KR101320165B1 - 간엽줄기세포의 무항생제 배양액 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간엽줄기세포의 무혈청, 무항생제 배양액 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 베타 디펜신 3 재조합 단백질을 이용한 간엽줄기세포의 무혈청, 무항생제 배양액 조성물, 그 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

간엽줄기세포의 무항생제 배양액 조성물 {Non-Antibiotic Culture Solution of Mesenchymal Stem Cell}

본 발명은 간엽줄기세포의 무혈청, 무항생제 배양액 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 베타 디펜신 3 재조합 단백질을 이용한 간엽줄기세포의 무혈청, 무항생제 배양액 조성물, 그 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

화장품 산업은 기술적 측면에서 화학, 생물학, 생리학, 약학 등의 기초과학과 응용 기술이 복합적으로 적용되는 분야로, 기술집약적이고 고부가가치 산업이다. 오늘날 화장품은 사람의 피부에 직접 사용하는 제품으로써 피부에 대한 안전성, 효능, 사용 편의성 등을 갖추어야 하며, 아름다움을 가꾸는 미적 기능 뿐 아니라 피부를 보호, 청결, 보습, 유연 및 피부 생리적 기능을 유지하는 생물학적 기능 또한 갖추어야 한다.

줄기세포를 직접 화장품에 적용 및 사용하는 방법은 다양한 조직에서 분리되는 줄기세포들을 줄기세포치료제와 같은 개념 및 방법으로 그대로 화장품에 원료로 넣어 사용하는 방법이다. 이러한 방법이 적용된 화장품에는 2가지의 치명적인 제한이 따르는데 첫 번째는 줄기세포가 화장품에 첨가된 후 그 수명을 유지하기가 불가능하다는 점과 다음은 안전성에 관한 문제로 얻어진 줄기세포에 존재 가능한 다양한 감염원이 완전히 제거되지 않으면 화장품의 감염으로 이어져 사용하는 고객에게 그 위험성이 전달될 가능성이 공존한 다는 것이다. 간략히 언급되었듯이 살아있는 상태의 세포가 환자의 파괴 혹은 병든 조직으로 들어가 새로운 조직을 재생 치료 효과를 유발하는 줄기세포치료제의 개념과는 달리 다양한 화학성분으로 구성된 화장품의 화학조성에서는 줄기세포가 전혀 생육할 수 없다는 점은 줄기세포를 직접 화장품에 응용하는 데 가장 중요한 기술적 한계로 여겨지고 있다. 또한, 설령 살아있는 상태로 피부에까지 전달되었다 할지라도 살아있는 세포는 세포 피부를 통과하여 체내로 전달될 수가 없다는 주장도 중요한 한계로 고려되고 있다.

안전성 (safety)에 관하여는 특히, 세포의 배양과정 중 바이러스성 감염원에 감염되는 경우 세포의 모양만으로는 그 분별이 쉽지 않아 최종 화장품의 제조 시까지 감염 사실이 파악되지 않을 확률이 매우 증가한다. 일부에서는 설령 줄기세포에서 감염된 세균 혹은 바이러스 등이 존재한다고 하여도 화장품의 제조과정에서 부분 혹은 전부가 제거될 수 있다고 주장하기는 하나 일반적인 화장품은 생산 중 열처리 시간이 길지 않고, 완전 고온 처리가 수행되는 경우가 드물기 때문에 오염 및 감염원의 충분한 제거는 기대하기 힘들다는 것이 논리적으로 타당하다.

앞서 설명한 대로 줄기세포를 직접 화장품에 사용하는 경우 따르는 다양한 제약과 한계점 때문에, 줄기세포를 일정 시간동안 배양하여 줄기세포가 생산하는 다양한 생리활성물질들을 배양액에 존재하게 한 후, 그 배양액을 화장품의 원료로 사용하는 방법이 유력한 대안으로 제시되고 있다. 이러한 방법은 줄기세포 등 다양한 세포들은 세포 배양의 과정에서 다른 세포를 활성화 시킬 수 있는 단백질, 펩타이드 및 각종 생리활성물질들을 세포배양 배지에 분비하는 특성을 활용하는 것으로, 이러한 배양액을 다른 세포에 처리할 경우 그 생물학적 유효성이 입증된다는 과학적인 근거에 바탕을 두고 있다. 또한 세포 자체를 직접 화장품원료로 사용하지 않기 때문에 윤리적 문제나 그리고 안전성에 관한 직접적인 한계를 어느 정도는 벗어날 수 있다.

종래 관련 특허기술로는 본 발명자들의 선행 연구로써, 인간 간엽줄기세포를 10%의 우태아혈청(FBS)가 있는 세포배양환경에서 기른 세포를 확보한 다음 적절한 세척 과정 후, FBS가 없는 배양액에서 무혈청간엽줄기세포를 획득하는 방법과 그러한 과정 중 UVB 조사를 통해 배양액내 유용성분을 증가시키는 기술이 있다 (대한민국특허출원 제10-2009-0059991호).

그러나, 무혈청 간엽줄기세포배양액 획득 기술에 추가하여 화장품 원료소재로써 상용화 하기 위해서는 세포배양용 항생제들을 사용하지 않고 배양할 수 있는 배양 및 배양액 획득 기술이 필요하다. 대부분의 동물세포의 배양에는 세균, 진균, 및 효모류의 감염을 막기 위해 다종의 항생물질이 첨가되나 대부분의 항생물질이 화장품원료로써 사용 금지 품목들이다. 그러므로 배양액의 획득 과정에서 항생물질을 사용하지 않는 배양법 혹은 화장품원료로 허가된 방부제를 활용하여 배양액을 획득하는 배양기술의 정립이 필요하다.

본 발명의 목적은 베타 디펜신 3 재조합 단백질을 이용하여, 화장품 원료로써 이용가능한 무항생제 간엽 줄기세포 배양액을 얻고, 이를 화장료 조성물 제조에 이용하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 베타 디펜신 3 재조합 단백질이 처리된 무혈청 간엽줄기세포 배양액을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 (a) 분리된 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 혈청 함유 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 간엽줄기세포를 베타 디펜신 3 재조합 단백질을 함유한 무혈청 배지에서 배양한 다음, 배양액을 회수하는 단계를 포함하는 포유동물 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 베타 디펜신 3 재조합 단백질을 함유하는 간엽줄기세포의 배양을 위한 배지 조성물을 제공한다.

본 발명은 베타 디펜신 3 재조합 단백질을 이용하여 화장품 원료로 이용가능한 무혈청, 무항생제 간엽줄기세포 배양액 조성물을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 베타-디펜신 3의 인간 간엽줄기세포에 대한 세포 안전성을 확인한 결과이다.
도 2는 다양한 농도의 베타-디펜신 3가 인간 간엽줄기세포 세포 생육에 미치는 영향을 확인한 결과이다 (상좌: 0.5 mg/ml beta-defensin 3, 상우: 0.1 mg/ml beta-defensin 3, 하좌: 0.05 mg/ml beta-defensin 3, 하우: 0.01 mg/ml beta-defensin 3).
도 3은 무처리, 1,2 Hexane-diol (0.5 mg/ml), xylitol (1 mg/ml), beta-defensin 3 (0.1 mg/ml)이 인간 간엽줄기세포의 무혈청 배양액의 IL-6 함량에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 4는 무처리, 1,2 Hexane-diol (0.5 mg/ml), xylitol (1 mg/ml), beta-defensin 3 (0.1 mg/ml) 처리한 무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양액의 항균력을 확인한 결과이다.
도 5는 HeLa, Vero c1008, MRC-5의 morphology을 확인한 결과이다.
도 6은 HeLa 세포에서 외래성 바이러스 검출을 위한 세포병변효과 시험을 확인한 결과이다.
도 7은 Vero c1008 세포에서 외래성 바이러스 검출을 위한 세포병변효과 시험을 확인한 결과이다.
도 8은 MRC-5 세포에서 외래성 바이러스 검출을 위한 세포병변효과 시험을 확인한 결과이다.
도 9는 HeLa 세포에서 Guinea-pig와 Chicken RBC를 이용한 혈구흡창 반응시험을 확인한 결과이다.
도 10은 Vero c1008 세포에서 Guinea-pig와 Chicken RBC를 이용한 혈구흡창 반응시험을 확인한 결과이다.
도 11은 MRC-5 세포에서 Guinea-pig와 Chicken RBC를 이용한 혈구흡창 반응시험을 확인한 결과이다.
도 12는 HeLa 세포에서 혈구응집반응 (28일째)을 확인한 결과이다.
도 13은 Vero c1008 세포에서 혈구응집반응 (28일째)을 확인한 결과이다.
도 14는 MRC-5 세포에서 혈구응집반응 (28일째)을 확인한 결과이다.
도 15는 무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양액의 HaCaT (왼쪽)과 CCD-986sk(오른쪽)에 대한 증식 촉진능을 확인한 결과이다

본 발명은, FBS(우태아혈청) 등의 혈청 함유 배양 배지에서 충분히 증식된 간엽줄기세포를 베타 디펜신 3 재조합 단백질을 함유하고 우태아혈청이 함유되지 않은 배양배지로 교체하여 최종적으로 무항생제, 무혈청 간엽줄기세포 배양액을 획득하는 것에 특징이 있다.

특히, 본 발명에 있어서, 간엽줄기세포는 성체줄기세포로 매우 높은 의약적 치료효과와 관련 응용기술에 대한 경제적 가치가 큰 생물학적 소재이다. 이러한 간엽줄기세포는 자가재생능과 다분화성을 갖는 세포로서, 골수간질세포, 지방세포, 신경세포 등으로 분화되는 세포이다.

줄기세포의 수득 과정

본 발명에 따른 간엽 줄기세포는 인간의 골수 또는 제대혈, 태반 내에 존재하는 세포 중에서 정제과정을 거쳐서 수득하는 것이 가능하다. 각각의 조직의 특성에 따라 줄기세포를 추출하는 과정은 이미 국내외 특허와 논문을 통하여 당업자에게 주지의 사실이고, 현재는 인간 유래 간엽 줄기세포를 연구용 목적으로 사용 가능한 세포주를 판매하고 있어, 쉽고 용이하게 간엽 줄기세포를 얻을 수 있다.

줄기세포의 배양 과정

본 출원시 이전에 다양한 문헌을 통해, 줄기세포 배양 과정에 있어서 필수적으로 포함되어야 할 과정들은 공개되어 있으며, 세포배양의 시작에 앞서 주지의 방법으로 공급원으로부터 추출한 생검 즉, 골수, 태반 등은 일반적인 항생제를 포함한 세척배지를 이용한 반복적인 세척과정을 통해 후속배양에 있을 오염의 가능성을 최소한으로 감소시킬 수 있다.

본 발명에서는 구체적으로, 간엽 줄기세포의 혈청배지에서 배양한 다음, 베타 디펜신 3 재조합 단백질을 포함하는 무혈청배지에서 계대배양하는 단계를 순차 진행함으로써, 화장료 조성물 제조에 적합한 무항생제 배양액 조성물을 제공할 수 있다.

혈청을 포함한 초기단계 세포배양을 위한 배지는 간엽 줄기세포와 같은 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지인 것이 바람직하다.본 발명에서는 당업계에서 일반적으로 세포배양에 사용하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)을 기본으로 하고, 세포배양에 통상적으로 사용되는 혈청을 포함한다.

이 때 초기 배지에 7~10%의 디메틸 술폭시드(DMSO ; dimethyl sulfoxide)를 첨가하면 동결 배지일 수도 있고,따라서 줄기세포를 동결한 다음 필요한 경우 해동하여 사용할 수 있다.

혈청은 0.1 내지 20%의 소 태아 혈청(FBS)을 첨가하는 것이 바람직하고, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가하는 것이 더욱 바람직하다.

항생제로는 페니실린-스트렙토마이신 등 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 모두 이용가능하며, 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있으며, 필요에 따라 글루타민 등의 산화영양소와 소디움 피루베이트등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.

더욱 바람직한 배지는 12mM 의 글루타민, 0.51mM 소디움 피루베이트, 0.110 FBS, 1 항생제(100IU/ml)로 보충된 글루코오스 및 DMEM을 함유하는데 이를 완전혈청배지라 한다. 이 때 글루코스의 농도범주는 대략적으로 1g/L 4.5g/L일 수 있다. 상기 완전혈청배지는 골수 또는 제대혈 유래 줄기세포의 보관과 유지 및 시험관내 안정된 기본배양조건을 제공해 주며 효과적인 세포의 안정화를 보여준다.

초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 90~95%, 온도 35~39℃, 5~10% CO2 배양기에서 배양하고, 5~10% CO2 배양 시에는 최종농도가 0.17~0.22 중량%가 되게 소디움 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해줄 수 있다.

초기배양 단계동안 조직단편은 배양 용기 바닥에 부착된 상태를 유지시키는게 바람직하며, 세포 배양의 표준 기술에 따른 트립신-EDTA 처리로 인한 짧은 자극으로 성장을 촉진할 수 있다.

누적집단배증시간 (doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 75~85% 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게 80%, 80 내지 90%, 또는 90% 내지 100% 합류시기에 세포를 채취하여 계대배양을 한다.

이하, 본 발명에 관하여 상세히 설명한다.

일 관점에서, 본 발명은 베타 디펜신 3 재조합 단백질로 처리된 포유동물의 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무항생제 배양액을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 배양액은 무혈청 배양액일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 포유동물은 사람, 돼지, 소 등일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 무항생제, 무혈청 간엽줄기세포 배양액은 간엽줄기세포를 혈청 함유 배지에서 배양한 다음, 베타 디펜신 3 재조합 단백질을 포함하는 무혈청 배지에서 배양함으로써 얻어지는 것이다.

이러한 배양액은 하기 실시예에 나타난 바와 같이, 다양한 세포주들에 대한 항바이러스능과 방부능을 가지고 있어, 화장료 조성물 제조에 적용하기 적절하다.

본 발명에 있어서, 상기 베타 디펜신 3 재조합 단백질은, 종래 알려져있는 베타 디펜신 (beta-defensin) 3 단백질 및 그 변형물은 모두 포함되는 것으로, 일 예로써, 하기 실시예에 제시되어 있는 서열번호 1의 아미노산을 가지는 베타 디펜신 3 재조합 단백질을 포함한다.

또한, 상기 베타 디펜신 3 재조합 단백질은 본 기술분야에 알려져 있는 다양한 공지의 방법으로 제작이 가능하며, 일 예로써 하기 실시예 1에서 제시된 제조 과정을 따를 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 베타 디펜신 3의 재조합 단백질을 처리하는 것은, 베타 디펜신 3 재조합 단백질을 배지에 포함시켜, 예컨대 DMEM 배지 등에 포함시켜 세포를 배양하는 것이고, 여기서 포함시키는 베타 디펜신 3 재조합 단백질의 농도는 실험예 1에서 입증된 바와 같이, 0.01mg/ml 이상 0.5mg/ml 미만이다.

본 발명에 따라 제조된 간엽줄기세포의 무항생제, 무혈청 배양액은 화장료 조성물 전체로서 사용될 수 있으나, 일반적으로 화장료 조성물 제조에 사용되는 첨가제들과 조합하여 화장료 조성물로 제조될 수 있어, 화장료 조성물 전체 100중량부에 대하여 0.01 내지 80중량부로 포함할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 기능성 화장료 조성물로써, 피부 미백, 피부 보습, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력, 피부 염증 완화 내지는 염증 개선, 피부 상태 개선 등의 기능을 제공하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 크림, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 로션, 모이스처 로션, 밀크로션, 영양로션, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아이스트린젠트, 팩, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 스킨 젤, 스킨 오일, 스킨 토너, 훼이스 로션(face lotion), 수렴수 및 디오더런트로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 갖을 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부 세정용일 수 있고, 상기 피부 세정용의 화장료 조성물은 크림, 로션, 화장수,클렌저, 폼, 클렌징 폼, 필링젤, 바디워시, 스크럽, 비누, 오일, 에멀젼, 헤어비누, 헤어 린스, 바디클렌져, 샴푸, 유액, 고형 세정제 및 액상 세정료로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 갖을 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 정제수, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 항염증제, 착색제, 물 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 기타 성분 등을 포함할 수 있으며, 이들 성분은 전체 조성물의 약 98.0 내지 99.1중량%의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용되는 계면활성제는 음이온성, 양이온성 및 양쪽성 모두를 포함하며, 사용량은 전형적으로 30중량%이상, 바람직하게는 70중량% 이상이다. 계면활성제의 종류 및 사용량을 선택 결정하는 것은 본 분야의 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 안정화제로는, 이로서 한정되는 것은 아니지만, 글리콜 스테아레이트가 포함된다. 안정화제가 사용되는 경우, 일반적으로, 조성물의 약 0.1 내지 5중량%이다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 보존제로는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 테트라나트륨 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 1-(3-클로로알릴)-3,5,7-트라아자-1-아다만탄, 파라벤, 메틸파라벤, 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온과 2-메틸-4-이소티아졸린-3-온의 혼합물, 페녹시에탄올, 벤질알코올, 벤조페논-4, 메틸클로로이소티아졸리논 및 메틸이소티아졸리논 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있다. 보존제가 사용되는 경우, 이의 양은 전형적으로 조성물의 약 0.01 내지 6중량%이고, 바람직한 양은 약 0.05 내지 4중량%,더욱 바람직한 양은 약 0.1 내지 2중량%이다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 습윤화제로는 밀 단백질(예, 라우르디모늄 하이드록시프로필 가수분해된 밀 단백질), 헤어 케라틴 아미노산, 나트륨 퍼옥실린카르볼산, 판테놀, 토코페롤(비타민 E) 및 디메티콘 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 또한 염화나트륨이 존재할 수 있으며 특히 헤어 케라틴 아미노산이 습윤화제로서 포함되는 경우 그러하다. 습윤화제는 전형적으로 조성물의 약 0.01 내지 10중량%, 바람직하게는 약 0.05 내지 1.5 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 1 중량%이 사용된다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 착색제로는 FDC 그린 3번, Ext. DC 바이올렛 2번, FDC 옐로우 5번 및 FDC 레드 40번 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있다. 착색제는 사용되는 경우 전형적으로 조성물의 약 0.001 내지 0.1중량%, 바람직하게는 약 0.005 내지 0.05중량%이다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 항염증제로는 국소적으로 투여하기에 적합하고 약학적으로 허용되는 화합물이라면 그 어느 것도 포함되며, 바람직하게는 알란토인이다. 항염증제는 사용하는 경우 염증 억제 또는 경감시키기에 충분한 양으로 사용되며 전형적으로는 조성물의 약 0.1 내지 2중량%, 바람직하게는 약 0.3 내지 1.5중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 1중량%이다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 항산화제는 효소형 항산화제와 비효소형 항산화제 모두 사용될 수 있다. 천연 효소형 항산화제의 예로는 과산화물디스뮤타제(SOD), 카탈라제 및 글루타티온 퍼옥시다제를 들 수 있다. 적합한 비효소형 항산화제로는 비타민 E(예, 토코페롤), 비타민 C(아스코브산), 카로테노이드, 에키나코시드(Echinacoside), 카페오일 유도체, 올리고머 프로안토시아니딘, 프로안타놀(예, 포도 종자 추출물), 실리마린(예, 밀크 엉겅퀴 추출물, 실리붐 마리아늄), 은행나무(Ginkgo biloba) 및 녹차 폴리페놀 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있다. 카로테노이드는 강력한 항산화제이며 이의 예로는 베타-카로틴, 칸타크산틴, 제아크산틴, 라이코펜, 루테인, 크로세틴 및 캡산틴 등이 포함된다. 바람직한 항산화제는 비타민 E, 비타민 C 또는 카로테노이드이다. 항산화제는 사용되는 경우 피부에서 유리-라디칼의 영향을 억제하거나 경감시키기에 충분한 양으로 사용된다. 항산화제의 전형적인 사용량은 조성물의 약 0.001 내지 1중량%이고, 바람직한 양은 약 0.01 내지 0.5중량%이다.

본 발명의 화장료 조성물은 본 분야에서 통상적으로 사용되는 다른 보조제를 함유할 수 있다. 이러한 보조제의 예로는 향료, 염료(헤어를 동시에 염색하거나 색조를 부가하는 염료를 포함), 용매, 불투명화제, 펄제(pearlescent agent)(예를 들어, 지방산과 폴리올의 에스테르, 지방산의 마그네슘 염 및 아연 염), 공중합체 계분산액, 농후화제(예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄 및 황산나트륨), 지방산 알킬올아미드, 셀룰로즈 유도체, 천연 검, 식물 추출물, 알부민 유도체(예를 들어 젤라틴), 콜라겐 가수분해 생성물, 천연 또는 합성폴리펩타이드, 난황, 레시틴, 라놀린 또는 라놀린 유도체, 지방, 오일, 지방 알코올, 실리콘, 디오더런트, 항균물질, 항지루성 물질, 각질용해제(예를 들어, 황, 살리실산, 벤조일 퍼옥사이드, 셀레늄 설파이드, PG, FA, 효소) 및 각화제(예를 들어, 타르, 황, 살리실산, 셀레늄 설파이드, 항균제, 벤조일 퍼옥사이드, 클로르헥시딘, 요오드, 트리클로산, 항진균제 및 효소) 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은, (a) 분리된 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 혈청 함유 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 간엽줄기세포를 베타 디펜신 3 재조합 단백질을 함유한 무혈청 배지에서 배양한 다음, 배양액을 회수하는 단계를 포함하는 포유동물 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청, 무항생제 배양액의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서, 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 혈청 함유배지에서 배양하는 단계는, 하기 실시예에 나타난 바와 같이, 동일한 함량의 혈청 함유 배지에서 배양할 수도 있고, 점차 순차적으로 혈청 함유량을 줄여가면서 계대배양 할 수도 있다.

일 예로, 10~20% 혈청 함유 배지에서 계대배양하거나, 10~20% 혈청 함유 배지에서 배양후, 5~7%, 13% 혈청 함유 배지 등으로 옮겨가며 순차적으로 혈청 함유량을 줄인 배지에서 배양한 다음, 베타 디펜신 3 재조합 단백질 함유 무혈청 배지에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 배양 과정에 있어서, 세포 배양 시작 후 24시간된 시점에서 배양배지를 제거하고, 다시 새롭게 준비된 배양배지를 넣어주며, 그로부터 3~4일 후에 새롭게 준비된 배양배지를 넣어주어 배양한 다음, 7~9일 후에 배양배지를 제거하고, 계대배양할 수 있으나, 배지를 갈아주는 시기나, 배양기간에 특별한 제한이 있는 것은 아니고 모두 적용가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서, 상기 베타 디펜신 3 재조합 단백질을 배지에 포함시켜, 예컨대 DMEM 배지 등에 포함시켜 세포를 배양하는 것이고, 여기서 포함시키는 베타 디펜신 3 재조합 단백질의 농도는 실험예 1에서 입증된 바와 같이, 0.01mg/ml 이상 0.5mg/ml 미만이다. 이는 종래에 일반적으로 함유되는 화학적 항생제들을 사용하지 아니하고, 베타 디펜신 3 재조합 단백질을 사용한다는 것이다.

특히, 본 발명에서는 기존에 사용하는 유해한 항생제를 사용하지 아니하고 베타 디펜신 3 재조합 단백질을 처리하여 무항생제 배양액을 얻는 것에 특징이 있다.

다른 관점에서, 본 발명은, 상기 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는, 포유동물 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청, 무항생제 배양액을 함유한 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

다른 관점에서, 본 발명은, 베타 디펜신 3 재조합 단백질을 함유하는 간엽줄기세포 배양을 위한 배지 조성물, 또는 배지 첨가용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 베타 디펜신 3 재조합 단백질은 간엽줄기세포 배양에 일반적으로 사용되는 유해한 항생제들 대신에 배지 조성물에 포함시켜 사용함으로써, 좀더 화장료 조성물 제조에 사용될 수 있는 적합한 간엽줄기세포 배양액을 제공할 수 있다.

이러한 배지 조성물은 종래 알려져 있는 상업용 배지들 (DMEM 등)에 베타 디펜신 3 재조합 단백질을 함유시켜 사용할 수도 있고, 또한, 세포 배양에 필요한 공지의 여러 성분들을 함께 함유시켜 사용할 수 있다.

이러한 베타 디펜신 3 재조합 단백질로는 하기 실시예에서 예시하는 서열번호 1의 아미노산 서열(HGGIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKK)을 가지는 베타 디펜신 3 재조합 단백질일 수 있으나, 이것 이외에도, 종래에 알려져 있는 베타 디펜신 3 또는 그 변형물 또한 포함될 수 있다.

또한, 상기 베타 디펜신 3 재조합 단백질의 농도는 0.001 내지 0.5 mg/ml일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 특히, 실시예에서는 골수 유래 줄기세포로 실험한 결과에 대해 기재되어 있으나, 제대혈 유래 줄기세포의 배양액 내에도 다양한 성장인자들이 포함되어 있어 동일한 효과가 있음은 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명의 베타 디펜신 3 재조합 단백질의 제조

1-1. 본 발명에 따른 항균 펩타이드의 동정 및 서열 분석

(1) HaCaT 세포로부터의 전체 RNA 추출과 cDNA 합성

인간 피부세포의 일종인 각질형성세포 세포주인 HaCaT 세포를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin 100 IU-100 /(GIBCO, Carlsbad, CA)과 함께 75 Cm² flask에서 37, 5% CO₂의 조건으로 배양하였다.

상기 HaCaT 세포를 75 Cm² 플라스크(flask)에서 증식정도(confluence) 85%에서 90%까지 증식시키고, 트리졸 시약(TRIzol reagent, Invitrogen)을 10 Cm² 당 1 ml씩 약 7.5 ml 가한다. 상온에서 가볍게 흔들면서 세포를 완전히 용해시켰다. 사용된 트리졸 시약 1 ml 당 0.2 ml의 클로로포름(chloroform)을 가하여 15초간 강하게 손으로 흔든 다음 상온에서 3분간 정치 반응시켰다. 이후 12,000 xg의 속도로 15분간 원심분리를 수행하고 상등액에 일정 비율의 이소프로파놀(isopropanol)을 가하였고, 강한 교반(vortexing)으로 충분히 섞은 후 실온에서 3분간 반응시켰다.

전체 RNA의 침전을 위해 4에서 12,000 xg의 속도로 15분간 원심분리하고, 75% 에탄올 용액으로 튜브의 내부를 씻어준 후 4에서 12,000 xg의 속도로 15분간 원심분리 하였다. 상등액을 완전히 제거한 후 상온에서 5분간 건조하고 0.05ml의 물을 사용하여 녹였다. 정제된 전체 RNA 30 에 0.3 / random hexamer(GIOCO) 2.5 와 10 mM dNTP mixture(Invitrogen) 2.5 를 잘 섞어주어, 65에서 5분간 반응 시켰다. 반응 직 후 바로 얼음으로 옮겨 1분간 방치하고 spin down하여 반응 산물을 모은 다음, 5X first-stand buffer(Invitrogen) 10 와 100 mM DTT 2.5 그리고 reverse transcriptase(superscript III, Invitrogen) 2.5 를 섞어주고, 상온에서 5분간 반응시킨 후 50에서 1시간 추가로 반응시켰다. 연속적으로 70에서 15분간 반응하여 cDNA를 합성하였으며, 하기 RT-PCR의 주형으로 사용하였다.

(2) 역전사중합효소반응(RT-PCR)

상기와 같이 합성된 HaCaT cDNA 2 , 10 pmole 농도의 센스 프라이머 2 , 10 pmole 농도의 안티센스 프라이머 2 , 10X Taq 폴리머라제 버퍼 2 , 10 mM dNTP mixture 2 , Taq 폴리머라제 2 , D.W 9 을 잘 섞은 후, 1) 94에서 5분간 초기 변성, 2) 94에서 30초간 변성 과정, 3) 58에서 1분 간 어닐링 과정, 4) 72에서 1분 30초간 신장 과정, 5) 72에서 5분간 최종 신장 과정으로 하여 2)단계에서 4)단계를 35회 반복하였다. 사용된 센스프라이머(서열번호 2)와 안티센스프라이머(서열번호 3)들은 아래와 같다.

서열번호 2: ATGAGGATCC ATTATCTTCT GTTTG

서열번호 3: AACACTCTCGTCATGTTTCAGGGTTT

획득된 PCR 증폭 산물의 가시화는 1% agarose 젤 전기영동을 통해 수행하였고, 그 결과, 165bp의 PCR 산물을 확보하였다.

(3) TOPO 클로닝, 서열분석 및 발현벡터 클로닝

역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통해 획득된 인간 베타 디펜신 ( Human Beta-Defensin 3)를 함유하는 유전자 산물을 아가로스 젤 전기영동을 통해 정제한 후, TA 클로닝 벡터(pTA-READY)에 클로닝하였다. 형질전환(transformation) 시킨 후 암피실린 100 /mL 첨가된 LB agar plate에 도말하한 다음 37에서 배양하였다. 잘 자란 콜로니들을 골라 동일한 농도의 암피실린이 함유된 LB 액체 배지 10 ml에 접종한 후 37에서 하룻밤 배양하였다.

배양액에서 플라스미드를 정제하고, 정제된 플라스미드를 주형으로 하여 다시 센스 프라이머(서열번호 4:ATG CAC CAC CAC CAC CAC CAC CAT GGA GGA ATC ATA AAC ACA TTA)와 안티센스 프라이머(서열번호 5: TTA TTT CTT TCT TCG GCA GCA TTT)를 사용한 PCR에서 약 165bp의 PCR 산물을 보이는 콜로니를 선별하였다.

인간 베타 디펜신 펩타이드의 유전자 서열을 확인하기 위하여 TA 클로닝 벡터에 내재하는 정방향 프라이머 (서열번호 6: 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3')와 역방향 프라이머 (서열번호 7: 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')를 이용하여 염기서열분석(sequencing)을 수행하였다.

클로닝된 인간 베타 디펜신 펩타이드를 재조합 단백질로 발현하기 위한 발현벡터로의 클로닝은 다음과 같이 수행하였다.

상기에서 확인된 인간 베타 디펜신 펩타이드의 cDNA 서열을 바탕으로 센스와 안티센스의 각각 말단에 NdeI 과 Xho I 제한효소 인식서열을 함유하는 프라이머를 디자인하고, 상기의 정제된 TA 클로닝 플라스미드를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 산물을 아가로스 젤에서 정제한 후, NdeI 과 Xho I 제한효소들로 동시 절단하였다.

인간 베타 디펜신 3(Human Beta-Defensin 3)를 글루타티온 에스-트랜스퍼라아제(Glutathione S-Transferase, GST) 융합단백질로 클로닝하기 위하여 pGST-READEY 벡터를 역시 NdeI 과 Xho I제한효소들로 동시 절단하였다. 이 제한효소 처리 산물을 아가로스 젤 전기영동 후 제한효소 절단이 확인된 벡터들만을 gel extraction으로 분리 정제하였다. 상기에서 제한 효소 동시 처리 후 준비된 인간 베타 디펜신 펩타이드의 유전자와 GST-융합단백질 발현용 벡터를 1:1 몰비로 라이게이션하여 형질전환 하였다.

1-2. 재조합 단백질로써 본 발명에 따른 인간 베타 디펜신 펩타이드의 발현과 정제

GST와 융합된 본 발명에 따른 인간 베타 디펜신 펩타이드를 함유하는 발현벡터를 갖는 BL21(DE3)를 100 /ml 농도의 ampicillin을 함유하는 LB 액체 배지 10ml에 접종한 후 37에서 하룻밤 배양하였다(전배양 하였다). 다음날 아침 동일한 농도의 암피실린을 함유하는 LB배지 1L에 배양된 배양액 10 ml을 접종하여(1/100 접종) 37에서 200 rpm으로 흔들면서 배양하였다. 660 nm에서 흡광도가 1.2에 도달하였을 때 최종 농도 1 mM에 해당하는 IPTG를 첨가하여 30도에서 4시간 추가로 배양하였다. 배양이 끝난 후, 6,000 rpm, 4에서 20분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 침전된 균체는 얼음으로 냉장한 PBS 50 ml에 현탁하여 얼음에서 10분간 방치하였다. Probe 타입 대장균 균체파쇄용 소니케이터(sonicator)를 이용하여 균체를 파쇄하고 12,000 rpm, 4에서 30분간 원심분리하여 비파쇄 균체외 불용성 분획을 제거하여 수용성 재조합 단백질 분획을 얻었다.

글루타티온(glutathione)-비드가 충진된 크로마토그래피 컬럼에 로드하여 GST와 융합된 형태의 본 발명에 따른 인간 베타 디펜신 유사 펩타이드의 융합단백질을 결합시키고, 0.05% triton X-100이 첨가된 PBS 200ml로 세척하여 불순물을 제거하였다. 10 mM 농도의 환원된 GST 용액을 컬럼에 가하여 GST와 융합된 본 발명에 따른 인간 베타 디펜신 유사체 단백질을 비드에서 분리시키고 융합단백질을 획득하였다. 획득된 융합단백질 수용액은 1,000 Da의 cutting-value를 갖는 멤브레인을 사용하여 ultrifiltration system으로 최종 부피 ~ 10ml로 농축하였다. 농축된 융합단백질 용액에 트롬빈을 처리하여 GST로부터 새로운 인간 베타 디펜신 펩타이드를 분리하고, 이를 세파덱스(Sephadex) G-25가 충진된 크로마토그래피에 로드하여 사이즈 추출(size extraction) 방법을 통해 본 발명에 따른 새로운 서열번호 1(HGGIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKK)의 베타 디펜신 3 재조합 단백질 펩타이드를 순수 분리하였다.

획득된 본 발명에 따른 인간 베타 디펜신 3 펩타이드는 1,000 Da의 cutting-value를 갖는 멤브레인을 사용하여 ultrifiltration system으로 최종 부피가 ~ 1ml 되도로 농축하였다. 안정적인 보관을 위해 동결건조하여 -20에 보관하여 사용하였다.

간엽줄기세포의 무혈청·무항생제 배양액의 제조

인간 골수 유래의 간엽줄기세포 배양을 시작하기 위하여 액체질소탱크(LN2 tank)에서 보관하고 있는 간엽줄기세포 (ATCC(the global bioresource center)에서 구입)의 세포 stock을 해동하여 간엽줄기세포 배양을 시작하였다.

이를 위해 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Cetificated, Cat. No. 16000, GIBCO)와 antibiotics(Antibiotics-Antimycotic, Cat. No. 15240-062, GIBCO)가 함유된 DMEM(GIBCO) 20ml을 37℃로 30분간 미리 승온한 후 75T 플라스크(NUNC)에 넣는다. 해동한 간엽줄기세포 바이알(vial)을 10ml 동일 배지에 현탁 후 2,000 rpm에서 3분간 원심 분리하여 세포만을 획득하였다. 상등액을 제거하고 획득된 세포를 1ml의 동일한 배지에 재 현탁한 후 10ul를 획득하여 C-Chip(Cat. No. DHC-N01, iNCYTO)과 광학현미경을 이용하여 계수하였다. 계수된 세포를 이용하여 5 × 10³ cell/cm²의 농도로 75 T-플라스크에 접종하여 5% CO₂, 37℃로 세포 배양을 시작하였다. 세포 배양 시작 24시간 후 배양에 사용 중인 배양배지를 제거하고 새롭게 준비된 10% FBS와 antibiotics가 함유된 DMEM 20ml을 넣어주었다.

배양 시작 7 ~ 9일 후 배양에 사용 중인 배양배지를 제거하고 Ca^{2 +}와 Mg^{2 +}를 함유하지않은 DPBS(GIBCO™ Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), GIBCO) 5ml로 가볍게 씻어주었다. 5ml의 Trypsin-EDTA 용액 (GIBCO)를 첨가하고 37℃에서 5분간 반응시켜 세포를 용기에서 떼어내었다. 5ml의 10% FBS와 antibiotics가 함유된 DMEM을 첨가하여 trypsin의 활성을 차단하였다. 획득된 세포 현탁액을 2,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 세포만을 획득하였다. 상등액을 제거하고 획득된 세포를 1ml의 동일한 배지에 재 현탁한 후 10ul를 획득하여 C-Chip(Cat. No. DHC-N01, iNCYTO)과 광학현미경을 이용하여 계수하였다. 계수된 세포를 이용하여 5× 10³ cell/Cm²의 농도로 75 T-flask 3개에 접종하였다. 각 75 T-flask에 20ml의 10% FBS와 antibiotics가 함유된 DMEM을 첨가하여 5% CO₂, 37℃로 세포 배양을 시작하였다. 세포의 배양에 의해 confluence가 90%에 도달하기 전에 동일한 방식으로 2차 및 3차 계대 배양을 수행하여, 충분한 양의 간엽줄기세포를 배양하였다.

3계대 배양후의 간엽줄기세포가 confluence가 90% ~ 100%에 도달하면, 각각의 175 T-flask에 FBS와 항생제(antibiotics)를 함유하지 않으며 0.1 mg/ml 농도로 베타 디펜신 (beta-defensin) 3 재조합단백질을 함유하는 DMEM(GIBCO) 20ml을 사용하여 3회 씻어주었다. 3회 세척 후 각각의 175 T-flask에 FBS와 항생제(antibiotics)를 함유하지 않으며 0.1 mg/ml 농도로 실시예1에서 제조된 베타 디펜신3 재조합단백질을 함유하는 DMEM(GIBCO) 50ml를 각각 넣어준 후 5일간 추가 배양하였다. 추가배양 후, 배양배지를 새로운 용기로 회수하고 6,000 rpm으로 원심 분리하여 잔류 세포 혹은 파쇄 세포와 분리하였다. 분리된 상등액을 0.22 um로 filtration 하여, 최종적으로 간엽줄기세포의 무혈청, 무항생제의 배양액을 얻었다.

실험예 1: 다양한 농도의 항균펩타이드 베타 디펜신 3의 인간 간엽줄기세포에 대한 세포 안전성

인간 각질형성세포에서 생산하여 분비하는 천연항균펩타이드인 베타 디펜신3의 간엽줄기세포 배양의 적용 한계를 확인하기 위하여 MTT 분석법으로 시험하였다. 이를 위해, LN2 tank에서 보관하고 있는 간엽줄기세포의 세포 stock을 해동하여 세포 배양을 시작하였다. 이를 위해 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Cetificated, Cat. No. 16000, GIBCO)와 antibiotics(Antibiotics-Antimycotic, Cat. No. 15240-062, GIBCO)가 함유된 DMEM(GIBCO) 배지를 사용하여 계대 배양을 2회 하면서 충분한 인간 간엽줄기세포를 배양하였다. 세 번째 계대 배양은 6 well plate를 사용하여 confluence가 90%이 될 때까지 배양하였다. 현미경을 통해 배양의 정도가 90% confluence에 도달한 시점에서, 재조합단백질로 발현 정제된 베타 디펜신3를 0.01 mg/ml에서 0.5 mg/ml 농도 범위로 함유하는 무혈청·무항생제 배지 (상업용 배지 (GIBCO Cat No. 11995에 베타 디펜신 3를 함유시킨 배지))를 사용하여 3회 세척 후 동일한 배지로 5일간 추가 배양하였다. 이후 MTT 용액(6.6mg/ml, 3-(4,5-dimethyl thiazol-2yl)-2,5 diphenyl-2H-tetrazolium bromide액)을 각 well에 50ul씩 넣고 3시간 추가 배양하였다. 배양액을 제거한 다음 dimethylsulfoxide(DMSO, Amresco, 0231-500ML)를 200ul씩 넣고 10분간 흔들어 준 다음 100ul씩 96well에 취하여 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 정도는 시료가 포함되지 않은 일반 DMEM 배지를 처리한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

세포안정성(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도)x100

그 결과, 무처리군에 비해 0.01, 0.05, 0.1 mg/ml 농도까지는 세포 안전성이 매우 높고, 0.5 이전까지는 매우 안정성이 높으나, 0.5 mg/ml에서는 세포에 매우 미약하지만 세포 생육이 저해되는 것으로 확인되었다.

실험예 2: 간엽줄기세포의 무혈청·무항생제 배양액의 IL-6 농도 시험

무항생제 배양을 위한 항생물질 대체제로써의 베타 디펜신3의 유효성을 최근 비파라벤계열의 화장품 방부제로 각광받고 있는 1,2 Hexane-diol 및 xylitol과 비교하였다. 이를 위해, 각각의 항생물질 대체제들을 적용하여 무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양액들을 획득하고, 간엽줄기세포배양액에서 확인되는 가장 대표적인 싸이토카인인 IL-6의 농도를 ELISA 분석으로 비교함으로써 유효 배양액 획득에 대한 유효성을 분석하였다.

구체적으로는 LN2 tank에서 보관하고 있는 간엽줄기세포의 세포 stock을 해동하여 세포 배양을 시작하였다. 이를 위해 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Cetificated, Cat. No. 16000, GIBCO)와 antibiotics(Antibiotics-Antimycotic, Cat. No. 15240-062, GIBCO)가 함유된 DMEM(GIBCO) 배지를 사용하여 계대 배양을 3회 수행하면서 충분한 인간 간엽줄기세포를 배양하였다. 현미경을 통해 배양의 정도가 90% confluence에 도달한 시점에서, 각각 세포 독성을 보이지 않는 최대 범위인 0.5 mg/ml 1,2 Hexane-diol, 1 mg/ml xylitol, 그리고 0.1 mg/ml 베타 디펜신3를 함유하는 무혈청·무항생제 배지를 사용하여 3회 세척 후 동일한 배지로 5일간 추가 배양하였다. 배양후 획득된 배양배지는 6,000 rpm으로 원심분리하에 잔류 세포 혹은 세포 파편들을 제거하였으며, 상등액을 0.22 um의 필터로 여과하여 시료로 사용하였다. 각각의 배양액을 IL-6에 특이적인 ELISA 분석의 검체로 사용하여, 각각의 무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양액들 내의 IL-6 싸이토카인 농도를 분석하였다.

분석 결과, 간엽줄기세포에 대한 세포 독성이 없는 범위들에서는 시험된 1,2 Hexane-diol (0.5 mg/ml), xylitol (1 mg/ml), 그리고 베타 디펜신3 (0.1 mg/ml)들간에 IL-6 함량에 대한 차이를 보이지 않았다. 따라서, 이러한 결과를 토대로, 베타 디펜신 3가 다른 화장품 방부제로 사용되는 hexane-diol, xylitol등과 같이 방부력을 가지면서도 다른 생물학적인 effect에 영향을 끼치지 않는다는 점을 확인하였다.

실험예 3: 간엽줄기세포의 무혈청·무항생제 배양액의 잔류 미생물 확인 시험

각각의 항생물질 대체제(1,2 Hexane-diol, xylitol, 베타 디펜신 3 재조합 단백질)들을 적용하여 간엽줄기세포의 무혈청·무항생제 배양액들을 획득하고, 이를 직접 미생물 배양용 agar 배지에 0.1 ml씩 도말하여 잔류 미생물의 존재여부를 비교하였다.

구체적으로는 LN2 tank에서 보관하고 있는 간엽줄기세포 stock을 해동하여 세포 배양을 시작하였다. 이를 위해 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Cetificated, Cat. No. 16000, GIBCO)와 antibiotics(Antibiotics-Antimycotic, Cat. No. 15240-062, GIBCO)가 함유된 DMEM(GIBCO) 배지를 사용하여 계대 배양을 3회 수행하면서 충분한 인간 간엽줄기세포를 배양하였다. 현미경을 통해 배양의 정도가 90% confluence에 도달한 시점에서, 각각 세포 독성을 보이지 않는 최대 범위인 0.5 mg/ml 1,2 Hexane-diol, 1 mg/ml xylitol, 그리고 0.1 mg/ml 베타 디펜신3를 함유하는 무혈청·무항생제 배지를 사용하여 3회 세척 후 동일한 배지로 5일간 추가 배양하였다. 배양후 획득된 배양배지는 6,000 rpm으로 원심분리하에 잔류 세포 혹은 세포 파편들을 제거하였으며, 상등액을 0.22 um의 필터로 여과하여 시료로 사용하였다. 각각의 배양액들 0.1 ml씩을 LB agar plate에 도말하고, 이를 37도에서 48시간 배양하여 생성되는 colony를 계수한 후 cfu / ml로 평가하였다.

그 결과, 시험된 1,2 Hexane-diol (0.5 mg/ml)과 xylitol (1 mg/ml) 사용군에서는 미생물의 존재가 확인되었으나, 시험된 총 6회 모두에서 베타 디펜신3 (0.1 mg/ml) 사용군에는 미생물이 존재하지 못함을 확인하였다 (표 1). 이러한 결과를 토대로, 종래 항생제들 보다도 더 우수한 항생 효과를 가지고 있음을 알 수 있다.

다양한 항생제 대체제들로 획득된 간엽줄기세포의 무혈청·무항생제 배양액 내 잔류 미생물수 시험

실험 횟수	무처리군	1,2 Hexane-diol (0.5 mg/ml)	xylitol (1 mg/ml)	베타 디펜신3 (0.1 mg/ml)
1	30	0	20	0
2	60	20	30	0
3	30	20	30	0
4	40	0	0	0
5	40	30	20	0
6	20	0	0	0

실험예 4: 간엽줄기세포의 무혈청·무항생제 배양액의 방부력 시험

각각의 항생물질 대체제(1,2 Hexane-diol, xylitol, 베타 디펜신 3 재조합 단백질)들을 적용하여 간엽줄기세포의 무혈청·무항생제 배양액들을 획득하고, 이를 다양한 감염성 미생물에 대해 paper diffusion method로 방부력을 시험, 비교하였다.

구체적으로는 LN2 tank에서 보관하고 있는 간엽줄기세포 stock을 해동하여 세포 배양을 시작하였다. 이를 위해 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Cetificated, Cat. No. 16000, GIBCO)와 antibiotics(Antibiotics-Antimycotic, Cat. No. 15240-062, GIBCO)가 함유된 DMEM(GIBCO) 배지를 사용하여 계대 배양을 3회 수행하면서 충분한 인간 간엽줄기세포를 배양하였다. 현미경을 통해 배양의 정도가 90% confluence에 도달한 시점에서, 각각 세포 독성을 보이지 않는 최대 범위인 0.5 mg/ml 1,2 Hexane-diol, 1 mg/ml xylitol, 그리고 0.1 mg/ml 베타 디펜신3를 함유하는 무혈청·무항생제 배지를 사용하여 3회 세척 후 동일한 배지로 5일간 추가 배양하였다. 배양후 획득된 배양배지는 6,000 rpm으로 원심분리하에 잔류 세포 혹은 세포 파편들을 제거하였으며, 상등액을 0.22 um의 필터로 여과하여 시료로 사용하였다. 각각의 항생물질 대체제들을 사용한 배양액 0.1 ml씩과 paper diffusion method를 사용하여 Enterococcus, Escherichia, Streptococcus, Staphylococcus, Proteus 종들에 대한 방부력을 시험, 비교하였다.

분석 결과, 시험된 무처리군, 1,2 Hexane-diol (0.5 mg/ml)과 xylitol (1 mg/ml) 사용군에서는 외부 미생물에 대한 방부력이 전혀 존재하지 않았으나, 베타 디펜신3 (0.1 mg/ml) 사용군에는 시험된 모든 균에 대한 넓은 방부력이 확인되었다 (도 4, 표 2).

무처리, 1,2 Hexane-diol (0.5 mg/ml), xylitol (1 mg/ml), beta-defensin 3 (0.1 mg/ml) 처리한 무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양액의 항균력

	무처리군	1,2 Hexane-diol (0.5 mg/ml)	xylitol (1 mg/ml)	beta-defensin 3 (0.1 mg/ml)
Enterococcus	-	-	-	+++
Escherichia	-	-	-	+++
Streptococcus	-	-	-	+++
Staphylococcus	-	-	-	+++
Proteus	-	-	-	++*

*) +: 페이퍼 디스크 주변의 저해 환의 지름 0.5 mm

실험예 5: 베타 디펜신3을 사용하여 획득한 간엽줄기세포의 무혈청·무항생제 배양액들의 감염성 바이러스 부정시험

0.1 mg/ml 농도의 베타 디펜신3 적용을 통해 성공적으로 개발된, 무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양 및 배양액 획득 기술을 통해 획득한 배양액을 사용하여, 인간 피부를 구성하는 각질형성세포 (keratinocyte)와 섬유아세포 (fibroblast) 세포주들에 대한 증식 촉진능을 시험하였다.

구체적으로는 LN2 tank에서 보관하고 있는 간엽줄기세포 stock을 해동하여 세포 배양을 시작하였다. 이를 위해 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Cetificated, Cat. No. 16000, GIBCO)와 antibiotics(Antibiotics-Antimycotic, Cat. No. 15240-062, GIBCO)가 함유된 DMEM(GIBCO) 배지를 사용하여 계대 배양을 3회 수행하면서 충분한 인간 간엽줄기세포를 배양하였다. 현미경을 통해 배양의 정도가 90% confluence에 도달한 시점에서, 0.1 mg/ml 베타 디펜신3를 함유하는 무혈청·무항생제 배지를 사용하여 3회 세척 후 동일한 배지로 5일간 추가 배양하였다. 배양후 획득된 배양배지는 6,000 rpm으로 원심분리하에 잔류 세포 혹은 세포 파편들을 제거하였으며, 상등액을 0.22 um의 필터로 여과하여 시료로 사용하였다.

획득된 배양액들의 검체로, indicator cell line으로 HeLa cell, Vero cell, MRC-5를 사용하여 직접 첨가하는 직접법의 방식으로 바이러스 부정시험을 수행하였다. Vero cell에 대한 양성대조 바이러스로 Reovirus type 3 또는 Parainfluenza virus type 3를 사용하였으며, MRC-5 cell에 대한 양성대조 바이러스로 Measles virus 또는 Influenza A virus H1N1을 사용하였다. HeLa cell에 대한 양성대조 바이러스로 Coxacki virus 또는 parainfluenza virus type 3를 사용하였다. 세포내에서 바이러스가 증식하게 되면 세포의 기능에 영향을 주게 된다. 대부분 바이러스가 감염된 세포는 막투과성의 변화로 세포가 부푼다든가, 세포괴사로 인하여 응축이 된다든가 바이러스의 융합(fusion) 단백질에 의해 거대 다핵세포가 형성이 된다든가 하는 형태적인 변화가 생긴다. 이런 변화를 세포병변효과(CPE) 라고 하고, 이런 현상을 이용하여 세포 내에 바이러스의 존재 유무를 알 수 있다. 세포병변효과가 나타나는 형태는 감염된 바이러스의 종류에 따라 다를 수 있다.

구체적으로는, 검체인 간엽줄기세포 무혈청·무항생제 배양액의 접종을 위하여 6-well plate에 각 검사세포를 깔고 대략 24시간동안 36 ± 2℃에서 Dulbecco's Modified Eagles Medium, DMEM)에 우혈청 10% 처리한 배양액을 이용하여 배양하였다. 배지를 제거한 후에 무혈청·무항생제 간엽줄기세포 배양액 또는 대조군액을 0.5 ml 씩 접종한 후 36 ± 2℃에서 70 ± 10분간 배양하였다. 접종한 플레이트는 15분 정도 간격으로 검체인 무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양액이 잘 흡수 되도록 흔들어준다. 70분 후에는 접종한 배양액을 제거하고 유지 배양액(DMEM에 2% 우혈청 처리한 배양액) 2 ml을 넣었다. 무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양액 및 대조액을 접종한 웰에서 세포병변 효과가 나타나는 지 2주일동안 일주일에 세 번씩 관찰 하였다. 또, 세포를 적절히 유지시키기 위해서 배양액(DMEM에 2% 우혈청 처리한 배양액)을 갈아주었다. 명확한 바이러스 존재의 판단을 위해 검사 세포주에서 바이러스성 세포병변을 일으킬 수 있는 바이러스들을 양성 대조군으로 사용하였다. 더욱이 이 바이러스로 검사세포에 감염시키면 세 가지 타입의 적혈구 중에 최소한 한 가지에서 혈구흡착반응이나 혈구응집반응 양성의 결과를 보여준다.

혈구응집반응시험은 헤마글루티닌을 갖고 있는 바이러스는 적절한 동물의 적혈구를 응집시킬 수 있는 능력을 시험하는 것이다. 이 반응은 적혈구 표면에 있는 수용체(receptor)와 바이러스의 헤마글루티닌이 결합하여 만들어지는 반응이다. 바이러스가 적혈구에 결합되어 적혈구 덩어리를 만들어 내는데 이를 혈구응집반응이라고 한다. 이 혈구응집반응은 육안으로 관찰될 수 있으며 이 반응이 일어난다는 것은 바이러스가 존재함을 의미한다.

① 닭 적혈구 응집반응

검체, 양성대조액, 음성대조액을 각각 50 μl 씩 96-웰 플레이트(V-bottom)에 넣는다. 각 웰 당 0.5% (v/v) 적혈구 용액을 50 μl 씩 첨가 하고 잘 섞어 준다. 적혈구 용액과 반응액이 잘 섞이도록 한 뒤 5℃와 36℃에서 30분정도 반응 시킨 후 응집여부를 기록한다.

② 기니피그 적혈구 응집반응

검체, 양성대조액, 음성대조액을 각각 50 μl 씩 96-웰 플레이트(V-bottom)에 넣는다. 각 웰 당 0.2% (v/v) 적혈구 용액을 50 μl 씩 첨가 하고 잘 섞어 준다. 적혈구 용액과 반응액이 잘 섞이도록 한 뒤 5℃와 36℃에서 30분정도 반응 시킨 후 응집여부를 기록한다.

외래 감염성 바이러스 오염물질의 존재 유무를 검사하기 위해 각 세포주 (HeLa, Vero c1008, MRC-5)를 사용하여 시험하였다. HeLa 세포주에는 Parainfluenza virus를 양성 대조군으로 사용하였으며, Vero c1008은 Reo virus, MRC-5는 Measles virus를 사용하였다 (도 5).

무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양액의 부정시험을 위해 음성대조군에는 2% FBS를 함유하는 세포 유지 배양액을 첨가하여 사용하였다. 시험 결과 양성 대조군에서는 세포병변 효과와 혈구응집 반응이 나타났고, 음성 대조군에서는 세포병변 효과가 나타나지 않아 정상적으로 부정시험이 진행됨을 확인할 수 있었다.

Guinea-pig와 chicken 적혈구의 혈구응집 반응 또는 혈구흡착 반응은 접종 후 14일 또는 28일 동안 무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양액 또는 음성 대조군용 시료를 접종한 검사 세포에서는 어떠한 반응도 관찰되지 않았다. 그러나, 양성 대조군용 시료를 접종한 검사 세포에서는 혈구응집 반응 및 혈구흡착 반응이 관찰되었다.

HeLa 세포주를 이용한 시험 결과, 검체인 무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양액을 접종한 각각의 검사 세포주에서 어떤 검사 세포주에서도 바이러스에 의한 세포병변효과가 관찰되지 않았다. Parainfluenza virus를 접종한 양성대조군에서는 세포병변 효과를 관찰할 수 있었으며, 아무것도 접종하지 않은 음성대조군 시료를 접종한 검사 세포주에서는 세포병변 효과가 나타나지 않았다 (도 6). 검체 또는 음성대조용 시료를 접종한 검사 세포주에서 guinea-pig와 chicken 적혈구의 혈구응집 반응 또는 혈구흡착 반응은 접종 후 12일 또는 28일 동안 어떠한 반응도 관찰되지 않았다. 양성대조군 시료를 접종한 검사 세포의 경우 guinea-pig에서는 혈구응집반응이 관찰되었고, chicken에서는 응집반응이 관찰되지 않았다. 혈구흡착반응은 guinea-pig와 chicken에서 모두 관찰되었다 (도 9, 도 12).

Vero c1008 세포주를 이용한 시험 결과, 무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양액을 접종한 각각의 검사 세포주에 어떤 검사 세포에서도 바이러스에 의한 세포병변효과가 관찰되지 않았다. Reo virus를 접종한 양성대조군에서는 세포병변효과를 관찰 할 수 있었으며, 아무것도 접종하지 않은 음성대조군에서는 세포병변효과를 관찰 할 수 없었다 (도 7). 무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양액 또는 음성대조군용 시료를 접종한 검사 세포주에서 guinea-pig와 chicken 적혈구의 혈구응집반응 또는 혈구흡착반응은 접종 후 14일 또는 28일 동안 어떠한 반응도 관찰되지 않았다. 양성대조군 시료를 접종한 검사 세포의 경우 guinea-pig에서는 혈구응집반응이 관찰되었고, chicken에서는 응집반응이 관찰되지 않았다. 혈구흡착반응은 guinea-pig와 chicken에서 모두 관찰되었다 (도 10, 도 13).

MRC-5 세포주를 이용한 시험결과, 무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양액을 접종한 각각의 검사 세포주에서 어떤 검사 세포에서도 바이러스에 의한 세포병변효과가 관찰되지 않았다. Measles virus를 접종한 양성대조군에서는 세포병변효과를 관찰할 수 있었으며, 아무것도 접종하지 않은 음성대조군에서는 세포병변효과가 나타나지 않았다 (도 8). 검체 또는 음성대조군용 시료를 접종한 검사 세포주에서 guinea-pig와 chicken 적혈구 혈구응집반응 또는 혈구흡착반응은 접종 후 14일 또는 28일 동안 어떠한 반응도 관찰되지 않았다. 양성대조군 시료를 접종한 검사 세포의 경우 guinea-pig에서는 혈구응집반응이 관찰되었고, chicken에서는 응집반응이 관찰되지 않았다. 혈구흡착반응은 guinea-pig와 chicken에서 모두 관찰되었다 (도 11, 도 14).

즉, 베타 디펜신3를 사용한 무혈청·무항생제 간엽줄기세포 배양액 내 외래성 바이러스 부정시험 결과, 줄기세포 배양액을 이용하여 28일간 관찰 결과 외래성 바이러스를 통한 세포병변 효과, 혈구응집현상, 혈구흡착현상을 관찰할 수 없었으며, 양성 대조군에서는 세포병변 효과를 관찰할 수 있었다 (표 3). 하기 표 3은 무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양액의 외래 바이러스 부정시험 결과를 나타낸 것이다.

실험예 6: 베타 디펜신3을 사용하여 획득한 간엽줄기세포의 무혈청·무항생제 배양액들의 인간 피부구성세포 증식 촉진 시험

0.1 mg/ml 농도의 베타 디펜신3 적용을 통해 성공적으로 개발된, 무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양 및 배양액 획득 기술을 통해 획득한 배양액을 사용하여, 인간 피부를 구성하는 각질형성세포 (keratinocyte)와 섬유아세포 (fibroblast) 세포주들에 대한 증식 촉진능을 시험하였다.

구체적으로는 LN2 tank에서 보관하고 있는 간엽줄기 세포 stock을 해동하여 세포 배양을 시작한다. 이를 위해 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Cetificated, Cat. No. 16000, GIBCO)와 antibiotics(Antibiotics-Antimycotic, Cat. No. 15240-062, GIBCO)가 함유된 DMEM(GIBCO) 배지를 사용하여 계대 배양을 3회 수행하면서 충분한 인간 간엽줄기세포를 배양하였다. 현미경을 통해 배양의 정도가 90% confluence에 도달한 시점에서, 0.1 mg/ml 베타 디펜신3를 함유하는 무혈청·무항생제 배지를 사용하여 3회 세척 후 동일한 배지로 5일간 추가 배양하였다. 배양후 획득된 배양배지는 6,000 rpm으로 원심분리하에 잔류 세포 혹은 세포 파편들을 제거하였으며, 상등액을 0.22 um의 필터로 여과하여 시료로 사용하였다.

획득된 배양액들의 세포 증식 촉진능을 시험하기 위하여, 24 well plate에 배양시킨 인간 각질형성세포주 HaCaT과 인간 섬유아세포주 CCD-986sk 세포들이 confluence 50 ~ 60%에 도달하였을 때, FBS를 함유하지 않는 DMEM으로 3회 세척한 후 무혈청·무항생제 줄기세포 배양액을 무처리, 0.5%, 1%, 2.5%, 5% 농도로 첨가하여 24시간 추가 배양하였다.

이후 MTT 용액(6.6mg/ml, 3-(4,5-dimethyl thiazol-2yl)-2,5 diphenyl-2H-tetrazolium bromide액)을 각 well에 50ul씩 넣고 3시간 추가 배양한다. 배양액을 제거한 다음 dimethylsulfoxide(DMSO, Amresco, 0231-500ML)를 200ul씩 넣고 10분간 흔들어 준 다음 100ul씩 96well에 취하여 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader로 540nm에서 흡광도를 측정한다. 세포 독성 정도는 시료가 포함되지 않은 일반 DMEM 배지를 처리한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

세포안정성(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도)x100

0.1 mg/ml 농도의 베타 디펜신3을 적용하여 획득된 무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양액에 대한 인간 피부 구성 세포주들인 HaCaT 세포와 CCD-986sk에 대한 증식 촉진능을 MTT 시험법으로 평가한 결과, 시험된 무혈청·무항생제 간엽줄기세포배양액의 적용 농도가 높을수록 두 세포주 모두에서 증식 촉진능이 있음을 확인할 수 있었다 (도 15).

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Claims (7)

1. 삭제
2. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 베타 디펜신 3 단백질로 처리된 포유동물의 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액을 함유하는 화장품 방부제 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 포유동물의 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액은 무혈청 및 무항생제 배지에서 간엽줄기세포를 배양한 배양액인 것을 특징으로 하는 화장품 방부제 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 포유동물 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액은 간엽줄기세포가 제거된 배양액인 것을 특징으로 하는 화장품 방부제 조성물.
   
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