítettük kereskedelmi szőrtelenítőkrémmel. A sebesülést egyszeres, 10 másodpercig végzett sárgaréz lemezzel való érintéssel (lxl cm, 8 g) hozzuk létre, amelyet előzetesen vízfürdőben 80 °C hőmérsékletre melegítünk. A kialakult hólyagot sebészetileg eltávolítjuk, és az égéseket naponta 5 napon keresztül helyi alkalmazással 25 mikroliter steril hordozó pufferoldattal (amely 0,8 tömeg/térfogat% hidroxipropil-cellulózt tartalmaz 10 mM hisztidin, 140 mM NaCl, pH 7,4 oldatban) kezeljük, amely különböző mennyiségű (500 ng, 100 ng vagy 10 ng) újrahajtogatott aktív dimer TGF-β anyagot tartalmaz, vagy önmagában pufferoldatban kezeljük vagy kezelés nélkül hagyjuk. Valamennyi helyileg alkalmazott anyag steril, endotoxinmentes és pirogénmentes. És valamennyi egeret a kísérlet során külön ketrecben tartunk. Minden kísérleti csoport 5 állatot tartalmaz.

nap TGF^-kezelés elteltével az egereket érzéstelenítjük, és a hólyagokat (amennyiben vannak) sebészetileg az égésről eltávolítjuk, majd az égéseket fényképezzük. Az égésterületeket, amelyek regenerált epitheliummal rendelkeznek, egyenletes vastagságú átlátszó vetítőfilmre képezzük le, majd minden egyes eredeti égési terület százalékos gyógyult felületét területméréssel meghatározzuk. Az eredményeket továbbá összehasonlítjuk fiatal (56-84 napos) C57/BL6 egerek epitheliumregenerálási folyamatával, amelyeken azonos középbőrégéseket hozunk létre, és amelyeket a kísérlet során nem kezelünk.

Egy ilyen kísérlet eredményeit mutatjuk be az alábbi táblázatban, amely kísérletben újrahajtogatott dimer aktív TGF^2 anyagot alkalmazunk. Az itt közölt adatok átlagértékek és csoportos kísérletek értékelései.

Cso- port	Állatok	TGF-P2 dózis sebesülésenként (ng)	A hatodik napon gyógyult eredeti égett felület, %
1.	idős	500	59±8
2.	idős	100	55±6
	idős	10	46±7
4.	idős	csak puffer	10±9
5.	idős	nem kezelt	16±6
6.	fiatal	nem kezelt	66±9

Az eredményekből és a területmérés-analízisből kitűnik, hogy az újrahajtogatott aktív dimer ΤΰΡ-β2 5 napon keresztül naponta történő alkalmazása alkalmas hordozópufferben stimulálja és gyorsítja az epitheliumregenerálódást részleges vastagságú sebek esetében idős egereken, és ez a stimulálás dózisfüggő (lásd 3. csoportok) és kimutatható, amennyiben a csak pufferrel vagy egyáltalán nem kezelt sebek (4. és 5. csoportok) kezelési eredményeivel hasonlítjuk öszsze. A fiatal egerek megfelelő módon gyógyulnak, és sebesüléseik epitheliumát regenerálják bármely TGF-β (6. csoport) alkalmazása nélkül. A hisztológiai analízis kimutatta, hogy a

6. napon a TGF-β anyaggal kezelt sebek javult epithelium-regenerálási folyamatot mutatnak a regenerált epidermis hiperkeratózisával együttesen.

HU 218 144 Β

B. Felnőtt patkányokban teljes vastagságú sérülések gyógyulásának elősegítése Az újrahajtogatott aktív dimer TGF-β vegyületek biológiai hatását második in vivő modell sebesülésgyógyításban is megvizsgáltuk. A vizsgálatban a vegyületek hatását vizsgáltuk teljes vastagságú sérülések gyógyításában (amelyeket sebészeti vágással idéztünk elő) felnőtt patkányokban a Mustoe, T. A. és munkatársai (1987), Science, 237: 1333 közleménye szerinti eljáráshoz hasonló eljárásnál.

Pentobarbiton segítségével érzéstelenített hím

Wistar-patkányokon (300-350 g), amelyeknek hátát előzetesen borotváltuk és kereskedelmi krémszőrtelenítővel szőrtelenítettük, egyetlen, teljes vastagságban előidézett, oldalán 1,5 cm szélességű, 5 cm hosszú lineáris bevágást végzünk sebészeti olló segítségével a hát középvonalában. A kísérletnek alávetett csoportokban a bevágások bal oldala [a hátoldalról felülről nézve egyetlen helyi kezelést (100 mikroliter) alkalmaztunk, amely kezelésben steril hordozópuffert használtunk (amely 0,8 tömeg/térfogat% hidroxi-propil-cellulózt tartalmaz 10 mM hisztidin, 140 mM NaCl, pH 7,4 oldatban], amely különféle mennyiségű (2 mikrogramm, 1 mikrogramm, 0,1 mikrogramm vagy 0,01 mikrogramm) újrahajtogatott aktív dimer TGF-β formát tartalmaz. A szemközti jobb oldali bevágásszél a megfelelő ekvivalens mennyiségű placebo kontrollanyaggal (marhaszérum-albumin) kezelt, a fenti pufferanyagban alkalmazva és a kontrollállatok sebesüléseinek széleit vagy csak hordozóanyag- pufferrel kezeljük, vagy egyáltalán nem kezeljük. Valamennyi helyileg alkalmazott anyag steril endotoxinmentes és pyrogénanyag-mentes. Minden sebesülés szélét ezután 5 egyenletesen elhelyezett, szaggatott, vízszintes varással, amely 5-0 Ethilon, rögzítjük. Valamennyi állatot külön ketrecbe helyezzük, és a sebesüléseket különböző időtartamig, amely maximálisan 21 nap, ezt a napot is beleértve, hagyjuk gyógyulni a kezelés után. Ezután az állatokat megöljük, és a teljes hátbőrt eltávolítjuk minden egyes állatról, és valamennyi szubkután zsírt gondosan kivágunk mint nemkívánatos részt a bőrökről sebészeti szike alkalmazásával. Ezután két távolságtartó sebészeti penge segítségével, amelyek párhuzamos helyzetűek (a pengék között 8 mm távolság van) csíkokat metszünk a bőrből (minden egyes bevágásvarrat között) nyújtási feszültségmérés céljára. Minden egyes bevágás egy végéről mintákat veszünk hisztológiai analízis céljára. A maximális eltűrt feszítést vagy terhelést a kivágott bőrminták esetében Universan Tensile Strength Machine Model 144 501 (Zwick, Ulm, FRG) berendezés segítségével mérjük. A méréseket 30x8 mm bőrmintákon végezzük, amelyeket hidraulikus szorítok közé rögzítünk, és ezután 10 mm/perc sebességgel szakítás! pontig húzunk. A maximális terhelést kiírón rögzítjük. A méréseket minden egyes sebesülés esetén 33 mintán, 4 állatból álló kísérleti csoportokon végezzük. Nem végeztünk méréseket olyan sebesüléseken, amelyek nyilvánvaló fertőzést vagy túlzott bevérzést mutattak (amely kisebb, mint a teljes sebesülés 3%-a).

Az alábbi táblázatban bemutatunk egy kísérletet, amelyet újrahajtogatott dimer aktív ΤΰΡ-β2 vegyülettel végeztünk, a bemutatott adatok 21 nap időtartam alatt három egyenletesen elhelyezett időpontban végzett húzási kísérletek eredményei, amelyeket TGF^2vel kezelt sebesülések, illetve placeboanyaggal kezelt sebesülések esetében végeztünk, és az itt kapott húzófesziiltségek arányait.

Csoport	Sebesülésenként a TGF [52 dózisa (mikrogramm)	A TGF-β:placebo kezelt minták húzásifeszültség-aránya
7. nap	14. nap	21. nap
1.	2,00	1,9:1	1,7:1	1,4:1
2.	1,00	1,8:1	1,4:1	1,3:1
3.	0,10	1,4:1	1,3:1	1,2:1
4.	0,01	1,2:1	1,1:1	1,0:1
5.	nulla*	1,0:1	1,0:1	1,0:1

* Csak a hordozópuffer alkalmazása vagy nem kezelt minta.

A fenti táblázatban közölt húzásifeszültség-mérési eredmények azt mutatják, hogy az újrahajtogatott aktív dimer ΤΟΡ-β2 egyszeri helyi alkalmazása alkalmas puffer hordozóanyagban a szakítószilárdságot kétszeresére növeli és felgyorsítja a gyógyulását a teljes szélességi bevágásos sebesüléseknek. Ez a hatás dózisfüggő 21 nap időtartamon belül (1-4. csoportok), amennyiben a kontrollcsoporttal (5. csoport) hasonlítjuk össze.

A hisztológiai analízis azt mutatja, hogy nagyban növekszik a mononukleáris sejtek, a fibroblasztok és a kollagéntermelés a TGF-β anyaggal kezelt sebesülésekben 21 napos időtartam alatt a kontrollsebesülésekkel összehasonlítva. A TGF-β anyaggal kezelt sebesülések esetén a kezelés után 14 nappal átmeneti hiperkeratózis is nyilvánvaló.

C. Beültetett sebkamramodell felnőtt patkányokban

Harmadik in vivő modellt alkalmazunk újrahajtogatott aktív dimer TGF-β vegyületek hatásának kimutatására sebesülésgyógyításban; a vizsgálatban felnőtt patkányokban porózus kamrabeültetések körül, sejtbenövések, érrendszer-kialakulás és szálas szemcsés szövetkeletkezés kialakulását vizsgáljuk a Spom, Μ. B. és munkatársai (1983), Science, 219:1329 közleményében leírt eljárás szerint.

Üres, merev poli(tetrafluor-etilén)-csöveket (belső átmérő 10 mm, külső átmérő 12 mm, hossz 32 mm), amelyek körülbelül 250 szabályosan elhelyezett perforációs

HU 218 144 Β lyukat tartalmaznak (átmérő 1 mm) és eltávolítható azonos anyagból készült sapkával lezártak, gázzal sterilizálunk, és sebészetileg bőr alá beültetünk szimmetrikus módon kis bevágásokon keresztül hátcombi területre pentobarbiton segítségével érzéstelenített felnőtt Wistar- 5 patkányokba (350-400 g). Minden egyes csípőbe egy gázzal sterilizált szövetkamrát ültetünk be, és a vágásokat sebészeti csipesszel összezárjuk (Clay-Adams Auto-Clips, 9 mm), amelyeket a sebészeti beavatkozás után 5 nappal eltávolítunk. A sebészeti beültetések után 10 a kamrák körül szálas kötőszövet alakul ki, de magában a cellákban viszonylag kevés szövet keletkezik. Ez a modell steril, meghatározott és zárt teret szolgáltat minden egyes kamrán belül, ahol a sebesülés gyógyulásának különböző válaszjellemzőit mennyiségileg meghatároz- 15 hatjuk. A kísérletre az állatokat a kamrák beültetése után 14 nappal alkalmazzuk, amikor a sebészeti vágás teljes mértékben begyógyult.

Ebben az időpontban naponta 100 mikroliter steril hordozópufferoldatot (amely 0,5 tömeg/térfogat% 20 hidroxi-propil-cellulózt tartalmaz, 10 mM hiszti dint,

140 mM NaCl, pH 7,4 oldatban) adagolunk, amely különböző mennyiségű (1 mikrogramm, 0,1 mikrogramm vagy 0,01 mikrogramm) újrahajtogatott aktív dimer TGF-β anyagot tartalmaz. Az injekciót közvetlenül a 25 bal oldali kamrákba adagoljuk (felülről a hát oldaláról nézve). A jobb oldali kamrák megfelelő ekvivalens mennyiségű placebo kontrollanyagokat kapnak (marhaszérum-albumin) a fenti hordozópufferben. A kontrollállatok a bal oldali kamrába a hordozó pufferanyagot önmagukban kapják, míg a jobb oldali kamrába nem alkalmazunk a kísérlet során kezelést. A kísérleti csoportok 5 állatból állnak. Az injekciókat 5 napon keresztül napi egyszer adagoljuk, és valamennyi injektált anyag steril, endotoxin- és pyrogénanyag-mentes. A kísérlet során valamennyi állatot külön-külön ketrecben tartunk, és az injekciósorozat befejezése után 24 órával az állatokat megöljük. Ezután minden egyes állatból a kamrákat aszeptikus módon eltávolítjuk, és a kamrák belsejéből a szálas szövetet nedvesen mérjük. A kamrafolyadékban található teljes savófehérjét Lowry és munkatársai (1951), J. Bioi. Chem., /93:265 közleménye szerinti eljárással becsüljük. Az egyes kamrák belsejéből és külsejéről eltávolított szálas szövetet hisztológiai vizsgálatra készítjük elő. A kamrák tartalmának sterilitását a kamrafolyadék-minták agy/szív infúziós lemezeken 72 óráig 37 °C hőmérsékleten végezett inkubálásával ellenőrizzük. Az olyan kamrákon, amelyek nyilvánvaló fertőzést vagy kitaszítást mutatnak, nem végzünk vizsgálatokat (kisebb, mint a teljes kamraszám 3%-a).

Az alábbi táblázatban egy újrahajtogatott dimer aktív TGF-p2 anyaggal végzett kísérlet eredményét mutatjuk be, ahol az adott értékek 5 illesztett kamrapárból kapott (bal és jobb oldali) fehérjeértékek átlagértékei minden egyes állatcsoport esetében.

Csoport	Bal kamrába adott ΤΟΙ -β2 dózis (mikrogramm)	Λζ illeszkedő kamrák (bal:jobb) fehérjetartalmának aránya
Rostos szövet	Savóprotein
1.	1,00	3,0:1	1,5:1
2.	0,10	2,5:1	1,4:1
3.	0,01	2,1:1	1,3:1
4.	nem kezelt*	1,0:1	1,0:1

* Csak hordozópuffcr, nem kezelt kamra.

A táblázatban közölt adatokból kitűnik, hogy amennyiben alkalmas hordozópufferben újrahajtogatott aktív dimer TGF-P2 vegyületet adagolunk 5 napon keresztül naponta helyi injekció formában, ez körülbelül háromszoros mennyiségben megnöveli a teljes rostos szövet felgyülemlését dózisfüggő módon a bal oldali kamrákban a jobb oldali kamrákkal összehasonlítva, amelyek csak a megfelelő ekvivalens mennyiségű placebofehérjével kezeltek. Kis mennyiségű szérumfehéijenövekedés is tapasztalható a bal oldali kamrákban dózisfüggő módon a többszöri TGF-P2 anyag injekció után (1-3. csoportok). A kontrollcsoportok esetében nem tapasztalható különbség a bal oldali és a jobb oldali kamrák között (5. csoport).

A fenti 1-3. csoportok állatainak halál utáni biopsiája egyértelműen azt mutatta, hogy a bal oldali TGF-β által kezelt kamrák szorosabban kötöttek a körülvevő kötőszövethez a testben, mint a szemközti jobb oldali, csak placeboinjekcióval kezelt kamrák. Ezen túlmenően hisztológiai vizsgálat szerint a TGF-β anyaggal kezelt kamrák körül található rostos szövet vastag40 sága és erezettsége jelentősen nagyobb, mint a placeboanyaggal kezelt kamrák körüli szöveté. Ezen túlmenően a TGF-β anyaggal kezelt kamrák belsejében található rostos szövetben nyilvánvaló a lemezek és migráló fibroblasztok, valamint mononukleáris sejtek jelenléte. A kontrollcsoport (4. csoport) esetében nem tapasztaltak érzékelhető különbséget sem a kamrákat körülvevő rostos szövet vastagságában és erezettségében, sem a kamra körülvevő kötőszövethez való kötésében. Az eredmények azt mutatják, hogy a TGF-β diffü50 ziója a kamrából eredményezte a megfigyelt különbségeket. A TGF-β anyaggal kezelt sejtek belsejében található savóban gyulladásos sejtek steril beszűrődése található, amely elsősorban makrofágokat tartalmaz, míg a szemközti oldali placebóval kezelt kamra folya55 dekában elsősorban polimorf magvú leukociták találhatók. Valamennyi 1-4 csoport esetében leírt 40 kamra tartalma, amelyet a példában bemutattunk, sterilnek bizonyult, amikor a kamra tartalmának mintáit agy/szív infúzióban 72 óráig 37 °C hőmérsékleten inku60 háltuk.

HU 218 144 Β

7. példa	Aktív hatóanyag TGF-p-szerű
Gyógyszerészeti formák			fehérje	1,0· 10-5
A. Krém			Propilénglikol	2,0
Alkotóelemek:	% (térfogat/térfogat)		Glicerin	2,0
Szorbitán-monosztearát	2,0	5	Magnézium-szulfát, vizes	0,7
Poli(oxi-etilén)-szorbitán-			Ionmentes víz	65,3
monosztearát	3,0		Tartósítóanyagok	q.s.
Cetil-alkohol	5,0		Az aktív hatóanyagot a vizes fázisban oldjuk gyen-
Folyékony könnyű paraffin	8,0		ge melegítés közben, és az oldatot	az olvasztottlipid-
Izopropil-mirisztát	2,0	10	fázisban diszpergáljuk. Az elegyet szobahőmérsékletre
Aktív hatóanyag TGF-P-szerű		hűtjük és homogenizáljuk.
fehérje	1,0-10-5		Hasonló eljárással 0,01-20 mikrogramm/ml ható-
Propilénglikol	2,0		anyag-tartalmú kenőcsöt állítunk elő. A kenőcsből
Glicerin	2,0		100 mikroliter/cm2 sebesülés dózist alkalmazunk.
Ionmentes víz	76,0	15	C. Parenterális oldat formált alak
Tartósítóanyagok és más			Alkotóelemek:
stabilizálószerek	q.s.		Aktív hatóanyag, TGF-P-szerű
A folyékony fázist 55-	60 °C hőmérsékletre mele-		fehérje	0,05 mg/ml
gítjük, az aktív hatóanyagot ebben oldjuk, és az olvasz-		± emberi szérumalbumin	1 mg/ml
tott lipid fázist erős keveréssel diszpergáljuk. Ezután az	20	Arginin vagy glicin	20 mg/ml
elegyet szobahőmérsékletre hűtjük és homogenizáljuk.		± szénhidrát	5-20 mg/ml
Hasonló eljárással 0,01	-20 mikrogramm/ml aktív		PH	7

hatóanyag-tartalmú krémet állítunk elő.

A krémből 100 mikroliter/cm² sebesülés dózist alkalmazunk. 25

B. Kenőcs

Alkotóelemek:

Szorbitán-trioleát Viasz, mikrokristályos Könnyű, folyékony paraffin Izopropil-mirisztát Lanolin-alkoholok % (térfogat/térfogat)

5,0

3,0

9,0 30

10,0

3,0

A szénhidrát lehet glükóz, mannóz, dextrán, hidroxi-etil-keményítő vagy ezek keveréke.

A pH értékét foszfáttal, szukcináttal vagy aminosavval vagy ezek keverékével állítjuk be.

0,05 mg TGF-P-szerű fehérje/0,5 ml ampullákat készítünk, és ezeket liofilizáljuk.

Mikroorganizmusok letétbe helyezése

Az alábbi mikroorganizmusokat helyeztük letétbe a

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig (FRG):

Mikroorganizmus E. coli LC137/pPLMu.hTGF-l E. coli LC137/pPLMu.hTGF-2 E. coli LC137/pPLMu.hTGF-3 Saccharomyces cerevisiae GRF 18

SEQ ID No. 1

Letétbe helyezési időpont 1989. november 28. 1989. november 28. 1989. november 28.

1986. március 4.

Hozzáférhetőségi szám DSM 5656 DSM 5657 DSM 5658

DSM 3665

Szekvenciatípus: megfelelő polipeptidnukleotid Szekvenciahossz: 339 alappár Lánc: kettős

Topológia: lineáris

Forrás: emberi cDNS Közvetlen kísérleti forrás: E. coli LC137/pPlMu.hTGF-pi (DSM 5656)

Jel lemzők: 1-336 kódterület a TGF - β 1 számára

GCC	CTG	GAC	ACC	AAC	TAT
Alá	Leu	Asp	Thr	Asn 5	Tyr
AAC	TGC	TGC	GTG	CGG	CAG
Asn	Cys 15	Cys	Val	Arg	Gin

TGC	TTC	AGC	TCC	ACG	GAG	AAG
Cys	Phe	Ser	Ser 10	Thr	Glu	Lys

CTG	TAC	ATT	GAC	TTC	CGC	AAG
Leu	T yr	Ile	Asp	Phe	Arg	Lys
20					25

HU 218 144 Β

GAC	CTC	GGC	TGG	AAG	TGG
Asp	Leu	Gly	Trp 30	Lys	Trp
CAT	GCC	AAC	TTC	TGC	CTC
His 40	Alá	Asn	Phe	Cys	Leu 45
AGC	CTG	GAC	ACG	CAG	TAC
Ser	Leu	Asp 55	Thr	Gin	Tyr
AAC	CAG	CAT	AAC	CCG	GGC
Asn	Gin	His	Asn	Pro 70	Gly
GTG	CCG	CAG	GCG	CTG	GAG
Val	Pro 80	Gin	Alá	Leu	Glu
GTG	GGC	CGC	AAG	CCC	AAG
Val	Gly	Arg	Lys 95	Pro	Lys
ATC	GTG	CGC	TCC	TGC	AAG
Ile	Val	Arg	Ser	Cys	Lys

TGC AGC TGA

Cys Ser

ATC	CAC	GAG	CCC	AAG	GGC	TAC
Ile	His	Glu 35	Pro	Lys	Gly	T yr

GGG CCC TGC CCC TAC ATT TGG

Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp 50

AGC	AAG	GTC	CTG	GCC	CTG	TAC
Ser	Lys 60	Val	Leu	Alá	Leu	T yr 65
GCC	TCG	GCG	GCG	CCG	TGC	TGC
Alá	Ser	Alá	Alá 75	Pro	Cys	Cys
CCG	CTG	CCC	ATC	GTG	TAC	TAC
Pro 85	Leu	Pro	Ile	Val	T yr 90	T yr
GTG	GAG	CAG	CTG	TCC	AAC	ATG
Val	Glu	Gin	Leu	Ser	Asn	Met

100

105 110

SEQ ID No. 2

Szekvenciatípus: polipeptidnek megfelelő nukleotid Szekvenciahossz: 339 alappár

Lánc: kettős Topológia: lineáris	GAT GCG	GCC Alá 5	TAT T yr
GCT Alá	TTG Leu
Asp	Alá
AAT	TGC	TGC	CTA	CGT	CCA
Asn	Cys 15	Cys	Leu	Arg	Pro

Forrás: emberi cDNS

Közvetlen kísérleti forrás: E. coli LC’137/pPLMu.hTGF-p2 (DSM 5657) Jellemzők: 1-336 kódterület a TGF-P2 számára

TGC	TTT	AGA	AAT	GTG	CAG	GAT
Cys	Phe	Arg	Asn 10	Val	Gin	Asp
CTT	TAC	ATT	GAT	TTC	AAG	AGG
Leu 20	T yr	Ile	Asp	Phe	Lys 25	Arg

HU 218 144 Β

GAT

CTA

GGG

TGG

AAA

TGG

ATA

CAC

GAA

CCC

AAA

GGG

TAC

Asp

Leu

Gly

Trp 30

Lys

Trp

Ile

His

Glu 35

Pro

Lys

Gly

T yr

AAT

GCC

AAC

TTC

TGT

GCT

GGA

GCA

TGC

CCG

TAT

TTA

TGG

Asn 40

Alá

Asn

Phe

Cys

Alá

Gly

Alá 45

Cys

Pro

Tyr 50

Leu

Trp

AGT

TCA

GAC

ACT

CAG

CAC

AGC

AGG

GTC

CTG

AGC

TTA

TAT

Ser

Ser

Asp 55

Thr

Gin

His

Ser

Arg 60

Val

Leu

Ser

Leu

T yr 65

AAT

ACC

ATA

AAT

CCA

GAA

GCA

TCT

GCT

TCT

CCT

TGC

TGC

Asn

Thr

Ile

Asn

Pro 70

Glu

Alá

Ser

Alá

Ser 75

Pro

Cys

Cys

CTG

TCC

CAA

GAT

TTA

GAA

CCT

CTA

ACC

ATT

CTC

TAC

TAC

273

Val

Ser 80

Gin

Asp

Leu

Glu

Pro 85

Leu

Thr

Ile

Leu

T yr 90

T yr

ATT

GGC

AAA

ACA

CCC

AAG

ATT

GAA

CAG

CTT

TCT

AAT

ATG

312

Ile

Gly

Lys

Thr 95

Pro

Lys

Ile

Glu

Gin 100

Leu

Ser

Asn

Met

ATT

GTA

AAG

TCT

TGC

AAA

TGC

AGC

TAA

339

Ile 105

Val

Lys

Ser

Cys

Lys 110

Cys

Ser

SEQ ID No. 3

Szekvenciatípus: megfelelő polipeptidhez tartozó nukleotid 45

Szekvenciahossz: 339 alappár

Lánc : kettős

Topológia: lineáris

Forrás: emberi cDNS

Közvetlen kísérleti forrás: E. coli

LC137/pPLMu.hTGF-33 (DSM 5658) Jellemzők: 1-336 kódterület a TGF~P3 számára

GCT

TTG

GAC

ACC

AAT

TAC

TGC

TTC

CGC

AAC

TTG

GAG

GAG

Alá

Leu

Asp

Thr

Asn

Tyr

Cys

Phe

Arg

Asn

Leu

Glu

Glu

5

10

AAC

TGC

TGT

GTG

CGC

CCC

CTC

TAC

ATT

GAC

TTC

CGA

CAG

Asn

Cys

Cys

Val

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ile

Asp

Phe

Arg

Gin

15

20

25

HU 218 144 Β

GAT

CTG

GGC

TGG

AAG

TGG

GTC

CAT

GAA

CCT

AAG

GGC

TAC

117

Asp

Leu

Gly

Trp

Lys

Trp

Val

His

Glu

Pro

Lys

Gly

Tyr

30

35

TAT

GCC

AAC

TTC

TGC

TCA

GGC

CCT

TGC

CCA

TAC

CTC

CGC

156

T yr

Alá

Asn

Phe

Cys

Ser

Gly

Pro

Cys

Pro

T yr

Leu

Arg

40

45

50

AGT

GCA

GAC

ACA

ACC

CAC

AGC

ACG

GTG

CTG

GGA

CTG

TAC

195

Ser

Alá

Asp

Thr

Thr

His

Ser

Thr

Val

Leu

Gly

Leu

T yr

55

60

65

AAC

ACT

CTG

AAC

CCT

GAA

GCA

TCT

GCC

TCG

CCT

TGC

TGC

234

Asn

Thr

Leu

Asn

Pro

Glu

Alá

Ser

Alá

Ser

Pro

Cys

Cys

70

75

GTG

CCC

CAG

GAC

CTG

GAG

CCC

CTG

ACC

ATC

CTG

TAC

TAT

273

Val

Pro

Gin

Asp

Leu

Glu

Pro

Leu

Thr

Ile

Leu

T yr

T yr

80

85

90

GTT

GGG

AGG

ACC

CCC

AAA

GTG

GAG

CAG

CTC

TCC

AAC

ATG

312

Val

Gly

Arg

Thr

Pro

Lys

Val

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Met

95

100

GTG

GTG

AAG

TCT

TGT

AAA

TGT

AGC

TAG

339

Val

Val

Lys

Ser

Cys

Lys

Cys

Ser

105

110

Claims (43)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás dimer, biológiailag aktív transzformáló növekedési faktor β típusszerű (TGF^-szerű) fehérje vagy sója előállítására, azzal jellemezve, hogy a TGF-p-szerű fehérje denaturált monomer formáját újrahajtogatjuk egy redoxrendszer és a következő szolubilizálószerek valamelyikének jelenlétében: enyhe detergens, mely lehetővé teszi a monomer TGF-βszerű fehérje dimerizálás után biológiai aktivitást biztosító térbeli konformációba való hajtogatását a monomer oldható formában való tartása mellett; rövid szénláncú alkanol; rövid szénláncú alkándiol; foszfolipid és két vagy több felsorolt szolubilizálószer keveréke.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a TGF-3-szerű fehérje monomer formáját a következő lépésekkel állítjuk elő:

   i) mikrobiális gazdaegyedet tenyésztünk, mely a 50 TGF^-szerű fehérjét kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz a megfelelő leolvasási keretben egy expressziós kontrollszekvenciához kapcsolva, így a fehérjét kifejezzük, és ii) a TGF-8-szerű fehérjét denaturált, monomer, 55 oldható formában kinyerjük.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a monomer TGF^-szerű fehérje oldhatatlan aggregátumként van jelen a mikrobiális gazdasejtekben, azzal jellemezve, hogy az eljárásban a következő további lépéseket hajt60 juk végre:

   HU 218 144 Β

   i) a gazdasejtekből elkülönítjük a TGF-P-szerű fehérjét tartalmazó, vízben oldhatatlan fehérjefrakciót, és ii) az oldhatatlan, TGF-p-szerű fehérjeaggregátumot szolubilizáljuk.
4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikrobiális gazdaegyedként élesztőt vagy baktériumot alkalmazunk.
5. 5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy csont morfogenetikus fehérjét vagy egy transzformáló növekedési faktor β fehérjét kódoló nukleotidszekvenciát alkalmazunk.
6. 6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oldhatatlan aggregátumot 1 és 4 közötti pH-n szolubilizáljuk.
7. 7. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oldhatatlan aggregátumot 2,5 körüli pH-értéken szolubilizáljuk.
8. 8. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oldhatatlan aggregátumot kaotrop szerrel teszszük oldhatóvá.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kaotrop szerként karbamidot vagy guanidin-hidrokloridot alkalmazunk.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kaotrop anyagot 4-9 M koncentrációban alkalmazzuk.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kaotrop szerként egy detergenst alkalmazunk.
12. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy TGF-p-szerű fehérjeként egy csont morfogenetikus fehérjét vagy egy transzformáló növekedési faktor β fehérjét alkalmazunk.
13. 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy TGF-P-szerű fehérjeként egy csont morfogenetikus fehérjét, TGF~p2-t vagy TGF-p3-at alkalmazunk.
14. 14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy TGF-P-szerű fehérjeként TGF-p2-t vagy TGF-p3-at alkalmazunk.
15. 15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy kis molekulatömegű szulfhidril/diszulfid redoxrendszer jelenlétében hajtjuk végre.
16. 16. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kis molekulatömegű szulfhidril/diszulfid redoxrendszerként oxidált és redukált formában lévő glutationt, oxidált és redukált formában lévő ditiotreitolt, oxidált és redukált formában lévő β-merkapto-etanolt, redukált formában lévő cisztint vagy redukált formában lévő cisztamint alkalmazunk.
17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szulfhidril/diszulfid redoxrendszert 1-100 mM koncentrációban alkalmazzuk.
18. 18. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szulfhidril/diszulfid redoxrendszerként oxidált és redukált formában lévő glutationt alkalmazunk 1-10 mM körüli koncentrációban.
19. 19. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szulfhidril/diszulfid redoxrendszerként oxidált és redukált formában lévő glutationt alkalmazunk

    1-10 mM körüli koncentrációban, mimellett az oxidált és redukált forma mólaránya 1:1 és 1:2 közötti.
20. 20. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy redoxrendszerként tioredoxin vagy diszulfidizomeráz fehérjét alkalmazunk.
21. 21. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy redoxrendszerként tioredoxin vagy diszulfidizomeráz fehérjét alkalmazunk 10-1000 pg/ml koncentrációban.
22. 22. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tioredoxin jelenlétében hajtjuk végre.
23. 23. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 10-1000 pg/ml koncentrációban alkalmazott tioredoxin jelenlétében hajtjuk végre.
24. 24. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szolubilizálószerként enyhe detergenst alkalmazunk, mely lehetővé teszi a monomer TGF-P-szerű fehérje dimerizálás után biológiai aktivitást biztosító térbeli konformációba való hajtogatását a monomer oldható formában való tartása mellett.
25. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enyhe detergensként nemionos detergenst, ionos detergenst vagy Zwitterionos detergenst alkalmazunk.
26. 26. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy detergensként egy szulfobetaint, 3-(3-klolamidopropilj-dimetil-ammonio-1 -propánszulfonátot, 3-(3-klolamido-propil)-dimetil-ammonio-2-hidroxi-l-propánszulfonátot, digitonint, kolátot vagy dezoxi-kolátot alkalmazunk.
27. 27. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy detergensként egy szulfobetaint, 3-(3-klolamidopropilj-dimetil-ammonio-1 -propánszulfonátot, 3-(3-klolamido-propil)-dimetil-ammonio-2-hidroxi-1 -propánszulfonátot, digitonint, kolátot vagy dezoxi-kolátot alkalmazunk 1-100 mM koncentrációban.
28. 28. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy detergensként 3-(3-klolamido-propil)-dimetilammonio-1-propánszulfonátot vagy 3-(3-klolamidopropil)-dimetil-ammonio-2-hidroxi-1 -propánszulfonátot alkalmazunk.
29. 29. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy detergensként 3-(3-klolamido-propil)-dimetilammonio-1 -propánszulfonátot vagy 3-(3-klolamidopropil)-dimetil-ammonio-2-hidroxi-1 -propánszulfonátot alkalmazunk 30-60 mM körüli koncentrációban.
30. 30. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rövid szénláncú alkanolt vagy alkándiolt, vagy ezek keverékét alkalmazzuk 10-50 térfogat% koncentrációban.
31. 31. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szolubilizálószerként foszfolipidet alkalmazunk.
32. 32. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 6-10 pH-értéken hajtjuk végre.
33. 33. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 8,0 körüli pH-értéken hajtjuk végre.
34. 34. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0-37 °C hőmérsékleten hajtjuk végre.
35. 35. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 4 °C körüli hőmérsékleten hajtjuk végre.

    HU 218 144 Β
36. 36. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Cu²⁺- vagy Fe³⁺- fémionokat tartalmazó, oxidációt elősegítő szerek jelenlétében hajtjuk végre.
37. 37. A 36. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Cu²⁺- vagy Fe³⁺- fémionokat 0,01-100 μΜ koncentrációban alkalmazzuk.
38. 38. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oxigéngázt is átbuborékoltatunk a reakciórendszeren.
39. 39. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapott dimer fehérjét kromatográfiásan tisztítjuk.
40. 40. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a monomer TGF-β-ί újrahajtogatás előtt Sszulfonáljuk.
41. 41. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szolubilizálószerként 3-(3-klolamido-propil)dimetil-ammonio-1 -propánszulfonátot alkalmazunk 30-60 mM körüli koncentrációban, továbbá oxidált és

    5 redukált formában lévő glutationt alkalmazunk 1-10 mM körüli koncentrációban, mimellett az oxidált és redukált forma mólaránya 1:1 és 1:2 közötti.
42. 42. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve. hogy a szulfhidril/diszulfid redoxrendszert az oxidált

    10 és a redukált forma 100:1 és 1:100 közötti mólarányában alkalmazzuk.
43. 43. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szulfhidril/diszulfid redoxrendszerként oxidált és redukált formában lévő glutationt alkalmazunk az oxi15 dált és redukált forma 6:1 és 1:6 közötti mólarányában.