CN105188731B - 用于治疗眼部疾病的蛋白质slurp-1 - Google Patents

用于治疗眼部疾病的蛋白质slurp-1 Download PDF

Info

Publication number
CN105188731B
CN105188731B CN201380064175.2A CN201380064175A CN105188731B CN 105188731 B CN105188731 B CN 105188731B CN 201380064175 A CN201380064175 A CN 201380064175A CN 105188731 B CN105188731 B CN 105188731B
Authority
CN
China
Prior art keywords
slurp
purposes according
protein
composition
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201380064175.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105188731A (zh
Inventor
让-马克·孔贝特
凯瑟琳·德洛什
克莱尔·阿巴迪
塞巴斯蒂安·穆兹
朱利安·佩里诺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BRIGHTPULSE HOLDING Ltd
Original Assignee
BRIGHTPULSE HOLDING Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BRIGHTPULSE HOLDING Ltd filed Critical BRIGHTPULSE HOLDING Ltd
Publication of CN105188731A publication Critical patent/CN105188731A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105188731B publication Critical patent/CN105188731B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)

Abstract

本发明涉及一种含有SEQ ID NO:1的蛋白质(SLURP‑1的成熟形式)以及包含该蛋白质的组合物，用于在受试者眼部诱导或加速瘢痕形成和/或预防感染。

Description

用于治疗眼部疾病的蛋白质SLURP-1
技术领域
本发明涉及一种含有SEQ ID NO:1的蛋白质以及包含该蛋白质的组合物，用于诱导或加速受试者眼部瘢痕形成(cicatrisation)和/或预防受试者眼部感染。
背景技术
眼部，特别是角膜和结膜处的损伤是病人就诊时最常见的疾病，也是视力受损最主要的原因之一。造成损伤的原因很多，主要是由于：过敏、感染(细菌、病毒和真菌性的)、干眼综合症、手术及其他外伤。这些损伤有害且疼痛感严重。这些损伤的症状可以是眼干、灼烧感和沙质性眼部刺激。有些症状还表现为发痒、摩擦感、刺痛感或眼部疲劳。其他症状包括眼部疼痛、发红、拉拽感以及眼后压迫。眼表面的损伤增加了对强光的不适感和敏感性。
眼表面损伤需要快速治疗和愈合，以避免伤情恶化以及溃疡等并发症，这些有可能导致视觉敏锐度下降，在一些最为严重的病例中还会导致失明。在干眼综合症引起的损伤的治疗中，存在着多种润滑溶液和水凝胶。但是这些产品只能缓解症状，却不能加速损伤愈合过程。
对于较深的损伤，会用到某些维生素A溶液和促进粘蛋白分泌的组合物，它们虽然可能有助于愈合，但功效却有限。
虽然有些化学化合物和生物分子被发现参与了其他组织的伤口愈合，但具体针对眼部应用的选择(范围)仍然很有限，而且目前没有有效的分子可以使用。
人体成分B(Human component B)(下文称为SLURP-1)是Ly-6/uPAR超家族中的成员，这由氨基酸序列比较所证明。这个超家族包含C末端的共有序列CCXXXXCN和不同数量的Ly-6/uPAR结构域重复。整个序列含有多个可产生蛋白质特异性二硫键的半胱氨酸残基(从8到10个)[1-3]。
取决于GPI锚定信号序列的存在，Ly-6/uPAR超家族可以分成两个亚家族[4]。
SLURP-1属于Ly-6/uPAR超家族的第一亚家族，不具有GPI锚定信号序列。SLURP-2也属于同一亚家族的成员[4,5]。先天性掌跖角化病(Mal de Meleda，MdM)患者常常与SLURP-1突变有关，并且MdM基因位于染色体8q24.3上Ly-6基因簇上[6-9]。
第二亚家族包含带有GPI锚定信号的蛋白质并且包括几种蛋白质：视黄酸诱导基因E(RIG-E)、E48抗原(人LY-6D)、LY6H、前列腺干细胞抗原(PSCA)、CD59或保护素、Lynxl和uPAR(尿激酶受体)[10-15]。
WO 94/14959中描述了SLURP-1。简单说，在透析的浓缩尿液中首次发现并提纯了该蛋白质，上述的浓缩尿液经过了吸附剂和特定纯化过程处理。其是一种在其成熟形式(103氨基酸-SEQ ID NO：2-带有N-末端信号肽)中的81氨基酸(SEQ ID NO:1)蛋白，其分子量约为8.9kD。它的序列位于人染色体8的长臂上(如很多Ly6/uPAR超家族的成员一样)，这说明经过染色体复制事件之后存在潜在的协同进化(共进化，co-evolution)[4]。
SLURP-1有两种不同的存在形式，这取决于在39位置酪氨酸上是否存在着硫酸基(sulfate group)：I型为硫酸化，2型则没有硫酸化。SLURP-1在多种器官以及诸如血液和尿液的体液中检测到。它主要由角化细胞和上皮细胞生成，因此广泛分布于上皮组织中[19-24]。
此外，系统发育分析表明SLURP-1和Ly-6/uPAR超家族成员的关系密切，与蛇神经毒素的关系也密切[4]。蛇神经毒素对乙酰胆碱受体具有抑制作用，因此抑制细胞与胞外介质之间的离子交换，进而阻止细胞信号传递[16,17]。蛇神经毒素与SLURP-1的三维结构相似性：SLURP-1很可能具有“三指”型表观，这正是蛇(神经毒素)蛋白的特异性特征，这说明两者之间具有重要的序列同源性[18,19]。两种蛋白质的相似性和蛇神经毒素的抑制活性指明了：SLURP-1可能像烟碱乙酰胆碱受体一样能与离子通道结合并与之相互作用。
非神经元细胞中的nAChR活化可以改变参与以下进程的蛋白质的基因表达，所述进程诸如细胞周期调控、细胞凋亡、细胞与细胞间以及细胞与基质间的相互作用。研究较多的同聚受体是由α7亚基组成；该特异性受体活化由不同的初始信号转换(转导)，但都导向一个共同的结束点。转换信号同时参与了离子活动和蛋白质激酶信号传递。Chernyavsky等人的结论是上述双活化(离子活动和蛋白质激酶信号传递)可带来基因表达和细胞形态(以及随后的角质形成细胞移动)的同时改变[20]。抑制离子或蛋白质信号会导致部分抑制，而抑制两种机制则导致它们效应的完全抑制，这些清楚地证实了同时和互补性(complementary)信号传递。
SLURP-1和烟碱受体之间的相互作用已经被多种出版物所证实，基于乙酰胆碱的存在，在使用SLURP-1的同时在人类角质形成细胞中发现了激动剂活性(与蛇神经毒素相反)[21]。这种相互作用通过胆碱途径控制细胞功能，也可能产生上皮细胞粘附、移动和伤口愈合[22,23]，然而一个团体得到了不一致的结果，其导致结论为：SLURP-1正在减缓愈合过程而SLURP-2加速愈合过程[26]。上述结果还与同组的第三实验进行对比，表明：SLURP-1和SLURP-2的组合，无论是与SLURP-1自身的抑制活性还是与SLURP-2自身的加速活性相比，在皮肤愈合过程中都带来了附加的(additive)积极效果。
还需要进一步研究来确定SLURP-1或SLURP-2是否对伤口愈合具有普遍适用性。
另外，在眼科领域，亟需开发药物和相关组合物以促进眼部疾病的高效、无副作用的愈合和完全恢复角膜透明性。
发明内容
本发明的目的是提供生物分子和/或组合物用于治疗眼部疾病，特别是诱导或加速瘢痕形成，减少炎症，和预防受试者眼部感染。
通过本发明实现了上述目的，本发明涉及权利要求1中限定的蛋白质。
除非另有说明，本文中使用的所有科技术语的含义等同于本发明所属领域普通技术人员所一般理解的含义。虽然与本文所描述的相似或相同的多种方法和材料可应用于本发明涉及的实践或试验中，但是下文中会提供优选的方法和材料。除非另有说明，文中描述的本发明应用的技术是本领域普通技术人员所公知的标准技术。
附图说明
图1示出了氨基酸全长序列SEQ ID NO：2和成熟SLURP-1蛋白SEQ ID NO:1之间的序列比较，(分别为氨基酸1-103和氨基酸23-103)。
图2示出了对照组和SLURP-1治疗组在乙醇诱导的完全去上皮后在特定时间点的角膜上皮伤口的荧光染色图像。对照组包括没有接受治疗(对照)的组，以及接受结膜下注射赋形剂(PBS)(SCJ赋形剂)治疗的组。粗体百分数指明角膜伤口表面的组平均值，括号内的百分数表示针对所考虑的组的代表性角膜的值。
图3A是示出对照组和SLURP-1治疗组中完全去上皮后角膜伤口愈合的时间进程的曲线图。经过计算的愈合率平均值±SEM。
图3B示出了对照组和SLURP-1治疗组完全去上皮后第二天的愈合率曲线图(50ng的SLURP结膜下给药和滴注(instillation))。
图3C示出了对照组和SLURP-1治疗组中完全去上皮后第三天的愈合率曲线图(50ng的SLURP结膜下给药和滴注)。
图4示出了PBS治疗组和SLURP-1治疗组在校准的乙醇诱导的去上皮后在指定时间点角膜上皮伤口的荧光素染色图像。粗体百分数表示角膜损伤表面的组平均值，括号内的百分数表示针对所考虑的组的代表性角膜的值。
图5A是示出对照组和SLURP-1治疗组去上皮后第0天(当天)到第二天所测量的伤口面积的时间进程的曲线图。
图5B是在对照组和SLURP-1治疗组在校准的去上皮后T0h-T47h之间计算的伤口愈合率的曲线图。
图5C是去上皮后T47h的伤口愈合程度的曲线图。伤口愈合程度是由比值计算得出：每组、每只角膜在T47h的荧光素伤口面积/基线荧光素伤口面积，以百分数表示。
图6示出了通过使用SLURP-1治疗人角膜上皮细胞系hTCEpi所开展的伤口愈合实验的照片。
具体实施方式
根据本发明，使用包含SEQ ID NO:1的蛋白来诱导或加速受试者眼部瘢痕形成(cicatrisation)和/或预防受试者眼部感染。
该眼部疾病优选选自糖尿病角质化(diabetic keratinopathy)、角膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、葡萄膜炎、角膜外伤、角膜磨损、角膜灼伤、角膜慢性溃疡、角膜营养不良、持续性角膜上皮缺损(PED)、激光术后角膜上皮缺损、PRK后角膜上皮缺损、角膜移植后角膜上皮缺损(corneal epithelial defect post-transcorneal transplant)。
SEQ ID NO:1对应于SLURP-1中81氨基酸的成熟形式。
在一个替换实施方案中，根据本发明，包括含有SEQ ID NO:1的蛋白质的组合物用于诱导或加速瘢痕形成和/或预防受试者眼部感染。
该组合物优选包含至少一种生物相容性聚合物。
更优选地，所述生物相容性聚合物选自由透明质酸、糖聚合物、卵磷脂凝胶、多聚丙氨酸衍生物(polyalanine derivates)、普朗尼克、聚(乙烯)二醇(poly(ethylene)glycol)、泊洛沙姆、壳聚糖(chitosan)、木葡聚糖(xyloglucan)、胶原蛋白、纤维蛋白、聚原酸酯以及它们的混合物组成的组。
甚至更优选地，生物相容性聚合物是透明质酸。
可替换地，所述生物相容性聚合物优选为糖聚合物，甚至更优选葡聚糖(葡萄糖聚合物)。
优选地，所述葡聚糖是羧甲基硫酸葡聚糖聚合物(carboxymethyl dextransulphate polymer)，更优选是一种再生剂(ReGeneraTing Agent)甚至更优选OTR4120(式I)，它的商品名称为Cacicol
式I表示一种具有基于葡萄糖亚基的骨架的硫酸乙酰肝素的类似物亚基。
该组合物可以是固体、半固体、凝胶状或液体；此外，它可以是溶液、悬浮液、乳剂或热固性凝胶。
在一个替换实施方案中，组合物包含至少一种纳米颗粒载体。
该纳米颗粒载体优选选自由聚-ε-己内酯、聚氰基丙烯酸酯(polycyanocrylate)和壳聚糖组成的组。
在一个替换实施方案中，该组合物是一种可注射的粘性聚合物组合物的形式。特别地，该组合物的聚合物是聚原酸酯。
组合物优选通过局部处理(topical treatment)或结膜下注射而给药。
更优选地，含有SEQ ID NO:1的蛋白质的量为每给药单位5ng到50μg，更优选每给药单位10ng到10μg。
在一个优选的实施方案中，通过结膜下注射给药组合物并且含有SEQ ID NO:1的蛋白质的量为每给药单位20ng到90ng。
实施例
实施例1：局部或结膜下给药后的角膜伤口愈合。
图2和图3报告了第一实验的数据，在实验中采用两种给药途径在大鼠去上皮模型中对比SLURP-1的瘢痕形成/眼部伤口愈合活性。第一种给药途径是保持角膜湿度尤其是应用简便的眼科产品的一般途径：滴注(局部使用)。在完全去上皮术后0和3天内、以6次/天的给药频率使用该途径。在相同外科处理之后，第二组动物用不同的给药途径治疗：结膜下途径。后一种给药是在0和3天每天给药1次而实施。
这两种给药途径有一个共同特征，即SLURP-1的使用量：接受滴注的组的处理溶液对应于结膜下处理组中使用的最高剂量。可容易想到：使用结膜下途径给药的产品在伤口治疗的长期过程中是可用的，这是因为它们储存在结膜槽(conjunctiva tank)中，结膜槽可以缓慢释放该产品；与之相反，局部给药的治疗会从眼表面迅速消失。根据这一假设，结膜下治疗使用的剂量方案是从局部使用的剂量(5μg)逐步减少到50ng的范围。
如图3A所示，两种给药途径都能加速伤口愈合进程。
在完全去上皮后的第二天，结膜下注射50ng SLURP-1后的愈合率明显高于结膜下注射PBS(p<0.05)的愈合率(图3B)。
关于结膜下给药途径，意外的发现是：与局部给药使用的剂量(在数量方面显著更高)相比，剂量最小(50ng)情况下的瘢痕形成效应更明显。
在给出相似的疗效结果的情况下，计算出两种给药方案途径的总给药量(结膜下为1μg/ml而局部途径为100μg/ml)。按照局部治疗，使用100μg/ml的溶液，在分开的两天中适时地每天进行6次给药，每次50μl滴液。那么在该治疗组中最终的总用量是6*2*5μg＝60μg。按照结膜下治疗，两次注射1μg/ml的溶液(50μl体积)，因而该途径给出的总用量是2*0.05μg＝0.1μg。当比较临床功效相似的两种给药量时，观察到结膜下和局部量的比值为600。
这显然支持了针对这种产品通过该特定的较不常见的给药途径在治疗眼部伤口愈合和其他所述临床疾病中使功效显著增强。
更为特别的是，实验涉及外科显微镜下进行的全角膜上皮机械切除术，其使用70％乙醇浸泡过的微海绵(microsponge)和15°的外科手术刀。然后用0.9％的氯化钠冲洗角膜，在去上皮后5个时间点(D1、D2、D3、D6、D7分别对应T24h、T48h、T72h、T144h和T168h)，利用局部0.5％的荧光素评估角膜再上皮化的治疗效果。
6组5只动物接受以下治疗：
第1组：D0和D3时结膜下注射50μl的赋形剂(媒剂、载体，vehicle)
第2组：D0和D3时，结膜下注射1μg/ml(50μl)的SLURP-1(每次给药50ng)
第3组：D0和D3时，结膜下注射10μg/ml(50μl)的SLURP-1(每次给药500ng)
第4组：D0和D3时，结膜下注射100μg/ml(50μl)的SLURP-1(每次给药5μg)
第5组：D0和D3时，6次局部滴注100μg/ml(50μl)的SLURP-1(每次给药5μg)
第6组：无治疗
在每个时间点(D1、D2、D3、D6、D7)，用钴蓝生物显微镜光获得正面照片，用绿色荧光标记角膜来测定剩余溃疡的面积和形状(图2)。在图上呈现每组愈合率的时间进程，以比较对照组(赋形剂和/或没有接受任何治疗的对照)和SLURP-1治疗组(图3A)。每个角膜的伤口愈合随访(follow up)通过使用计算机辅助手段测算伤口面积(At)进行：荧光染色面积与全角膜面积的比值。在每个时间点，愈合率计算为：(At0-At)/At0进行计算。结果显示为平均值±SEM。使用GraphPad Prim(美国圣地亚哥GraphPad软件)进行ANOVA测试，然后进行Dunnett多重比较测试或非参数曼惠特尼比较测试。
该模型诱导边缘不足(边缘细胞不全，limbic insufficiency)，导致角膜新血管化并减缓愈合进程。表现出中央溃疡严重的角膜不在研究范围内。
如图3B所示，在完全去上皮的第二天，结膜下注射50ngSLURP-1之后的愈合率显著高于结膜下注射PBS(p<0.05Dunnett)和对照(p<0.01Dunnett)。SLURP-1滴注后的愈合率也显著高于对照(p<0.05，Dunnett)，但与PBS注射后的情形没有明显不同。
如图3C所示，在完全去上皮后的第三天，SCJ 50ng SLURP-1的治疗组及滴注组的愈合率显著高于对照组(p<0.05，Dunnett),但与PBS组的愈合率相比没有明显差异。
这一观察(结果)表明SCJ程序(或PBS)本身诱导促进角膜愈合的反应。
关于新血管形成，在每组中，新血管在再上皮化过程开始后即可见。角膜新血管化的定性跟进(follow up)并没有说明SLURP-1治疗组和对照之间有任何差异。这是一项非常重要的观察，显示出SLURP-1的愈合性能与促血管生成作用不相关，也并不会阻碍角膜透明度的恢复。
这意味着在结膜下给药和滴注后，SLURP-1呈现出显著的角膜作用，并且没有副作用，尤其不存在角膜新血管化(其与(角膜)缘缺陷相关)，表明愈合效果与角膜转分化过程不相关。
实施例2：在校准(校正，calibrated)角膜去上皮模型中，局部或者结膜下给药后 的角膜伤口愈合。
遵循由第一角膜去上皮模型中得到的初步结果(其不仅暗示了愈合过程而且暗示了边缘不足)，选择乙醇诱导的去上皮的校准模型作为第二研究模型，从而专注于SLURP-1的角膜愈合特性。此项研究的目的是为了证实表明与对照相比被测试的蛋白质使再上皮化增强的初步结果，并评估蛋白质诱导的可能的剂量反应(剂量响应)。
该模型涉及用环钻(trephine)产生的校准伤口，其造成直径为4毫米的环形切口。即使在没有任何治疗的情况下，这样一个微小伤口的愈合速度也是非常快的(有时候2天左右)。因此，在切口当天，仅仅给药一次，并在第一个48小时内，通过一天两次的检验来对功效进行评估。
注射体积根据第一实验做了调整；剂量等同于给药体积的两倍和一半浓度的溶液(half concentrated solutions)。选择这种不同的剂量以延长结膜下注射产生的槽内的留存时间(retention time)以延长角膜表面上SLURP-1的存在，从而补偿在该标准化模型中进行的单次给药。
在这种第二实验模型中，证实了SLURP-1的功效；即，与局部途径相比，在加速眼部伤口愈合方面，低注射量的结膜下途径效率高6至60倍。
更具体地，如Hattori等人[25]所描述的，获得角膜上皮伤口。简而言之，在全身及局部麻醉后，以角膜为中心使用环钻(trephine)形成直径为4毫米的环形切口。接着，将已用70％乙醇浸泡的直径为4毫米的环形滤纸放置在切口区域持续5秒钟。在用5毫升的盐水轻柔冲洗后，除去分离的角膜上皮。
在D0时(角膜去上皮时间)通过1单次结膜下注射或6次滴注单独对右眼进行治疗给药。五组4到6只动物接受了以下治疗：
第1组：D0时，结膜下注射SLURP-10.5μg/mL(100μL)(每次给药50ng)
第2组：D0时，结膜下注射SLURP-15μg/mL(100μL)(每次给药500ng)
第3组：D0时，结膜下注射SLURP-150μg/mL(100μL)(每次给药5μg)
第4组：D0时，SLURP-1100μg/mL(50μL)(每次给药5μg)，6次滴注
第5组：D0时，结膜下注射赋形剂(100uL)
用生物显微镜检查右眼角膜。每个右眼角膜接收一滴0.5％的荧光素(诺华制药有限公司(Novartis pharma S.A.S))并利用钴蓝光检查。通过双眼(binocular)获得数码照片。在校准角膜去上皮模型的治愈随访(follow-up)中，分别在第0天、第1天上午(T23h)、第1天下午(T28h)、第2天上午(T47h)以及第2天下午(T56h)检查角膜(图4)。
数码照片由图像软件分析(Adobe Photoshop)。对于每只眼睛，在每个时间点，剩余的溃疡面积与总角膜面积进行了对比。针对每个组，愈合率的时间进程都在图像中得以呈现，从而比较对照(赋形剂和/和未进行任何治疗的对照)与SLURP-1治疗组。结果显示为平均值±SEM。使用GraphPad Prism(美国圣地亚哥GraphPad软件)进行ANOVA检测，然后是Dunnett多重比较测试或非参数曼惠特尼比较测试。
图5A中示出了对照和SLURP-1治疗组的角膜伤口闭合的时间进程。在比较T0h至T47h之间计算的愈合率时，SCJ注射500ng和5μg SLURP-1，相比于滴注或PBS结膜下给药组，愈合率显著提高(图5B)。由于在50ng-SCJ注射组中没有观察到显著效果，因此存在着剂量反应(剂量响应)效应。此外，在T47h，无论是结膜下注射500ng SLURP-1的治疗组、还是结膜下注射5μg SLURP-1的治疗组(图5C)，完全愈合角膜的数量均高于对照组(6个角膜中3个愈合)，其中500ng(5个角膜中有4个愈合)和5μg(5个角膜中有5个愈合)之间具有明显差异。
实施例3：对人角膜上皮细胞系hTCEpi的SLURP-1伤口闭合试验。
用于监测细胞迁移的伤口闭合试验是来自Platypus Technologies的Oris细胞迁移测定-胶原I包被。使用倒置显微镜视觉上测定细胞接种密度。吸取最佳细胞接种密度的100微升置于测试孔中，并在加湿室中培养(37℃，5％CO2)1到4小时，以使细胞附着。细胞松弛素D用作阳性对照。
以增加量的SLURP-1一式三份地进行实验。测试量为0μg/ml(阴性对照)、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、25μg/ml和50μg/ml。24小时后，板上的受伤区域呈现出不同的愈合程度。用10μg/ml SLURP-1治疗的细胞显示出最佳伤口愈合程度，如图6中可看到的。
从以上数据分析可以得知，本发明可获得的优点是突出的(apparent)。
特别地，在加速愈合率和更快减少伤口面积方面，特别是在保护眼睛表面免受感染方面，SLURP-1特定浓度和特定给药途径的有效关联带来了最优的效果。
此外，SLURP-1愈合性能与促血管生成效果不相关，也不会损害角膜透明度的恢复。
参考文献
1. Ploug,M.and V.Ellis,Structure-function relationships in thereceptor for urokinase-type plasminogen activator.Comparison to other membersof the Ly-6family and snake venom alpha-neurotoxins.FEBS Lett,1994.349(2):p.163-8.
2. Ploug,M.,et al.,Localization of the disulfide bonds in the NH2-terminal domain of the cellular receptor for human urokinase-type plasminogenactivator.A domain structure belonging to a novel superfamily of glycolipid-anchored membrane proteins.J Biol Chem,1993.268(23):p.17539-46.
3. Casey,J.R.,et al.,The structure of the urokinase-type plasminogenactivator receptor gene.Blood,1994.84(4):p.1151-6.
4. Adermann,K.,et al.,Structural and phylogenetic characterization ofhuman SLURP-1,the first secreted mammalian member of the Ly-6/uPAR proteinsuperfamily.Protein Sci,1999.8(4):p.810-9.
5. Tsuji,H.,et al.,SLURP-2,a novel member of the human Ly-6superfamily that is up-regulated in psoriasis vulgaris.Genomics,2003.81(1):p.26-33.
6. Ward,K.M.,et al.,Identification of recurrent mutations in the ARS(component B)gene encoding SLURP-1 in two families with mal de Meleda.JInvest Dermatol,2003.120(1):p.96-8.
7. Eckl,K.M.,et al.,Mal de Meleda(MDM)caused by mutations in the genefor SLURP-1 in patients from Germany,Turkey,Palestine,and the United ArabEmirates.Hum Genet,2003.112(1):p.50-6.
8. Fischer,J.,et al.,Mutations in the gene encoding SLURP-1 in Mal deMeleda.Hum Mol Genet,2001.10(8):p.875-80.
9. Fischer,J.,et al.,Genetic linkage of Meleda disease to chromosome8qter.Eur J Hum Genet,1998.6(6):p.542-7.
10. Tone,M.,L.A.Walsh,and H.Waldmann,Gene structure of human CD59 anddemonstration that discrete mRNAs are generated by alternativepolyadenylation.J Mol Biol,1992.227(3):p.971-6.
11. Reiter,R.E.,et al.,Prostate stem cell antigen:a cell surfacemarker overexpressed in prostate cancer.Proc Natl Acad Sci U S A,1998.95(4):p.1735-40.
12. Horie,M.,et al.,Isolation and characterization of a new member ofthe human Ly6 gene family(LY6H).Genomics,1998.53(3):p.365-8.
13. Shan,X.,et al.,Characterization and mapping to human chromosome8q24.3 of Ly-6-related gene 9804 encoding an apparent homologue of mouse TSA-1.J Immunol,1998.160(1):p.197-208.
14. Brakenhoff,R.H.,et al.,The human E48 antigen,highly homologous tothe murine Ly-6 antigen ThB,is a GPI-anchored molecule apparently involved inkeratinocyte cell-cell adhesion.J Cell Biol,1995.129(6):p.1677-89.
15. Mao,M.,et al.,RIG-E,a human homolog of the murine Ly-6 family,isinduced by retinoic acid during the differentiation of acute promyelocyticleukemia cell.Proc Natl Acad Sci U S A,1996.93(12):p.5910-4.
16. Samson,A.O.and M.Levitt,Inhibition mechanism of the acetylcholinereceptor by alpha-neurotoxins as revealed by normal-modedynamics.Biochemistry,2008.47(13):p.4065-70.
17. Samson,A.,et al.,The mechanism for acetylcholine receptorinhibition by alpha-neurotoxins and species-specific resistance to alpha-bungarotoxin revealed by NMR.Neuron,2002.35(2):p.319-32.
18. Chimienti,F.,et al.,Identification of SLURP-1 as an epidermalneuromodulator explains the clinical phenotype of Mal de Meleda.Hum MolGenet,2003.12(22):p.3017-24.
19. Mastrangeli,R.,et al.,ARS Component B:structuralcharacterization,tissue expression and regulation of the gene and protein(SLURP-1)associated with Mal de Meleda.Eur J Dermatol,2003.13(6):p.560-70.
20. Chernyavsky,A.I.,et al.,Coupling of ionic events to proteinkinase signaling cascades upon activation of alpha7 nicotinic receptor:cooperative regulation of alpha2-integrin expression and Rho kinaseactivity.J Biol Chem,2009.284(33):p.22140-8.
21. Arredondo,J.,et al.,Biological effects of SLURP-1 on humankeratinocytes.J Invest Dermatol,2005.125(6):p.1236-41.
22. Grando,S.A.,M.R.Pittelkow,and K.U.Schallreuter,Adrenergic andcholinergic control in the biology of epidermis:physiological and clinicalsignificance.J Invest Dermatol,2006.126(9):p.1948-65.
23. Grando,S.A.,Cholinergic control of epidermal cohesion.ExpDermatol,2006.15(4):p.265-82.
24. Favre,B.,et al.,SLURP1 is a late marker of epidermaldifferentiation and is absent in Mal de Meleda.J Invest Dermatol,2007.127(2):p.301-8.
25. Hattori,M.,et al.,Effects of all-trans retinoic acidnanoparticles on corneal epithelial wound healing.Graefes Arch Clin ExpOphthalmol,2011.
26. Chernyavsky,A.I.,et al.,Novel cholinergic peptides SLURP-1 and-2regulate epithelialization of cutaneous and oral wounds.Wound Rep Reg,2012.20:p.103-113.。

Claims (16)

1.由SEQ ID NO:1组成的蛋白质在制备用于诱导或加速受试者角膜伤口愈合的药剂中的用途。
2.包括由SEQ ID NO:1组成的蛋白质和至少一种生物相容性聚合物的组合物在制备用于诱导或加速受试者角膜伤口愈合的药剂中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述生物相容性聚合物选自由糖聚合物、卵磷脂凝胶、多聚丙氨酸衍生物、泊洛沙姆、胶原蛋白、纤维蛋白、聚原酸酯以及它们的混合物组成的组。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述生物相容性聚合物为糖聚合物。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述糖聚合物为葡聚糖。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述葡聚糖为羧甲基硫酸葡聚糖聚合物。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述羧甲基硫酸葡聚糖聚合物为
8.根据权利要求2所述的用途，其中所述生物相容性聚合物选自由透明质酸、壳聚糖、木葡聚糖以及它们的混合物组成的组。
9.包括由SEQ ID NO:1组成的蛋白质和至少一种纳米颗粒载体的组合物在制备用于诱导或加速受试者角膜伤口愈合的药剂中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述纳米颗粒载体选自由聚-ε-己内酯、聚氰基丙烯酸酯和壳聚糖组成的组。
11.根据权利要求2或9所述的用途，其中所述组合物通过局部处理给药。
12.权利要求2或9所述的用途，其中所述组合物通过结膜下注射给药。
13.根据权利要求2或9所述的用途，其中由SEQ ID NO:1组成的蛋白质的量为每给药单位5ng-50μg。
14.根据权利要求13所述的用途，其中由SEQ ID NO:1组成的蛋白质的量为每给药单位10ng-10μg。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述组合物通过结膜下注射给药且由SEQ IDNO:1组成的蛋白质的量为每给药单位20ng-90ng。
16.根据权利要求15所述的用途，其中由SEQ ID NO:1组成的蛋白质的量为每给药单位40ng-60ng。
CN201380064175.2A 2012-12-07 2013-12-09 用于治疗眼部疾病的蛋白质slurp-1 Expired - Fee Related CN105188731B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12196007.4A EP2740485B1 (en) 2012-12-07 2012-12-07 Protein slurp-1 for use in the treatment of ocular diseases
EP12196007.4 2012-12-07
PCT/EP2013/075981 WO2014087022A1 (en) 2012-12-07 2013-12-09 Protein slurp-1 for use in the treatment of ocular diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105188731A CN105188731A (zh) 2015-12-23
CN105188731B true CN105188731B (zh) 2019-02-05

Family

ID=47297008

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380064175.2A Expired - Fee Related CN105188731B (zh) 2012-12-07 2013-12-09 用于治疗眼部疾病的蛋白质slurp-1

Country Status (15)

Country Link
US (1) US10098925B2 (zh)
EP (1) EP2740485B1 (zh)
JP (1) JP6335188B2 (zh)
KR (1) KR20150108351A (zh)
CN (1) CN105188731B (zh)
AU (1) AU2013353957B2 (zh)
BR (1) BR112015013215A2 (zh)
CA (1) CA2891201A1 (zh)
CL (1) CL2015001520A1 (zh)
EA (1) EA201591095A1 (zh)
IL (1) IL239078A0 (zh)
MX (1) MX2015006779A (zh)
SG (2) SG11201503658XA (zh)
WO (1) WO2014087022A1 (zh)
ZA (1) ZA201503747B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2740485B1 (en) * 2012-12-07 2018-10-31 Brightpulse Holding LTD. Protein slurp-1 for use in the treatment of ocular diseases
EP3685822A1 (fr) * 2019-01-24 2020-07-29 Organes Tissus Régénération Réparation Remplacement Composition cosmetique/dermatologique
CN114601915B (zh) * 2022-03-25 2023-04-07 四川大学华西医院 Slurp1蛋白在制备预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物中的用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994014959A1 (en) * 1992-12-22 1994-07-07 Applied Research Systems Ars Holding N.V. New protein from urine named component b
WO2004091646A3 (en) * 2003-04-16 2004-12-16 Univ Lausanne Use of slurp-1 for treating diseases related to acetylcholine receptors dysfunction
WO2010138379A2 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Allergan, Inc. Methods of treating chronic neurogenic inflammation using galanin retargeted endopeptidases

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130122066A1 (en) * 2010-07-30 2013-05-16 Biopham Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh Drug delivery devices and growth factor formulations for accelerated wound healing
EP3345627B1 (en) * 2011-06-03 2021-01-06 Ophidion Inc. Compositions and methods for transport across the blood brain barrier
US9132193B2 (en) * 2012-11-05 2015-09-15 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Use of Slurp1 as an imunomodulatory molecule in the ocular surface
CN109589324B (zh) * 2012-11-08 2022-06-14 国立大学法人山口大学 角结膜病症的治疗剂
EP2740485B1 (en) * 2012-12-07 2018-10-31 Brightpulse Holding LTD. Protein slurp-1 for use in the treatment of ocular diseases

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994014959A1 (en) * 1992-12-22 1994-07-07 Applied Research Systems Ars Holding N.V. New protein from urine named component b
WO2004091646A3 (en) * 2003-04-16 2004-12-16 Univ Lausanne Use of slurp-1 for treating diseases related to acetylcholine receptors dysfunction
WO2010138379A2 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Allergan, Inc. Methods of treating chronic neurogenic inflammation using galanin retargeted endopeptidases

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Identification of SLURP-1 as an epidermal neuromodulator explains the clinical phenotype of Mal de Meleda;Fabrice Chimienti等;《Human Molecular Genetics》;20031231;第12卷(第22期);3017-3024
Novel cholinergic peptides SLURP-1 and -2 regulate epithelialization of cutaneous and oral wounds;Alexander I. Chernyavsky等;《Wound Repair Regen.》;20120131;第20卷(第1期);103-113

Also Published As

Publication number Publication date
EP2740485B1 (en) 2018-10-31
CA2891201A1 (en) 2014-06-12
EA201591095A1 (ru) 2015-11-30
MX2015006779A (es) 2015-10-29
CL2015001520A1 (es) 2016-05-20
WO2014087022A1 (en) 2014-06-12
AU2013353957B2 (en) 2018-05-17
JP2016502558A (ja) 2016-01-28
IL239078A0 (en) 2015-07-30
SG11201503658XA (en) 2015-06-29
CN105188731A (zh) 2015-12-23
JP6335188B2 (ja) 2018-05-30
EP2740485A1 (en) 2014-06-11
KR20150108351A (ko) 2015-09-25
US10098925B2 (en) 2018-10-16
ZA201503747B (en) 2016-03-30
SG10201705592YA (en) 2017-08-30
AU2013353957A1 (en) 2015-05-28
US20150320831A1 (en) 2015-11-12
BR112015013215A2 (pt) 2018-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Handa et al. Increase in the advanced glycation end product pentosidine in Bruch's membrane with age.
JP6247692B2 (ja) 皮膚瘢痕を治療する組成物及び方法
Campochiaro et al. Vitreous aspirates from patients with proliferative vitreoretinopathy stimulate retinal pigment epithelial cell migration
Kandarakis et al. The effect of epidermal growth factor on epithelial healing after penetrating keratoplasty in human eyes
CN102256613B (zh) 用于治疗或者预防粘连的多肽
EA013966B1 (ru) Применение эритропоэтина для лечения сахарного диабета
TW201615187A (zh) 用於舒緩及減輕近視之醫藥組合物及其製備方法與用途
CN110724203A (zh) 一种促进tfeb核转位的短肽及基于其的线性短肽和其减轻脑缺血损伤的应用
CN105188731B (zh) 用于治疗眼部疾病的蛋白质slurp-1
Acosta et al. Treatment of corneal ulcers with platelet rich plasma
JP7026050B2 (ja) 慢性創傷を治療するための組成物及び方法
Chen et al. Pathogenic role of endoplasmic reticulum stress in diabetic corneal endothelial dysfunction
US5145680A (en) Eye drop formulation useful for treating lesions of corneal epithelium
Cheng et al. Recent advances in ocular graft-versus-host disease
CN112891326B (zh) 一种载有那他霉素的海藻酸凝胶药膜及其制备方法
CN111150831B (zh) 多肽KdPT的应用
RU2699206C1 (ru) Способ лечения дефектов роговицы с помощью аутологичного тромбофибринового сгустка
JP2009542609A (ja) 薬剤
CN111346217B (zh) 多肽tdl23的新用途
US20240016893A1 (en) Compositions and methods for treating wounds
Yan et al. Smart coating by thermo-sensitive Pluronic F-127 for enhanced corneal healing via delivery of biological macromolecule progranulin
Mohamed et al. Vitiligo: Highlights on Pathogenesis, Clinical Presentation and Treatment
CN115715798A (zh) 用于糖尿病创面修复的细胞因子及其应用
RU2455020C2 (ru) Способ повышения репаративной активности
WO2022076117A1 (en) Biomimetic wound healing devices and related methods of treating diabetic wounds

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20190205

Termination date: 20191209

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee