TWI649095B - 以非人類幹細胞之培養上清液為起始材料之化妝品或皮膚再生促進劑、及蛋白質之離子導入法 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供一種化妝品，其目的為關於老年人口比率升高之現在，以預防隨著年齡增長而發生的皮膚損傷，亦即斑點或皺紋的發生等，且可保持皮膚健康的狀態，安全性高，無倫理面上的問題，並可提供充份量。
本發明係提供含有以非人哺乳類之骨髓或牙髓幹細胞培養上清液粉末為主要成份之化妝品。另外，提供藉由離子導入法導入前述化妝品之蛋白質之離子導入法。

Description

以非人類幹細胞之培養上清液為起始材料之化妝品或皮膚再生促進劑、及蛋白質之離子導入法
本發明係關於選自非人類骨髓幹細胞、骨髓幹細胞及脂肪幹細胞所成群中任一種幹細胞之培養上清液作為原料之化妝品等。
隨著年齡增長而斑點或皺紋增加是眾所皆知，但已知此也因於短波長紫外線(UVB)之曝露量隨著年齡增長而增加。接著，認為因為UVB使人類真皮中皮膚纖維母細胞(HDF)之膠原蛋白酶產生量增加，促進膠原蛋白分解，誘導改性彈性組織沈澱，其結果係皮膚表現皺紋或黃變。
化妝品係自古以來，以各種來自植物的成分作為原料所製造、所使用，但最近市售許多摻混胎盤、角鯊烷、膠原蛋白等之來自動物成份之化妝品，以防止因年紀增長而 皮膚的衰弱，例如皺紋或小皺紋的形成，改善保濕性等為目的。
另外，同樣的目的，亦開發含有細胞培養上清液之化妝品等，揭示培養人類肺之平滑肌細胞、上皮細胞、纖維母細胞等，以其細胞破碎物或培養上清液作為化妝品用組成物使用(參考特開2005-336188號公報，以下稱為先前技術1)。
另一方面，亦已知非如此之細胞培養上清液，使用得自人類骨髓或牙髓等之幹細胞作為神經疾病治療用醫藥組成物之方法(參考WO 02/086108號公報，以下稱為先前技術2)。
另外，揭示將人類脫落乳牙之牙髓幹細胞(stem cells from exfoliated deciduous teeth；SHED)之培養上清液，作為損傷部位之治療用組成物使用(參考國際公開WO 2011/118795號公報，以下稱為先前技術3)。
先前技術文獻 〔專利文獻〕
〔專利文獻1〕特開2005-336188
〔專利文獻2〕國際公開WO 02/086108號公報
〔專利文獻3〕國際公開WO 2011/118795號公報
先前技術1係揭示將白血病抑制因子(Lymphoma inhibition factor：LIF)、LIF類似體、或LIF模倣體(以下，統稱為「LIF等」。)，摻混於化妝品用組成物之技術。就先前技術1將含有LIF之培養上清液，添加於經冷凍保存之表皮細胞時，in vitro形成優質的表皮細胞上，其係優秀者。
然而，因為in vitro之實驗結果係並無所謂的直接反映於in vivo實驗之保證，所以有所謂的不能實際證明摻混於化妝品時的效果之問題。
另外，先前技術2係使用增殖能力比通常細胞高的幹細胞，就所謂可利用此等產生之身體因子之點上，其為優良技術。
然而，因為使用來自人類的幹細胞，所以抱有所謂的(a)隨著年齡增長，可採取的幹細胞數減少，(b)因為年齡增長所引起的基因突變累積，不一定能擔保移植幹細胞時之安全性，(c)因為骨髓幹細胞(BMSC)的數量、增殖能力及分化能力隨著年齡降低，所以即使為幹細胞，細胞增殖能力低，(d)藉由骨髓穿刺採取幹細胞係對生物體之侵襲度大，伴隨著危險之問題。另外，使用人類細胞，除了難以提供充份的幹細胞來源，於倫理面上亦有許多問題。
先前技術3就使用人類牙髓幹細胞之培養上清液，所以比使用細胞本身時安全性高之點上，其為優良技術。
然而，與先前技術2相同，雖說是稱為醫療廢棄物之脫落齒，因為使用人類細胞，有倫理面上的問題，另外， 有所謂的難以提供充份的幹細胞來源之問題。
另一方面，認為具有多功能性之幹細胞，可使分化成皮膚組織、骨組織、肌肉組織及其他各種組織。接著，老年人口比率變高的現在，隨著年齡增長而發生的皮膚損傷，亦即，有對於藉由預防斑點或皺紋的發生等，保持皮膚健康狀態之社會性要求。另外，不論年齡，亦有所謂的解決毛髮稀疏、掉髮等之毛髮相關的煩惱之社會性要求。
接著，有對於減輕或改善來自UVB的傷害之效果高的化妝品等之社會性要求。
本發明之發明者為解決如上述之課題，重複努力研究的結果，完成本發明者。
亦即，本發明之第1種型態係含有選自非人哺乳類之牙髓幹細胞、骨髓幹細胞及脂肪幹細胞所成群中任一種幹細胞之培養上清液粉末為主要成份之化妝品。在此，前述非人哺乳類之幹細胞係以由選自豬脫落乳牙牙髓、豬骨髓及豬脂肪組織所成群中任一種組織所得者為宜。另外，前述培養上清液粉末係以將選自前述豬脫落乳牙牙髓、豬骨髓及豬脂肪細胞所成群中任一種幹細胞之培養上清液，經酒精濃縮後，冷凍乾燥所得者為宜。
另外，前述培養上清液粉末係以含有選自血小板生長因子(PDGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、類胰島素生長因子(IGF)、角質細胞生長因子(KGF)、肝細胞 生長因子(HGF)、及轉型生長因子(TGF)所成群中至少1種以上之生長因子為宜。
進而，前述化妝品係以選自液劑、乳霜劑、軟膏劑、凝膠劑、乳液劑及硬膏劑所成群中任一種之劑型為宜。
另外，前述化妝品係以適用於包含頭皮之皮膚或毛髮者為宜。
本發明之第2種型態係收納於具備含溶解劑之第1區、及含選自豬脫落乳牙牙髓幹細胞培養上清液粉末、豬骨髓幹細胞培養上清液粉末及豬脂肪幹細胞培養上清液粉末所成群中任一種之上清液粉末及載體而成之有效成份組成物之第2區，以及使前述第1及第2區之隔牆貫通用之棒狀構件之容器之化妝品，於將要使用前，藉由前述棒狀構件，於前述第1及第2區之隔牆設有貫通孔，使前述有效成份組成物溶解於前述生理食鹽水為特徵之化妝品。前述溶解劑係以選自充電負離子之液體、生理食鹽水及磷酸緩衝生理食鹽水所成群中任一種之液體為宜。
另外，前述化妝品係適用於包含頭皮之皮膚或毛髮者為宜。
本發明之第3種型態係使薄片狀保濕性構件吸收前述之化妝品，放在欲使吸收的部位，使帶正帶之電極接觸皮膚所需部位，使帶負電之棒狀電極，於前述薄片上邊旋轉、邊移動為特徵之前述生長因子之離子導入法。
前述所需部位係選自手腕、手、手掌、腳、膝蓋內側、及足底所成群者。
本發明之第4種型態係含有選自非人哺乳類之牙髓幹細胞培養上清液粉末、骨髓幹細胞培養上清液粉末及脂肪幹細胞培養上清液粉末所成群中任一種之幹細胞之培養上清液粉末作為有效成份之皮膚再生促進劑。在此，前述之非人哺乳類之幹細胞係以由選自豬脫落乳牙牙髓、豬骨髓及豬脂肪組織所成群中任一種組織所得者為宜，前述之培養上清液粉末係以將選自前述之豬脫落乳牙牙髓幹細胞培養上清液、前述之骨髓幹細胞培養上清液及前述之脂肪幹細胞培養上清液所成群中任一種之培養上清液，經酒精濃縮後，冷凍乾燥所得者為宜。
另外，前述之培養上清液粉末係以含有選自血小板生長因子(PDGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、類胰島素生長因子(IGF)、角質細胞生長因子(KGF)、肝細胞生長因子(HGF)、及轉型生長因子(TGF)所成群中至少1種以上之生長因子為宜。
前述之皮膚再生促進劑係以選自液劑、乳霜劑、軟膏劑、凝膠劑、乳液劑及硬膏劑所成群中任一種之劑型為宜。
依據本發明，可提供比含有人類幹細胞或其培養上清液之化妝品更安全，並且具有優異的去除皺紋、美白等之效果，以及生髮、育髮等之效果之化妝品。
用以實施發明之最佳型態
以下係更詳細地說明本發明。
本發明之化妝品使用之豬牙髓幹細胞培養上清液粉末係可如下述操作而得。
首先，豬的顎係以使用剛宰殺後之食肉用豬的下顎及下顎齒為宜。在此，剛宰殺後者為宜係因為所得細胞的鮮度佳。並且，食肉用者為宜係因容易取得牙髓，不感染病毒或菌，安全性高及成本低。另外，就自下顎及下顎齒所得之幹細胞數量上，以出生後3個月~12個月的豬為宜，以出生後5個月~6個月的豬更好。
首先，將取得之剛宰殺後之食肉用豬的下顎齒及顎骨，以-40~-30℃冷藏運送，但可使用例如放入保冷劑之冰箱(-30℃)等。
接著，為將此下顎全體表面殺菌，例如使用聚烯吡酮碘(Isodine)等之消毒藥進行消毒。之後，例如使用牙科用之Diamond Point鑽石器械等，將牙冠以水平方向切斷，接著，沿著牙髓腔成垂直方向切削。藉由如此切斷，可順利地去除牙齒的外蓋。之後，自經如以上處理之牙冠及牙根部二者，使用例如牙科用手用結石刮(hand scalers)、牙科用手用根管銼等採取牙髓。
將所得的牙髓，例如使用眼科用穿刀等切斷，懸浮於含有所需的血清或抗生素之基本培養基。作為在此使用之培養基，可列舉添加1%(v/v)之5~20%(v/v)之牛血清、5×103~5×104U/ml之青黴素及5~50mg/ml之鏈黴素 之Dulbecco's Modified Eagle's培養基等。
接著，調製含所需濃度之膠原蛋白酶及中性蛋白酶(dispase)之酵素溶液，使用此將牙髓細胞單離。例如懸浮於含1~5mg/ml之膠原蛋白酶及中性蛋白酶之酵素溶液，於35~38℃的恆溫槽中，處理細胞30分鐘~1.5小時。
之後，進行離心操作(例如約1,500rpm(約1,000×g))2~5分鐘，以3分鐘為宜，回收以酵素處理所單離之牙髓細胞。此時，因為藉由無菌細胞過濾器(Cell Strainer)之細胞篩選，會使SHED或DPSC之神經幹細胞分離之回收效率降低，所以以不使用為宜。
另外，脂肪幹細胞係可如下述操作而得。因為細胞的鮮度高，另外容易取得，所以使用豬的腸間膜之脂肪組織。運送條件係與食肉用豬之下顎齒及顎骨時相同。首先，採取、收集剛宰殺後之食肉用豬的腸間膜之脂肪組織。接著，對所得之脂肪組織，去除其他組織，將細胞以手術刀或剪刀等切碎。
接著，懸浮於含有所需的血清或抗生素之基本培養基。在此使用的基本培養基係如前所述。接著，與調製牙髓幹細胞時同樣地如前所述，調製含所需濃度之膠原蛋白酶及中性蛋白酶之酵素溶液，使用此而得脂肪細胞。
接著，將所單離之牙髓細胞、骨髓細胞或脂肪細胞，使用所需培養基培養，得到培養上清液。例如，將所得之細胞再懸浮於2~8ml之前述基本培養基，接種於適當大 小的附著性細胞培養用培養皿。例如接種於直徑6cm之前述培養皿，添加培養液(例如含10%FCS之DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)後，於5%CO2之存在下，於調整成約35~38℃之培養箱中，培養約10天~20天程度。
去除培養基後，使用PBS等，洗淨細胞1~數次。取代以上的操作(去除培養基及洗淨細胞)，回收形成菌落的黏著性細胞亦可。此時，例如於含0.01~0.1%之胰蛋白酶及2mM之EDTA之溶液，以37℃處理5分鐘，自培養皿剝離細胞。藉由回收剝離的細胞，可得到附著性之幹細胞。
接著，培養篩選出的黏著性細胞。例如將細胞接種於與前述同樣的附著性細胞培養用培養皿，於相同的條件下培養，因應需要進行繼代。例如以肉眼觀察，達成半滿(subconfluent)(培養容器的底面約70%為附著的細胞所覆蓋的狀態)或全滿(confluent)時，進行與前述相同的處理，自培養容器剝離、回收細胞，再度接種於含適當量之新鮮相同組成之培養液之培養用容器。繼代培養係可重複進行至達到必要的細胞數。例如若進行繼代培養1~8次時，細胞數增加至約1×107個/ml。
進行如以上之培養後，回收細胞，例如於液態氮中保存亦可。
培養初期係至成為半滿，因應需要，例如以每週2~3次之頻率交換培養基。將成為半滿之培養三角錐瓶的上 清液，使用抽氣器(aspirator)等去除，使細胞接觸含0.01~0.1%(v/v)之胰蛋白酶之Hepes溶液，自三角錐瓶底面剝離。在此加入適量的新鮮培養基，懸浮剝離細胞，移至已滅菌之離心管。接著，以800~1,200×g(約1,500rpm)，於室溫下，離心2~5分鐘，以3分鐘為宜。例如調製含0.05%之胰蛋白酶之Hepes溶液，加入少量此溶液於已去除培養基之三角錐瓶，遍佈底面全體，細胞剝離時，加入約5~8ml之新鮮培養基，以約1,500rpm，室溫下離心分離3分鐘，可濃縮。每1ml之濃縮細胞溶液之濃度，藉由連續稀釋-瓊脂平板法(viable counting)求出，於加入10~40ml新鮮培養基之培養三角錐瓶，添加約10~40ml，進行繼代培養，得到豬脫落乳牙牙髓幹細胞(pSHED)、骨髓幹細胞或脂肪幹細胞。
另外，於豬下顎骨體部的下顎前齒部的舌側，例如使用牙科用鑽石器械等穿孔。於此孔中，例如插入裝有18G注射針之針筒等，吸出骨髓。所採取的骨髓係培養至成為如前述之半滿，自培養三角錐瓶的底面剝離，藉由離心分離，進行繼代培養，得到豬骨髓幹細胞(pBMSC)。
如上所得之幹細胞係來自間葉系之體性幹細胞之乳牙牙髓幹細胞、骨髓幹細胞或脂肪幹細胞。此等幹細胞之培養上清液中，因為分泌出血管內皮生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子(HGF)、類胰島素生長因子(IGF)、血小板生長因子(PDGF)、轉型生長因子β(TGF-β)-1及-3、TGF-α、KGF、HBEGF、SPARC及其他細胞激素， 所以以此等幹細胞為宜。
為得到本發明使用之幹細胞培養上清液所使用之幹細胞係由食用豬所得者，但因為細胞本身安全性高，無須自人類組織採取，所以有無因如此採取之侵襲的問題，及利用所得細胞時，亦無倫理的問題之大的優點。
另外，前述幹細胞之培養上清液(pSHED-CM)係含有選自前述VEGF、HGF、IGF、PDGF及TGF-β所成群之2個以上之組合，但就提高膠原蛋白之再形成能力之點上係適宜的。
另外，於前述幹細胞培養上清液，亦可添加1種以上已知之對應的細胞激素使用。
前述幹細胞上清液係以規定的條件培養前述幹細胞，之後，藉由離心分離等去除細胞而可得。對如此得到的培養上清液，進行例如離心、濃縮、溶劑取代、透析、冷凍乾燥、脫鹽及其他各種處理，亦可使用此等。例如使於乾冰-丙酮中冷凍後，使乾燥，可得到上述培養上清液之冷凍乾燥粉末。
幹細胞之培養液係可使用於基本培養基或於基本培養基添加血清等之培養基。作為基本培養基，除了前述之DMEM之外，可使用Iscove's modified Dulbecco's培養基(IMDM；GIBCO社等)、HamF12培養基(HamF12：SIGMA社、GIBCO社等)、RPMI1640培養基等。另外，亦可使用併用二種以上之基本培養基之混合培養基。作為混合培養基之一例，可列舉混合等量IMDM及HamF12之 培養基(例如市售之商品名：IMDM/HamF12(GIBCO社))。
另外，作為可添加於培養基之成份，可舉例如血清(牛胎兒血清、馬胎兒血清、人類血清、羊血清)、血清替代物(Knockout serum replacement(KSR)等)、牛血清白蛋白(BSA)、抗生素、各種維生素、各種礦物質。
另外，為得到不含血清之前述「幹細胞之培養上清液」係藉由幹細胞培養之全部過程，或最後或自最後的數次繼代培養時，使用無血清培養基為宜。前述幹細胞之培養係可直接適用通常所使用之條件進行。
本發明之化妝品所含之pSHED係其中含如前述之各種生長因子。因此，藉由塗佈於皮膚等，可使經皮吸收此等生長因子。作為可添加於本發明之化妝品之成份，可列舉透明質酸、膠原蛋白、纖維蛋白原(例如bolheal(註冊商標))及其他有機系生物體吸收性材料；透明質酸、膠原蛋白、纖維蛋白糊及其他之生物體親和性高之凝膠化材料。另外，亦可添加製劑學上所容許之其他成份(例如載體、賦形劑、崩散劑、緩衝劑、乳化劑、懸浮劑、無痛化劑、安定劑、保存劑、防腐劑、生理食鹽水等)。
在此使用之膠原蛋白係可溶性(酸可溶性膠原蛋白、鹼可溶性膠原蛋白、酵素可溶性膠原蛋白等)者，但就對本發明之化妝品之適合性上係適合的。
作為賦形劑，可使用例如乳糖、澱粉、山梨醇、D-甘露醇、白糖等，作為崩散劑，可使用羧甲基纖維素、碳酸 鈣等。作為緩衝劑，可使用磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽等，作為乳化劑，可使用阿拉伯膠、褐藻酸鈉、西黃蓍膠等。作為懸浮劑，可使用單硬脂酸甘油酯、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、月桂基硫酸鈉等。
作為安定劑，可使用丙二醇、抗壞血酸等，作為保存劑，可使用苯酚、氯化苯二甲羥銨、苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯等。作為防腐劑，可使用氯化苯二甲羥銨、對羥基苯甲酸、氯丁醇等。此等以外，亦可使含有pH調整劑等。
本發明之化妝品之最終型態並無特別限定，例如可為化妝水、乳液、潤膚液、凝膠、乳霜等。
另外，前述化妝品係以適用於包含頭皮之皮膚或毛髮者為宜。
前述化妝品之製造方法並無特別限定，例如使用豬下顎時，以如下操作所製造為宜。
首先，如前述操作，自所得之豬下顎得到牙髓幹細胞。取代豬下顎，使用脂肪組織，如前述操作，得到脂肪幹細胞。接著，例如使用無血清培養基，於前述條件下培養牙髓幹細胞，例如使用滴管(Spuit)或移液管(pipette)等，回收此等培養上清液。回收的培養上清液係可直接使用，或亦可進行離心、濃縮、透析、冷凍乾燥、稀釋及脫鹽等中至少一種以上的處理後使用。
另外，如後述實施例所示，所得之幹細胞培養上清 液，即使不進行高度精製的狀態，仍表示所需作用。此事意味著可簡便且迅速地製造使用於本發明化妝品之組成物，亦有所謂的可避免精製中可能發生之活性降低的優點。
如上述操作所得之培養上清液係首先測定蛋白質量，之後測定膠原蛋白之精製活性，求出比活性。因為藉由以比活性為指標，可保持一定的品質。
比活性低時，藉由旋轉分離柱(spin column)濃縮或乙醇沈澱而可濃縮。進行旋轉分離柱濃縮時，將可施加於該管柱之最大量之培養上清液，移至所需之旋轉分離柱，以3,000×g~5,000×g，離心約30~90分鐘。將所得之濃縮培養上清液與同量之無血清的溶劑，加入此管，藉由再度以3,000×g~5,000×g，離心約30~90分鐘，交換培養上清液之溶劑成無血清之溶劑。
例如使用Amicon Ultra Centrifugal Filter Units-10K(Millipore製)作為旋轉分離柱時，可負載的最大量為15ml。因此，若負載約15ml之培養上清液，於4℃，以4,000×g離心約60分鐘時，可濃縮至200μl。加入與濃縮至200μl之培養上清液同量之滅菌PBS，再次於4℃，以4,000×g離心約60分鐘，交換培養上清液之溶劑成PBS。回收所得之溶液於微試管，成為濃縮幹細胞培養上清液。最終所得的量成為約200μl時，濃縮度成為75倍。
另外，乙醇沈澱時，例如以下述步驟進行。首先，對某量之培養上清液，加入9倍容積之100%乙醇混合，於 約-10~30℃放置30~90分鐘。接著，於約4℃，以10,000×g~20,000×g，離心約10~20分鐘。去除上清液，加入1/5容積之90%乙醇，充份地攪拌。接著，於約4℃，以10,000×g~20,000×g，離心3~10分鐘。去除上清液，將所得之沈澱物，以所需量之滅菌水，例如溶解於500μl之滅菌水，回收於微試管，可得到濃縮幹細胞培養上清液。
例如，對5ml之培養上清液，加入45ml之100%乙醇，充份地混合，於-20℃靜置60分鐘。接著，於4℃，以15,000×g離心15分鐘，去除上清液。之後加入10ml之90%乙醇，充份地攪拌。再次地於4℃，以15,000×g離心5分鐘，去除上清液。使所得之沈澱物懸浮於500μl之滅菌水，回收於微試管，成為濃縮幹細胞培養上清液。此時，最初使用的培養上清液為5ml時，濃縮度成為10倍。
另外，本發明之化妝品使用之幹細胞之培養上清液，亦可如下操作而成為冷凍乾燥品。首先，將如前述操作所得之幹細胞培養上清液或濃縮幹細胞培養上清液，放入各一定量於約50~150ml之容量之容器，樣品試管加蓋，以約-100℃~約-60℃，以2小時至半天冷凍。此等上清液冷凍後，打開樣品試管蓋子，安裝於冷凍乾燥機。接著，進行冷凍乾燥1~2天，所得之樣品為冷凍乾燥幹細胞培養上清液。此冷凍乾燥幹細胞上清液係可以約-100℃~約-60℃保存。
例如於8支50ml容量之樣品瓶(Vial)(附橡膠塞)，放入約20ml之培養上清液，蓋上橡膠栓，以約-30℃，使冷凍數小時。接著，打開此樣品瓶瓶蓋，安裝於冷凍乾燥機(Yamato科學(股)製，DC41A)。接著，進行冷凍乾燥直至樣品乾燥，可得到冷凍乾燥培養上清液。
藉由以上操作，可得到具有良好保存安定性之培養上清液之冷凍乾燥品。
將前述化妝品，藉由離子導入法，自皮膚導入時，使薄片狀保濕性構件吸收前述化妝品，覆蓋於使吸收之部位，使所需部位接觸帶正電之電極，使帶負電之棒狀電極，於前述薄片上，邊旋轉、邊移動。
在此，前述所需部份並無特別限定，但選自例如手腕、手、手掌、腳、膝蓋內側及足底所成群者係因為可使安定地接觸帶正電之電極，所以適宜。
作為前述薄片狀之保濕構件，可使用不織布所製作之市售之面膜用薄片、紗布、棉花等。前述化妝品為液狀或乳液狀時，含浸前述薄片狀保濕構件使用即可。另外，前述化妝品係乳霜或凝膠時，可塗佈於皮膚，其上放置如此之保濕構件即可。
以下係舉前述化妝品為化妝水時為例，進行說明。
首先，使前述之培養上清液粉末，溶解於適當量的生理食鹽水等而成粉末溶解液，將此含浸至自保濕構件滴落之程度。接著，使此保濕構件覆蓋所需部位，例如整個臉部，使一部份身體接觸帶正電之電極。例如以單側的手握 住帶正電的電極。
接著，放置帶負電之滾輪於保濕構件上，緩緩地於保濕構件上滾動。此時，不需特別施力。因為前述之粉末溶解液中所含的生長因子中任一種皆帶負電，所以與滾輪的負荷電相斥，向帶正電之電極側移動。藉由此移動，生長因子自皮膚吸收。
另外，前述化妝品雖可將前述溶解液保存於塑膠製或玻璃製瓶子、塑膠製或玻璃製之附滴管的瓶子、附細排出口之塑膠製容器等之各種容器，但為頭皮用或毛髮用之化妝品時，使用附細排出口之塑膠製容器，使附著於頭皮係適合的。
使前述化妝品附著於頭皮及毛髮，使無疏漏地遍布整個頭皮後，與前述同樣地操作，進行離子導入。之後，使用塑膠製薄膜，例如聚乙烯薄膜等包住整個頭髮，進行護髮。
前述中任一種情況，若將發生蒸氣的裝置，放置自頭部規定的距離，噴霧蒸氣時，導入效率高。
以下係說明關於本發明之實施例，但並非局限於此者。另外，實施例中之%為重量(質量)基準，除非特別例外。
另外，此發明並不受前述發明之實施型態及實施例之說明任何限制者。不超出專利申請範圍之記載，該業者可容易想到之範圍之各種改變型態亦包含於此發明。以下係使用實施例，更詳細地說明本發明。
〔圖1〕圖1係模型式表示對紫外線照射所引起之皮膚老化(光所引起之皮膚年齡增加)，豬幹細胞培養上清液之皮膚再生效果圖。
〔圖2〕圖2係表示於豬骨髓幹細胞(pBMSC)、豬牙髓幹細胞(pDPSC)及豬脫落乳牙牙髓幹細胞(pSHED)，加入溴脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)時，加入BrdU之細胞比率圖。圖2中，*係表示p<0.05。
〔圖3〕圖3係表示對光所引起皮膚老化之豬生長因子(pGF)之效果之顯微鏡照片。由圖3(A)係表示未投與pGF之對照皮膚，以及圖3(B)係投與pGF時之皮膚，形成如後述之複製片，以顯微鏡觀察各複製片時之影像之顯微鏡照片。
〔圖4〕圖4係表示未投與幹細胞培養上清液之對照組、豬脫落乳牙牙髓幹細胞培養上清液投與組(pSHED-CM)及豬牙髓幹細胞投與組(pSHED)之皮膚之光老化狀態圖。
〔圖5〕圖5係表示圖4所示之各組小鼠之皮膚狀態之組織染色影像。圖中，分別表示，上側之箭號係表皮，下側箭號係真皮。
〔圖6〕圖6係表示未照射UV之皮膚細胞(陰性對照)、照射UV之皮膚細胞(UVS，經光老化之皮膚細胞)及光老化後投與豬生長因子之皮膚細胞(PGF)圖。 圖6中，**係表示p<0.01。
〔圖7〕圖7係表示培養豬骨髓幹細胞(pBMSC)及豬牙髓幹細胞(pSHED)之第3天及第7天之細胞狀態之顯微鏡照片。
〔圖8〕圖8係表示試驗開始前後之斑點狀態之照片。圖8(A)係表示試驗開始前，圖8(B)係表示試驗結束後(6個月後)之斑點狀態。
〔圖9〕圖9係表示試驗開始前後之額頭皺紋狀態之照片。圖9(A)係表示試驗開始前，圖9(B)係表示結束後(12個月後)之皺紋狀態。
〔圖10〕圖10係表示由試驗開始前後之皮膚，與圖3同樣地製作複製片之觀察影像之顯微鏡照片圖。圖10(A)係表示試驗開始前，圖10(B)係表示試驗結束後之狀態。
〔圖11〕圖11係表示試驗開始前之毛髮狀態之照片。
〔圖12〕圖12係表示試驗開始14天後之毛髮狀態之照片。
〔圖13〕圖13係表示試驗開始前之頭皮狀態之照片。
〔圖14〕圖14係表示試驗開始3天後之頭皮狀態之照片。
〔圖15〕圖15係表示試驗開始5天後之頭皮狀態之照片。
〔圖16〕圖16係表示試驗開始7天後之頭皮狀態之照片。
實施例1
來自豬SHED/BM/脂肪組織之生長因子之製造及品質評估
<材料及方法> (1)細胞之分取及培養
自食用肉公社(日本愛知縣名古屋市港區)，取得出生後5~6個月豬顎骨(有下顎齒之下顎骨)及腸間膜。剛宰殺後之食肉用豬下顎齒、顎骨及腸間膜係以放入保冷劑之冰箱(-30℃)運送。
自前述豬的牙齒及下顎骨，依據以下步驟，得到豬的牙髓幹細胞(SHED)。
將運送的豬的牙齒及下顎骨，以聚烯吡酮碘(Isodine)消毒，之後，使用牙科用之Diamond Point鑽石器械等，將附著於下顎骨之下顎齒之牙冠以水平方向切斷，接著，沿著牙髓腔成垂直方向切削，去除牙齒的外蓋。由經如此處理之牙冠及牙根部，使用牙科用手用結石刮(hand scalers)採取牙髓。
將所得的牙髓，例如使用眼科用穿刀等切斷，懸浮於含2mg/ml之膠原蛋白酶溶液。將此懸浮液，放置於37℃ 之恆溫槽中1小時，單離細胞。將單離的細胞，於含10%FBS及1%Anti-Anti(Invitrogen,Carlsbad,CA)之Dulbecco'sModified Eagle's培養基(DMEM；SIGMA,St.Louis,MO)中，於37℃，5%CO2之條件下，為得到繼代用的細胞，進行預備培養。
首先，培養初期係以每週2~3次之頻率交換培養基，培養至成為半滿。將成為半滿之細胞，使用含0.05%之胰蛋白酶之Hepes溶液，使剝離，以1,500rpm，室溫下離心分離3分鐘，進行收集。將所得之細胞移至新鮮的培養基，於與前述相同之條件下，使用全量，進行繼代培養。
豬骨髓(BM)係得自豬之下顎骨之下顎骨體部皮質骨。首先，將前述之下顎前齒部舌側，以牙科用鑽石器械等穿孔，於此孔中，插入裝有18G注射針之5ml針筒等，吸出骨髓，進行採取。將採取的骨髓，移至含有10%之牛血清、100U/ml之青黴素及100μg/ml之鏈黴素之DMEM中，與前述相同的條件下進行預備培養，接著，於前述DMEM中，37℃，5%CO2之條件下培養至半滿。前述之添加量係全部以最終濃度表示。
與豬SHED同樣地使用前述之0.05%胰蛋白酶溶液，進行剝離，以1,500rpm，離心分離3分鐘，進行繼代培養。
自豬腸間膜，以解剖用剪刀及穿刀切下、收集脂肪組織，去除多餘的組織，於生理食鹽水中洗去血液。除此之 外，與前述同樣地操作，單離脂肪細胞而得脂肪幹細胞。
(2)細胞之增殖狀況分析
依據BrdU染色試劑組(Invitrogen,Carlsbad,CA)所附加的操作說明書，將溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)，如上述操作，加入所得之SHED或BM，評估各細胞於12小時之增殖速度。對於各組一個樣品，準備3片投影片，使用此等進行評估。重複此實驗5次。一元配置分散分析後，藉由Tukey-Kramer test進行有意差檢定。
為進行STRO-1之免疫螢光染色，將豬SHED或豬BM，以3%之三聚甲醛(Paraformaldehyde)固定。之後，以磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)沖洗2次，以100mM之甘胺酸溶液處理20分鐘。接著，以0.2%之Triton-X(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)溶液，將此等細胞於室溫下，滲透處理30分鐘。之後，加入含5%之驢子血清及0.5%之牛血清白蛋白之PBS，於此溶液中，於37℃下培養20分鐘。
接著，混合一次抗體之小鼠抗人STRO-1抗體(任一種皆為R&D,Minneapolis,MN)與細胞成1：100之比率，於PBS中，室溫培養1小時。接著，藉由吸引去除PBS，將混合二次抗體之山羊抗小鼠免疫球蛋白M-FITC抗體(Southern Biotech,Birmingham,AL)與此等細胞成1：500，於37℃下培養30分鐘。之後，使用封片液(VECTASHIELD)及DAPI(Vector Laboratories Inc,Burlingame,CA)固定。
(3)動物實驗(參考圖1)
5週齡的雌性無毛小鼠(Hos；HR-1)係由SLC社(SLC Inc.，日本，靜岡)所提供。將全部小鼠，於控制溫度及濕度之條件(22±1℃，濕度50%)下，放置於12小時明暗循環。此等動物係使自由攝取水及固體飼料，放射線曝露中，各動物可於籠子中自由移動。觀察係每日進行。使用UVB放射裝置RMX-3W(Handok Biotech,Seoul,Korea)，對小鼠背部，每1週5次，自燈至動物背部之距離為89cm，照射10週。此照射係以10個SE燈(東芝社製)成列組成，無UVB用濾器處理而進行。照射放射線的波長波峰係312nm附近。另外，照射量係使具有290~320nm之波長之放射線之照射量，成為相當於UVB總量之55%的量。
照射線量係最初的2週為1MED(最小紅斑量；60mJ/cm2)，第3週係2MED(120mJ/cm2)，第4週為3MED(180mJ/cm2)，第5~8週為4MED(240mJ/cm2)。全部UVB線量約為115MED(6.9J/cm2)，誘導皺紋形成。
誘導皺紋後5週，於小鼠背部限定的區域，皮下注射pSHED-CM(100%)。作為陽性對照係將懸浮於PBS之豬SHED(4×105)直接注射於真皮，作為陰性對照係僅直接皮下注射PBS。
(4)調製豬SH-CM
將豬SHED(4×105細胞)，於DMEM/F12 (Invitrogen-Gibco-BRL,Grand Island,NY)無血清培養基中，於37℃，5%CO2之條件下培養。培養72小時後，回收豬SHED之培養上清液，於室溫下，以300×g離心5分鐘，使用孔徑為0.22μm之管柱用濾器(Millipore社製)過濾。
(5)皮膚複製片及影像解析
誘導皺紋時及進行前述注射1週後，使用矽氧烷系印模材料(Flextime 1；Heraeus Kulzer,New York,NY)，取得背部之皮膚表面之負型複製片。為自相同的皮膚區域得到皺紋複製片，以油性筆在皮膚上作記號。
最後注射豬SH-CM及豬SHED於皮膚5週後，自作記號的區域取下印模。為使容易測定，全部複製片切成1cm正方，使用相同印模材料，將各複製片的內面加工成平坦表面。以208°的角度受光，使用CCD相機，自複製片取得影像。
使用皺紋解析裝置皮膚粗糙度分析儀(skin visiometer)SV 600(Courage & Khazaka,Cologne,Germany)觀察負型複製片之影像。評估皮膚皺紋使用的參數係每單位面積之皺紋數、深度及皺紋面積。
(6)組織學的解析
將背部皮膚(1cm×1cm)，以含有10%(v/v)之含甲醛水之中性緩衝溶液固定。接著，包埋於聚酯蠟中，製作6mm的切片。切片經蘇木精&伊紅(H&E)染色，進行梅生三色染色(Masson's trichrome staining)。
首先，進行蘇木精&伊紅染色(以下簡稱「H&E染色」)。以二甲苯3槽，進行脫鏈烷烴處理。以純乙醇4槽，進行脫水，以流水洗淨3分鐘。接著，浸漬於Mayer Hematoxylin液5分鐘，將核染色，以約45℃的流水，水洗3分鐘。
接著，浸漬於伊紅液5分鐘，之後，以純乙醇4槽，進行組織脫水，以二甲苯處理4次，軟固定，進行清徹密封處理。
接著，進行梅生三色染色。與蘇木精&伊紅染色同樣地進行切片的脫鏈烷烴後水洗。使用10%之三氯乙酸(和光純藥工業(股)，特級)水溶液與10%之重鉻酸鉀(和光純藥工業(股)，特級)水溶液之等量混合液，進行第1媒染(mordanting)。接著，水洗3分鐘，以蒸餾水洗淨1分鐘。
使用含1.0g之蘇木精(MERCK社製造)之100ml之95%乙醇(A液)及2g之氯化鐵、1ml的鹽酸及95ml的蒸餾水之B液(任一種皆為和光純藥工業(股)，特級)時，混合作為Weigert氏鐵蘇木精溶液，於其中浸漬10分鐘。接著，水洗10分鐘。
將2.5%之磷鎢酸溶液(Phosphotungstic Acid)(和光純藥工業(股)，特級)水溶液與2.5%之磷鉬酸溶液(phosphomolybdic acid)(和光純藥工業(股)，特級)水溶液，等量混合，浸漬於此溶液中1分鐘，進行第2次媒染。接著，於0.75%之orange G(和光純藥工業 (股)，1級)液，浸漬2分鐘。以1%醋酸水進行2槽處理。
接著，以2容積之以1%比率溶解二甲苯胺．麗春紅(CHROMA社製造)於1%醋酸水之溶液，以及1容積之以1%比率溶解酸性品紅(acid fuchsine)(和光純藥工業(股)，化學用)於1%醋酸水之溶液之比率混合，調製二甲苯胺．麗春紅．品紅液，於此溶液浸漬20分鐘。以1%之醋酸水進行2槽處理。
接著，浸漬於2.5%之磷鎢酸溶液7分鐘，以1%之醋酸水進行2槽處理。接著，以苯胺藍進行中間染色，以1%之醋酸水溶液進行2槽處理，1枚1枚地浸漬於異丙醇，與蘇木精&伊紅染色同樣地進行清徹密封處理。
(7)人類真皮中之皮膚纖維母細胞(HDF)之培養及UVB照射線量
添加10%之牛胎兒血清、100U/ml之青黴素及100mg/ml之鏈黴素之DMEM中，於5%CO2，37℃之條件下，培養HDF。無血清培養基中培養24小時後，以PBS洗淨培養燒瓶中之細胞，與3~4滴的PBS一同曝露於UVB，成50~250mJ/cm2之範圍。UVB照射係使用前述之UV光源(Waldmann,Schwenningen,Germany)進行。照射後立刻吸引去除PBS，取代成完全培養基。UVB照射線量係最終後續的實驗用，固定於70mJ/cm2。
(8)細胞增殖分析
於96孔盤之各孔中，接種5×103細胞/孔之HDF， 使用CCK-8試劑組(Dojindo,Gaithersburg,MD)，測定HDF之增殖速度。以無血清培養基培養24小時後，與豬SH-CM一同或無豬SH-CM，連續培養HDF24小時，接著，曝露於UVB(70mJ/cm2)90秒。
接著，將UVB照射細胞於完全培養基中培養24小時後回收。將HDF-F放入10ml之CCK-8溶液，培養3小時。使用微量盤分析儀(TECAN,Grodig,Austria)，測定450nm之吸收。
基於使用對照組而製成之標準曲線，自各孔之OD值求出細胞數。
(9)西方點墨(Western blot)解析
接種HDF(2×104細胞/孔)於24孔盤，如前述進行前處理。接著，於RIPA緩衝溶液(含0.15M之NaCl、1mM之EDTA、1%之Triton X-100、1%之SDS、50mM之NaF、1mM之Na3VO4、5mM之二硫蘇糖醇、1mg/ml之亮抑酶肽(Leupeptin)及20mg/ml之PMSF之50mM之Tris-HCl(pH7.4))中，使細胞溶解。使用雙縮尿試劑(biuret reagent)測定此細胞溶解液之蛋白質量，將50μg之蛋白質，供予8%SDS-聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。SDS-PAGE結束後，轉錄凝膠電泳之泳動模式於PVDF膜。
將此膜，與對I型膠原蛋白之抗體(Santa Cruz,Saint Louis,MO)、對基質金屬蛋白酶-1(MMP-1,Matrix Metalloproteinase-1)之抗體(Calbiochem,Darmstadt, Germany)一同於室溫培養15分鐘。接著，將此PVDF膜，使用PBS洗淨，辣根過氧化氫酵素軛合物抗山羊IgG抗體(1：100,000,Santa Cruz,Saint Louis,MO)一同於室溫培養15分鐘。之後，免疫球蛋白西方點墨試劑進行點墨，重疊X光薄膜，使感光。
<結果> (1)pSHED及pBMSC之特徵解析
pSHED及pDPSC係表示與pBMSC相同的纖維母細胞之形態。由免疫螢光解析，表示pSHED及pBMSC係含STRO-1陽性細胞。另外，pSHED之增殖速度係比pBMSC有意義地快(參考圖2)。
(2)藉由豬SHED-CM減輕UV所誘發的皺紋
UV曝露期間中，觀察小鼠皮膚細微皺紋。處理中，pSHED-CM處理組及pSHED注射組係比僅注射PBS之PBS投與組，觀察到皺紋少(參考圖3(A)及3(B)，對各組n=8)。
圖3(A)及圖3(B)顯示藉由反覆投與pSHED-CM而減輕(圖中，pSHED-CM之反覆投與組係表示為「pGF」。)。pSHED注射組亦顯示與pSHED-CM組相同的趨勢。
如圖4所示，以皮膚粗糙度分析儀SV 600測定複製片之皺紋參數時，注射天然級之pSHED-CM(100%)時，皺紋的全部參數有意義地降低。另外，pSHED處理 係比藉由pSHED-CM處理，顯示更高的有效性。
(3)組織學的觀察
UVB照射無毛小鼠，因為於皮膚附屬器發現大的變化，所以調查pSHED-CM對於UVB照射無毛小鼠之真皮厚度的影響。
圖5係表示藉由蘇木精-伊紅染色(H&E染色)之裸鼠皮膚之真皮厚度之組織染色結果。如圖5(A)~(C)所示之膠原蛋白纖維的量係(圖中之上下箭頭所包夾的部份)，pSHED-CM處理組(圖5(B))與pSHED注入組(圖5(C))相對於對照組，有意義地變多。
另外，由測定真皮厚度，對於pSHED注入組及pSHED-CM處理組，顯示真皮厚度有意義地增加(圖5(B))。另外，於上述兩組觀察到膠原纖維束明顯增加，但於對照組未觀察到(圖5(A))。
(4)藉由pSHED-CM促進HDF增殖
為調查關於藉由豬SHED改善皮膚皺紋之副分泌機制，與pSHED-CM一同，以與上述相同條件，使用一次培養之HDF，進行細胞增殖分析。如圖6所示，有意義地降低因UVB照射所引起之HDF增殖(圖6中，表示為「UVS」)，若藉由豬SHED-CM進行前處理時，增殖之降低幅度減少(圖6中，表示為「pGF」。)，顯示pSHED-CM對HDF具有保護效果。
因為前述pSHED-CM含多種生長因子，所以藉由前述豬SHED-CM促進增殖時，顯示藉由分泌自pSHED之 生長因子者。
因為前述豬SH-CM係含多種生長因子，所以藉由前述豬SHED-CM促進增殖時，顯示藉由分泌自豬SHED之生長因子者。
(5)I型膠原蛋白及MMP1之表現
前述經豬SHED-CM處理之裸鼠，真皮中之膠原蛋白含量有意義地增加。因此，調查前述pSHED-CM處理後之HDF中I型膠原蛋白及MMP1之蛋白質表現。藉由UVB照射，明顯地I型膠原蛋白表現量降低，MMP1之表現被誘導而增加。
另外，I型膠原蛋白表現量雖於pSHED-CM前處理後有意義地增加，相對地MMP1之表現量於pSHED-CM前處理後降低。由以上顯示，進行pSHED-CM處理之裸鼠之真皮所見到的膠原蛋白含量增加係真皮纖維母細胞中膠原蛋白合成受到刺激及膠原蛋白分解受到抑制而產生。
實施例2
來自豬SHED/BMSC/脂肪幹細胞之生長因子混合物之製造及品質評估
(1)生長因子混合物(粉末)之調製
使用前述之豬SHED、豬BMSC或豬脂肪幹細胞於調製豬生長因子(pGF)混合物。使用含10%FCS之DMEM，將豬SHED、豬BMSC或豬脂肪幹細胞，繼代培養2~8代，培養皿中之細胞成80%全滿之階段，採樣10ml之上清液 (培養基：CM)，加入9倍容量之乙醇，作成乙醇稀釋CM。將此乙醇稀釋CM，以-20℃培養60分鐘後，放入50ml容量之旋轉分離柱，於4℃下，以15,000rpm離心15分鐘，得到沈澱物。將此沈澱物，以90%乙醇於-20℃洗淨，再次以旋轉分離柱，同樣地離心處理。
如前述操作，將濃縮的沈澱物冷凍乾燥，得到含生長因子之粉末。
(2)粉末中之生長因子
將粉末中所含之各生長因子，以前述之西方點墨分析法解析。所檢測出的生長因子為PDGF、VEGF、IGF、KGF、HGF及TGF。
(3)品質評估
細胞培養時，加入豬培養幹細胞或豬骨髓幹細胞之培養上清液的結果如圖7(A)~(D)所示。任一種皆觀察到增殖速度比不加此等時還快。
實施例3
來自非人類之牙髓幹細胞之培養上清液對皮膚之效果
(1)調製來自非人類之牙髓幹細胞培養上清液
自實施例2所得之來自非人類(豬)之牙髓幹細胞培養上清液，採取1ml，冷凍乾燥而得到粉末。
將此冷凍乾燥粉末，使溶解於30ml之生理食鹽水，放入噴洗瓶，作為皮膚用樣品1，檢討對皮膚之效果。
(2)對皮膚試驗之條件等
對皮膚之試驗係以下述步驟進行。首先，確認試驗者之皮膚狀態，對於試驗者本身是否認識現在是何種狀態，進行諮詢。接著，以照相機拍攝試驗開始前之整個臉部的狀態(參考圖8(A))，以顯微鏡(200倍)拍攝皮膚的狀態(參考圖10(A))。
接著，使樣品1的總量含漬於面膜用不織布1(富士紙化學(股)製，面膜)。覆蓋此不織布於試驗者的臉上，以實施時間20分/次，實施次數1~2次/週，0.2~1mA之條件，進行離子導入。
離子導入中，使整個臉可接觸蒸氣，將蒸氣機(TAKARA BELMONT(股)製，Noage)放置於距離臉部30~50cm的位置。之後，自臉部卸下面膜，以乳霜等調理肌膚，進行最後階段。試驗者係女性7名，年齡為20代~70代，平均41歲。
(3)效果
進行離子導入14次之結果作為試驗後，與試驗開始前同樣地以顯微鏡確認皮膚的狀態。比較試驗前後之皮膚狀態時，試驗者肌膚顏色與試驗開始前比較，整體上變白了。另外，斑點變淡(圖8(A)及8(B))並且皺紋(圖9(A)及9(B))亦變淺。
以顯微鏡觀察皮膚的狀態時，認為有明顯的變化，皺紋的部份凹處變少(圖10(A)及10(B))。
藉由使用含豬牙髓幹細胞培養上清液之化妝品，顯示具有使皺紋變淺的效果及肌膚顏色變白的效果。
實施例4 生髮及育髮效果之檢討 (1)調製來自非人類之脂肪幹細胞培養上清液
自實施例2所得之來自非人類(豬)之脂肪幹細胞培養上清液，採取1ml，冷凍乾燥而得到粉末。
將此冷凍乾燥粉末，使溶解於30ml之生理食鹽水，作為生髮及育髮試驗用之樣品2，放入噴洗瓶。
(2)生髮及育髮試驗之條件等
生髮及育髮用試驗係以下述步驟進行。首先，確認試驗者之頭髮及頭皮之狀態，對於試驗者本身是否認識現在是何種狀態，進行諮詢。接著，以相機拍攝試驗開始前之頭髮狀態，另外，以顯微鏡(20~200倍)拍攝頭皮的狀態。圖13~16係以200倍拍攝者。
接著，取適量的清潔凝膠(National total product(股)製，Pleasure cleansing gel)於手心，將此塗佈於頭皮，進行頭皮的按摩，使毛孔周圍及毛孔堵塞的污垢浮出。接著，使用市售之洗髮精(Cosmenist(股)製，Pleasure C洗髮精)，去除浮出的污垢。污垢多時，進行洗髮2次。
之後，使噴洗瓶口接觸頭皮，使如前述調整的樣品2附著於頭皮。另外，亦使附著於毛髮。
實施時間係15分/次，實施次數為週1~2次，0.2~1mA，進行離子導入。接著，以聚乙烯薄膜包裹頭皮及毛髮全體，自其上方再捲上毛巾如頭巾，進行10~20分 鐘護髮。之後，卸下毛巾及聚乙烯薄膜，以毛巾擦乾或吹風機進行最後階段。試驗者8位的明細係男性6位，女性2位(年齡：30~50代，平均為38歲)。
如前述進行離子導入後，試驗者本身於洗髮後清潔的頭皮，使用樣品1或2。容器口的部份靠近頭皮，使直接附著，之後，以手揉搓頭皮，進行頭皮按摩2~3分鐘。另外，使附著於頭髮。
(3)生髮及育髮效果
男性試驗者之毛髮於試驗前後如何變化如圖11~18所示。
圖11係表示試驗開始時頭髮的狀態。另外，試驗開始第7天的頭髮狀態如圖16所示。圖11與12相對比，即使目測亦明顯地確認頭髮增加。
試驗開始後之頭皮變化係如圖13(實驗開始前)、圖14(實驗開始第3天)、圖15(第5天)及圖16(第7天)。此觀察結果，確認試驗開始第3天生髮(參考圖14之箭號)，第7天，自一個毛孔長出複數根毛髮(參考圖16之箭號)。
8位試驗者全部觀察到生髮及育髮效果。具體上，即使是有白髮的試驗者時，新長出的毛髮並非白髮而是黑髮。並且，對任何一位試驗者，因為毛髮生長速度快，毛髮本身亦粗，所以頭頂部的毛髮量變多。
試驗者中，最快指尖感到生髮的時期是試驗開始的隔天(第1天)。
由以上確認藉由使用含豬脂肪幹細胞培養上清液之化妝品，明顯地表現生髮及育髮的效果。
實施例5
含有來自pSHED/pBMSC之生長因子之化妝品之製造例如以下所示。
產業上利用性
本發明係適用於化妝品領域。

Claims (8)

  1. 一種化妝品，其特徵係以含有培養由出生後3個月~12個月的豬脫落乳牙牙髓所得到之牙髓幹細胞而獲得的選自血小板生長因子(PDGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、類胰島素生長因子(IGF)、角質細胞生長因子(KGF)、肝細胞生長因子(HGF)、及轉型生長因子(TGF)所成群中至少2種以上之生長因子之培養上清液粉末為主要成份，其適用在包含頭皮的皮膚或毛髮。
  2. 如申請專利範圍第1項之化妝品，其中前述之培養上清液粉末係將前述豬脫落乳牙牙髓幹細胞培養上清液，經酒精濃縮後，冷凍乾燥所得者。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之化妝品，其係選自液劑、乳霜劑、軟膏劑、凝膠劑、乳液劑及硬膏劑所成群中任一種之劑型。
  4. 一種如申請專利範圍第1項記載之生長因子之離子導入法，其特徵係使薄片狀保濕性構件吸收如申請專利範圍第1項或第3項之化妝品，放在欲使吸收的部位，使帶正電之電極接觸與放置前述薄片狀保濕性構件的部位相異的所需部位，使帶負電之棒狀電極，於前述薄片上邊旋轉、邊移動。
  5. 如申請專利範圍第4項之生長因子之離子導入法，其中，前述所需部位係選自手腕、手、手掌、腳、膝蓋內側、及足底所成群者。
  6. 一種皮膚再生促進劑，其特徵係以含有培養由出生後3個月~12個月的豬脫落乳牙之牙髓幹細胞而獲得的選自血小板生長因子(PDGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、類胰島素生長因子(IGF)、角質細胞生長因子(KGF)、肝細胞生長因子(HGF)、及轉型生長因子(TGF)所成群中至少2種以上之生長因子之培養上清液粉末作為有效成份。
  7. 如申請專利範圍第6項之皮膚再生促進劑，其中前述之培養上清液粉末為將前述之豬脫落乳牙牙髓幹細胞培養上清液經酒精濃縮後，冷凍乾燥所得者。
  8. 如申請專利範圍第6項或第7項之皮膚再生促進劑，其係選自乳霜劑、軟膏劑、凝膠劑、乳液劑及硬膏劑所成群中任一種之劑型。
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