CN111150831B - 多肽KdPT的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了多肽KdPT在制备治疗干眼症的药物中的应用。本发明首次发现了多肽KdPT可用于干眼症的治疗,可开发为治疗干眼症的新型药物。本发明的KdPT肽用于治疗干眼症时,其治疗效果优于现有治疗药物(人工泪液)。
Description
技术领域
本发明涉及干眼症治疗技术领域,尤其是一种治疗干眼症的多肽KdPT。
背景技术
KdPT为已报道的抗炎三肽,序列为:KPT,即序列为Lys-Pro-Thr三个氨基酸的寡肽,其中的脯氨酸(P,Pro)为D型氨基酸。根据已经公开的现有技术,KdPT可以用于治疗肠道炎症,如炎性肠病(IBD)等。但是,未见KdPT有治疗干眼症的用途的相关报道。
发明内容
基于上述问题,本发明的目的在于提供多肽KdPT的新用途,即用于治疗干眼症。
为实现上述目的,本发明提供的技术方案为:多肽KdPT在制备治疗干眼症的药物中的应用。
作为上述方案的进一步优化,所述多肽KdPT的给药浓度为1~100μg/ml。
作为上述方案的进一步优化,所述多肽KdPT的给药浓度为100μg/ml。本申请的发明人经多次试验发现,当多肽KdPT的给药浓度为100μg/ml时,治疗干眼症的效果明显优于其它浓度时的多肽KdPT,尤其是用药14天后,患者的干眼症状接近消失,治疗效果最佳。
作为本发明的另一个方面,本发明提供了一种治疗干眼症的药物,所述药物中含有多肽KdPT。
作为上述方案的进一步优化,所述多肽KdPT的给药浓度为1~100μg/ml。
作为上述方案的进一步优化,所述多肽KdPT的给药浓度为100μg/ml。
作为上述方案的进一步优化,所述药物中含有溶剂,所述溶剂为生理盐水。需要说明的是,本发明的治疗干眼症的药物的溶剂包括但不限于生理盐水,还可以是其它常规的溶剂,只要不影响本发明的多肽KdPT治疗干眼症的疗效即可。
综上所述,本发明的有益效果为:
本发明首次发现了多肽KdPT可用于干眼症的治疗,可开发为治疗干眼症的新型药物。本发明的KdPT寡肽用于治疗干眼症时,给药浓度为1-100μg/ml,给药方式为滴眼给药,每日2-3次,溶剂为生理盐水。本发明的KdPT肽用于治疗干眼症时,其治疗效果优于现有治疗药物(人工泪液)。
附图说明
图1为KdPT固相合成的HPLC图谱;
图2为受试样品对小鼠干眼症模型荧光素钠染色评分的影响(7天、14天)结果图;
图3为受试样品对小鼠干眼症模型泪液分泌量的影响结果图;
图4为受试样品对干眼症小鼠模型病理评分的影响结果图;
图5为正常对照组(×200)的显微镜照片;
图6为模型对照组(×200)的显微镜照片;
图7为KdPT低剂量组(×200)的显微镜照片;
图8为KdPT中剂量组(×200)的显微镜照片;
图9为KdPT高剂量组(×200)的显微镜照片;
图10为阳性对照组(×200)的显微镜照片。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明,本发明中的实验方法均为常规方法,本发明中的试剂、材料、细胞、实验动物等均可从市场上或其它公开渠道获得。
实施例1多肽合成
采用固相合成KdPT,共合成500mg,纯度>95%,KdPT固相合成的HPLC图谱参见图1。
实施例2造模、分组与给药
造模:8周龄雄性SPF级Balb/c小鼠80只,检疫3-7天。用移液枪吸取1%荧光素钠5μL,滴至小鼠右眼中,90s后,用100μL生理盐水冲洗右眼,连续冲洗三次,用棉签轻轻吸走眼角周围液体,裂隙灯钴蓝光下观察小鼠右眼,选取右眼眼表正常的小鼠进行干眼症造模。造模的小鼠右眼滴入5μL 0.2%苯扎氯铵溶液,每天2次,持续4周,诱导小鼠蒸发过快型干眼模型。正常对照组给予生理盐水,其它操作均相同。
分组:造模4周后按评分随机分为6组,分别为正常对照组、模型对照组、KdPT低剂量组(1μg/mL)、KdPT中剂量组(10μg/mL)、KdPT高剂量组(100μg/mL)、阳性对照组(人工泪液),每组10只动物。
给药:分组后各组给予相应的受试药物治疗,给药方案见表1。
表1各组动物给药方案
实施例3效果检测
分别于治疗3天、5天、7天、10天、14天后在裂隙灯钴蓝光下观察并记录实施例2的小鼠眼表形态,同时进行荧光素钠染色评分,用酚红棉线测定泪液分泌量,治疗14天后处死动物取眼球及周围眼睑进行组织病理学观察。
1)角膜荧光素钠染色评分
用移液枪吸取1%液态荧光素钠5μL滴至小鼠眼表,并闭合眼睑使荧光素钠均匀涂布于角膜表面,90s后用200μL生理盐水冲洗3次,棉签轻轻吸取眼睛周围液体后,用裂隙灯显微镜钴蓝光下观察角膜上皮荧光素钠染色情况。将眼表分为四个象限,并对每个象限进行评分,评分分为四个等级:无染色为0分;轻微的点状染色为0.5分;弥漫的点状染色为1分;覆盖少于三分之一角膜的弥漫染色为2分;覆盖三分之一至三分之二角膜的弥漫染色为3分;覆盖超过三分之二角膜的弥漫染色为4分,四个象限总分为12分,得分越高表示干眼症越严重。
2)泪液分泌量测定
麻醉并固定小鼠,用显微结膜镊轻拉小鼠下眼睑暴露下结膜囊,将酚红棉线一端置于下睑内侧结膜囊内一段时间后取出,测量被泪液浸湿的酚红棉线红色部分总长度。
3)病理学观察
实验结束后,小鼠麻醉处死,迅速取下包括上下眼睑在内的整个眼球,眼球固定液固定并染色,制作病理切片,光学显微镜下观察结膜和角膜组织的病理学变化。
数据处理:实验数据由GraphPad Prism 7.0生物统计学软件进行统计学处理:计量数据以Mean±SD表示,采用two-way ANOVA结合Dunnett's多重比较法进行分析;采用方差分析结合Dunnett’s多重比较法进行分析;计数资料采用Kruskal-Wallis秩和检验进行分析;采用one-way ANOVA结合Dunnett's多重比较法进行分析。
4)实验结果与分析
4.1)一般状态观察与体重
各组小鼠一般状态均无明显异常;与正常对照组相比,模型对照组小鼠体重无统计学差异(P>0.05);与模型对照组相比,各治疗组小鼠体重均无统计学差异(P>0.05),结果参见表2。
表2受试样品对干眼症小鼠模型体重的影响(n=10,Mean±SD)
时间/组别 | 正常对照组 | 模型对照组 | KdPT低剂量组 | KdPT中剂量组 | KdPT高剂量 | 阳性对照组 |
给药前 | 27.03±1.35 | 27.34±1.67 | 26.30±2.28 | 26.38±2.09 | 27.40±1.32 | 27.68±2.49 |
给药7天 | 27.59±1.68 | 27.85±1.40 | 27.41±2.33 | 27.61±2.16 | 27.85±1.13 | 27.46±1.98 |
给药14天 | 28.42±1.79 | 28.68±1.45 | 28.44±2.28 | 28.43±2.30 | 28.56±0.87 | 28.28±2.23 |
注:与模型对照组相比,*:P<0.05;**:P<0.01。
4.2)角膜荧光素钠染色评分
与正常对照组相比,模型对照组荧光素染色评分显著升高,具有统计学差异(P<0.05或<0.01),说明造模成功;与模型对照组相比,各治疗组均有降低荧光素钠眼表评分的趋势,其中以KdPT高剂量组(100μg/mL)和阳性对照组(人工泪液)较为明显,且有明显的统计学差异(P<0.01),结果参见表3、图2。
表3受试样品对干眼症小鼠模型荧光素钠眼表评分的影响(n=10,Mean±SD)
注:与模型对照组相比,*:P<0.05;**:P<0.01。
4.3)泪液分泌量测定
与正常对照组相比,模型对照组小鼠酚红棉线长度明显缩短,泪液分泌量明显降低(P<0.01),说明造模成功;与模型对照组相比,各治疗组均有增加酚红棉线长度,增加泪液分泌量的趋势,且以KdPT高剂量组(100μg/mL)最为显著,其中KdPT中剂量组(10μg/mL)、高剂量组(100μg/mL)、阳性对照组有显著的统计学差异(P<0.01),结果参见表4、图3。
表4受试样品对小鼠干眼症模型泪液分泌量的影响(n=10,Mean±SD)
注:与模型对照组相比,*:P<0.05;**:P<0.01。
4.4)病理学变化
与正常对照组相比,模型对照组病理评分显著升高(P<0.01)。与模型对照组相比,各治疗组均有降低病理评分的趋势,其中以KdPT高剂量组(100μg/mL)、阳性对照组最为明显,且有显著的统计学意义(P<0.01),结果参见表5、图4。图5-10显示各组结膜和角膜组织的显微镜照片。
表5受试样品对干眼症小鼠模型病理学的影响(n=10,Mean±SD)
注:与模型对照组相比,*:P<0.05;**:P<0.01。
从图5可以看出,正常对照组结膜处上皮完整,上皮细胞形态正常,未见杯状细胞,角膜前表面上皮厚度均匀,细胞形态正常,无角质,基质厚度均匀,无血管、炎症,可见大量人为裂隙,角膜内皮完整,厚度均匀,未见明显异常。
从图6可以看出,模型对照组结膜上皮完整正常,可见少量杯状细胞,角膜前表面上皮厚度不均匀,局部变窄,并出现裂隙,基质重度肿胀,表现为裂隙扩张,角膜内皮完整,厚度均匀,未见明显异常。
从图7可以看出,KdPT低剂量组结膜上皮完整,可见少量杯状细胞,少量上皮细胞胞核固缩深染,上皮外侧可见少量嗜酸性物质;角膜前表面上皮厚度均匀,细胞形态正常,基质厚度不均匀,表现为局部裂隙重度扩张,但未见血管、炎症,角膜内皮完整,厚度均匀,未见明显异常。
从图8可以看出,KdPT中剂量组结膜上皮完整正常,可见少量杯状细胞,上皮下结缔组织内可见少量炎性细胞浸润;角膜前表面上皮厚度均匀,细胞形态正常,无角质,基质厚度均匀,无血管、炎症,可见大量人为裂隙,角膜内皮完整,厚度均匀,未见明显异常。
从图9可以看出,KdPT高剂量组结膜上皮完整,上皮细胞形态正常,未见明显杯状细胞,角膜前表面上皮厚度均匀,细胞形态正常,无角质,基质厚度均匀,无血管、炎症,可见大量人为裂隙,角膜内皮完整,厚度均匀,未见明显异常。
从图10可以看出,阳性对照组结膜上皮完整,上皮细胞形态正常,未见明显杯状细胞,上皮下结缔组织内少量炎性细胞浸润,角膜前表面上皮厚度均匀,细胞形态正常,无角质,基质厚度不均匀,表现为少量裂隙增大,角膜内皮完整,厚度均匀,未见其它明显异常。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (3)
1.多肽KdPT在制备治疗干眼症的药物中的应用,其特征在于,所述多肽KdPT的序列为Lys-Pro-Thr,其中Pro为D型氨基酸,所述干眼症为蒸发过快型干眼症。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述多肽KdPT的给药浓度为1~100μg/ml。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述多肽KdPT的给药浓度为100μg/ml。
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