KR20150108351A - 안 질환의 치료에 사용하기 위한 단백질 slurp-1 - Google Patents

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장-마르크 콤베트
캐서린 델로체
클레어 아바디
세바스티앙 마우스
줄리앙 페리노
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브라이트펄스 홀딩 리미티드
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Abstract

본 발명은, 대상체의 눈에서 유착을 유도 또는 촉진하고/하거나 감염을 예방하는데 사용하기 위한, 서열번호 1(성숙 형태의 SLURP-1)을 포함하는 단백질 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

안 질환의 치료에 사용하기 위한 단백질 SLURP-1 {PROTEIN SLURP-1 FOR USE IN THE TREATMENT OF OCULAR DISEASES}
본 발명은, 대상체의 눈에서 유착을 유도 또는 촉진하고/하거나 감염을 예방하는데 사용하기 위한, 서열번호 1을 포함하는 단백질 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
눈, 특히 각막 및 결막 병변은 이들의 의사와 상담하는 환자에서 가장 진단된 상태 중의 하나이고 시력 상실의 주요 원인 중의 하나이다. 이들 병변은 다양한 기원의 것일 수 있지만, 알러지, 감염(세균, 바이러스 및 진균), 건조 눈 증후군, 수술 및 기타 외상성장해에 주로 기인한다. 이들 병변은 유해하고 매우 고통스럽다. 이들 병변의 증상은 건조, 따가움 및 모래와 같은 눈 자극일 수 있다. 증상은 또한 가렵고, 따끔거리고, 쏘는듯하거나 피로한 눈으로 설명될 수 있다. 기타 증상은 안 통증, 발적, 인장 감각 및 눈 후부의 압력이다. 눈 표면에 대한 손상은 불쾌감 및 밝은 광에 대한 감도를 증가시킨다.
눈 표면 병변은, 가장 중증의 경우에 시력 손실 및 실명을 유도할 수 있는 궤양 등의 상황 및 합병증의 악화를 회피하기 위해 매우 신속하게 치료 및 치유될 필요가 있다. 건조 눈 증후군에 기인하는 병변의 치료를 위해, 다수의 윤활 용액 및 수화 하이드로겔이 존재한다. 그러나, 이들 생성물은 증상을 완화시킬 뿐이지, 당해 병변의 치유 과정을 촉진시키지 않는다.
보다 심각한 병변의 경우, 치유를 보조할 수 있지만 한정된 효율을 갖는, 무친 분비를 증강시키는 일부 비타민 A 용액 및 조성물이 존재한다.
기타 조직에서 창상 치유에 관여하는 것으로 밝혀진 일부 화학적 화합물 및 생물학적 분자가 존재하지만, 눈에 대한 특정의 적용을 위한 선택은 여전히 매우 좁고, 효과적인 분자는 현재 이용가능하지 않다.
인간 성분 B(이하 SLURP-1로서 지칭됨)은 아미노산 서열 비교에 의해 입증된 Ly-6/uPAR 상과의 구성원이다. 이러한 상과는 C-말단 컨센서스 서열 CCXXXXCN 및 상이한 수의 Ly-6/uPAR 도메인 반복체를 함유한다. 전체 서열은 단백질 특이적 디설파이드 결합을 유도하는 복수의 시스테인 잔기(8 내지 10개)[1-3]를 함유한다.
Ly-6/uPAR 상과는 GPI 앵커 신호 서열의 존재에 따라 2개의 상과로 나눌 수 있다[4].
SLURP-1은 Ly-6/uPAR 상과의 제1 아과에 속하고, GPI-앵커 신호 서열을 갖지 않는다. SLURP-2는 또한 동일한 아과의 구성원이다[4,5]. 멜라다병(Mal de Meleda; MdM)을 갖는 환자는 종종 SLURP-1 중의 돌연변이와 연관되어 있고, MdM 유전자는 염색체 8q24.3 상의 Ly-6 유전자의 클러스터에 위치되어 있다[6-9].
제2 아과는 GPI 앵커 신호를 갖는 단백질을 포함하고, 몇몇 단백질: 레티노산-유도된 유전자 E(RIG-E), E48 항원(인간 Ly-6D), Ly6H, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), CD59 또는 프로텍틴, Lynx1 및 uPAR(유로키나제 수용체)을 포함한다[10-15].
SLURP-1은 국제공개공보 제WO 94/14959호에 기재되어 있다. 요약하면, 단백질은 최초로 발견되었고, 흡수제를 사용한 처리 및 특이적 정제 프로세스 후에 투석 뇨 농축물로부터 정제되었다. 이는, 약 8.9kD의 분자량을 갖는 이의 성숙 형태(N-말단 신호 펩티드를 갖는 103개 아미노산 - 서열번호 2)의 81개 아미노산(서열번호 1) 단백질이다. 이의 서열은 다수의 Ly6/uPAR 상과 구성원으로서 인간 염색체 8의 긴 암(arm) 상에 위치되어 있고, 이는 염색체 중복 사상 후에 잠재적 공-진화를 확인시켜 준다[4].
SLURP-1은 위치 39에서 티로신 상의 설페이트 그룹의 존재에 따라 2개의 상이한 형태로 존재한다: 형태 1은 설페이트화되는 반면, 형태 2는 설페이트화되지 않는다. SLURP-1은 혈액 및 뇨 등과 같은 기관 및 체액에서 검출된다. 이는 케라티노사이트 및 상피 세포에 의해 주로 생성되고, 따라서 주요 상피 조직 분포를 갖는다[19-24].
더욱이, 계통 분석은 SLURP-1과 Ly-6/uPAR 상과 구성원 사이의 밀접한 관계 및 뱀 신경독과의 밀접한 관계를 입증했다[4]. 뱀 신경독은 아세틸콜린 수용체에 대한 저해 효과를 나타내고, 따라서 세포와 세포외 매질 사이의 이온 교환을 저해한 다음, 세포 신호전달을 방지한다[16,17]. 뱀 신경독과 SLURP-1 사이의 중요한 서열 상동성은 3차원 구조 유사성에 의해 강조된다: SLURP-1은 "3개-핑거" 외관, 뱀 단백질의 특정의 기능을 가질 가능성이 있다[18,19]. 두 단백질의 유사성 및 뱀 신경독의 저해 활성은 SLURP-1이 니코틴 아세틸콜린 수용체 등의 이온 채널과 결합하고 상호작용하기 위해 사용될 수 있음을 지적했다.
비-신경 세포에서 nAChRs의 활성화는 세포 사이클 조절, 아폽토시스, 세포-세포 및 세포-기질 상호작용 등의 프로세스에 관여하는 단백질의 유전자 발현을 변형시킬 수 있다. 주로 연구된 호모머 수용체는 α7 아단위로 구성되어 있고; 이러한 특이적 수용체의 활성화는 상이한 개시 신호에 의해 전달되지만, 공통의 종점을 유도한다. 형질도입된 신호는 이온성 사상 및 단백질 키나제 신호전달을 동시에 수반한다. 체르니아브스키 등(Chernyavsky et al.)은 이러한 이중 활성화(이온성 사상 및 단백질 키나제 신호전달)이 유전자 발현 및 세포 형태의 동시 변화(및 이어서 케라티노사이트의 운동)를 유도할 수 있는 것으로 결론지었다[20]. 동시 및 상보성 신호전달은, 이들의 효과의 완전한 저해를 유도하는 두 메카니즘을 저해하면서, 부분 저해를 유도하는 이온성 또는 단백질 신호전달을 저해함으로써 명백하게 입증되었다.
SLURP-1과 니코틴 수용체 사이의 상호작용은 상이한 간행물에서 확인되었고, 아세틸콜린의 존재하에 효능제 활성(뱀 신경독과 대조적으로)은 SLURP-1을 사용하여 인간 케라티노사이트에서 발견되었다[21]. 이러한 상호작용은 콜린작용성 경로를 통해 세포 기능을 조절하고, 아마도 상피 세포 부착, 운동 및 창상 치유를 유도하지만[22, 23], 부조합 결과는 SLURP-1이 보다 느린 치유 프로세스이고 SLURP-1가 이를 촉진시킨다는 결론을 유도하는 팀에 의해 수득된다[26]. 이들 결과는, SLURP-1과 SLURP-2의 조합이, 이들 자체에 대한 SLURP-1 저해 또는 SLURP-2 촉진 활성과 비교하는 경우, 피부 치유 프로세스에 대한 추가의 양성 효과를 유도하는 것을 진술하는 동일한 그룹으로부터의 제3 실험과 비교되어야 한다.
추가의 연구는 SLURP-1 또는 SLURP-2가 일반적으로 창상 치유에 유용한지의 여부를 확인하기 위해 요구된다.
더욱이, 고효율로, 부작용 없이 및 완전한 각막 투명성의 회복과 함께 안 질환 후의 치유를 촉진하기 위한 의약 및 관련 조성물을 개발하는 것이 안과 분야에서 강력히 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 안 질환의 치료, 특히 대상체의 눈에서 유착의 유도 또는 촉진, 염증의 감소 및 감염의 예방에 사용하기 위한 생물학적 분자 및/또는 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적은 청구항 제1항에 정의된 바와 같은 단백질과 관련되는 본 발명에 의해 달성된다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 통상의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 다수의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 하기에 기재되어 있다. 달리 언급하지 않는 한, 본 발명에 사용하기 위해 본원에 기재된 기술은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 표준 방법이다.
도 1은 전장, 서열번호 2의 아미노산 서열과 성숙 SLURP-1 단백질, 서열번호 1 사이의 서열 비교를 나타낸다(각각 아미노산 1-103 및 아미노산 23-103).
도 2는 대조군 및 SLURP-1 처리된 그룹에서 전체 알콜-유도된 탈-상피화 후의 지시된 시점에서 각막 상피 창상의 형광 염색의 이미지를 나타낸다. 대조군 그룹은 무처리(대조군)를 제공한 하나의 그룹 및 비히클(PBS)의 결막하 주사(SCJ 비히클)로 처리된 하나의 그룹을 포함한다. 볼드체 퍼센트는 각막 창상 표면의 그룹 평균을 나타내고, 괄호 안의 퍼센트는 고려된 그룹에 대한 대표적 각막의 값을 나타낸다.
도 3a는 대조군 및 SLURP-1 처리된 그룹에서 전체 탈-상피화 후에 각막 창상 치유의 시간 경과를 나타내는 그래프이다. 계산된 치유 속도는 평균 ± SEM이다.
도 3b는 대조군 및 SLURP-1 처리된 그룹에서 전체 탈-상피화후 2일에 대한 치유 속도의 그래프를 나타낸다(50ng의 SLURP 및 점적을 사용한 결막하 투여).
도 3c는 대조군 및 SLURP-1 처리된 그룹에서 전체 탈-상피화후 3일에 대한 치유 속도의 그래프를 나타낸다(50ng의 SLURP 및 점적을 사용한 결막하 투여).
도 4는 PBS 및 SLURP-1 처리된 그룹에서 보정된 알콜-유도된 탈-상피화 후의 지시된 시점에서 각막 상피 창상의 형광 염색의 이미지를 나타낸다. 볼드체 퍼센트는 각막 창상 표면의 그룹 평균을 나타내고, 괄호 안의 퍼센트는 고려된 그룹에 대한 대표적 각막의 값을 나타낸다.
도 5a는 대조군 및 SLURP-1 처리된 그룹에서 탈-상피화후 0일 내지 2일에 측정된 창상 면적의 시간 경과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 대조군 및 SLURP-1 처리된 그룹에서 보정된 탈-상피화후 T0h와 T47h 사이의 계산 치유 속도의 그래프이다.
도 5c는 보정된 탈-상피화후 T47h에서 창상 치유 정도의 그래프이다. 창상 치유 정도는 각각의 각막에 대해 및 각각의 그룹에 대해 비율: T47h에서 형광 창상의 면적/기준선에서 형광 창상의 면적에 의해 계산되고, 퍼센트로 표시된다.
도 6은 인간 각막 상피 세포주 hTCEpi를 SLURP-1로 처리함으로써 수행된 창상 치유 실험의 사진을 나타낸다.
본 발명에 따라서 서열번호 1을 포함하는 단백질은 대상체의 눈에서 유착의 유도 또는 촉진 및/또는 대상체의 눈에서 감염의 예방에 사용된다.
바람직하게는, 안 질환은 당뇨병성 각막병(keratinopathy), 각막염, 결막염, 각결막염, 포도막염, 각막외상, 각막 박리, 각막 열상, 각막 만성 궤양, 각막 위축증, 영속적 각막 상피 결손(PED), 레이저 수술 후의 각막 상피 결손, PRK 후의 각막 상피 결손, 및 경각막 이식 후의 각막 상피 결손으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
서열번호 1은 SLURP-1의 81개 아미노산 성숙 형태에 상응한다.
대체 실시형태에서, 본 발명에 따라서, 서열번호 1을 포함하는 단백질을 포함하는 조성물은 유착의 유도 또는 촉진 및/또는 대상체의 눈에서 감염의 예방에 사용된다.
상기 조성물은 바람직하게는 적어도 하나의 생체적합성 중합체를 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 생체적합성 중합체는 히알루론산, 당 중합체, 레시틴 겔, 폴리알라닌 유도체, 플루로닉, 폴리(에틸렌)글리콜, 폴록사머, 키토산, 크실로글루칸, 콜라겐, 피브린, 폴리오르토에스테르 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
보다 더 바람직하게는, 상기 생체적합성 중합체는 히알루론산이다.
또는, 상기 생체적합성 중합체는 바람직하게는 당 중합체, 보다 더 바람직하게는 덱스트란(글루코즈 중합체)이다.
바람직하게는, 상기 덱스트란은 카복시메틸 덱스트란 설페이트 중합체, 보다 바람직하게는 레게네라팅(ReGeneraTing)(RGTAR), 보다 더 바람직하게는 카시콜 20R의 명칭하에 판매되는 OTR4120(화학식 I)이다.
Figure pct00001
화학식 I은 글루코즈 아단위 기반 골격을 갖는 헤파린 설페이트의 유사체 아단위를 나타낸다.
상기 조성물은 고체, 반고체, 겔상 또는 액체일 수 있고, 더욱이, 이는 용액, 현탁액, 유탁액 또는 열경화성 겔일 수 있다.
대체 실시형태에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 나노입자 담체를 포함한다.
상기 나노입자 담체는 바람직하게는 폴리-ε-카프롤락톤, 폴리시아노크릴레이트 및 키토산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
대체 실시형태에서, 상기 조성물은 주사가능한 점성 중합체 조성물의 형태이다. 특히, 상기 조성물의 중합체는 폴리-오르토에스테르이다.
상기 조성물은 바람직하게는 국소 치료 또는 결막하 주사에 의해 투여된다.
보다 바람직하게는, 서열번호 1을 포함하는 단백질의 양은 투여 단위당 5ng 내지 50㎍, 보다 바람직하게는 10ng 내지 10㎍이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 조성물은 결막하 주사에 의해 투여되고, 서열번호 1을 포함하는 단백질의 양은 투여 단위당 20ng 내지 90ng이다.
실시예
실시예 1: 국소 또는 결막하 투여 후에 각막 창상 치유
도 2 및 3은 랫트의 탈-상피화 모델에서 2개의 투여 경로를 사용하여 SLURP-1의 유착/안 창상 치유 활성을 비교하는 제1 실험의 데이터를 보고한다. 제1 투여 경로는 각막의 수분 유지 및 구체적으로는 이의 용이한 사용: 점적(국소 적용)을 위해 사용된 안 생성물에 대한 일반적 경로이다. 이 경로는 외과적 완전 탈-상피화 후의 0일 및 3일에서 6회/1일의 투여 빈도로 사용되었다. 동일한 외과적 처리 후, 제2 세트의 동물을 상이한 경로의 투여: 결막하 경로에 의해 처리했다. 후자의 투여는 0일 및 3일에서 1일 1회 실시했다.
두 투여 경로는 공통의 특징, 즉 SLURP-1 적용된 양을 갖는다: 점적을 제공한 그룹은 결막하 처리된 그룹에서 사용된 최고 용량에 상응하는 용액으로 처리했다. 결막하 경로를 통해 투여된 생성물은, 이들이 저장되는 결막하 탱크에 의해 이들이 서서히 방출될 수 있기 때문에 창상 치료 동안 보다 장시간 동안 이용가능할 것이고; 반대로 국소 투여된 처리는 눈 표면으로부터 신속하게 제거된다는 것을 용이하게 생각할 수 있다. 이러한 가설 후, 결막하 처리에 사용된 용량 섭생은 국소(5㎍) 사용되고 점차 50ng까지 증가시키는 용량 범위였다.
도 3a에 제시된 바와 같이, 두 투여 경로는 창상 치유 프로세스를 촉진시킬 수 있다.
전체 탈-상피화후 2일에서, 50ng SLURP-1의 결막하 주사후 치유 속도는 PBS의 결막하 주사와 비교하여 유의적으로 높았다(p<0.05)(도 3b).
예상치 않은 발견은, 양 측면에서 훨씬 높은 국소 투여에 사용된 용량과 비교하는 경우, 점적 효과가 최저 용량(50ng)에서 더욱 현저한 결막하 투여 경로에 관한 것이다.
전체 투여된 양은 유사한 유효성 결과를 제공하는 투여 섭생의 두 경로에서 계산했다(즉, 결막하의 경우에 1㎍/mL 및 국소 경로의 경우에 100㎍/mL). 국소 치료에 있어서, 50㎕ 점적의 6회 투여를 100㎍/mL 용액으로 2개의 시간적 별개 일에 1일당 수행했다. 이어서, 이러한 처리 그룹에 사용된 최종 양은 6×2×5㎍ = 60㎍이었다. 결막하 처리에 있어서, 1㎍/mL 용액을 2회 주사했고(50㎕ 용적), 따라서 이러한 경로에 의해 제공된 전체 양은 2×0.05㎍ = 0.1㎍이었다. 유사한 임상적 유효성을 유도하는 두 투여량을 비교하는 경우, 결막하 및 국소 양 사이에 600의 비율이 관찰되었다.
이는 안 창상 치유 및 기타 언급된 임상적 상태를 치료하기 위해 이러한 생성물에 대한 이러한 특정의 보다 덜 일반적인 투여 경로에 의한 생성물의 심각하게 증가된 유효성에 명백하게 바람직하다.
보다 특히, 전체 각막 상피의 기계적 절개를 수반한 실험은 70% 에탄올-침지 마이크로스폰지 및 15°외과적 나이프를 사용하여 수술용 현미경하에 수행했다. 이어서, 각막은 0.9% NaCl로 세정하고, 각막 재-상피화에 대한 처리의 효과는 탈-상피화후 5개 시점(각각 T24h, T48h, T72h, T144h 및 T168h에 상응하는 D1, D2, D3, D6 및 D7)에서 국소 0.5% 형광을 사용하여 평가했다.
5마리 동물의 6개 그룹은 하기 처리를 제공했다:
그룹 1: D0 및 D3에서 50㎕ 비히클 결막하 주사
그룹 2: D0 및 D3에서 1㎍/mL(50㎕) SLURP-1 결막하 주사(투여당 50ng)
그룹 3: D0 및 D3에서 10㎍/mL(50㎕) SLURP-1 결막하 주사(투여당 500ng)
그룹 4: D0 및 D3에서 100㎍/mL(50㎕) SLURP-1 결막하 주사(투여당 5㎍)
그룹 5: D0 및 D3에서 100㎍/mL(50㎕) SLURP-1, 6개 국소 점적(투여당 5㎍)
그룹 6: 무처리
각각의 시점(D1, D2, D3, D6 및 D7)에서, 코발트 블루 생체현미경 광을 사용하여 전체 안면 사진을 촬영하고, 각막의 녹색 형광 표지를 사용하여 잔류 궤양의 형상 및 면적을 측정했다(도 2). 치유 속도의 시간 과정은 "대조군" 그룹(임의의 처리가 없는 비히클 및/또는 대조군) 대 SLURP-1 처리된 그룹을 비교하기 위해 각 그룹에 대해 그래프 상에 제시되어 있다(도 3a). 각각의 각막의 창상 치유 팔로우-업은 창상 면적(At)의 컴퓨터 지원 측정: 전체 각막 면적에 대한 형광-염색된 면적의 비율을 통해 수행했다. 각각의 시점에서, 치유 속도: (At0-At)/At0을 계산했다. 결과는 평균 ± SEM으로 제시되어 있다. ANOVA 시험, 이어서 둔네트 다중 비교 시험 또는 비-파라미터 만 휘트니 비교 시험은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)(GraphPad Software, San Diego, U.S.A.)을 사용하여 수행했다.
상기 모델은 각막 신생혈관화를 유도하고 창상 프로세스를 지연시키는 윤부 결함을 유도했다. 강력한 중심 궤양을 제시한 각막은 상기 연구로부터 제외했다.
도 3b에 제시된 바와 같이, 전체 탈-상피화후 2일에, 50ng SLURP-1의 결막하 주사후의 치유 속도는 PBS(p<0.05, Dunnett) 및 대조군(p<0.01, Dunnett)의 결막하 주사와 비교하여 유의적으로 높았다. SLURP-1의 점적 후의 치유 속도는 또한 대조군(p<0.05, Dunnett)보다 유의적으로 높지만, PBS 주사후와 비교하여 유의차가 없다.
도 3c에 제시된 바와 같이, 전체 탈-상피화후 3일에, SCJ 50ng 처리된 그룹 및 점적 그룹의 치유 속도는 대조군(p<0.05, Dunnett)보다 유의적으로 높지만, PBS를 사용한 치유 속도와 비교하여 유의차가 없다.
이러한 관찰은 SCJ 프로세스(또는 PBS) 자체가 반응 촉진 각막 치유를 유도하는 것을 시사한다.
혈관신생화와 관련하여, 신생혈관은 재-상피화 프로세스의 개시 직후에 각 그룹에서 가시적이었다. 각막 신생혈관화의 질적 팔로우-업은 SLURP-1-처리된 그룹과 대조군 사이의 어떠한 차이도 입증하지 않았다. 이는, SLURP-1의 치유 특성이 혈관신생촉진 효과와 연관되지 않고 각막 투명성의 회복을 손상하지 않는 것을 나타내는 매우 중요한 관찰이다.
이는 SLURP-1이 부작용의 부재하에 및 특히, 윤부 결함과 연관되는 각막 신생혈관화의 부재하에 결막하 투여 및 점적 후에 유의한 각막 효과를 나타냈음을 의미하고, 이는 치유 효과가 각막 트랜스-분화 프로세스와 관련되지 않음을 입증한다.
실시예 2: 보정된 탈-상피화 모델에서 국소 또는 결막하 투여 후에 각막 창상 치유
치유 프로세스 뿐만 아니라 윤부 결함을 암시하는 제1 각막 탈-상피화 모델에서 수득된 예비 결과 후, 알콜-유도된 탈-상피화의 보정된 모델은 SLURP-1의 각막 치유 특성에 초점을 맞추기 위해 제2 연구 모델로서 선택했다. 이 연구의 목적은 대조군과 비교하여 시험된 단백질에 의한 재-상피화의 증강을 나타내는 예비 결과를 확인하고 단백질에 의해 유도된 가능한 용량-반응을 평가하는 것이다.
상기 모델은 4mm 직경의 원형 절개를 유발하는 트레핀을 사용하여 생성된 보정된 창상을 수반했다. 이러한 미소한 창상의 치유는 임의의 처리의 부재하에서도 매우 신속하다(종종 약 2일). 따라서, 투여는 절개 일에 1일 1회 수행했고, 유효성은 1일 2회 검사에 의해 최초 48시간 동안 평가했다.
주사된 용적은 제1 실험으로부터 조절했다; 용량은 2배의 투여 용적 및 절반 농축 용액과 동등했다. 이러한 상이한 용량은, 이러한 표준 모델에서 수행된 특유의 투여를 보상하기 위해 각막 표면에 대한 SLURP-1의 지속적 존재를 유도하는 각막하 주사에 의해 생성된 탱크에서 체류 시간을 증가시키도록 선택했다.
이러한 제2 실험 모델에서, SLURP-1 효과가 확인되었다: 즉 낮은 주사량을 사용한 결막하 경로는, 국소 경로와 비교하는 경우, 안 창상 치유의 촉진에 있어서 6 내지 60배 더 효율적이었다.
보다 특히, 각막 상피 창상은 문헌[참조: Hattori et al [25]]에 기재된 바와 같이 수득했다. 요약하면, 전신 및 국소 마취 후, 트레핀을 사용하여, 각막을 중심으로 한 4mm 직경의 원형 절개를 생성했다. 이어서, 70% 에탄올로 침지시킨 4mm 직경의 원형 필터 페이퍼를 5초 동안 절개된 면적 위에 위치시켰다. 5mL 염수로 조심스럽게 세척한 후, 탈착된 각막 상피를 제거했다.
처리는 D0(각막 탈-상피화 시간)에서 1회의 단일 결막하 주사 또는 6개의 점적을 통해 우측 눈에만 투여했다. 4 내지 6마리 동물의 5개 그룹은 하기 처리를 제공했다:
그룹 1: D0에서 0.5㎍/mL(100㎕) SLURP-1 결막하 주사(투여당 50ng)
그룹 2: D0에서 5㎍/mL(100㎕) SLURP-1 각막하 주사(투여당 500ng).
그룹 3: D0에서 50㎍/mL(100㎕) SLURP-1 각막하 주사(투여당 5㎍)
그룹 4: D0에서 100㎍/mL(50㎕) SLURP-1(투여당 5㎍), 6개 점적
그룹 5: D0에서 비히클 결막하 주사(100㎕)
우측 각막은 생체현미경으로 검사했다. 각각의 우측 각막은 0.5% 형광(Novartis pharma S.A.S)의 1개 점적을 제공했고, 코발트 블루 광을 사용하여 검사했다. 디지탈 사진은 쌍안경을 통해 촬영했다. 보정된 각막 탈-상피화 모델에서 치유 팔로우-업 동안, 각막은 0일, 1일 AM(T23h), 1일 PM(T28h), 2일 AM(T47h) 및 2일 PM(T56h)에서 검사했다(도 4).
디지탈 사진은 이미지하 소프트웨어(Adobe Photoshop)로 분석했다. 각각의 눈 및 각각의 시점에 있어서, 잔류 궤양의 면적을 전체 각막 면적과 비교했다. 치유 속도의 시간 과정은 대조군(비히클 및/또는 임의의 처리 없는 대조군) 대 SLURP-1 처리된 대조군을 비교하기 위해 각 그룹에 대해 그래프로 제시되어 있다. 결과는 평균 ± SEM으로 제시되어 있다. ANOVA 시험, 이어서 둔네트 다중 비교 시험 또는 비-파라미터 만 휘트니 비교 시험은 그래프패드 프리즘(GraphPad Software, San Diego, U.S.A.)을 사용하여 수행했다.
대조군 및 SLURP-1 처리된 그룹에서 각막 창상 폐쇄의 시간 과정은 도 5a에 제시되어 있다. T0h와 T47h 사이에 보정된 치유 속도를 비교하는 경우, 500ng 및 5㎍ SLURP-1의 SCJ 주사는 점적 또는 PBS 결막하 투여 그룹과 비교하여 치유 속도를 유의적으로 증가시켰다(도 5b). 유의한 효과는 50ng-SCJ 주사 그룹에서 관찰되지 않았기 때문에 용량 반응 효과가 있었다. 더욱이, T47h에서, 전체 치유된 각막의 수는 500ng 또는 5㎍에서 SLURP-1의 결막하 주사로 처리된 그룹에서 더욱 높았고(도 5c), 대조군 그룹(6개 각막 중의 3개)과 비교하여 주목된 차이는 500ng(5개 각막 중의 4개) 및 5㎍(5개 각막 중의 5개) 사이에 존재했다.
실시예 3: 인간 각막 상피 세포주 hTCEpi에 대한 SLURP-1을 사용한 창상 폐쇄 분석
세포 이동을 모니터링하기 위해 사용된 창상 폐쇄 분석은 플라티푸스 테크놀로지스(Platypus Technologies)로부터 코팅된 오리스 세포 이동 분석-콜라겐 I이다. 세포 파종 밀도는 도립 현미경을 사용하여 시각적으로 측정했다. 최적 세포 파종 밀도의 100㎕를 시험 웰에 피펫팅하고, 습윤 챔버(37℃, 5% CO2)에서 1 내지 4시간 동안 항온처리하여 세포 부착을 가능하게 한다. 사이토찰라신 D를 양성 대조군으로 사용했다.
실험은 증가량의 SLURP-1로 삼중으로 수행했다. 시험된 양은 0㎍/ml(음성 대조군), 1㎍/ml, 5㎍/ml, 10㎍/ml, 15㎍/ml, 25㎍/ml 및 50㎍/ml이다. 24시간 후, 플레이트 상의 창상 면적은 상이한 정도로 치유되었다. 10㎍/ml의 SLURP-1로 처리된 세포는 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이 최적 창상 치유를 나타냈다.
상기 데이터의 분석으로부터, 본 발명이 달성하는 것을 가능하게 하는 잇점이 명백하다.
특히, 특정 농도의 SLURP-1과 특정 투여 경로 사이의 효과적 연관은 촉진된 치유 속도 및 보다 신속하게 감소된 창상 면적, 특히 감염으로부터 안 표면의 보호의 측면에서 최적 결과를 제공한다.
더욱이, SLURP-1의 치유 특성은 혈관신생촉진 효과와 연관되지 않고, 각막 투명성의 회복을 손상시키지 않는다.
참조문헌
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
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Claims (15)

  1. 대상체의 눈에서 유착을 유도 또는 촉진하는데 사용하기 위한, 서열번호 1을 포함하는 단백질.
  2. 대상체의 눈에서 감염을 예방하는데 사용하기 위한, 서열번호 1을 포함하는 단백질.
  3. 대상체의 눈에서 유착을 유도 또는 촉진하는데 사용하거나 대상체의 눈에서 감염을 예방하는데 사용하기 위한, 서열번호 1 및 적어도 하나의 생체적합성 중합체를 포함하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 생체적합성 중합체가 히알루론산, 당 중합체, 레시틴 겔, 폴리알라닌 유도체, 플루로닉, 폴리(에틸렌)글리콜, 폴록사머, 키토산, 크실로글루칸, 콜라겐, 피브린, 폴리오르토에스테르 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 사용하기 위한 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 생체적합성 중합체가 히알루론산 및/또는 당 중합체인, 사용하기 위한 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 당 중합체가 덱스트란인, 사용하기 위한 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 덱스트란이 카복시메틸 덱스트란 설페이트 중합체인, 사용하기 위한 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 카복시메틸 덱스트란 설페이트 중합체가
    Figure pct00007
    인, 사용하기 위한 조성물.
  9. 대상체의 눈에서 유착을 유도 또는 촉진하는데 사용하거나 대상체의 눈에서 감염을 예방하는데 사용하기 위한, 서열번호 1을 포함하는 단백질 및 적어도 하나의 나노입자 담체를 포함하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 나노입자 담체가 폴리-ε-카프롤락톤, 폴리시아노크릴레이트 및 키토산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 사용하기 위한 조성물.
  11. 제3항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 국소 투여 또는 결막하 주사에 의해 투여되는, 사용하기 위한 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 서열번호 1을 포함하는 단백질의 양이 투여 단위당 5ng 내지 50㎍인, 사용하기 위한 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 서열번호 1을 포함하는 단백질의 양이 투여 단위당 10ng 내지 10㎍인, 사용하기 위한 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조성물이 결막하 주사에 의해 투여되고, 서열번호 1을 포함하는 단백질의 양이 투여 단위당 20ng 내지 90ng인, 사용하기 위한 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 서열번호 1을 포함하는 단백질의 양이 투여 단위당 40ng 내지 60ng인, 조성물.

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