CN107823631A - 一种组合物及其制备方法与在制备治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用 - Google Patents

一种组合物及其制备方法与在制备治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种组合物及其制备方法与在制备治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用。本发明提供的组合物由静脉内皮细胞生长因子和富血小板血浆组成，两种组分相互配合，共同对糖尿病足溃疡模型动物的溃疡起到了良好的治疗作用，其有效率可达95％。而试验表明，单独采用静脉内皮细胞生长因子或PRP，在相同剂量下，效果不及组合物，其中单独给予静脉内皮细胞生长因子的对照组有效率为30％，而单独给予PRP的对照组有效率为60％。该结果表明，本发明提供的组合物中两组分产生了良好的增效协同作用。

Description

一种组合物及其制备方法与在制备治疗糖尿病足溃疡的药物 中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种组合物及其制备方法与在制备治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用。
背景技术
随着社会进步和人们生活、饮食方式的转变，糖尿病发病率逐年增高。中国近期一项流行病学研究结果表明，中国的糖尿病患病率已达9.7％，高于世界平均水平6.4％。糖尿病患者因周围神经病变与外周血管疾病合并过高的机械压力，可引起足部软组织及骨关节系统的破坏与畸形形成，进而引发一系列足部问题，从轻度的神经症状到严重的溃疡、感染、血管疾病、Charcot关节病和神经病变性骨折。如果积极治疗不能充分解决下肢出现的症状和并发症，则会造成灾难性的后果。糖尿病足是糖尿病最严重的并发症和非外伤性截肢的主要原因。随着我国人口老龄化的发展，糖尿病足发病率逐年增高，处理不当有可能会截肢或死亡，而85％截肢起因于溃疡。糖尿病足溃疡的发生使糖尿病患者生活质量降低，住院时间延长，给社会和家庭带来了巨大的经济负担，因此，在糖尿病患者中开展对足部问题的早期预防和治疗将有重要的意义。
目前，随着技术的发展和人们对糖尿病足溃疡认识的增加，越来越多的方法应用于临床。目前临床上一般采用药物、血管搭桥、介入手术、超声消融等方法治疗糖尿病足，但是均具有一定的局限性，难以取得令人满意的疗效，因此迫切需要寻求新的治疗方法。
人脐静脉内皮细胞是来源于人脐带静脉、具有干细胞潜能的一类细胞，具有取材容易，来源充足及操作简便等特点。内皮细胞可以通过分泌多种细胞因子，包括血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)等，在血压调节，凝血和纤溶，炎性细胞的黏附和迁移，以及血管形成等生理、病理过程中发挥重要作用。这些细胞因子能改善机体局部微环境，增加细胞活力、促进细胞更新、促进受损细胞组织愈合，并诱导血管新生，对溃疡创口起到很好的治愈作用。尝试将内皮细胞分泌的生长因子应用于糖尿病足的防治具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供及一种组合物及其制备方法与在制备治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用。
本发明提供的组合物由静脉内皮细胞生长因子和富血小板血浆组成。
本发明中，所述富血小板血浆的制备方法为全血经1600rpm/min，离心10min后，丢弃红细胞层；然后5000rpm/min，离心5min，然后弃除部分血浆，使剩余的血浆重悬沉淀，制成富血小板血浆。其中，所述剩余血浆的体积为全血的1/10～1/2。
本发明中，静脉内皮细胞生长因子为脐静脉内皮细胞生长因子。
所述脐静脉内皮细胞为P2或P3代细胞。
所述脐静脉内皮细胞的获取方式为：将脐带去除血液并PBS缓冲液清洗后，以质量分数为0.1％的I型胶原酶溶液酶解脐带内壁，37℃消化10min；收集消化液，1500rpm/min，离心5min，收集细胞沉淀，以完全培养基(含有10vol％FBS的DMEM-F12培养基)重悬至密度为1×105cell/mL～1.5×105cell/mL，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。48h后首次换液，此后2～3天换液一次，直至细胞融合度达80～90％，传代。
本发明中，脐静脉内皮细胞生长因子的制备方法为：
预培养脐静脉内皮细胞至汇合度达到80％以上，清洗细胞后以选择培养基培养，3天后收集培养液，依次经0.45μm滤膜、0.22μm滤膜过滤后，浓缩至液体蛋白质浓度为800mg/L～1200mg/L；浓缩液用冻干机制成冻干粉，获得脐静脉内皮细胞生长因子；
所述预培养采用含1ng/ml～10ng/ml EGF和10vol％FBS的DMEM-F12培养基；
所述选择培养基为1640培养基。
一些实施例中，预培养的接种密度为1×105cell/mL～10×105cell/mL。
一些实施例中，预培养的时间为3天。
一些实施例中，浓缩采用超滤浓缩，循环时间为3h。
一些实施例中，浓缩至蛋白质浓度为1000mg/L。
本发明中，静脉内皮细胞生长因子和富血小板血浆的质量-体积比为1g/mL～5g/mL。
一些实施例中，静脉内皮细胞生长因子和富血小板血浆的质量-体积比为1g/mL。
一些实施例中，静脉内皮细胞生长因子和富血小板血浆的质量-体积比为3g/mL。
一些实施例中，静脉内皮细胞生长因子和富血小板血浆的质量-体积比为5g/mL。
本发明所述的组合物在制备治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用。
本发明还提供了一种治疗糖尿病足溃疡的药物，包括本发明的组合物。
本发明提供的药物的剂型为注射剂。
治疗糖尿病足溃疡的方法为在溃疡创口周围多点肌肉注射本发明提供的药物，每点注射量为1ml/L，注射总量为5mL。注射次数为1次。
本发明提供的组合物由静脉内皮细胞生长因子和富血小板血浆组成，两种组分相互配合，共同对糖尿病足溃疡模型动物的溃疡起到了良好的治疗作用，其有效率可达95％。而试验表明，单独采用静脉内皮细胞生长因子或PRP，在相同剂量下，效果不及组合物，其中单独给予静脉内皮细胞生长因子的对照组有效率为30％，而单独给予PRP的对照组有效率为60％。该结果表明，本发明提供的组合物中两组分产生了良好的增效协同作用。
具体实施方式
本发明提供了及一种组合物及其制备方法与在制备治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、脐静脉内皮细胞分离、培养
取新鲜采集的人脐带，用PBS缓冲液清洗表面血渍后，用手术剪剪去包扎脐带首尾的绳子连同脐带，剩余脐带约20cm，用止血钳夹住脐带一端，用平镊挤掉血管内血液。
用一次性注射器吸取37℃预热的PBS插入脐静脉断端，冲洗脐静脉至流出的液体无色透明
抽取37℃预热的0.1％I型胶原酶溶液将脐静脉内剩余的PBS冲出，待下端流出胶原酶溶液时用止血钳夹闭血管，继续注入胶原酶溶液至脐静脉充盈饱满，37℃消化10min。
将消化液注入离心管，1500r/min，离心5min，弃上清，加入含有10vol％FBS的DMEM-F12的完全培养基重悬细胞，调整细胞接种密度为(1～1.5)×105cell/mL，混匀后接种。置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
48h后进行首次换液，此后2～3天换液一次，直至细胞融合度达80-90％，进行传代或冻存。
2、脐静脉内皮细胞生长因子冻干粉制备：
取脐静脉内皮细胞P2或P3代细胞，添加含1～10ng/ml的EGF的DMEM-F12+10％FBS培养基，接种于培养皿或培养瓶中，接种密度1～10×105cell/ml；
3天一换液，直到细胞达80％以上汇合度，用PBS清洗细胞2遍，换用1640培养基(RPMI 1640培养基溶液，Gibco)培养；
3天后，收集条件培养基；
条件培养基0.45μm滤膜过滤除去大颗粒物质，滤液再经0.22μm滤膜过滤，其后采用Slice200切向流器浓缩，循环过滤的时间为3h，浓缩后液体蛋白质浓度约为1000mg/L；
浓缩液用冻干机制成冻干粉，至于4℃保存备用。
3、制备PRP
清洁消毒后，静脉抽取全血10-20ml。第一次离心，1600r/min，离心10min，血液将被分层血浆和红细胞2层，丢弃红细胞层；第二次离心，5000r/min，离心5min，离心后吸弃部分血浆，用余下的1～5ml左右血浆重悬沉淀，制备成PRP。
用PRP重悬2中制备好的细胞因子冻干粉，至浓度为1g/mL、3g/mL或5g/mL制备成最终的组合物。
实施例2
本发明的注射液修复鼠糖尿病足溃疡效果
已造模成功的兔子糖尿病足溃疡模型100只，随机分为5组：
其中对照组一20只，仅注射PRP；
其中对照组二20只，注射生理盐水溶解实施例1制得的细胞因子冻干粉至浓度为3g/mL；
实验组一20只，注射实施例1制备的浓度为1g/mL的组合物；
实验组二20只，注射实施例1制备的浓度为3g/mL的组合物；
实验组三20只，注射实施例1制备的浓度为5g/mL的组合物。
注射方法为注射一次，溃疡创口周围多点肌肉注射，每点的注射量为1ml，注射的总剂量为5ml。注射后连续1个月，观察对照组和实验组的溃疡大小、创面肉芽生长情况、愈合时间及注射液的毒副作用。
疗效判定标准：治愈：创口愈合；显效：创口愈合80％以上；有效：创口愈合40％以上；无效；死亡。
表1 各组疗效
表1显示，实验组三对溃疡的治愈率最高，且愈合天数最短。与其他各组皆存在显著性差异。而治疗前后，各实验组和对照组的溃疡面均未恶化，兔子无死亡，说明实验组和对照组制剂无毒副作用。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，由静脉内皮细胞生长因子和富血小板血浆组成。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述静脉内皮细胞生长因子为脐静脉内皮细胞生长因子。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述脐静脉内皮细胞生长因子的制备方法为：
预培养脐静脉内皮细胞至汇合度达到80％以上，清洗细胞后以选择培养基培养，3天后收集培养液，依次经0.45μm滤膜、0.22μm滤膜过滤后，浓缩至液体蛋白质浓度为800mg/L～1200mg/L；浓缩液用冻干机制成冻干粉，获得脐静脉内皮细胞生长因子；
所述预培养采用含1ng/ml～10ng/ml EGF和10vol％FBS的DMEM-F12培养基；
所述选择培养基为1640培养基。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述预培养的接种密度为1×105cell/mL～10×105cell/mL。
5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述预培养的时间为3天。
6.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述浓缩采用超滤浓缩，循环时间为3h。
7.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述浓缩至蛋白质浓度为1000mg/L。
8.根据权利要求1～7任一项所述的组合物，其特征在于，所述静脉内皮细胞生长因子和富血小板血浆的质量-体积比为1g/mL～5g/mL。
9.权利要求1～8任一项所述的组合物在制备治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用。
10.一种治疗糖尿病足溃疡的药物，其特征在于，包括权利要求1～8任一项所述的组合物。
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