KR20180128097A

KR20180128097A - 비 인간 줄기세포의 배양 상등액을 원료로 하는 화장품 또는 피부 재생 촉진제, 및 단백질의 이온 도입 방법

Info

Publication number: KR20180128097A
Application number: KR1020187034079A
Authority: KR
Inventors: 미노루 우에다; 야스히로 야마시타
Original assignee: 재패닉 코포레이션
Priority date: 2012-02-10
Filing date: 2013-02-08
Publication date: 2018-11-30
Also published as: WO2013118877A1; KR20140130159A; IN2014DN07174A; TWI649095B; CN107049910A; CN104203211A; JP6286689B2; EP2813211A1; HK1204568A1; EP2813211A4; SG11201404603SA; TW201343195A; US20150018750A1; JPWO2013118877A1

Abstract

노령 인구의 비율이 높아지고 있는 현재, 노화에 따라 발생하는 피부 손상, 즉 기미 나 주름의 발생 예방 등에 의해 피부를 건강한 상태로 유지할 수 있고, 안전성이 높으며, 윤리 면에서 문제가 없고, 또한 충분한 양을 제공할 수 있는 화장품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본원 발명은 비 인간 포유류의 골수 또는 치수 줄기세포 배양 상등액 분말을 주성분으로 함유하는 화장품을 제공한다. 또한, 상기 화장품을 이온 도입법에 의해 도입하는 단백질 이온 도입 방법을 제공한다.

Description

비 인간 줄기세포의 배양 상등액을 원료로 하는 화장품 또는 피부 재생 촉진제, 및 단백질의 이온 도입 방법{Cosmetic product or skin regeneration promoter comprising nonhuman stem cell culture supernatant as starting material, and method for ion introduction for protein}

본 발명은 비 인간 치수 줄기세포, 골수 줄기세포 및 지방 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 줄기세포의 배양 상등액을 원료로 하는 화장품 등에 관한 것이다.

나이가 들면 기미와 주름이 증가하는 것은 잘 알려져 있지만, 이것은 단파장 자외선(UVB)에 노출 양이 증가하는 것과 함께 나이가 드는 것으로 알려져 있다. 그리고 UVB는 인간 진피 중의 피부 섬유 아세포(HDF)에 의한 콜라게나아제(Collagenase)의 생산량을 증가시키기 위해 콜라겐의 분해를 촉진하여 변성 탄성 조직의 침착을 유도하고 그 결과 피부에 주름이나 황변이 발생하는 것으로 사료되고 있다.

화장품은 예로부터 다양한 식물 유래 성분을 원료로 제조되어 사용되어오고 있지만, 최근에는 태반, 스쿠알렌, 콜라겐 등의 동물 유래 성분을 배합한 화장품이 노화에 의한 피부의 쇠약, 예를 들어 주름이나 잔주름의 형성을 방지하고 보습성을 개선하는 것 등을 목적으로 하여 다수 시판되고 있다.

또한 같은 목적으로 세포의 배양 상등액을 함유하는 화장품 등도 개발되어 인간 폐의 평활근 세포, 상피 세포, 섬유 아세포 등을 배양하고 세포 파쇄물 또는 배양 상등액을 화장품용 조성물로 사용하는 것이 개시되어있다(특개 2005-336188호 공보 참조, 이하 종래 기술 1이라 한다).

한편, 이러한 세포의 배양 상등액이 아니라 인간의 골수와 치수 등으로부터 얻은 줄기 세포를 신경 질환 치료용 의약 조성물로 이용하는 방법도 알려져 있다 (WO 02/086108호 공보 참조, 이하 종래 기술 2 라 한다).

또한 인간의 탈락 유치의 치수 줄기 세포(stem cells from exfoliated deciduous teeth; SHED)의 배양 상등액을 손상부 치료용 조성물로 사용하는 것이 개시되었다(국제 공개 WO 2011/118795호 공보 참조, 이하 종래 기술 3이라 한다)

[특허 문헌 1] 특개 2005-336188 [특허 문헌 2] 국제 공개 WO 02/086108호 공보 [특허 문헌 3] 국제 공개 WO 2011/118795호 공보

종래 기술 1에서는 백혈병 억제 인자(Lymphoma inhibition factor: LIF), LIF 유사체 또는 LIF 모방체(이하 집합적으로 "LIF 등"이라 한다)을 화장품용 조성물에 배합하는 기술을 제안하고 있다. 종래 기술 1은 LIF를 함유하는 배양 상등액을 동결 보존되어 있던 표피 세포에 첨가하면 in vitro 상에서 양질의 표피 세포가 형성된다는 점에서 뛰어나다.

그러나 in vitro 실험 결과가 그대로 in vivo에서의 실험에도 반영된다는 보장이 없기 때문에 화장품에 배합한 경우의 효과가 입증되지 않은 문제가 있다.

또한, 종래 기술 2는 일반 세포보다 증식능이 높은 줄기 세포를 사용하고 있으며, 그 생산하는 생체 인자를 이용할 수 있다는 점에서 뛰어난 기술이다.

그러나 인간 유래의 줄기 세포를 사용하고 있기 때문에, (a) 나이가 들수록 채취 가능한 줄기 세포 수가 감소하고, (b) 노화로 인해 유전자 변이가 축적되기 때문에 줄기 세포를 이식하는 경우 안전이 반드시 보장되지 않으며, (c) 골수 줄기 세포(BMSC)의 수, 증식 능력과 분화 능력은 나이와 함께 감소하기 때문에 줄기 세포라고는 말해도 세포 증식능이 낮고, (d) 골수 천자(bone-marrow puncture)에 의해 줄기 세포를 채취하는 것은 생체에 침입도가 크고, 위험을 동반한다는 것과 같은 문제를 안고 있다. 또한 인간의 세포를 사용하는 것은 충분한 줄기 세포 자원의 제공이 어려울 뿐만 아니라 윤리 면에서도 문제가 많다.

종래 기술 3은 인간의 치수 줄기 세포의 배양 상등액을 사용하고 있기 때문에 세포 자체를 사용하는 경우보다 안전성이 높다는 점에서 뛰어난 기술이다.

그러나, 종래 기술 2와 같이, 의료 폐기물로 불리는 탈락 치아라고는 해도 인간의 세포를 사용한다는 점에서 윤리 면에서 문제가 있고, 또한 충분한 줄기 세포 자원의 제공이 어렵다는 문제가 있다.

한편, 다능성을 가지는 줄기 세포는 피부 조직, 뼈 조직, 근육 조직 기타 다양한 조직으로 분화시킬 수 있다. 그리고 노령 인구의 비율이 높아지고 있는 현재, 노화에 따라 동반하는 피부 손상, 즉 기미나 주름의 발생 예방 등에 의해 피부를 건강한 상태로 유지하는 것에 대한 사회적 요구가 있다. 또한 나이를 불문하고 머리숱, 탈모 등 모발에 관한 고민을 해결하고자 하는 사회적 요구도 있다.

그리고 UVB로부터의 손상을 경감시키거나 개선하는 효과가 높은 화장품 등에 대한 강한 사회적 요구가 있다.

본 발명의 발명자는 상기와 같은 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭 한 결과, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명의 제 1 측면은 비 인간 포유류의 치수 줄기 세포, 골수 줄기 세포와 지방 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 줄기 세포의 배양 상등액 분말을 주성분으로 함유하는 화장품이다. 여기서, 상기 비 인간 포유류의 줄기 세포는 돼지의 탈락 유치의 치수, 돼지 골수 및 돼지 지방 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 조직에서 얻은 것이 바람직하다. 또한, 상기 배양 상등액 분말은 상기 돼지의 탈락 유치 치수, 돼지 골수 줄기 세포 및 돼지 지방 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 줄기 세포의 배양 상등액을 알코올 농축한 후 동결 건조하여 얻은 것이 바람직하다.

또한, 상기 배양 상등액 분말은 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF), 인슐린 성장 인자(IGF), 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 간세포 성장 인자(HGF) 및 트랜스 포밍 성장 인자(Transforming growth factor, TGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종 이상의 성장 인자를 함유하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 화장품은 액제, 크림제, 연고제, 젤제, 유액제 및 경고제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인 것이 바람직하다.

또한, 상기 화장품은 두피를 포함한 피부 또는 모발에 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제 2 측면은, 용해제를 포함하는 제 1 구획과 돼지의 탈락 유치 치수 줄기 세포 배양 상등액 분말, 돼지 골수 줄기 세포 배양 상등액 분말 및 돼지 지방 줄기 세포 배양 상등액 분말로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 정세 분말과 담체로 이루어진 유효 성분 조성물을 포함하는 제 2 구획과, 상기 제 1 및 제 2 구획의 격벽을 관통시키기 위한 봉상의 부재를 저장 용기에 내재시킨 화장품이며, 사용 직전에 상기 봉상의 부재에 의해 상기 제 1 및 제 2 구획의 격벽에 관통 구멍을 마련하여, 상기 유효 성분 조성물을 상기 생리 식염수에 용해시키는 것을 특징으로 하는 화장품이다. 상기 용해제는 마이너스 이온이 충전된 액체 식염수 및 인산 완충 생리 식염수로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 액체 인 것이 바람직하다.

본 발명의 제 3 측면은, 상기 화장품을 시트 형태의 보습성 부재에 흡수시키고, 흡수시키고 싶은 부위에 올려서 플러스로 대전된 전극을 피부의 원하는 부위에 접촉시켜 마이너스로 대전된 봉상의 전극을 상기 시트 위를 회전시키면서 이동시키는 것을 특징으로 하는 단백질의 이온 도입 방법이다.

상기 원하는 부위는 팔, 손, 손바닥, 다리, 무릎 뒤, 그리고 발바닥으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명의 제 4 측면은 비 인간 포유류의 치수 줄기 세포 배양 상등액 분말, 골수 줄기 세포 배양 상등액 분말 및 지방 줄기 세포 배양 상등액 분말로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 줄기 세포의 배양 상등액 분말을 유효 성분으로 함유하는 피부 형성 촉진제이다. 여기서, 상기 비 인간 포유류의 줄기 세포는 돼지 탈락 유치의 치수, 돼지 골수 및 돼지 지방 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직에서 얻은 것이 바람직하고, 상기 배양 상등액 분말은 상기 돼지의 탈락 유치 치수 줄기 세포의 배양 상등액, 상기 골수 줄기 세포의 배양 상등액 및 상기 지방 줄기 세포의 배양 상등액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 배양 상등액을 알코올 농축 한 후 동결 건조하여 얻어진 것이 바람직하다.

위의 피부 형성 촉진제는 액제, 크림제, 연고제, 젤제, 유액제 및 경고제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면, 인간 줄기 세포 및 그 배양 상등액을 함유하는 화장품보다 안전하며, 뛰어난 주름 개선, 미백 등의 효과, 그리고 발모, 육모 등의 효과를 갖는 화장품을 제공할 수 있다.

도 1은 자외선 조사에 의한 피부 노화(빛에 의한 피부의 노화)에 대한 돼지 줄기 세포의 배양 상등액의 피부 재생 효과를 모식적으로 나타내는 도이다.
도 2는 돼지 골수 줄기 세포(pBMSC), 돼지 치수 줄기 세포(pDPSC) 및 돼지의 탈락 유치 치수 줄기 세포(pSHED)에 브로데옥시우리딘(BrdU)을 첨가하였을 때 BrdU를 첨가한 세포의 비율을 나타내는 그래프이다. *는 p <0.05를 나타낸다.
도 3은 빛에 의한 피부 노화에 대한 돼지 성장 인자(pGF)의 효과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 3 (A)는 pGF을 투여하지 않은 대조군의 피부, 또한 도 3(B)는 pGF를 투여했을 때 피부에서, 이후에 서술하는 바와 같이 복제(replica)를 형성하고 각 복제본을 현미경으로 관찰했을 때의 상을 나타내는 현미경 사진이다.
도 4는 줄기 세포 배양 상등액 미 투여 대조군, 돼지 탈락 유치 치수 줄기 세포 배양 상등액 투여군(pSHED-CM) 및 돼지 치수 줄기 세포 투여군(pSHED)의 피부 광노화의 상태를 나타내는 그래프이다.
도 5는 도 4에 표시된 각 군의 마우스의 피부 상태를 나타내는 조직 염색 상이다. 위쪽 화살표는 표피를 아래쪽 화살표는 진피를 각각 나타낸다.
도 6은 UV 조사를 하지 않은 피부 세포(음성대조군), UV 조사한 피부 세포(UVS, 광 노화한 피부 세포), 광노화 후 돼지 성장 인자를 투여 한 피부 세포(pGF)를 나타내는 그래프이다. **는 p <0.01를 나타낸다.
도 7은 돼지 골수 줄기 세포(pBMSC) 및 돼지 치수 줄기 세포(pSHED)의 배양 3 일째 및 7 일째의 세포 상태를 나타내는 현미경 사진이다.
도 8은 시험 시작 전후의 기미 상태를 나타내는 사진이다. 도 8(A)는 시험 시작 전, 도 8(B)는 시험 종료 후(6개월 후) 기미의 상태를 나타낸다.
도 9는 시험 시작 전후의 이마 주름의 상태를 나타내는 사진이다. 도 9(A)는 시험 시작 전, 도 9(B) 종료 후(12개월 후) 이마 주름의 상태를 나타낸다.
도 10은 시험 시작 전후의 피부에서 도 3과 동일하게 하여 만든 복제 관찰 상을 나타내는 현미경 사진이다. 도 10(A)는 시험 시작 전, 도 10(B)는 시험 종료 후의 상태를 나타낸다.
도 11은 시험 시작 전 모발의 상태를 나타내는 사진이다.
도 12는 시험 시작 14일 후의 모발 상태를 나타내는 사진이다.
도 13은 시험 시작 전에 두피 상태를 나타내는 사진이다.
도 14는 시험 시작 3일 후 두피 상태를 나타내는 사진이다.
도 15는 시험 시작 5일 후 두피 상태를 나타내는 사진이다.
도 16은 시험 시작 7일 후 두피 상태를 나타내는 사진이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 화장품에 사용되는 돼지의 치수 줄기 세포 배양 상등액 분말은 하기와 같이 얻을 수 있다.

먼저 돼지 턱은 도살 직후의 식용육 돼지 하악과 하악 치아를 사용하는 것이 바람직하다. 여기에서 도살 직후의 것이 바람직하다는 것은 얻을 수 있는 세포의 신선도가 좋기 때문이다. 또한 식용육인 것이 바람직하다는 것은 치수의 입수가 용이하고 바이러스나 세균에 감염되지 않은 안전성이 높으며, 비용이 낮기 때문이다. 또한, 생후 3개월 ~ 12개월 돼지인 것이 하악과 하악 치아에서 얻을 수 있는 줄기 세포의 숫자 측면에서 바람직하고, 생후 5 ~ 6개월 돼지인 것이 더욱 바람직하다.

먼저, 입수한 도살 직후의 식용육 돼지 하악 치아와 턱뼈를 -40 ~ -30℃에서 냉장하여 반송하지만, 예를 들어, 저온상태를 유지시키는 아이스 박스(-30℃) 등을 사용할 수 있다.

그런 다음, 아래 턱 전체 표면을 살균하기 위해, 예를 들어, 이서진 등의 소독약을 이용하여 소독을 실시한다. 그 후, 예를 들어, 치과용 다이아몬드 포인트 등을 이용하여 치관을 수평 방향으로 절단하고, 이어서 수강(공수가 들어있는 뼈의 빈 구멍)에 따라 수직 방향으로 절단한다. 이렇게 절단하여 치아의 천개(canopy)를 원활하게 제거할 수 있다. 그 후, 상기와 같이 처리한 치관 및 치근 부 모두에서 치수를, 예를 들어, 치과용 스케일러, 치과용 파일 등을 이용하여 채취한다.

얻어진 치수를, 예를 들어, 안하용 천도 등을 이용하여 재단하고 원하는 혈청과 항생 물질을 함유 한 기본 배지에 현탁한다. 여기에서 사용하는 기본 배지로는 5 ~ 20%(v/v)의 소 혈청, 5 × 10³ ~ 5 × 10⁴ U/mL의 페니실린 및 5 ~ 50 mg/mL의 스트렙토마이신을 1%(v/v) 첨가 한 Dulbecco's Modified Eagle's medium(EMEM) 등을 들 수 있다.

이어서, 원하는 농도의 콜라게나아제(collagenase)와 디스파아제(dispase)를 포함 효소 용액을 조제하고, 이를 이용하여 치수 세포를 분리한다. 예를 들어, 1 ~ 5 mg/mL의 콜라게나아제와 디스파아제를 포함하는 효소 용액에 현탁하여, 35 ~ 38℃의 항온수조 안에서 30분 ~ 1.5시간 동안 세포를 처리한다.

그 후, 2 ~ 5분간, 바람직하게는 3분 동안 원심 분리(예를 들면, 약 1,500 rpm(1,000 × g))을 실시하고, 효소 처리에 의해 분리된 치수 세포를 회수한다. 이 때, 셀 스트레이너(Cell Strainer)에 의한 세포 선별은 SHED 및 DPSC의 신경 줄기 세포 분획의 회수 효율을 저하시키기 때문에 사용하지 않는 것이 바람직하다.

또한 지방 줄기 세포는 하기와 같이 얻을 수 있다. 세포의 신선도가 높고, 또한 입수가 용이하기 때문에 돼지의 창자 간 막의 지방 조직을 사용한다. 반송 조건은 식용육 돼지의 하악 치아와 턱뼈의 경우와 동일하다. 먼저, 도살 직후의 식용육 돼지 창자 간 지방 조직을 채취하여 모은다. 이어서, 얻어진 지방 조직에 붙어있는 다른 조직을 제거하고 세포를 칼이나 가위 등으로 다진다.

그 다음 원하는 혈청과 항생물질을 함유하는 기본 배지에 현탁한다. 여기에서 사용하는 기본 배지는 상기에서 사용한 배지와 같다. 이어서, 치수 줄기 세포를 제조하는 경우와 마찬가지로, 상기와 같이 원하는 농도의 콜라게나나제와 디스파아제를 포함하는 효소 용액을 조제하고, 이를 이용하여 지방 줄기 세포를 얻는다.

이어서, 분리된 치수 세포, 골수 세포 또는 지방 세포를 원하는 배지를 이용하여 배양하고 배양 상등액을 얻는다. 예를 들어, 얻어진 세포를 2 ~ 8 mL의 상기 기본 배지에 재현탁하고 적당한 크기의 부착성 세포 배양용 접시에 파종한다. 예를 들어, 직경 6 cm의 상기 접시에 파종하여 배양액(예: 10% FCS 함유 DMEM(Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium))을 첨가한 후, 5% CO₂ 존재 하에서 약 35 ~ 38℃로 조정 한 인큐베이터 중간에 약 10일 ~ 20일 정도 배양한다.

배지 제거 후 PBS 등을 이용하여 세포를 1 ~ 여러 번 세척한다. 이상의 조작(배지 제거 및 세포 세척)에 대신하여 콜로니를 형성한 접착성 세포를 회수할 수도 있다. 이 경우, 예를 들어, 0.01 ~ 0.1% 트립신 및 2 mM의 EDTA를 함유한 용액에서 5분 동안 37℃에서 처리하고 접시에서 세포를 박리시킨다. 박리된 세포를 회수하여 부착성 줄기 세포를 얻을 수 있다.

이어서, 선발한 접착성 세포를 배양한다. 예를 들면, 세포를 상기와 동일한 부착성 세포 배양용 접시에 파종하여 동일한 조건에서 배양하여 필요에 따라 계대를 실시한다. 예를 들어, 육안으로 관찰하여 하위융합(subconfluent; 배양 용기 바닥의 약 70%가 부착된 세포로 덮여있는 상태) 또는 합류(confluent)에 도달할 때 상기와 같은 처리를 실시하고 세포를 배양 용기로부터 박리시켜 회수하고 다시 적당한 양의 신선한 동일 조성의 배양액을 포함하는 배양 용기에 파종한다. 계대 배양은 필요한 세포 수에 도달할 때까지 반복할 수 있다. 예를 들어, 계대 배양을 1-8회 실시하면 세포 수는 약 1 × 10⁷ 개/mL까지 증가한다.

상기와 같이 배양 한 후, 세포를 회수하고, 예를 들면 액체 질소에 저장할 수 있다.

배양 초기에는 하위융합 때까지 필요에 따라, 예를 들어 주 2 ~ 3회의 빈도로 배지를 교환한다. 하위융합된 배양 플라스크의 상등액을 흡인기 등을 이용하여 제거하고, 세포 0.01 ~ 0.1%(v/v)의 트립신을 포함하는 Hepes 용액을 맞추고 플라스크의 바닥에서 떨어지게 한다. 여기에 신선한 배지를 적당량 첨가하여 벗겨진 세포를 현탁하여 멸균이 끝난 원심 튜브에 옮긴다. 이어서 800 ~ 1,200 × g(약 1,500 rpm)로 실온에서 2 ~ 5분간, 바람직하게는 3분간 원심 분리한다. 예를 들어, 0.05% 트립신을 포함하는 Hepes 용액을 조제하고, 이 용액을 배지를 제거한 플라스크에 소량 첨가하여 바닥 전체에 돌아가도록 하여 세포가 벗겨진 곳에서 약 5 ~ 8 mL의 신선한 배지를 첨가하여 약 1,500 rpm으로 3분간 실온에서 원심 분리하여 농축할 수 있다. 농축된 세포 용액 1 mL 당 농도를 바이어블 카운트로 구하고, 신선한 배지 약 10 ~ 40 mL를 첨가한 배양 플라스크에 약 10 ~ 40 mL를 첨가하여 계대 배양하고 돼지의 탈락 유치 치수 줄기 세포(pSHED), 골수 줄기 세포 또는 지방 줄기 세포를 얻는다.

또한 돼지 하악골 마디 하악 앞니의 혀 쪽에, 예를 들어 치과용 다이아몬드 포인트 등으로 천공을 만든다. 이 구멍에 예를 들어, 18G 주사 바늘을 붙인 주사기 등을 삽입하여 골수를 흡입한다. 채취한 골수는 상기 서술 한 바와 같이 하위융합될 때까지 배양하고, 배양 플라스크의 바닥으로부터 박리하여 원심 분리하여 계대 배양하고 돼지 골수 줄기 세포(pBMSC)를 얻는다.

상기와 같이 얻어진 줄기 세포는 간엽계 유래의 체세포 줄기 세포인 젖니 치수 줄기 세포, 골수 줄기 세포 또는 지방 줄기 세포이다. 이러한 줄기 세포의 배양 상등액 중에는 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 간세포 성장 인자(HGF), 인슐린 양 성장 인자(IGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 형질 전환 성장 인자-베타(TGFβ)-1 및 -3, TGF-α, KGF, HBEGF, SPARC 기타 사이토카인이 분비되기 때문에 이러한 줄기 세포를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 줄기 세포 배양 상등액을 얻기 위해 사용하는 줄기 세포는 식용 돼지에서 얻을 수 있는 것이나, 세포 자신의 안전성이 높고 인간의 조직에서 채취할 필요가 없기 때문에 이러한 채취에 의한 침략 문제가 없으며 또한 얻어진 세포를 이용할 때의 윤리적인 문제도 없다는 큰 장점이 있다.

또한, 상기 줄기 세포의 배양 상등액(pSHED-CM)은 상기 서술 한 VEGF, HGF, IGF, PDGF와 TGF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 조합을 포함할 수 있으나, 콜라겐의 재형성능이 높다는 점에서 바람직하다.

또한, 상기 서술한 줄기 세포 배양 상등액에 1 이상의 공지된 사이토카인에 해당되는 것을 첨가하여 사용할 수도 있다.

상기 줄기 세포 상등액은 상기 줄기 세포를 소정의 조건에서 배양 한 다음, 원심 분리 등에 의해 세포를 제거함으로써 얻을 수 있다. 이렇게 얻은 배양 상등액에, 예를 들면, 원심분리, 농축, 용매의 치환, 투석, 동결 건조, 탈염 등의 각종 처리를 하여 그들을 사용할 수도 있다. 예를 들어, 드라이 아이스-아세톤에 냉동시킨 후 건조시키면, 상기 배양 상등액의 동결 건조 분말을 얻을 수 있다.

줄기 세포 배양액에는 기본 배지 또는 기본 배지에 혈청 등을 첨가한 배지를 사용할 수 있다. 기본 배지로는 상기 서술 한 DMEM 외에 Iscove's Modi ed Dulbecco's Medium(IMDM; GIBCO), HamF12(SIGMA, GIBCO), RPMI1640 배지 등을 사용할 수 있다. 또한 두 가지 이상의 기본 배지를 병용하는 혼합 배지를 사용할 수도 있다. 혼합 배지의 일례로서 IMDM과 HamF12을 동등하게 혼합한 배지(예를 들어 상품명: IMDM / HamF12(GIBCO)로 시판되는)을 들 수 있다.

또한, 배지에 첨가할 수 있는 성분으로, 예를 들어 혈청(소 태아 혈청, 말 태아 혈청, 인간 혈청, 양 혈청 등), 혈청 대체물(Knockout serum replacement(KSR) 등), 소 혈청 알부민(BSA), 항생제, 각종 비타민, 각종 미네랄을 들 수 있다.

또한 혈청을 포함하지 않는 상기 서술 한 "줄기 세포의 배양 상등액"을 얻기 위해서는 줄기 세포 배양의 전 과정을 통해서, 또는 마지막 또는 마지막에서 몇 번의 계대 배양시 혈청 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 줄기 세포의 배양은 통상적으로 사용되는 조건을 그대로 적용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 화장품에 포함된 pSHED는 그 안에 상술 한 바와 같이 각종 성장 인자를 포함한다. 이 때문에 피부에 도포 등을 함으로써 이러한 성장 인자를 경피 흡수시킬 수 있다. 본 발명의 화장품에 첨가할 수 있는 성분으로는 히알루론산, 콜라겐, 피브리노겐(예를 들면, BOLHEAL(등록 상표)) 등 유기 생체 흡수성 재료; 히알루론산, 콜라겐, 섬유소 접착제 등 생체 친화성이 높은 겔 재료를 들 수 있다. 또한 제제 학적으로 허용되는 다른 성분(예를 들어, 담체, 부형제, 붕해제, 완충제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리식염수 등)를 첨가 할 수도 있다.

여기에 사용되는 콜라겐은 가용성(산 가용성 콜라겐, 알칼리 가용성 콜라겐, 효소 수용성 콜라겐 등)인 것이 본 발명의 화장품에의 적합성 측면에서 바람직하다.

부형제로는 예를 들면, 유당, 전분, 소르비톨, D- 만니톨, 흰 설탕 등을 사용할 수 있으며, 붕해제로는 카르복시메틸 셀룰로오스, 탄산 칼슘 등을 사용할 수 있다. 완충제로는 인산염, 구연산염, 아세트산염 등을 사용할 수 있으며, 유화제로는, 아라비아검(Gum arabic), 알긴산 나트륨, 트라간트고무(Tragacanth) 등을 이용할 수 있다. 현탁 제로는 모노스테아린산 글리세린(Glyceryl Monostearate), 모노스테아린산 알루미늄(Aluminium monostearate), 메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시 메틸 셀룰로오스, 라우릴 황산 나트륨(sodium lauryl sulfate) 등을 사용할 수 있다.

안정제로는 프로필렌 글리콜, 아스코르빈산(ascorbic acid) 등을 사용할 수 있으며, 보존제로는 페놀, 염화 벤잘코늄(benzalkonium chloride), 벤질 알코올, 클로로 부탄올, 메틸 파라벤(Methylparaben) 등을 이용할 수 있다. 방부제로는 염화 벤잘코늄, 파라 옥시 벤조산(para-hydroxybenzonate), 클로로 부탄올 등을 이용할 수 있다. 이 외에도 pH 조정제 등을 함유시킬 수도 있다.

본 발명의 화장품의 최종 형태는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 화장수, 유액, 로션, 젤, 크림 등으로 할 수 있다.

상기 서술 한 화장품의 제조 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 돼지 하악을 사용하는 경우에는 하기와 같이 제조되는 것이 바람직하다.

우선, 상기 서술 한 바와 같이하여 얻어진 돼지 하악에서 치수 줄기 세포를 얻는다. 돼지 하악 대신 지방 조직을 사용하여 상기와 같이 지방 줄기 세포를 얻는다. 이어서, 예를 들면, 혈청이 없는 배지를 이용하여 상기와 같은 조건 하에서 치수 줄기 세포를 배양하고, 예를 들어, 스포이드나 피펫 등을 이용하여 그 배양 상등액을 회수한다. 회수 한 배양 상등액은 그대로 사용하여도 좋고, 또는 원심분리, 농축, 투석, 동결 건조, 희석 및 탈염 등, 이 중에서 하나 이상의 방법으로 처리한 후 사용할 수도 있다.

또한, 하기 설명하는 실시 예에 나타낸 바와 같이, 얻어진 줄기 세포의 배양 상등액은 고도로 정제하지 않은 상태에서도 원하는 작용을 나타낸다. 이는 본 발명의 화장품에 사용하는 조성물은 간편하고 신속하게 제조할 수 있는 것을 의미하고, 정제 중 발생하는 활성 저하를 방지할 수 있다는 장점이 있다.

상기 얻어진 배양 상등액은, 먼저 단백질량을 측정한 후 콜라겐의 정제후 활성을 측정하여 활성비를 구한다. 활성비를 지표로 하여 품질을 일정하게 유지할 수 있기 때문이다.

활성비가 낮은 경우에는 스핀 컬럼 농축 또는 에탄올 침전에 의해 농축을 할 수 있다. 스핀 컬럼 농축을 할 경우, 그 컬럼에 걸 수 있는 최대 금액의 배양 상등액을 원하는 스핀 컬럼에 옮기고, 3,000 × g에서 5,000 × g에서 약 30 ~ 90분간 원심 분리한다. 얻어진 농축 배양 상등액과 같은 양의 혈청의 용매를 이 튜브에 첨가하여 다시 3,000 × g에서 5,000 × g에서 약 30 ~ 90분간 원심 분리하여 배양 상등액의 용매를 혈청이 없는 용매로 교체할 수 있다.

예를 들어, 스핀 컬럼으로 Amicon Ultra Centrifugal Filter Units-10K(밀리포어)를 사용하는 경우, 컬럼에 걸 수 있는 최대량은 15 mL이다. 따라서 약 15 mL의 배양 상등액을 로딩하고 4,000 × g에서 60분 동안 4 ℃에서 원심 분리하면 200 ㎕까지 농축할 수 있다. 200 ㎕까지 농축 한 배양 상등액과 동량의 멸균 PBS를 넣고 다시 4,000 × g에서 60 분 동안 4 ℃에서 원심 분리하여 배양 상등액의 용매를 PBS로 교환한다. 얻어진 용액을 마이크로 테스트 튜브에 회수하여 이를 농축 줄기 세포 배양 상등액으로 사용한다. 마지막으로 얻을 수 있는 양이 약 200 ㎕이 된 경우에는 농축도는 75배가 된다.

또한 에탄올 침전의 경우, 예를 들어, 하기와 같은 순서로 한다. 먼저 어떤 배양 상등액에 대해 9배의 100% 에탄올을 첨가하여 혼합하고 약 -10 ~ 30℃에서 30 ~ 90분간 방치한다. 이어 약 4 ℃의 10,000 ~ 20,000 × g에서 약 10 ~ 20분간 원심 분리한다. 상등액을 제거하고 1/5 용액의 90 % 에탄올을 가하여 잘 저어 준다. 이어 약 4 ℃의 10,000 ~ 20,000 × g에서 3 ~ 10분간 원심 분리한다. 상등액을 제거하고 얻어진 펠렛을 원하는 양의 멸균수, 예를 들어, 500 ㎕의 멸균 수에 용해하여 마이크로 테스트 튜브에 회수하여 농축 줄기 세포 배양 상등액을 얻을 수 있다.

예를 들어, 5 mL의 배양 상등액에 45 mL의 100 % 에탄올을 첨가하여 잘 혼합하여 -20 ℃에서 60 분간 방치한다. 이어서 4 ℃의 15,000 × g에서 15분간 원심 분리하여 상등액을 제거한다. 그 후 10 mL의 90 % 에탄올을 가하여 잘 저어 준다. 다시 4 ℃의 15,000 × g에서 5분간 원심 분리하여 상등액을 제거한다. 얻어진 펠렛을 멸균수 500 ㎕에 현탁시켜 마이크로 테스트 튜브에 회수하여 농축 줄기 세포 배양 상등액으로 사용한다. 이 경우 먼저 이용한 배양 상등액이 5 mL이면 농축도는 10배가 된다.

또한, 본 발명의 화장품에 사용하는 줄기 세포의 배양 상등액은 하기와 같이 동결 건조 제품으로 사용할 수도 있다. 먼저 상기 얻은 줄기 세포의 배양 상등액 또는 농축 줄기 세포 배양 상등액을 약 50 ~ 150 mL 용량의 용기에 일정량씩 넣고 샘플 튜브의 뚜껑을 닫아 약 -100℃ ~ 약 -60℃에서 2시간에서 반나절에 걸쳐 동결시킨다. 이 상등액을 동결한 후, 샘플 튜브의 뚜껑을 열고 동결 건조기에 세팅한다. 이어 1 ~ 2일간 동결 건조를 실시하여 얻어진 시료를 동결 건조 줄기 세포 배양 상등액으로 사용한다. 이 동결 건조 줄기 세포 상등액은 약 -100 ℃ ~ -60 ℃에서 저장할 수 있다.

예를 들어, 50 mL 용량의 바이알(고무 마개 포함) 8 개에 약 20 mL 씩 배양 상등액을 넣고 고무 마개를 하고 약 -30℃에서 수 시간 동안 동결시킨다. 이어서, 이 바이알의 뚜껑을 열고 동결 건조기(야마토 과학(주), DC41A)에 세팅한다. 이어서, 시료가 건조될 때까지 동결 건조하여, 동결 건조 배양 상등액을 얻을 수 있다.

상기와 같은 조작에 의해 보다 좋은 저장 안정성을 갖는 배양 상등액의 동결 건조 제품이 얻어진다.

위의 화장품을, 이온 도입법에 의해 피부에서 도입하는 경우에는, 상기 화장품을 시트 형태의 보습성 부재에 흡수시키고, 흡수시키고 싶은 부위, 예를 들면 얼굴이나 두피에 올려 플러스로 대전된 전극을 원하는 부위에 접촉시켜 마이너스로 대전된 막대 모양의 전극을 상기 시트 위를 회전시키면서 이동시킨다.

여기서, 상기 원하는 부위는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 팔, 손, 손바닥, 다리, 무릎 뒤 및 발바닥으로 이루어진 군에서 선택되는 것이나, 플러스로 대전된 전극을 안정적으로 접촉할 수 있는 부분이 바람직하다.

상기 시트 상 보습성 부재로는 부직포로 만들어진 시판 팩 용 시트, 거즈, 코튼 등을 사용할 수 있다. 상기 화장품이 액상 또는 유액 상태인 경우에는 상기 시트상 보습 부재에 함침시켜 사용하면 된다. 또한, 상기 화장품이 크림 또는 젤인 경우에는 피부에 도포하여 그 위에 이러한 보습 부재를 올리면 된다.

하기, 상기의 화장품이 화장수인 경우를 예로 들어 설명한다.

먼저 상기 배양 상등액 분말을 적당한 양의 생리 식염수 등에 용해시켜 분말 용해액으로 하여 이를 보습 부재에 흡수되어 액체가 떨어질 정도에 함침시킨다. 그런 다음 보습 부재를 원하는 부위, 예를 들어, 얼굴 전체에 올려 몸의 일부를 플러스로 대전된 전극에 접촉시킨다. 예를 들어, 한 손으로 플러스로 대전 된 전극을 잡는다.

이어서 마이너스로 대전한 롤러를 보습 부재 위에 올려 천천히 보습 부재 위에서 굴린다. 이때 특히 힘을 줄 필요는 없다. 상기 분말 용해액에 포함된 성장 인자는 모두 마이너스로 대전되어 있기 때문에, 롤러의 마이너스 전하와 반발하고 플러스로 대전 된 전극 쪽으로 이동한다. 이 이동에 의해 성장 인자가 피부에서 흡수된다.

또한, 상기 화장품은 상기 용해액을 플라스틱재질 또는 유리재질의 병, 플라스틱재질 또는 유리재질의 스포이드가 있는 병, 좁은 배출구가 붙어 있는 플라스틱제 용기 등 다양한 용기에 저장하여 사용하는 수 있지만, 두피용 또는 모발용 화장품으로 사용하는 경우에는 좁은 배출구가 붙은 플라스틱 용기를 사용하는 것이 두피에 부착시키는데 적합하다.

두피 및 모발에 상기 화장품을 부착시켜 두피 전체에 골고루 분포한 후, 상기와 같은 방법으로 이온 도입한다. 그 후, 플라스틱 재질 필름, 예를 들면, 폴리에틸렌 필름, 등을 이용하여 머리카락 전체를 감싸고 팩을 한다.

위의 두 경우 모두, 증기를 발생시키는 장치를 머리로부터 소정의 거리를 두고 증기를 분사하게 되면 도입 효율이 높다.

이하 본 발명의 실시예에 대해 설명하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 실시 예 중의 %는 특별히 언급하지 않는 한, 중량(질량) 기준이다.

또한 본 발명은 상기 발명의 실시 형태 및 실시예의 설명에 어떠한 한정이 되는 것은 아니다. 특허 청구 범위의 기재에 벗어나지 않고 당업자가 용이하게 추측할 수 있는 범위에서 다양한 변형 형태도 본 발명에 포함된다. 하기 실시 예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1

돼지 SHED/BM/지방 조직 유래 성장 인자의 제조 및 품질 평가

< 재료 및 방법>

(1) 세포의 분양 및 배양

식육공사(일본 아이치현 나고야시 미나토구)에서, 생후 5 ~ 6개월 돼지의 턱뼈(하악 치아가 붙은 하악 골) 및 장간 막을 입수했다. 도살 직후의 식용 돼지의 하악 치아, 턱뼈 및 장간 막은 보냉제가 함유된 아이스 박스(-30℃)에서 반송하였다.

상기 돼지의 치아와 하악 골에서 하기의 순서로 돼지의 치수 줄기 세포(SHED)를 얻었다.

반송된 돼지의 치아와 하악 골을 이서진으로 소독 한 후 치과용 다이아몬드 포인트를 사용하여 하악 골에 붙어있는 하악 치아의 치관을 수평 방향으로 절단하고 이어서 수강에 따라 수직 방향으로 절단하여 천개(캐노피)를 제거하였다. 이렇게 처리한 치관 및 치근부에서 치과용 스케일러를 사용하여 치수를 채취했다.

얻어진 치수를 안하용 천도를 사용하여 자르고, 2 mg/mL의 콜라게나아제 용액에 현탁했다. 이 현탁액을 37℃의 항온조 안에서 1시간마다 세포를 분리하였다. 분리된 세포를 10% FBS 및 1% Anti-Anti(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 포함한 Dulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM; SIGMA, St. Louis, MO)에서 37℃, 5% CO₂ 조건에서 계대용 세포를 얻기 위하여 예비 배양하였다.

우선, 배양 초기에는 하위융합 할 때까지 주 2 ~ 3회의 빈도로 배지를 교환하면서 배양하였다. 하위융합된 세포를 0.05% 트립신을 포함하는 Hepes 용액을 사용하여 박리시켜 1,500 rpm으로 실온에서 3분간 원심 분리하여 모았다. 신선한 배지에서 얻은 세포를 옮겨 상기와 같은 조건 하에서 전량을 사용하여 계대 배양하였다.

돼지 골수(BM)는 돼지 하악 골의 하악골 마디 피질골에서 얻었다. 먼저, 상기 하악 전치 부분 혀 쪽을 치과용 다이아몬드 포인트로 천공을 내어 이 구멍에 18G 주사 바늘을 붙인 5 mL 주사기를 삽입하여 골수를 흡인하여 채취하였다. 채취 한 골수를 10% 소혈청, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM으로 옮겨 상기와 같은 조건에서 예비 배양 한 후, 상기 DMEM에서 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 하위융합이 될 때까지 배양하였다. 상기 첨가량은 모두 최종 농도로 표시했다.

돼지 SHED와 마찬가지로 위의 0.05% 트립신 용액을 사용하여 박리하고 1,500 rpm으로 3분간 원심 분리하여 계대배양 하였다.

돼지 창자 사이 막에서 해부용 가위 및 천도로 지방 조직을 잘라 모아 여분의 조직을 제거하고 생리식염수 속에서 혈액을 씻어내었다. 그 외에는, 상기와 동일하게 지방 세포를 분리하여 지방 줄기 세포를 얻었다.

(2) 세포의 증식 상태 분석

BrdU 염색 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 첨부된 설명서에 따라 브로모데옥시 우리딘(BrdU)을 상기 얻어진 SHED 또는 BM에 혼합하여 각각의 세포의 12시간 동안의 증식 속도를 평가하였다. 각 군의 시료 1개에 대해 3장의 슬라이드를 준비하고 이들을 이용하여 평가를 실시했다. 이 실험을 5회 반복했다. 하나의 배치 분산 분석 후 Tukey-Kramer 검정에 의해 유의차 검정을 실시했다.

STRO-1의 면역 형광 염색을 위해 돼지 SHED 또는 돼지 BM을 3% 파라포름알데히드로 고정했다. 그 후, 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 2회 세척하고, 100 mM 글리신 용액에 20분간 처리하였다. 이어 0.2%의 Triton-X(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 용액에서 상기 세포를 30분 동안 실온에서 투과 처리했다. 그 후, 5% 당나귀 혈청 및 0.5% 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS를 첨가하고 이 용액에 20분 동안 37℃에서 배양했다.

다음으로, 일차 항체 마우스 항 사람 STRO-1 항체(R & D, Minneapolis, MN)과 세포를 1 : 100의 비율이 되도록 혼합하고 PBS로 1시간 실온에서 배양하였다. 이어서 PBS를 흡입하여 제거하고 이차 항체의 염소 항 마우스 면역 글로불린 M-FITC 항체(Southern Biotech, Birmingham, AL)과 상기 세포를 1 : 500이 되도록 혼합하여 30분 동안 37℃에서 배양하였다. 그 후, 벡터실드(VECTASHIELD)와 DAPI(Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA)를 이용하여 장착하였다.

(3) 동물 실험(도 1 참조)

5주령의 암컷의 털이 없는 마우스(Hos; HR-1)는 SLC(SLC Inc., 일본 시즈오카)에서 제공되었다. 전체 마우스를 온도 및 습도를 제어 조건(22 ± 1℃, 습도 50%) 아래에 12시간의 명암주기에서 두었다. 이 동물에게는 물 및 고형 사료를 자유롭게 섭취하도록 하고 방사선 노출 동안 각 동물이 케이지 안을 자유롭게 이동할 수 있도록 하였다. 관찰은 매일 하였다. UVB 방사선 장치 RMX-3W(Handok Biotech, Seoul, Korea)를 이용하여 마우스 등에 1주일에 5회, 램프에서 동물의 등까지의 거리를 89 cm로 하여 10주 조사하였다. 이 조사는 10개의 SE 램프((주) 도시바)에서 열을 구성하고 UVB에 대한 필터처리 없이 실행하였다. 조사하는 방사선의 파장 피크는 312 nm 부근으로 하였다. 또한 조사량은 290 ~ 320 nm의 파장을 갖는 방사선의 조사량이 UVB 전량의 55%에 해당하는 양이 되도록 하였다.

조사선 양은 첫 2주 동안은 1 MED(최소 홍반량; 60 mJ/cm²), 3주째는 2 MED(120 mJ/cm²), 4주째는 3 MED(180 mJ/cm²), 5 ~ 8주째는 4 MED(240 mJ/cm²)로 하였다. 전체 UVB선 양은 약 115 MED(6.9 J/cm²)로 주름 형성을 유도하였다.

주름 유도 후 5주 동안 마우스의 등에 한정적인 영역에 pSHED-CM(100%)을 피하 주사하였다. 양성 대조군으로 PBS에 현탁한 돼지 SHED(4 × 10⁵)을 직접 피부에 주사하였고 음성 대조군으로 PBS만을 직접 피하에 주사하였다.

(4) 돼지 SH-CM의 제조

돼지 SHED(4 × 10⁵ 세포)를 DMEM/F12(Invitrogen-Gibco-BRL, Grand Island, NY) 혈청이 없는 배지에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 배양 72시간 후에 돼지 SHED의 배양 상등액을 회수하여 300 × g에서 5분간 실온에서 원심 분리하여 구멍의 지름이 0.22 μm인 주사기용 필터(밀리포아)를 이용하여 여과하였다.

(5) 피부 복제 및 이미지 분석

주름 유도시 및 상기 주사한 1주일 후, 실리콘계 인상재 플렉스 타임 1(Flextime 1; Heraeus Kulzer, New York, NY)을 이용하여 등의 피부 표면의 네가티브 형 복제를 하였다. 같은 피부 영역에서 주름의 복제본을 얻기 위해 유성 마커 펜으로 피부에 표시를 하였다.

피부에 돼지 SH-CM 및 돼지 SHED을 마지막으로 주사하고서 5주 후에, 표시를 한 영역에서 인상을 떼어내었다. 측정하기 쉽도록 전체 복제본을 1 cm 사방으로 자르고 같은 인상재를 이용하여 각 복제의 뒷면을 평면으로 가공하였다. 208° 각도에서 빛을 맞추고, CCD 카메라를 사용하여 복제본에서 이미지를 가져왔다.

네가티브 형 복제 이미지를 주름 분석 장비 스킨 비지오 미터(skin visiometer) SV 600(Courage & Khazaka, Cologne, Germany)을 이용하여 관찰 하였다. 피부 주름 평가에 이용한 파라미터는 단위 면적당의 주름 수, 깊이 및 주름의 면적으로 하였다.

(6) 조직 학적 분석

등의 피부(1 cm × 1 cm)를 10%(v/v)의 포르말린을 함유하는 중성 완충 용액에 고정했다. 이어서, 폴리에스테르 왁스에 포매(embedding)하고 6 mm의 절편을 제작하였다. 절편을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)에 표백하여 메이슨 트리크롬 염색(Masson trichrome stain)을 실시했다.

먼저 헤마톡실린 및 에오신 염색(이하 "H&E 염색"이라 한다)를 실시했다. 자일렌(레조몰)에서 3번 탈 파라핀 처리를 하였다. 순수 에탄올로 4번 탈수를 하고 흐르는 물에 3분간 세척하였다. 이어 메이어 헤마톡실린 용액(Mayer's Hematoxylin Solution)에 5분간 침지하여 핵을 염색하고 약 45℃의 흐르는 물에 3분 동안 세척하였다.

그런 다음, 에오신 용액에 5분간 침지한 후 순수 에탄올로 4번 조직 탈수하고, 자일렌으로 4회 처리하여 부드럽게 장착한 다음 투명하게 봉입 처리를 실시했다.

그리고 메이슨 트리크롬 염색을 실시했다. 헤마톡실린 및 에오신 염색과 마찬가지로 절편을 탈 파라핀 하고 세척하였다. 10% 트리클로로 아세트산(화광순약공업(주), 특급) 수용액과 10% 중크롬산 칼륨(화광순약공업(주), 특급) 수용액과 동등한 양의 혼합액을 이용하여 제 1 매염을 실시했다. 다음으로 3분간 세척하고 증류수로 1분간 세척 하였다.

1.0 g의 헤마톡실린(MERCK)를 포함하는 100 mL의 95% 에탄올(A액)과 2 g의 염화 제 2 철과 1 mL의 염산 및 95 mL의 증류수를 포함하는 B액(화광순약공업(주), 특급)을 사용할 때 혼합하여 Weigert's Iron Hematoxylin으로 하였으며, 10분간 여기에 침지하였다. 이어서 10분간 세척하였다.

2.5% 인 텅스텐산(phosphotungstic acid stain, 화광순약공업(주), 특급) 수용액과 2.5% 인 몰리브덴산(phosphomolybdic acid, 화광순약공업(주), 특급) 수용액을 동등한 양으로 혼합하여 1분 동안 이 용액에 침지하여 제 2 매염을 실시했다. 이어서, 0.75% 오렌지G(화광순약공업(주), 특급)액에 2분간 침지했다. 1% 아세트산에 2번 처리를 실시했다.

이어서, ponceau-xylidine(CHROMA)를 1% 아세트산에 1%의 비율로 녹인 용액을 2 배, Fuchsin Acid(화광순약공업(주), 화학용)을 1% 아세트산에 1%의 비율로 녹인 용액을 1 배의 비율로 혼합하여 ponceau-xylidine-Fuchsin Acid 용액을 조제하여 이 용액에 20분간 침지했다. 1% 아세트산에 2번 처리를 실시하였다.

이어서, 2.5% 인 텅스텐산 용액에 7분간 침지하고 1% 아세트산에 2번 처리를 실시했다. 이어서, 아닐린 블루(Aniline Blue)로 염색하고 1% %아세트산 수용액으로 2번 처리를 실시하여, 이소프로파놀에 1장씩 침지하여 헤마톡실린 및 에오신 염색과 마찬가지로 투명한 봉입 처리를 실시했다.

(7) 인간의 진피 중 피부 섬유아세포(HDF)의 배양 및 UVB 조사선 량

10%의 소 태아 혈청, 100 U/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 중에서 5% CO₂, 37℃의 조건에서 HDF를 배양하였다. 혈청이 없는 배지에서 24시간 배양한 후, 배양 플라스크의 세포를 PBS로 세척하고 3 ~ 4 방울의 PBS와 함께 50 ~ 250 mJ/cm₂의 범위가 되도록 UVB에 노출했다. UVB 조사는 상술한 UV 광원(Waldmann, Schwenningen, Germany)를 이용하여 실시했다. 조사 후 즉시 PBS를 흡인하여 제거하고 완전 배지로 대체했다. UVB 조사선 양은 마지막으로, 이후 실험에 70 mJ/cm₂로 고정했다.

(8) 세포 증식 분석

96 웰 플레이트의 각 웰에 HDF를 5 × 10³ 세포/웰에 파종하여 CCK-8 키트(Dojindo, Gaithersburg, MD)를 이용하여 HDF의 증식 속도를 측정했다. 혈청이 없는 배지에서 24시간 배양한 후, 돼지 SH-CM과 함께 또는 돼지 SH-CM 없이, HDF를 24시간 연속 배양하고, 이어서 UVB(70 mJ/cm²)에 90초간 노출했다.

이어 UVB 조사한 세포를 완전 배지에서 24시간 배양하여 회수하였다. HDF-F를 10 mL의 CCK-8 용액에 넣고 3시간 배양하였다. 마이크로 플레이트 리더(TECAN, Gro¨ dig, Austria)을 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정했다.

대조군을 사용하여 만든 표준 곡선에 따라 각 웰의 OD 값에서 세포 수를 구하였다.

(9) 웨스턴블랏 분석

HDF(2 × 10⁴ 세포/웰)를 24 웰 플레이트에 파종하여 상기 서술한 바와 같이 전처리를 실시했다. 이어서 RIPA 완충액(0.15 M의 NaCl, 1 mM의 EDTA, 1% Triton X-100, 1%의 SDS, 50 mM의 NaF, 1 mM의 Na₃VO₄, 5 mM의 DTT(dithiothreitol), 1 mg/mL의 Leupeptin 및 20 mg/mL의 PMSF를 포함하는 50 mM의 Tris-HCl(pH 7.4))에서 세포를 용해시켰다. 이 세포 용해액의 단백질 양을 뷰렛 시약을 사용하여 측정하고, 50 μg의 단백질을 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE) 전기 영동을 실시하였다. SDS-PAGE 종료 후 겔 전기 영동의 패턴을 PVDF 막에 전사했다.

이 막을 I 형 콜라겐에 대한 항체(Santa Cruz, Saint Louis, MO) 매트릭스 메탈로 프로티나아제 1(MMP-1)에 대한 항체(Calbiochem, Darmstadt, Germany)와 함께 실온에서 15분 배양하였다. 이어서 PVDF 막을 PBS를 이용하여 세척하고 서양 고추 냉이(horseradish) 퍼옥시데이즈-콘쥬게이트 항 염소 IgG 항체(1 : 100,000, Santa Cruz, Saint Louis, MO)와 함께 실온에서 15분 동안 배양하였다. 이 후 면역 글로불린 웨스턴 시약으로 블러킹하여, X선 필름을 겹쳐 감광시켰다.

<결과>

(1) pSHED 및 pBMSC의 특징 분석

pSHED 및 pDPSC는 pBMSC와 같은 섬유 아세포의 형태를 보여주었다. 면역 형광 분석에서 pSHED 및 pBMSC이 STRO-1 양성 세포를 포함하는 것을 알 수 있었다. 또한 pSHED의 증식 속도는 pBMSC보다 유의적으로 빠른 것으로 나타났다 (도 2 참조).

(2) UV에 의해 유도된 주름의 돼지 SHED-CM에 의한 경감

UV 노출 기간 동안 마우스의 피부의 미세한 주름을 관찰했다. 처리 중에 pSHED-CM 처리군 및 pSHED 주사군은 PBS만을 주사한 PBS 투여군보다 주름이 적게 나타나는 것이 관찰되었다(도 3 (A) 및 (B) 참조, 각 군에 대해서 n = 8).

도 3 (A) 및 도 3 (B)에서, pSHED-CM의 반복 투여에 의해 감소 된 것으로 나타났다(도에서 pSHED-CM의 반복 투여 군은 "pGF"고 나타냈다.). pSHED 주사군도 pSHED-CM 군과 같은 경향을 보였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 스킨 비지오미터 SV 600으로 복제본의 주름 파라미터를 측정 한 결과, 천연 수준의 pSHED-CM(100%)을 주사했을 때 주름의 모든 마라미터가 유의하게 감소했다. 또한 pSHED 처리는 pSHED-CM 처리보다 높은 효과를 보였다.

(3) 조직학적 관찰

UVB 조사한 털이 없는 마우스는 피부의 부속 기관에 큰 변화가 보였기 때문에, UVB 조사한 털이 없는 마우스 진피의 두께에 대한 pSHED-CM의 영향을 조사하였다.

도 5는 헤마톡실린-에오신 염색(H&E 염색)에 따른, 털이 없는 마우스 피부의 진피 두께의 조직 염색 결과를 나타낸다. 도 5(A) ~ (C)에 나타낸 바와 같이, 콜라겐 섬유의 양(도의 상하 화살표에 끼워진 부분)이 pSHED-CM 처리군(도 5(B))과 pSHED 주입군(도 5(C))에서 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다.

또한 진피 두께 측정에서 pSHED 주사군 및 pSHED-CM 처리군에서 진피 두께가 유의적으로 증가하고 있는 것으로 나타났다(도 5(B) 및 (C)). 또한 아교섬유속의 현저한 증가가 상기 두 실험군에서 관찰되었으나, 대조군에서는 관찰되지 않았다(도 5 (A)).

(4) pSHED-CM에 따른 HDF의 증식 촉진

돼지 SHED에 의한 피부 주름 개선에 관한 파라크린 메커니즘(paracrine mechanism)을 조사하기 위해 pSHED-CM과 함께 상기와 같은 조건에서 일차 배양한 HDF를 사용하여 세포 증식 분석을 실시했다. 도 6에 나타낸 바와 같이, UVB 조사에 의해 HDF의 증식은 유의하게 감소했지만(도 6 중 "UVS"로 표시), 돼지 SHED-CM에 의한 전처리를 하면 증식의 감소 폭이 감소하고(도 6 중 "pGF"고 표현한다.) pSHED-CM이 HDF에 대해 보호 효과가 있는 것으로 나타났다.

상기 pSHED-CM은 다양한 성장 인자를 포함하기 때문에, 상기 돼지 SHED-CM에 의한 증식 촉진은 pSHED에서 분비된 성장 인자가 중개하는 것으로 사료된다.

상기 돼지 SHED-CM은 다양한 성장 인자를 포함하기 때문에 상기 돼지 SHED-CM에 의한 증식 촉진은 돼지 SHED에서 분비된 성장 인자가 중개하는 것으로 사료된다.

(5) I 형 콜라겐 및 MMP1의 발현

상기 돼지 SHED-CM 처리한 털이 없는 마우스에서 진피 중의 콜라겐 함량이 유의적으로 증가했다. 따라서 상기 pSHED-CM 처리 후의 HDF에 있어서 I 형 콜라겐 및 MMP1의 단백질 발현을 조사했다. UVB 조사에 의해 I 형 콜라겐의 발현양이 명확하게 감소하고 MMP1의 발현이 유도되어 증가했다.

또한, I 형 콜라겐의 발현양은 pSHED-CM 전처리 후 유의하게 증가했지만, 반대로 MMP1의 발현양은 pSHED-CM 전처리 후 감소하였다. 이상으로부터 pSHED-CM 처리를 한 털 없는 마우스의 피부에서 콜라겐 함량의 증가는 진피 섬유 아세포에서 콜라겐 합성이 자극된 것 및 콜라겐 분해가 억제된 것으로 인해 발생한 것으로 나타났다.

실시예 2

돼지 SHED/BM/지방 줄기세포 유래 성장인자 혼합물의 제조 및 품질 평가

(1) 성장인자 혼합물(분말)의 조제

상기 돼지 SHED, 돼지 BM 또는 돼지 치수 줄기세포를 돼지 성장 인자(pGF) 혼합물의 제조에 사용하였다. 10% FCS를 포함하는 DMEM을 이용하여 돼지 SHED, 돼지 BM 또는 돼지 치수 줄기세포를 2 ~ 8 대, 계대배양하여 배양 접시에 있는 세포가 80% 융합된 단계에서, 10 mL 상등액(배지 : CM)를 샘플링하여 9배의 에탄올을 가하여 에탄올 희석 CM으로 하였다. 이 에탄올 희석 CM을 -20℃에서 60분간 배양한 후 50 mL 용량의 스핀 컬럼에 넣고 4℃에서 15,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 이 침전물을 90% 에탄올로 -20 ℃에서 세척하고 다시 스핀 컬럼에 걸어 상기와 같이 원심분리하였다.

이상과 같이 농축된 침전물을 동결 건조하여 성장 인자를 포함하는 분말을 얻었다.

(2) 분말 속 성장 인자

분말 속에 포함되는 각 성장 인자를 상기 서술한 웨스턴 블로팅법으로 분석했다. 검출된 성장 인자는 PDGF, VEGF, IGF, KGF, HGF 및 TGF였다.

(3) 품질 평가

세포 배양 시, 돼지 배양 줄기세포 또는 돼지 골수 줄기세포의 배양 상등액을 첨가한 결과를 도 7(A) ~ (D)에 나타낸다. 이는 모두 이것을 첨가하지 않는 경우보다 증식속도가 빠른 것으로 관찰되었다.

실시예 3

비 인간 유래 치수 줄기세포의 배양 상등액의 피부에 대한 효과

(1) 비 인간 유래 치수 줄기세포의 배양 상등액 조제

실시예 2에서 얻어진 비 인간 유래(돼지)의 치수 줄기세포의 배양 상등액에서 1 mL를 취하여 동결 건조하여 분말을 얻었다.

이 동결 건조 분말을 30 mL의 생리 식염수에 용해시켜 세척병에 담아 피부용 시료 1로 하여 피부에 대한 효과를 검토했다.

(2) 피부에 대한 시험 조건 등

피부에 대한 시험은 하기 단계로 실행하였다. 먼저 피험자의 피부 상태를 확인하고 피험자 자신이 현재 어떤 상태라고 인식하고 있는지에 대한 상담을 실시했다. 다음 시험 시작 전에 얼굴 전체의 상태를 카메라로 촬영(도 8(A) 참조) 피부의 상태를 현미경(200배)에서 촬영하였다(도 10(A) 참조).

이어서, 시료 1의 전량을 페이스 팩 용 부직포 1(후지 종이화학(주), 페이스 마스크)에 함침시켰다. 이 부직포를 피검자의 얼굴에 올리고 20분/회(팔, 손, 손바닥, 다리, 무릎 뒤 및 발바닥), 1 ~ 2 회/주, 0.2 ~ 1 mA의 조건에서 이온 도입을 실시하였다.

이온 도입 중에 얼굴 전체에 증기가 쏘일 수 있도록 스티마(다카라 벨몬트(주), 노아쥬)를 얼굴에서 30 ~ 50 cm 떨어진 위치에 놓았다. 그 후, 페이스 팩을 얼굴에서 분리하여, 크림 등으로 피부를 정돈하고 마무리하였다. 피험자는 여성 7명으로 연령은 20대 ~ 70대, 평균 41세였다.

(3) 효과

이온 도입을 14회 실시한 결과를 시험 후의 결과로 하여, 시험 시작 전과 같이 현미경으로 피부 상태를 확인했다. 시험 전후의 피부 상태를 비교 한 결과, 피검자의 피부색이 시험 시작 전에 비해 전체적으로 하얗게 되었다. 또한 기미가 엷게 됨과 함께(도 8(A)와 (B)), 주름(도 9(A)와 (B))도 얇아졌다.

피부의 상태를 현미경으로 관찰하면 분명한 변화가 확인되었으며, 주름 부분의 파임이 줄었다(도 10(A)와 (B)).

돼지 치수 줄기세포의 배양 상등액을 포함한 화장품을 사용하여 주름을 얇게하는 효과 및 피부 색깔을 희게 하는 효과가 있는 것으로 나타났다.

실시예 4

발모 및 육모 효과 검토

(1) 비 인간 유래 지방 줄기세포의 배양 상등액의 조제

실시예 2에서 얻어진 비 인간 유래(돼지)의 지방 줄기세포의 배양 상등액에서 1 mL를 취하여 동결 건조하여 분말을 얻었다.

이 동결 건조 분말을 30 mL의 생리 식염수에 용해시켜 발모 및 육모 시험용 시료 2로 하여 세척한 병에 넣었다.

(2) 발모 및 육모 시험 조건 등

발모 및 육모 용 시험은 하기와 같은 순서로 실행하였다. 먼저 피험자의 두발과 두피의 상태를 확인하고 피험자 자신이 현재 어떤 상태라고 인식하고 있는지에 대한 상담을 실시했다. 다음으로 시험 시작 전 두발 상태를 카메라로 촬영하고, 또한 두피의 상태를 현미경(20 ~ 200배)에서 촬영했다. 도 13 ~ 16은 200배로 촬영한 것이다.

그 다음 적당량의 클렌징 젤(내셔널 토탈프로덕트(주), 플레쥬어 클렌징 젤)을 손바닥에 취하여 이것을 두피에 도포하여 두피 마사지를 하고 모공 주변 및 모공 속에 막혀있는 오염을 제거하였다. 이어서, 시판되고 있는 샴푸((주) 코스메틱 니스트, 플레쥬어 C 샴푸)를 사용하여 오염을 제거하였다. 오염이 심한 경우에는 2번 샴푸를 했다.

그 후, 세척한 병의 입구를 두피에 접촉시켜 상기와 같이 조제한 시료 2를 두피에 부착시켰다. 또한 모발에도 부착시켰다.

시간은 15분/회(팔, 손, 손바닥, 다리, 무릎 뒤 및 발바닥), 횟수는 주 1 ~ 2회, 0.2 ~ 1 mA로 이온 도입을 실시하였다. 이어서 폴리에틸렌 필름으로 두피와 머리카락 전체를 포장하고 그 위에 수건을 터번처럼 감고, 10 ~ 20분간 팩을 했다. 그 후, 수건과 폴리에틸렌 필름을 벗고 수건 건조 또는 건조기로 마무리했다. 피험자 8 명중 남성 6명, 여성 2명(나이: 30대 ~ 50대, 평균 38세)이었다.

상기와 같이 이온 도입 한 후 피험자 자신이 머리를 감은 후 깨끗한 두피에 시료 1 또는 2를 적용하기로 했다. 두피에 용기 입구 부분을 꽉 눌러 직접 부착시켜 그 후, 손으로 두피에 문지르듯이 두피 마사지를 2 ~ 3분 하였다. 또한 모발에 부착시켰다.

(3) 발모 및 육모 효과

남성 피험자의 모발이 시험 전후로 어떻게 변화했는지를 도 11 ~ 16에 나타내었다.

도 11은 시험 시작시의 두발 상태를 나타낸다. 또한 시험 시작 7일 후 두발의 상태를 도 12에 나타내었다. 도 11과 12를 대비하면 육안으로도 명백하게 두발이 증가하고 있는 것이 확인되었다.

시험 시작 후 두피의 변화를 도 13(시험 시작 전), 도 14(시험 시작 3일 후), 도 15(5일 후) 및 도 16(7일 후)에 나타내었다. 이 관찰 결과, 시험 시작 3일 후에 발모가 확인되었고(도 14의 화살표 참조), 7일 후에는 하나의 모공에서 여러 모발이 돋아있는 것이 확인되었다(도 16의 화살표 참조).

8명의 피험자 모두에게서 발모 및 육모 효과가 관찰되었다. 구체적으로는 새로 돋은 모발은 백발의 피험자의 경우에도 백발이 아니라 검은 모발이었다. 또한 어떤 피험자에게서는 모발의 성장이 빠르고 모발 자체도 굵어서 정수리의 모발의 볼륨이 많아지는 것을 확인하였다.

피험자 중 가장 빠른 시기에 발모를 감지한 것은 시험 시작 다음날(1일 후)이었다.

이상으로부터 돼지 지방 줄기세포의 배양 상등액을 포함한 화장품을 사용하여 발모 및 육모 효과가 현저하게 나타나는 것으로 확인되었다.

실시예 5

pSHED/pBMSC 유래 성장인자를 함유하는 화장품의 제조예는 하기와 같다.

3GF 스킨로션 (시험 No.11k-614)

성분	성분코드	종류별명칭	표시명칭	배합량(wt％)
	1370	정제수	물	나머지
	100040	1,3-부틸렌글리콜(1,3-Butylene glycol)	ＢＧ	5～10
	1075	에탄올	에탄올	5～10
	522119	파라옥신벤조산에스테르 (ρ-amimobenzoic acid)	메틸파라벤(Methylparaben)	0.1～0.5
	105359	폴리옥시에칠렌하이드로제네이티드캐스터오일(Polyoxyethylene Hydrogenated Castor Oil)	PEG-60 하이드로제네이티드캐스터오일	0.01～0.1
	110759	에디테이트디소듐(edetate disodium)	EDTA-2 Na	0.01～0.1
	520894	히알루론산나트륨(Sodium hyaluronate)（２）	히알루론산 Na	0.01～0.1
	520095	알로에 추출물（２）	알로에베라(Aloe vera) 추출물	0.01～0.1
	523147	차 추출물（１）	차잎 추출물	0.01～0.1
	503038	카모미라(chamomilla) 추출물(２)	카모밀라꽃 추출물 배양상등액분말	0.01～0.1
			카모밀라꽃 추출물 배양상등액분말	0.01～0.1
	109336	향료	향료	적당
물성	항목		주입(input)
	외관		액상
	색조		무색투명
	향		없음
	pH		4.50～5.50
	점도		없음

(시험 No.11K-641)

성분	성분코드	종류별명칭	표시명칭	배합양(wt%)
	성분코드	종류별명칭	표시명칭
	1370	정제수	물	나머지
	104368	미리스틴산(myristic acid)	미리스틴산	10～20
	1224	농축 글리세린(고순도 글리세린)	글리세린	10～20
	2220	스테아린산(stearic acid)	스테아린산	5～10
	1346	수산화칼륨(potassium hydroxide)	수산화K	5～10
	103809	라우린산(lauric acid)	라우린산	1～5
	105288	폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)1540	PGE-32	1～5
	108556	폴리에틸렌글리콜300	PEG-6	1～5
	105370	폴리옥시에틸렌라우릴에테르(Polyoxyethylene lauryl ether)	라우레스-7	1～5
	501064	디스테아린산에틸렌글리콜(Ethylene Glycol Distearate)	디스테아린산글리콜	0.5～1.0
	102544	친유성모노스테아린산글리세린(Glyceryl Monostearate, Lipophilic)	스테아린산글리세릴	0.5～1.0
	100040	1,3-부틸렌글리콜(1,3-Butylene glycol)	BG	0.5～1.0
	1191	올리브유(olive oil)	올리브유	0.1～0.5
	523096	고융점폴리에틸렌분말	폴리에틸렌	0.01～0.1
	520388	군청핑크(Ultramarines)	군청	0.01～0.1
	2303	히드록시프로필셀룰로오스(Hydroxypropylcellulose)	히드록시프로필셀룰로오스	0.01～0.1
	102258	에틸셀룰로오스(Ethylcellulose)	에틸셀룰로오스	0.01～0.1
	8206	히드록시프로필 메틸셀룰로오스(Hydroxypropyl Methylcellulose)	히드록시프로필 메틸셀룰로오스	0.01～0.1
			배양상등액분말	0.01～0.1
	109336	향료	향료	적당
물성	항목		주입(input)
	외관		크림상
	색		흰색
	향		없음
	pH		9.50~11.0
	점도		80,000mPa·S이상 （Spindle No.4-6 rpm,1 min）

3GF 크림 (시험 No.11k-642)

성분	성분코드	종별명칭	표시명칭	배합양(wt%)
	1370	정제수	물	나머지
	521058	폴리옥시프로필렌스테아릴에테르	PPG-15스테아릴	1～5
	1224	농축 글리세린(고순도 글리세린)	글리세린	1～5
	520576	식물성 스쿠알렌	스쿠알렌	1～5
	105420	폴리옥시에틸렌스테아릴에테르	스테아레스-2	1～5
	2220	스테아린산(stearic acid)	스테아린산	1～5
	105420	폴리옥시에틸렌스테아릴에테르	스테아레스-21	1～5
	109250	베헤닐알콜(behenyl alcohol)	베헤닐알콜	1～5
	104210	메틸 폴리실록산(methyl polysiloxane)	디메티콘	0.5～1.0
	555103		디폴리히드록시스테아린산 PEG-30	0.5～1.0
	522119	para-hydroxybenzonate	메틸파라벤	0.1～0.5
	522119	para-hydroxybenzonate	프로필파라벤	0.1～0.5
	520894	히알루론산나트륨(Sodium hyaluronate)(2)	히알루론산 Na	0.01～0.1
	506029	인산 아스코르빌 마그네슘(Magnesium L-Ascorbyl 2-Phosphate)	인산 아스코르빌 Mg	0.01～0.1
	1501	팔미틴산레티놀(Retinol palmitate)	팔미틴산레티놀	0.01～0.1
	500129	디포타슘 글리시리제이드(dipotassium glycyrrhizate)	글리칠리산 2K	0.01～0.1
	104457	천연비타민E	토코페롤	0.01～0.1
	1390	대두유	콩기름	0.01～0.1
	3610	L-알긴(Ｌ-Arginine)	알긴	0.01～0.1
	520095	알로에 추출물(2)	알로에베라(Aloe vera) 추출물	0.01～0.1
	523147	차 추출물(1)	차잎 추출물	0.01～0.1
	503038	카모미라(chamomilla) 추출물(2)	카모밀라꽃 추출물	0.01～0.1
	523096	고융점폴리에틸렌분말	폴리에틸렌	0.01～0.1
	520388	군청핑크(Ultramarines)	군청	0.01～0.1
	2303	히드록시프로필셀룰로오스(Hydroxypropylcellulose)	히드록시프로필셀룰로오스	0.01～0.1
	102258	에틸셀룰로오스(Ethylcellulose)	에틸셀룰로오스	0.01～0.1
	100040	1,3-부틸렌글리콜(1,3-Butylene glycol)	ＢＧ	0.01～0.1
	1076	무수에탄올	에탄올	0.01～0.1
	5217	디부틸히드록시톨루엔(dibutylhydroxytoluene)	ＢＨＴ	0.01～0.1
			배양상등액분	0.01～0.1
	109336	향료	향료	적당
물성	항목		주입(input)
	외관		크림상
	색		흰색
	향		미세원료냄새
	점도		10,000～50,000 mPa·S (Spindle No.4-6rpm, 1min）

3GF 미용액 (시험 No.11k-643)

성분	성분코드	종별명칭	표시명칭	배합양(wt%)
	1370	정제수	물	나머지
	100040	1,3-부틸렌글리콜(1,3-Butylene glycol)	ＢＧ	5～10
	1075	에탄올	에탄올	5～10
	1224	농축 글리세린(고순도 글리세린)	글리세린	1～5
	1446	트리에탄올아민(triethanolamine)	TEA	0.5～1
	101243	카르복시 비닐 폴리머(carboxyvinyl polymer)	카르보머	0.1～0.5
	3015	알란토인(Allantoin)	알란토인	0.1～0.5
	522119	para-hydroxybenzonate	메틸파라벤	0.1～0.5
	110759	에디테이트디소듐(edetate disodium)	EDTA-2Na	0.01～0.1
	520894	히알루론산나트륨(Sodium hyaluronate)(2)	히알루론산 Na	0.01～0.1
	520095	알로에 추출물(2)	알로에베라(Aloe vera) 추출물	0.01～0.1
	523147	차 추출물(1)	차잎 추출물	0.01～0.1
	503038	카모미라(chamomilla) 추출물(2)	카모밀라꽃 추출물	0.01～0.1
	523096	고융점폴리에틸렌분말	폴리에틸렌	0.01～0.1
	520388	군청핑크(Ultramarines)	군청	0.01～0.1
	2303	히드록시프로필셀룰로오스(Hydroxypropylcellulose)	히드록시프로필셀룰로오스	0.01～0.1
	102258	에틸셀룰로오스(Ethylcellulose)	에틸셀룰로오스	0.01～0.1
	1075	에탄올	에탄올	0.01～0.1
			배양상등액분말	0.01～0.1
	109336	향료	향료	적당
물성	항목		주입(input)
	외관		젤 상
	색		미백색
	향		없음
	pH		6.00 ~ 7.00
	점도		10,000～20,000mPa·S (Spindle No.4-6rpm,1min）

3GF 필링젤(peeling gel) (시험 No.11k-644)

성분	성분코드	종별명칭	표시명칭	배합양(wt%)
	1370	정제수	물	나머지
	500263	솔비톨액(sorbitol)	솔비톨	1～5
	101243	카르복시 비닐 폴리머(carboxyvinyl polymer)	카르보머	1～5
	500066	염화스테아릴트리메틸암모니움(Stearyl Trymethyl Ammonium Chloride)	스테아릴트리모니움클로라이드	1～5
	1075	에탄올	에탄올	0.5～1.0
	522119	para-hydroxybenzonate	메틸파라벤	0.5～1.0
	100040	1,3-부틸렌글리콜(1,3-Butylene glycol)	ＢＧ	0.5～1.0
	520286	가수분해 실크분말(Hydrolyzed silk)	가수분해 실크	0.01～0.1
	560620		가수분해 히알루론산	0.01～0.1
	520894	히알루론산나트륨(Sodium hyaluronate)(2)	히알루론산 Na	0.01～0.1
	520095	알로에 추출물(2)	알로에베라(Aloe vera) 추출물	0.01～0.1
	523147	차 추출물(1)	차잎 추출물	0.01～0.1
	503038	카모미라(chamomilla) 추출물(2)	카모밀라꽃 추출물	0.01～0.1
	523096	고융점폴리에틸렌분말	폴리에틸렌	0.01～0.1
	520388	군청핑크(Ultramarines)	군청	0.01～0.1
	2303	히드록시프로필셀룰로오스(Hydroxypropylcellulose)	히드록시프로필셀룰로오스	0.01～0.1
	102258	에틸셀룰로오스(Ethylcellulose)	에틸셀룰로오스	0.01～0.1
			배양상등액분말	0.01～0.1
	109336	향료	향료	적당
물성	항목		주입(input)
	외관		젤 상
	색		미백색
	향		없음
	pH		2.00～3.00
	점도		7,000～15,000mPa·S Spindle No.4-6rpm,1min）

Claims

생후 3개월 내지 12개월의 돼지의 탈락유치의 치수로부터 얻은 치수 줄기세포, 돼지 골수로부터 얻은 골수 줄기세포, 및 돼지 지방 조직으로부터 얻은 지방 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 줄기세포를 배양하여 얻는, 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 혈관 내피세포 성장인자(VEGF), 인슐린 성장인자(IGF), 케라티노사이트 성장인자(keratinocyte growth factor, KGF), 간세포 성장인자(HGF) 및 트랜스포밍 성장인자(Transforming growth factor, TGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 적어도 2 종 이상의 성장인자를 함유하는 배양 상등액 분말을 주성분으로 함유하는 주름개선용 또는 모발증가용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 배양 상등액 분말은, 상기 돼지의 치수 줄기세포, 골수 줄기세포 및 지방 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 줄기세포의 배양 상등액을 알코올로 농축한 후 동결 건조하여 얻은 것을 특징으로 하는 주름개선용 또는 모발증가용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 액제, 크림제, 연고제, 젤제, 유액제 및 경고제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 주름개선용 또는 모발증가용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 두피를 포함한 피부 또는 모발에 적용하는 것을 특징으로 하는 주름개선용 또는 모발증가용 화장료 조성물.
용해제를 포함하는 제 1 구획과, 생후 3개월 내지 12개월의 돼지의 탈락유치의 치수로부터 얻은 치수 줄기세포, 돼지 골수로부터 얻은 골수 줄기세포, 및 돼지 지방 조직으로부터 얻은 지방 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 줄기세포를 배양하여 얻는, 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 혈관 내피세포 성장인자(VEGF), 인슐린 성장인자(IGF), 케라티노사이트 성장인자(keratinocyte growth factor, KGF), 간세포 성장인자 (HGF) 및 트랜스포밍 성장인자(Transforming growth factor, TGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 적어도 2 종 이상의 성장인자를 함유하는 배양 상등액 분말과, 담체로 구성되는 유효 성분 조성물을 포함하는 제 2 구획과, 상기 제 1 및 제 2 구획의 격벽을 관통시키기 위한 봉상의 부재와, 상기 용해제에 용해시킨 상기 배양 상등액 분말을 두피에 부착시키기 위한 좁은 배출구를 갖는 저장 용기에 내재시킨 화장료 조성물로, 사용 직전에 상기 봉상의 부재에 의해 상기 제 1 및 제 2 구획의 격벽에 관통 구멍을 내어, 상기 유효 성분 조성물을 생리 식염수에 용해시키는 것을 특징으로 하는 주름개선용 또는 모발증가용 화장료 조성물.
제5항에 있어서, 상기 용해제는 마이너스 이온으로 충전된 액체, 생리식염수 및 인산 완충 생리식염수로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 액체인 것을 특징으로 하는 주름개선용 또는 모발증가용 화장료 조성물.
제5항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 두피를 포함한 피부 또는 모발에 적용하는 것을 특징으로 하는 주름개선용 또는 모발증가용 화장료 조성물.
제1항 또는 제5항에 기재된 화장료 조성물을 시트 형태의 보습성 부재에 흡수시키고, 상기 화장료 조성물을 흡수시키고 싶은 부위에 올려 플러스로 대전된 전극을, 상기 시트상의 보습성 부재를 올린 부위와 다른 원하는 부위에 접촉시켜, 마이너스로 대전된 막대 모양의 전극을 상기 시트 위에서 회전시키면서 이동시키는 것을 특징으로 하는 단백질의 이온 도입 방법.