RU2455020C2

RU2455020C2 - Способ повышения репаративной активности

Info

Publication number: RU2455020C2
Application number: RU2010129035/15A
Authority: RU
Inventors: Александр Владимирович Зурочка (RU); Александр Владимирович Зурочка; Юрий Геннадьевич Суховей (RU); Юрий Геннадьевич Суховей; Владимир Александрович Зурочка (RU); Владимир Александрович Зурочка; Мария Александровна Добрынина (RU); Мария Александровна Добрынина; Сергей Анатольевич Петров (RU); Сергей Анатольевич Петров; Ирина Генриховна Унгер (RU); Ирина Генриховна Унгер; Елена Геннадьевна Костоломова (RU); Елена Геннадьевна Костоломова
Original assignee: Учреждение Российской академии наук Тюменский научный центр Сибирского отделения РАН (ТюмНЦ СО РАН); Александр Владимирович Зурочка; Юрий Геннадьевич Суховей
Priority date: 2010-07-13
Filing date: 2010-07-13
Publication date: 2012-07-10
Also published as: RU2010129035A

Abstract

Изобретение относится к медицине и касается способа повышения репаративной активности организма, заключающегося в обработке раны ранозаживляющим составом с пептидами, используемыми в лекарственной основе. В качестве пептидов используют синтетические пептиды, имеющие структуру LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO и THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO. Изобретение обеспечивает повышение репаративной активности в отношении раневого процесса. 7 ил.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии и иммунологии, хирургии, травматологии, фармакологии, клинической фармакологии, и может использоваться как способ, ускоряющий заживление ран различного генеза, благодаря повышению репаративной активности организма.

Ближайшим по совокупности существенных признаков аналогом того же назначения являются принятые за прототип средство и способ его введения, обладающие репаративной активностью, описанные в патенте России №2008006, опубл. 2 февраля 1994 г. Известное средство получено путем выделения методом последовательной жидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии из супернатантов активированных монодисперстным полистирольным латексом нейтрофилов человека, выделенных из периферической крови доноров методом градиентного центрифугирования на градиенте плотности фиколлверографина. После троекратного внутримышечного введения средства в определенной дозе получают ускорение репарации и эпителизации ран.

Недостатками указанного средства являются не только отсутствие химической формулы средства, длительное трудоемкое его получение, требуется живая донорская кровь (для получения данного вещества нужны живые клетки), но и способ введения (внутримышечно), являющийся инвазивным, болезненным для пациента, требующим для его осуществления определенных условий (определенную подготовку персонала, дополнительных средств (шприцы, спиртовые шарики…)). Кроме того, при парентеральном введении вводимые вещества неизбежно распространяются по всему организму и оказывают влияние на другие органы и ткани, что может привести к нежелательным эффектам.

Медико-техническая задача способа как изобретения - повышение репаративной активности в отношении раневого процесса.

Поставленная задача решается тем, что в способе повышения репаративной активности организма, заключающимся в обработке раны ранозаживляющим составом с пептидами, используемыми в лекарственной основе, согласно изобретению в качестве пептидов используют синтетические пептиды, имеющие структуру от LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO и до THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO, м.м. от 1794 до 1397 дальтон, в ранозаживляющем составе в качестве лекарственной основы используют гель, готовят ранозаживляющий состав, в котором гель - 5 граммов, синтетических пептидов - 10 миллиграммов, ранозаживляющий состав наносят на открытую рану из расчета площади раны, один раз в сутки.

За счет того, что в качестве пептидов используют синтетические пептиды имеющие структуру от LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO и до THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO, м.м. от 1794 до 1397 дальтон, в ранозаживляющем составе в качестве лекарственной основы используют гель, готовят ранозаживляющий состав, в котором гель - 5 граммов, синтетических пептидов - 10 миллиграммов, ранозаживляющий состав наносят на открытую рану из расчета площади раны, один раз в сутки, повышается репаративная активность в отношении раневого процесса.

Заявляемый способ обладает новизной в сравнении с прототипом, отличается высокой эффективностью, простотой использования, атравматичностью и безболезненностью для пациента, имеет широкий спектр показаний, при этом степень выраженности репарационной активности заявляемого способа по сравнению с известными аналогами значительно выше, то есть имеются все признаки достижения заданного результата.

Заявителю не неизвестны технические решения, обладающие указанными отличительными признаками, обеспечивающие в совокупности достижение заданного результата, поэтому он считает, что заявляемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ может найти широкое применение в аллергологии и иммунологии, хирургии, травматологии, фармакологии, клинической фармакологии.

Способ и оценка активности заявляемого способа осуществлялись на мышах следующим образом.

на фиг.1 - последовательность нанесения, обработки раны и наблюдение за динамикой репаративного процесса;

на фиг.2 - изменение веса тела животных в процессе наблюдения;

на фиг.3 - изменение температуры тела животных в процессе наблюдения;

на фиг.4 - динамика репаративного процесса у животных из контрольной группы;

на фиг.5 - динамика репаративного процесса под влиянием пептида ZP-1;

на фиг.6 - динамика репаративного процесса под влиянием пептида ZP-2;

на фиг.7 - фото ран всех животных в динамике репаративного процесса.

Модель открытой раны. Для стандартизации площади и глубины формирования раны использовался трафарет из тонкого оргстекла с отверстием размером 3,5×7,2 мм. Животному предварительно дается легкий эфирный наркоз - мышь помещается на 10 секунд в эксикатор, где лежит вата, обильно смоченная эфиром. Затем один исследователь фиксирует мышь руками, а другой - обрабатывает среднюю линию нижней трети спины мыши 70° спиртом, прикладывает трафарет, вытягивает за шерсть кожу на высоту 1 мм и делает срез стерильными хирургическими ножницами. При этом способе не затрагивается мышечный слой. В результате у мыши получается открытая рана площадью 7-10 мм² на глубину кожного покрова. Вся процедура занимает около 15 секунд. После этого рана обрабатывается одним из тестируемых биологически активным веществом (фиг.1).

Исследование проведено на 56 лабораторных мышах, ♂, возрастом 4-6 месяцев. Животные были разделены на 7 равных групп: 6 - опытных и 1 контрольную. В качестве тестируемых биологически активных веществ были выбраны 6 препаратов - антибиотик пептид MNP1-3, антибиотик пептид LL37, тромбодефенсин, интерцид, пептид Zp-1 (LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO) и пептид Zp-2 (THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO), приготовленных на гелевой основе. Контрольным животным рану обрабатывали гелевым раствором.

Методы исследования. Проводились ежедневное взвешивание животных через 2 часа после кормления, измерение ректальной температуры тела. Для анализа заживления по типу вторичного натяжения проводилось измерение площади раневой поверхности. Для этого на рану накладывалась стерильная пластинка целлофана и на нее маркером переносили контуры раны. Затем дважды проводили измерение диаметра контура раны штангенциркулем и с учетом среднего значения вычисляли площадь раны по формуле S=π·А·В, где А и В - радиусы овала. Затем рассчитывалось посуточное уменьшение площади раны в процентах.

Собственные результаты. На фиг.2 представлены полученные данные влияния на вес лабораторных мышей изучаемых веществ.

Как видно из результатов, отраженных на фиг.2, изучаемые препараты не оказывали статистически значимого влияния на вес животных в течение всего процесса наблюдения.

На фиг.3 представлены полученные данные по термометрии лабораторных мышей в динамике после введения им изучаемых веществ.

Данные, представленные на фиг.3, показывают, что в течение первых суток после нанесения раны, с одной стороны, у всех опытных животных температура тела повысилась на 0,5-0,7°С, с другой - все тестируемые препараты в той или иной степени способствовали снижению температуры тела у опытных животных относительно контрольных. К 11-м суткам после нанесения раны температура тела у всех животных практически стабилизировалась.

Известно, что под раной понимают нарушение целостности покровных тканей тела, которое обычно сопровождается потерей ткани. При этом регенерация - это восстановление тканей, органов, отдельных частей живых существ, подвергшихся разрушению или утрате. Различают следующие типы регенерации:

Регенерация физиологическая - регенерация тканей, отмирающих в процессе нормальной жизнедеятельности организма, например регенерация эпидермиса.

Регенерация репаративная - регенерация участков органов или тканей, погибших в результате какого-либо патологического процесса.

Регенерация патологическая - регенерация, характеризующаяся замедленным течением процессов заживления или избыточным развитием замещающей ткани.

Известно, что весь процесс репарации раны состоит из трех основных фаз - воспаления, пролиферации и эпителизации. В классической патологии принято выделять три стадии воспаления:

I. Стадия альтерации (повреждения).

II. Стадия экссудации и эмиграции.

III. Стадия пролиферации и репарации.

Однако новые исследования и новые факты показали, что указанные стадии не монолитны, между ними нет четких границ (например, альтерация может быть максимально выражена на стадии гнойной экссудации, а нарушения микроциркуляции могут быть неодинаковыми в одно и то же время в различных участках очага воспаления).

Стадия альтерации. Это начальная, пусковая стадия воспаления, характеризующаяся повреждением тканей. Она включает разнообразные изменения клеточных и внеклеточных компонентов в месте действия повреждающего фактора, в том числе активацию физиологических процессов.

Стадия экссудации и эмиграции. Это выход жидкой части крови, электролитов, белков и клеток из сосудов в ткани. Выход лейкоцитов (эмиграция) занимает в этом процессе особое место. Основной причиной экссудации является повышение проницаемости гистогематического барьера, т.е. сосудистой стенки, прежде всего капиллярных сосудов и венул. Смысл эмиграции состоит в том, чтобы в очаге воспаления скопилось достаточное число клеток, играющих роль в развитии воспаления (фагоцитоз и т.д.). В эмиграции участвуют все формы лейкоцитов: нейтрофилы, моноциты, лимфоциты, эозинофилы, базофилы. При остром воспалении первыми эмигрируют нейтрофилы, спустя несколько часов - моноциты и лимфоциты и другие формы лейкоцитов. После завершения воспалительного процесса в очаге наблюдается постепенное исчезновение клеток крови, начиная с тех лейкоцитов, которые появились раньше (нейтрофильные гранулоциты). Позже элиминируются лимфоциты и моноциты.

Пролиферация и завершение процесса. На этой стадии постепенно прекращаются разрушительные процессы и сменяются созидательными процессами. Прежде всего - это размножение клеток и возмещение возникшего ранее дефекта новообразованными клетками. Одновременно с размножением клеток и даже несколько опережая его, идет процесс активного погашения воспалительного процесса, что проявляется ингибицией ферментов, дезактивацией воспаления, расщеплением и выведением токсических продуктов. Активность клеток воспаления тормозится разными механизмами. Что касается ингибиторов, то в этом отношении важнейшую роль играет α₂-макроглобулин (α₂-М). В контроль за воспаление включаются и другие ингибиторы, в том числе альфа-антихимотрипсин (α₁-AX), который тормозит катепсин I и химотрипсин. Антитромбин III и α₂-антиплазмин ингибируют сериновые ферменты и являются главными ингибиторами системы коагуляции, фибринолиза и комплемента. Изменяется взаимоотношение между клетками. Они перестают вырабатывать одни медиаторы и начинают синтезировать другие. Теперь на тот же медиатор клетка может дать совсем другой ответ, потому что на ее поверхности появляются совсем другие рецепторы, а прежние проникают внутрь (интернализация).

На фиг.4 представлена динамика репаративного процесса у лабораторных мышей в контроле.

Из результатов измерения площади раневой поверхности видно, что у контрольных животных фаза воспаления длится 2 суток, фаза пролиферации - 4 суток (с пиком активности на 4 сутки), фаза эпителизации - 10 суток (пик активности на 7 сутки). 100% эпителизация раневой поверхности у животных из контрольной группы произошла на 16 сутки.

Из результатов, отраженных на фиг.5, видно, что под влиянием препарата пептид Zp-1 (LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO) фаза воспаления длится одни сутки, между фазой воспаления и пролиферации не происходит снижения активности репаративных процессов, и фаза воспаления плавно переходит в фазу пролиферации, которая длится 2 суток. Процесс эпителизации начинается на 5 сутки с максимумом активности на 6 сутки. 100% эпителизация раны у животных из данной группы произошла на 15 сутки, то есть на 1 сутки раньше, чем у контрольных животных.

Из результатов, отраженных на фиг. 6, видно, что под влиянием препарата пептида пептид Zp-2 (THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO) фазы воспаления и пролиферации протекают взаимосвязано и очень активно около 3 суток. При этом процесс эпителизации начинается очень рано - на 3 сутки с максимумом активности на 4 сутки. 100% эпителизация раны у животных из данной группы произошла на 11 сутки, то есть на 5 суток раньше, чем у контрольных животных (на 31% быстрее).

На фиг.7 представлены фото ран всех животных в динамике репаративного процесса. Можно отметить следующие особенности течения репаративного процесса. У животных из контрольной группы на 1-2-3-4 сутках поверхность раны у 40% животных имела мокнущий вид, а на 5 сутки у них были выделения гноя и крови. У 20% животных из опытной группы с тестируемым пептидом MNP1-3 на 11 сутки появился струп, который сохранялся до 19 суток. У части животных (20%) из опытной группы с испытуемым препаратом тромбодефенсин на 1-2-3 сутки поверхность раны имела мокнущий характер, а на 5 сутки у них появлялись гнойные выделения с примесью крови. У животных из опытной группы с тестируемым препаратом интерцид на 13 сутки после нанесения раны сформировался небольшой рубец, который сохранился до конца срока наблюдения (21 сутки). В этой же группе восстановление шерстного покрова также было замедлено.

У животных из опытной группы под влиянием препарата пептид пептид Zp-2 (THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO) процесс эпителизации сопровождается быстрым восстановлением шерстного покрова без образования рубцов. У животных из остальных групп на протяжении всего процесса заживления раны были сухие, без образования рубцов, с формированием нормального шерстного покрова, других особенностей течения репаративного процесса у них не отмечено.

Таким образом, проведенное исследование показало, что биологически активное вещество пептиды ZP-1 и ZP-2 является наиболее активными с целью получения ранозаживляющего препарата, но большей активностью обладает ZP-2.

В заявляемом способе повышается репаративная активность в отношении раневого процесса, за счет того, что в качестве пептидов используют синтетические пептиды, имеющие структуру от LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO и до THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO, м.м. от 1794 до 1397 дальтон, в ранозаживляющем составе в качестве лекарственной основы используют гель, готовят ранозаживляющий состав, в котором гель - 5 граммов, синтетических пептидов - 10 миллиграммов, ранозаживляющий состав наносят на открытую рану из расчета площади раны, один раз в сутки.

Claims

Способ повышения репаративной активности организма, заключающийся в обработке раны ранозаживляющим составом с пептидами, используемыми в лекарственной основе, отличающийся тем, что в качестве пептидов используют синтетические пептиды, имеющие структуру LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO и THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO, с молекулярной массой соответственно 1794 и 1397 Да, в ранозаживляющем составе в качестве лекарственной основы используют гель, готовят ранозаживляющий состав, в котором гель 5 г, синтетических пептидов 10 мг, ранозаживляющий состав наносят на открытую рану из расчета площади раны один раз в сутки.