CN114601915B - Slurp1蛋白在制备预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种SLURP1蛋白在制备预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物中的用途。针对现有皮肤弹性纤维疾病治疗困难，还未见有通过促进真皮成纤维细胞增殖活性、增加弹性蛋白合成方式来治疗皮肤弹性纤维疾病的报道等问题，本发明首次发现了内源性或外源性的SLURP1蛋白通过自分泌或旁分泌的方式，能够增强真皮成纤维细胞增殖活性，促进弹性蛋白表达，提示SLURP1蛋白可以用于制备预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物，为SLURP1蛋白开发了一种新的用途，也为皮肤弹性纤维疾病提供了一种新的用药选择，具有重要的现实意义。

Description

SLURP1蛋白在制备预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种SLURP1蛋白在制备预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物中的用途。

背景技术

皮肤弹性纤维病是以真皮弹性纤维结构或数量异常为特征的一大类疾病，包括遗传性及获得性，临床多表现为皮肤松弛、弹性减退，部分可累及内脏，甚至危及生命，幼年发病者还可致生长迟滞及发育障碍。迄今，皮肤弹性纤维病发病机制尚未完全厘清，治疗仍相当困难。既往，维生素E、氯法齐明、秋水仙碱、氨苯砜及糖皮质激素等多种药物被尝试用于治疗该类疾病，但疗效甚微，目前仍多采用整形手术等方式进行对症处理。弹性蛋白是构成真皮弹性纤维的主要成分(约占90％)，主要由真皮成纤维细胞合成。因此，促进真皮成纤维细胞增殖、增加弹性蛋白合成有望成为治疗皮肤弹性纤维病的新方法。

分泌型LY6/尿激酶型纤溶酶原激活物受体相关蛋白1(secreted LY6/urokinasetype plasminogen activator receptor(uPAR)related protein-1,SLURP1)是一种分泌型胆碱能神经肽，属于LY6/uPAR超家族，由N端信号肽(1-22氨基酸)及纤溶酶原激活物受体结合位点(23-103氨基酸)结构域组成，表达于多种细胞(角质形成细胞、成纤维细胞、免疫细胞等)及组织(皮肤、牙龈、子宫颈等)，并分泌入血液、尿液、唾液、汗液等体液中。目前，已有报道显示SLURP1对牙周韧带成纤维细胞具有保护作用。专利CN109490545A也提供了SLURP1、SHISA5和FAM25A蛋白作为标志物在制备用于检测骨关节炎试剂中的应用。但目前，尚无任何SLURP1对真皮成纤维细胞作用的报道，亟待研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：现有皮肤弹性纤维疾病治疗困难，还未见有通过促进真皮成纤维细胞增殖活性、增加弹性蛋白合成方式来治疗皮肤弹性纤维疾病的报道。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种SLURP1蛋白在制备预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物中的用途。

其中，所述皮肤弹性纤维疾病为具有真皮弹性纤维碎裂或减少特征的一类疾病。

进一步的，所述皮肤弹性纤维疾病包括皮肤松弛症、弹性假黄瘤样真皮乳头层弹性组织溶解症或真皮中层弹性组织溶解症中的至少一种。

其中，所述的SLURP1蛋白在制备预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物中的用途中，SLURP1蛋白通过增强真皮成纤维细胞增殖活性起作用。

其中，所述的SLURP1蛋白在制备预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物中的用途中，SLURP1蛋白通过促进弹性蛋白表达起作用。

本发明还提供了一种预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物，所述药物中包括SLURP1蛋白。

其中，所述皮肤弹性纤维疾病为具有真皮弹性纤维碎裂或减少特征的一类疾病。

进一步的，所述皮肤弹性纤维疾病包括皮肤松弛症、弹性假黄瘤样真皮乳头层弹性组织溶解症或真皮中层弹性组织溶解症中的至少一种。

本发明的有益效果为：

本发明通过细胞转染技术沉默及过表达真皮成纤维细胞的SLURP1基因，使用表皮角质形成细胞与真皮成纤维细胞共培养，首次发现SLURP1蛋白对真皮成纤维细胞有显著的保护作用，能够增加真皮成纤维细胞的增殖活性，促进弹性蛋白的分泌，提示SLURP1蛋白对皮肤弹性纤维疾病具有潜在的治疗作用，可以用于制备预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物。

附图说明

图1所示为实施例1中的细胞免疫荧光图，显示真皮成纤维细胞HDF及表皮角质形成细胞HaCaT中SLURP1蛋白表达情况，SLURP1在HaCaT细胞及HDF细胞中均有表达；比例尺＝50μm；

图2所示为实施例1中实时荧光定量PCR图，显示真皮成纤维细胞HDF及表皮角质形成细胞HaCaT中SLURP1基因表达情况，SLURP1 mRNA在HaCaT细胞中表达高于HDF细胞(**p<0.01，n＝3)；

图3所示为实施例2中的质粒构建模式图及实时荧光定量PCR图：(a)pCMV6-SLURP1质粒构建模式图；(b-c)RT-qPCR检测SLURP1下调表达及上调表达效率：(b)与NC对照组比较，siRNA组SLURP1 mRNA表达明显降低，且差异具有统计学意义(*p<0.05，n＝3)；(c)与pCMV6-entry对照组比较，pCMV6-SLURP1组SLURP1 mRNA表达明显升高，且差异具有统计学意义(*p<0.05，n＝3)。

图4所示为实施例3中CCK-8法检测HDF细胞活性：(a)与NC对照组比较，转染48h后siRNA组细胞活性出现降低，且随着转染时间延长细胞活性降低越多(*p<0.05，n＝3)；(b)与pCMV6-entry对照组比较，转染48h后pCMV6-SLURP1组细胞活性出现升高，且随着转染时间延长细胞活性升高越多(*p<0.05，n＝3)。

图5所示为实施例5中CCK-8法检测HDF细胞活性：(a)与对照组比较，HaCaT共培养组HDF细胞活性随着HaCaT接种时密度增加逐渐增加，随着培养时间延长HDF细胞活性逐渐增加(ns：not significant，*p<0.05，**p<0.01，n＝3)；(b)HaCaT组及转染NC-siRNA的NC组HDF细胞活性均增高，与对照组比较差异均有统计学意义(**p<0.01，n＝3)；转染SLURP1-siRNA的siRNA组HDF细胞活性较HaCaT组、NC组降低，且差异均有统计学意义(ns：notsignificant，*p<0.05，**p<0.01，n＝3)。

图6所示为实施例6中ELISA检测HDF弹性蛋白ELN的表达：(a)与NC对照组比较，siRNA组ELN表达下调，且差异具有统计学意义(*p<0.05，n＝3)；(b)与pCMV6-entry对照组比较，pCMV6-SLURP1组ELN表达上调，且差异具有统计学意义(*p<0.05，n＝3)。

图7所示为SLURP1对HDF合成真皮弹性纤维可能作用途径模式图：(a)自分泌途径；(b)旁分泌途径。表皮角质形成细胞KC，真皮成纤维细胞HDF，弹性蛋白ELN。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式作解释说明，但并不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

实施例中所使用的真皮成纤维细胞HDF由上海中乔新舟生物科技有限公司提供，表皮角质形成细胞HaCaT由广州赛库生物技术有限公司提供，其余试剂或材料均为普通市售产品。

实施例1真皮成纤维细胞HDF与表皮角质形成细胞中SLURP1的表达

1、细胞免疫荧光

(1)消化、计数、重悬：待培养瓶内HDF、HaCaT细胞长至80％后，以0.25％胰酶消化、血球计数板计数，调整细胞密度至适宜密度。

(2)铺板：将以75％乙醇浸泡晾干后的爬片放置于24孔板内，每孔加入500ul的DMEM完全培养基润洗，然后每孔加入500ul细胞重悬液，摇匀。

(3)培养：将孔板放于37℃5％CO₂孵箱内静置培养2天。

(4)固定：吸出孔板内原培养基，PBS清洗3次后加入4％多聚甲醛溶液固定10min，吸走固定液后用PBS再次清洗3次后干燥。

(5)一抗孵育：稀释SLURP1抗体(1:50)，滴加至切片上，在室温下孵育1-2h后于4℃冰箱过夜。

(6)二抗孵育：复温洗涤切片后滴加抗兔荧光二抗(1:400)，于37℃5％CO₂孵箱中避光孵育45min。

(7)DAPI核染色：洗涤切片，滴加DAPI工作液，室温下避光孵育5min。

(8)洗涤后甘油封片，避光冷藏。

(9)图像采集：荧光显微镜下观察、采图，结果如图1所示，可见真皮成纤维细胞HDF及表皮角质形成细胞HaCaT中SLURP1蛋白表达情况。

2、RNA抽提

(1)收样

当HDF和HaCaT细胞在6孔板内培养长满后，弃原培养基，予冷PBS洗涤细胞2-3次，弃PBS，每孔加入1ml Trizol，枪头吹打充分裂解细胞后，收集匀浆至1.5ml EP管中，并在管壁标记细胞分组及日期，-80℃冰箱冻存。

(2)提取RNA

①将-80℃保存的RNA放置于冰上解冻。同时氯仿置于冰上预冷，离心机4℃预冷。

②待RNA融化后，每管加入200μl氯仿，振荡15sec，静置5min。同时异丙醇冰上预冷。

③离心机12000g离心15min。离心后，液体从上至下分为3层，分别为上层无色水相，中层白色沉淀，下层红色有机相。RNA主要在上层水相中。将上层水相移至新的EP管中。

④每管加入异丙醇500μl，振荡2-3s，静置10min。

⑤离心机12000g离心10min。同时配制75％乙醇，每管准备1ml。

⑥离心后，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻微振荡，使RNA脱壁。

⑦离心机7500g离心5min后，弃上清，风干。

⑧每管加入25μl DEPC水溶解RNA。

(3)琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，超微量分光光度计检测RNA纯度。

3、逆转录PCR

去基因组DNA体系体积为10ul，含10×Reaction Buffer with MgCl₂ 1ul，DNaseI 1ul，模板RNA 1ug，补足nuclease-free water至10μl。37℃孵化30min后添加50mM EDTA1ul，65℃再孵化10min。

逆转录PCR扩增反应体系体积20μl，含Primer Oligo(DT)1μl，5×ReactionBuffer 4μl，RiboLock RNase Inhibitor(20U/μl)1μl，10mM dNTP Mix 2μl，RevertAid M-MuLV RT(200U/μl)1μl，去基因组产物11ul。逆转录PCR反应条件：42℃反应60min，70℃5min终止反应。产物放-20℃备用。

4、实时荧光定量PCR

(1)引物设计

通过NCBI基因库检索所用基因序列，采用primer 5.0软件严格按照引物设计原则设计合成引物序列。引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。引物序列如下：SLURP1(NM_020427.3)，正向引物序列如SEQ ID NO:1(5’-TTCTGAGCACGGAGCAATGG-3’)所示，反向引物序列如SEQ ID NO:2(5’-TGGTTGAAGGGGTACTCTGC-3’)所示。GAPDH(NM_001357943.2)，正向引物序列如SEQ ID NO:3(5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’)所示；反向引物序列如SEQID NO:4(5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’)所示。

(2)PCR扩增

PCR扩增体系体积10μl，含SYBR Green 5μl，10μM正反向引物各0.5μl，模板cDNA 2μl，DEPC水2μl。PCR反应条件：95℃预变性1min后，95℃变性10sec，56℃退火20sec，72℃延伸20sec，共40个循环。溶解曲线采集：65℃至95℃每秒上升0.1℃。

(3)引物验证

在正式实验前，先取一个样本对所设计引物进行验证，以确定引物特异性。

(4)基因表达量计算

检测所有样本各基因表达水平，每个样本每个目标基因设计3个复孔。所得数据经Bio-Rad CFX Manager 3.1软件进行处理和分析，通过2-ΔΔCt法计算基因表达水平，以GAPDH为内参基因标准化结果。结果如图2所示，同免疫荧光图相类似，本实施例在基因层面证实SLURP1在HDF及HaCaT细胞中表达，并且HaCaT表达量高于HDF细胞表达量。

由此可见，SLURP1在HDF细胞和HaCaT细胞中均有表达，通过沉默或过表达HDF细胞，可以说明HDF自身分泌的内源性SLURP1对HDF本身的影响；通过沉默或过表达HaCaT细胞中SLURP1，采用HaCaT与HDF共培养的方式，可以说明由HaCaT分泌的外源性SLURP1对HDF的影响。

下面通过后续的实施例来进行说明。

实施例2构建真皮成纤维细胞HDF敲减及过表达模型

设计并构建多条siRNA(购自广州锐博生物科技有限公司)及重组pCMV6-SLURP1质粒(购自上海汉恒生物有限公司)。将对数生长期的HDF细胞消化、重悬后，以适宜密度接种于6孔板，在37℃，5％CO₂孵箱培养48h后分别以

RNAiMAX(Thermo,USA)、Lipofectamine^TM3000转染(Thermo,USA)HDF，按转染试剂说明书进行操作，继续培养48h后收集HDF细胞RNA，通过RT-qPCR(具体方法同实施例1)筛选出具有最佳SLURP1基因沉默效率的siRNA(靶序列如SEQ ID NO:5所示：ACCTCTGCAACTCGGAACT)及最佳过表达效果的重组pCMV6-SLURP1质粒用于后续研究(如图3所示)。

实施例3内源性SLURP1对真皮成纤维细胞HDF细胞活性的影响

在前期成功构建SLURP1敲减及过表达HDF模型的基础上，采用CCK-8法检测HDF细胞活性。本法利用水溶性四唑盐-

-8(2-2-甲氧基-4-硝苯基)-3(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑可被电子载体1-Methoxy PMS还原成橙黄色水溶性的甲臜染料，生成的甲臜量与细胞增殖数量成正比，从而可用于检测细胞增殖能力。

将对数生长期的HDF细胞消化、重悬后，以适宜密度接种于96孔板，在37℃，5％CO₂孵箱培养24h，分别转染NC-siRNA(对照组)、SLURP1-siRNA(SLURP1沉默组)与pCMV6-entry(对照组)、pCMV6-SLURP1(SLURP1过表达组)。实验组为SLURP1-siRNA(SLURP1沉默组)、pCMV6-SLURP1(SLURP1过表达组)，对照组分别为NC-siRNA，pCMV6-entry，设置一个空白组，空白组为不加细胞只加DMEM完全培养基，每一样品设3个复孔，转染后继续培养24h、48h、72h后每孔加入10μl的CCK-8溶液，在37℃5％CO₂孵箱内孵育2h后，在酶标仪450nm波长下测量各孔吸光度值。HDF细胞活性(％)＝[(实验组平均吸光度值-空白组平均吸光度值)/(对照组平均吸光度值-空白组平均吸光度值)]×100％。

实验结果如图4所示，结果显示：与NC对照组比较，转染48h后siRNA组细胞活性出现降低，且随着转染时间延长细胞活性降低越多(*p<0.05，n＝3)。与pCMV6-entry对照组比较，转染48h后pCMV6-SLURP1组细胞活性出现升高，且随着转染时间延长细胞活性升高越多(*p<0.05，n＝3)。

由此可见，内源性SLURP1具有促进HDF增殖的作用。

实施例4构建表皮角质形成细胞与真皮成纤维细胞共培养模型

参考文献方法(Ries C,et al.Toxicology.2009；263(1):26-31)将表皮角质形成细胞HaCaT用无血清DMEM培养基混悬后接种于6孔板内，待细胞贴壁后离心，取其上清培养基加入以适宜密度接种至96孔板内已贴壁的HDF孔内，培养基用于HaCaT与HDF的物质交换，以此构建HaCaT与HDF共培养体系。

实施例5外源性SLURP1对真皮成纤维细胞HDF细胞活性的影响

将表皮角质形成细胞HaCaT用无血清DMEM培养基混悬后以3种不同密度接种于6孔板内，待细胞贴壁后离心，取其上清培养基加入以相同适宜密度接种至96孔板内已贴壁的HDF孔内，对照组HDF未经HaCaT共培养。继续培养一定时间，以CCK-8法检测HDF细胞活性(检测方法同实施例3)。

随后将NC-siRNA、SLURP1-siRNA转染至HaCaT干扰其SLURP1表达，转染48h。分别使用未经HaCaT处理的培养基(对照组)、HaCaT培养基(HaCaT组)、转染空载NC-siRNA至HaCaT处理的培养基(NC组)及转染SLURP1-siRNA至HaCaT处理的培养基(siRNA组)继续培养HDF48h，采用CCK-8法检测HDF细胞活性(检测方法同实施例3)。所用培养基均为无血清DMEM培养基。

结果如图5所示，由图5a可知：与对照组比较，HaCaT共培养组HDF细胞活性随着HaCaT接种时密度增加逐渐增加，随着培养时间延长HDF细胞活性逐渐增加(ns：notsignificant，*p<0.05，**p<0.01，n＝3)；图5b显示：HaCaT组及转染NC-siRNA的NC组HDF细胞活性均增高，与对照组比较差异均有统计学意义(**p<0.01，n＝3)；转染SLURP1-siRNA的siRNA组HDF细胞活性较HaCaT组、NC组降低，且差异均有统计学意义(ns：notsignificant，*p<0.05，**p<0.01，n＝3)。

由此可见，由表皮角质形成细胞分泌的外源性SLURP1可促进HDF增殖。

实施例6 SLURP1对弹性蛋白ELN表达的影响

在前期成功构建SLURP1敲减及过表达HDF模型的基础上，通过ELISA法检测HDF细胞弹性蛋白ELN浓度。

将对数生长期HDF细胞消化、重悬后，以适宜密度接种于24孔板，在37℃5％CO₂孵箱培养24h，分别转染NC-siRNA、SLURP1-siRNA与pCMV6-entry、pCMV6-SLURP1。实验组为SLURP1-siRNA、pCMV6-SLURP1，对照组分别为NC-siRNA，pCMV6-entry。转染后继续培养72h后，收集其上清，根据ELISA Elastin试剂盒(Cusabio,China)说明进行检测。

结果如图6所示，由图可知：与NC对照组比较，siRNA组ELN表达下调，且差异具有统计学意义(*p<0.05，n＝3)；与pCMV6-entry对照组比较，pCMV6-SLURP1组ELN表达上调，且差异具有统计学意义(*p<0.05，n＝3)。

由此可见，SLURP1具有调控皮肤弹性蛋白表达，促进真皮弹性纤维合成的作用。

通过上述实施例，本发明从基因层面和细胞层面都发现了SLURP1蛋白具有增强真皮成纤维细胞活性的作用，也具有促进弹性蛋白表达的作用。SLURP1蛋白可能通过自分泌途径或旁分泌途径来调控真皮成纤维细胞活性和弹性蛋白表达，具体如图7所示。

本发明首次发现了SLURP1蛋白可以用于制备预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物，为预防或治疗皮肤弹性纤维疾病提供了一种新的药物选择和治疗途径，也为SLURP1蛋白提供了一种新的用途，具有很好的应用前景。

序列表

<110> 四川大学华西医院

<120> SLURP1蛋白在制备预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物中的用途

<141> 2022-03-25

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttctgagcac ggagcaatgg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggttgaagg ggtactctgc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcaccacca actgcttagc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcatggact gtggtcatga g 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acctctgcaa ctcggaact 19

Claims (5)

1.SLURP1蛋白在制备预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的SLURP1蛋白在制备预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物中的用途，其特征在于：所述的皮肤弹性纤维疾病为具有真皮弹性纤维碎裂或减少特征的一类疾病。

3.根据权利要求2所述的SLURP1蛋白在制备预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物中的用途，其特征在于：所述的皮肤弹性纤维疾病包括皮肤松弛症、弹性假黄瘤样真皮乳头层弹性组织溶解症或真皮中层弹性组织溶解症中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的SLURP1蛋白在制备预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物中的用途，其特征在于：所述SLURP1蛋白通过增强真皮成纤维细胞增殖活性起作用。

5.根据权利要求1所述的SLURP1蛋白在制备预防或治疗皮肤弹性纤维疾病的药物中的用途，其特征在于：所述SLURP1蛋白通过促进弹性蛋白表达起作用。

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