CN108992438A - 莱菔硫烷在制备治疗圆锥角膜疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种莱菔硫烷在制备治疗圆锥角膜疾病药物中的新应用。系列试验证明莱菔硫烷治疗圆锥角膜的疗效显著，见效快、毒副作用小，是一种安全、高效、稳定且制备工艺简单的治疗圆锥角膜疾病的药物，适于工业化生产，易于推广。本发明为缓解、治疗圆锥角膜及其并发症提供了一种新的药物来源。

Description

莱菔硫烷在制备治疗圆锥角膜疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，涉及一种缓解和/或治疗圆锥角膜疾病的药物或保健食品，特别涉及一种已知混合物莱菔硫烷在缓解和/或治疗圆锥角膜疾病药物或保健食品中的应用。

背景技术

圆锥角膜是一种原发性变性疾病，以角膜扩张为特征，可导致角膜中央部向前凸出、变薄呈圆锥形并产生高度不规则散光的角膜病变。流行病学研究报道圆锥角膜患病率从8.8-229/100000不等，有研究发现亚洲人群圆锥角膜的发病率和患病率明显高于白种人，随着患者就诊率的增加和临床诊断技术的提高，圆锥角膜的发病率有逐年上升的趋势。该病多在青少年时期起病，双眼发病，可造成难以矫正的角膜散光和角膜组织结构改变，晚期可导致角膜水肿或瘢痕，严重影响视力，甚至失明，对患者及家庭的生活影响极大。

目前，早期圆锥角膜的治疗方法主要是角膜接触镜、角膜胶原交联等，晚期圆锥角膜最有效的治疗方法是角膜移植术，但一方面术后可能存在免疫排斥反应和角膜植片浑浊而需再次手术，另一方面我国角膜供体稀缺，无疑延长了患者等待时间和错失最佳的治疗时机。而关于圆锥角膜相关药物研究较少，因此迫切需要寻找一种治疗圆锥角膜的药物，可用于该病的早期干预治疗，阻止或延缓圆锥角膜的进展。

圆锥角膜的病理机制尚不清楚，目前还没有与该疾病发病机制密切相关的治疗靶点。圆锥角膜的发病机制相当复杂，尚无公认、系统的学说解释该病的发生发展过程。相关研究多集中在遗传因素、角膜生物力学和氧化应激等方面。

临床上常把圆锥角膜分成四期：①潜伏期，圆锥角膜不明显，角膜曲率<48D，常为一眼已确诊为圆锥角膜，另一眼为潜伏期。②初期，以屈光不正为主，角膜曲率一般在48-50D之间，开始未进展性近视，逐渐发展成为散光或不规则散光，一般可用框架眼镜矫正，散光大的还可以用硬性角膜接触镜矫正。角膜地形图可表现为后圆锥，角膜前表面曲率可正常，仅表现后表面曲率异常，可伴有视力下降，角膜中央基质可变薄；③完成期，出现典型的圆锥角膜症状，视力明显下降，角膜曲率>50D，框架眼镜不能矫正视力，中央角膜明显变薄，往往只有正常角膜厚度的1/3，有四个临床特征为Munson症、Fleischer环、Vogt线、角膜呈锥状明显前凸和中央变薄；④瘢痕期，一般在中央角膜的圆锥顶部形成丝网状及片状混浊、白色瘢痕，视力明显下降，各种眼睛均不能矫正。

根据疾病的严重程度不同，圆锥角膜的治疗方法也不相同。传统上，早期圆锥角膜使用框架眼镜，轻度至中度圆锥角膜使用角膜接触镜，严重圆锥角膜可采用角膜移植手术。其他手术治疗方式包括角膜胶原交联、角膜基质内环植入术、人工晶状体植入术等。

迄今为止，大多数学者认为圆锥角膜的根本问题是角膜力学特性的改变。圆锥角膜患者的角膜弹性模量等生物力学特性异于正常角膜。长期以来圆锥角膜生物力学研究的主要关注点为角膜基质胶原纤维的成分改变、纤维板层之间的连接以及蛋白酶在其中发挥的作用，却忽视了角膜基质细胞的作用。虽然角膜基质细胞占角膜基质总体积的比例不足5％，但角膜基质细胞可以产生胶原纤维，所以，角膜基质细胞可能是角膜胶原纤维在圆锥角膜中发挥作用的根本原因，同时，角膜基质细胞还具有合成糖蛋白和黏蛋白的作用，可以受到多种化学物质的调控。

研究证实了氧化应激在圆锥角膜发病机制中起着至关重要的作用，氧化应激是活性氧(reactive oxygen species，ROS)积累的标志，与正常角膜基质细胞相比，培养的圆锥角膜基质细胞中ROS生成明显增加。目前多数学者认为，圆锥角膜基质细胞对氧化应激的高敏感性和基质降解酶活性增加在基质破坏过程中起关键性作用。

关于圆锥角膜相关药物治疗报道甚少，圆锥角膜相关药物治疗的研究比较局限。研究表明新型软性角膜接触镜可以通过吸收和释放乳铁蛋白来恢复氧化应激条件下细胞的活力，对于以高水平氧化应激为病理特征的眼表疾病，比如圆锥角膜，负载乳铁蛋白的角膜接触镜为它们提供了新的治疗方法。另外，有研究报道，槲皮素是一种潜在的新型治疗剂，通过体外评估槲皮素对圆锥角膜胶原分泌和肌成纤维细胞形成的作用，证明槲皮素不仅可减少瘢痕形成，而且降低了圆锥角膜中氧化应激水平。

莱菔硫烷(sulforaphane,SF)作为Nrf-2的激活剂，是一种异硫氰酸盐，分子式为C₆H₁₁NOS₂，其特征是含硫的N＝C＝S功能基团，富含于十字花科蔬菜，如孢子甘蓝、卷心菜和西兰花，已证实具有多重保护作用。动物实验研究表明莱菔硫烷通过激活Nrf-2/ARE信号通路，减缓了心脏、肾脏、肝脏和大脑的缺血性损伤。口服SF可安全且有效地诱导人类上呼吸道中粘膜抗氧化酶的表达，降低氧化应激引起的炎症效应。SF还是迄今为止蔬菜中发现的最强的抗癌成分，动物模型、体外细胞及临床试验研究均证明SF可能是一种有效的癌症抑制剂。在小鼠模型中研究发现含有莱菔硫烷或莱菔硫烷的提取物可有效抑制肺腺癌、结肠息肉和皮肤癌。II期临床试验表明，莱菔硫烷可使40％前列腺癌患者血清中PSA降低，且无临床毒性。随机双盲对照研究表明，在吸烟者中，短期摄入西兰花匀浆可降低流感风险。随机双盲临床试验表明，西兰花可改善2型糖尿病患者的胰岛素抵抗。口服SF可安全且有效地诱导人类上呼吸道中粘膜抗氧化酶的表达，降低氧化应激引起的炎症效应。另外，动物实验研究表明莱菔硫烷通过激活Nrf-2/ARE信号通路，减缓了心脏、肾脏、肝脏和大脑的缺血性损伤。

SF对眼部疾病的保护作用也有相关报道，研究发现SF通过增强Nrf-2核转位，显著上调了ARE调控的主要抗氧化酶，并减轻了Fuchs角膜营养不良中氧化应激诱导的角膜内皮细胞凋亡；SF处理可以保护视网膜色素上皮细胞和光感受器细胞免受光学损伤，并通过上调Nrf-2推迟小鼠视网膜光感受器细胞的变性。

然而，关于SF对圆锥角膜中角膜基质细胞的作用迄今未见相关报道。因此，抗氧化应激药物SF在预防治疗圆锥角膜中的应用及深入研究具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题，提供莱菔硫烷缓解或/和治疗圆锥角膜的性能和功效，并针对上述现有技术存在的问题，提供莱菔硫烷新的药用用途，即在治疗、缓解圆锥角膜疾病的药物或保健食品中的新应用。

为实现上述目的，本发明一方面提供一种莱菔硫烷(Sulforaphane，SF)在制备缓解和/或治疗眼角膜扩张性疾病的药物中的应用。

其中，所述眼角膜扩张性疾病选择圆锥角膜。

在筛选具有缓解、治疗圆锥角膜作用的天然活性成分的过程中，发明人发现已知的化学成分中莱菔硫烷具有强烈的抑制圆锥角膜疾病中角膜组织发生氧化应激反应的作用，下调圆锥角膜中ROS的产生；下调圆锥角膜中Nox-2和Nox-4的表达水平；上调圆锥角膜中Nrf-2、HO-1的表达；降低角膜曲率，增加中央角膜厚度，缓解圆锥角膜的进展，进而发挥保护效应。

其中，所述药物由莱菔硫烷和药学上可接受的载体组成。

特别是，药学上可接受的载体通常被保健专家认可用于这一目的且作为药剂的非活性成分。有关药学上可接受的载体的汇编可以在《药物赋形剂手册》(Handbook ofPharmaceutical excipients，第2版，由A.Wade和P.J.Weller编辑；AmericanPharmaceutical Association出版，Washington and The Pharmaceutical Press,London,1994)等工具书中找到。

尤其是，所述的载体包括赋形剂，如凡士林、矿物油、玉米油、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚羧乙烯等；润滑剂，如透明质酸钠、卡波姆、甲基纤维素等；

其中，所述药物是通过经胃肠道给药和非经胃肠道给药途径给药。

特别是，所述的非经胃肠道给药途径选择注射给药、呼吸道给药、皮肤给药、粘膜给药或腔道给药。

尤其是，所述非经胃肠道给药制剂选择注射剂、注射粉剂、滴眼液、眼膏剂、眼用凝胶剂给药。

其中，所述莱菔硫烷的纯度≥50％，优选为≥80％，进一步优选为≥90％，更进一步优选≥98％。

特别是，所述莱菔硫烷的含量≥50％，优选为≥80％，进一步优选为≥90％，更进一步优选≥98％。

本发明另一方面提供一种用于缓解和/或治疗圆锥角膜疾病的药物，含有莱菔硫烷。

其中，所述莱菔硫烷的纯度≥50％，优选为≥80％，进一步优选为≥90％，更进一步优选≥98％。

特别是，所述的药物还含有药学上可接受的载体。

尤其是，所述药物选择注射剂、滴眼液或眼用凝胶剂，优选为注射剂或滴眼液。

特别是，所述药物中莱菔硫烷的重量与所述药学上可接受的载体的体积之比为1：1-10：1，优选为5：1，即每1ml药物中含有莱菔硫烷1-10mg，每1L药物中含有莱菔硫烷1-10g。

尤其是，所述药学上可接受的载体选择玉米油、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、透明质酸钠或水，优选为玉米油。

本发明再一方面提供一种莱菔硫烷在制备抑制圆锥角膜角膜组织中ROS生成抑制剂的应用。

特别是，在制备抑制圆锥角膜角膜基质细胞中ROS生成抑制剂的应用。

本发明又一方面提供一种莱菔硫烷在制备抑制圆锥角膜中Nox-2的表达的抑制剂中的应用；在制备抑制圆锥角膜中Nox-4的表达的抑制剂中的应用；在促进圆锥角膜中Nrf-2的表达的促进剂中的应用；在促进圆锥角膜中HO-1的表达的促进剂中的应用。

本发明提供的制备用于治疗圆锥角膜药物中的应用，包括向圆锥角膜患者给予治疗有效量的莱菔硫烷的药物，其治疗有效量为结膜下注射SF溶液5μL/d(SF溶液浓度为5mg/mL)；或者滴眼液方式给予SF浓度为5mg/mL的SF溶液(qd)。

除非另外说明，本文所用的术语“治疗有效量”为需要产生有效作用的药物的用量；“治疗有效量”是可以调整和变化的，最终由医务人员确定，其所考虑的因素包括给药途径和制剂的性质、接受者的体重、年龄等一般情况以及所治疗疾病的性质和严重程度。

本发明的药物给药为向圆锥角膜患者结膜下注射SF(5μL/d，5mg/mL)，共2周；或者滴眼液方式给予SF(5mg/mL，qd)，共2周。

与现有技术相比，本发明具有如下的明显优点：

1、本发明对已知化合物莱菔硫烷发掘了新的药用价值，将其用于缓解、治疗圆锥角膜，并可制备成缓解和/或治疗圆锥角膜搅拌的药物或保健食品，从而为已知混合物莱菔硫烷的应用开拓了一个新的领域。

2、本发明的系列试验研究证明莱菔硫烷可显著降低圆锥角膜的角膜曲率，增加中央角膜厚度，缓解圆锥角膜的进展，发挥保护效应。

3、本发明的莱菔硫烷药理作用强，用于预防、调理和治疗圆锥角膜疾病的功效显著，见效快、毒副作用小、安全性好，具有良好的药用前景。

4、本发明的产品原料来源丰富、价廉、临床使用安全，制备工艺简单，可制成各种剂型，且服量小，使用方便，因此易于推广。

5、本发明的莱菔硫烷明显降低了角膜中ROS，下调圆锥角膜中ROS的产生；还可以下调圆锥角膜中的Nox-2和Nox-4的表达水平；上调圆锥角膜中Nrf-2的表达，激活圆锥角膜中Nrf-2的表达，减弱细胞氧化应激，对圆锥角膜起到保护作用；SF还能够刺激并诱导HO-1在圆锥角膜中的表达；表明莱菔硫烷(SF)具有抵抗角膜基质细胞发生氧化应激的作用，SF通过Nrf-2介导，诱导产生HO-1。

圆锥角膜模型中检测到活性氧簇(ROS)的产生显著增加，角膜曲率显著增加，中央角膜厚度显著降低；使用SF处理后，不仅降低了ROS的产生，而且降低了角膜曲率，增加了中央角膜厚度；同时，SF处理显著降低圆锥角膜中增加的Nox-2、Nox-4的表达水平，更加显著提高圆锥角膜中代偿性升高的Nrf-2、HO-1的表达水平。

附图说明

图1为角膜组织HE染色观察图，其中a-d：10x物镜(放大100x)，bar＝100μm；e-h：20x物镜(放大200x)，bar＝50μm；i-l：40x物镜(放大400x)，bar＝25μm；

图2为角膜曲率和中央角膜厚度的变化分析图，其中图2a为角膜曲率变化统计分析图；图2b为中央角膜厚度的变化统计分析图，n＝14，均数±标准差；

图3为角膜冰冻切片免疫荧光染色图；其中图3a-d为DHE染色结果图(红色)；图3e-h为相对应的DAPI染色结果图(蓝色)；如3i-l为DHE与DAPI的共定位图像(merge)；a-l：放大200x，bar＝50μm，ST＝基质，EPI＝上皮；

图4为角膜中ROS的水平变化统计分析图n＝6，均数±标准差)；

图5A为角膜石蜡切片的Nox-2染色检测结果图；

图5B为Western blot法检测角膜中Nox-2蛋白的表达水平分析图；

图6A为角膜石蜡切片的Nox-4染色结果图；

图6B为Western blot法检测角膜中Nox-4蛋白的表达水平分析图；

图7A为角膜石蜡切片的Nrf-2染色结果图；

图7B为Western blot法检测组角膜中Nrf-2蛋白的表达水平分析图；

图8A为角膜石蜡切片的HO-1染色结果图；

图8B为Western blot法检测角膜中HO-1蛋白的表达水平分析图；；

图9为不同实验条件下HO-1，Nox-2，Nox-4，Nrf-2等角膜基质细胞相关基因mRNA的表达水平分析图。

具体实施例方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

以下通过试验例来进一步阐述本发明所述药物的有益效果，这些试验例包括了本发明药物的药效学试验。

试验例1

1.实验材料

1.1药品与试剂

1.2动物

健康新西兰白兔(56只)，雌性，6-7个月龄，北京大学第一医院实验动物中心提供。对所有实验白兔行裂隙灯眼部检查未见异常，且均无外眼病。严格控制室内的湿度和温度(24±1℃)，12h亮/12h暗的条件，提供充足的食物和水源。本实验获得北京大学第一医院伦理委员会批准(受理编号：J201413)。

1.3仪器

2.实验方法

2.1动物分组:

将雌性健康的新西兰白兔随机分为4组(对照组、圆锥角膜组、SF处理组、SF联合锌原卟啉处理组)，每组14只，其中6只做免疫组织化学相关实验，5只用来做werstern blot，3只做RT-qPCR，其中：

对照组(Control，C1组)：采用含15％右旋糖酐的PBS溶液浸泡角膜30min；圆锥角膜组(Keratoconus，K1组)：5mg/mL II型胶原酶(含15％右旋糖酐的PBS溶液配置)浸泡角膜30min，24h后结膜下注射莱菔硫烷(SF)的溶剂即玉米油(5μL/d)，共14d；SF处理组(SF，S1组)：II型胶原酶处理(制得圆锥角膜模型)24h后，再结膜下注射SF溶液(5μL/d，5mg/ml)，共14d；SF联合锌原卟啉(Znpp)处理组(Z1组)：II型胶原酶处理(制得圆锥角膜模型)24h后，再结膜下注射SF和Znpp(各5μL/d)，共14d。

在整个实验过程中，所有兔子均选取右眼为实验眼，进行相应处理，同一只兔子的左眼不做任何处理。所有实验均严格按照北京大学和美国视觉与眼科协会(ARVO)有关在科学研究中使用实验动物的相关规定。本研究中使用的实验动物协议是经北京大学动物保健和使用委员会制度(IACUC)制定的。

2.2圆锥角膜模型建立

分别测量每只新西兰白兔的体重后进行术前观察，采用手持裂隙灯下观察结膜、角膜、前房反应等眼前节情况；手持角膜曲率计测量获得最大角膜曲率半径和最小角膜曲率半径，每眼测8次，取平均值；手持角膜超声测厚仪测量中央角膜厚度，每眼测6次，取平均值；术前测定结果如表1所示。

5％戊巴比妥钠做兔耳缘静脉麻醉，盐酸奥布卡因滴眼液3次，5min/次，行角膜表面麻醉；角膜上皮铲去除角膜中央直径8.5mm范围内上皮组织。刮净上皮后将直径为8mm角膜环钻固定在以瞳孔为中心的角膜表面；分别将200μL的5mg/mL II型胶原酶溶液滴于角膜环钻内，浸泡角膜30min(室内温度20℃)；随后以棉签吸干角膜环钻内溶液，PBS溶液冲净无残留药物后涂氧氟沙星眼膏，每天两次，预防感染，7d后停药，获得圆锥角膜模型白兔。

圆锥角膜模型白兔的角膜曲率显著增加，中央角膜厚度显著下降，角膜基质纤维排列疏松、紊乱和间隙增大。实验组角膜基质细胞大体形态一致，角膜基质细胞未见明显减少，且未发现明显的炎症细胞。圆锥角膜模型构建成功。

2.3给药

采用结膜下注射的方式给药：S1组：在制得兔圆锥角膜模型24h后，在兔结膜下注射SF溶液(5mg/mL，溶解于玉米油中)，每天1次，连续给药14d；K1组：在制得兔圆锥角膜模型24h后，在兔结膜下注射玉米油；Z1组：在制得兔圆锥角膜模型24h后，在兔结膜下注射SF和Znpp溶液(5mg/mL)。

2.4术后观察

术后1d、7d、14d采用手持裂隙灯观察结膜、角膜、前房反应及角膜上皮修复情况等；术后14d采用手持角膜曲率计检测实验动物双眼的角膜曲率，每眼重复测8次，取平均值，n＝14；术后14d采用手持角膜超声测厚仪测量实验动物双眼的中央角膜厚度。每眼重复测6次，取平均值，n＝14；术后测定结果如表1所示。

2.5术后角膜形态学观察

术后14d采用过量5％戊巴比妥钠耳缘静脉注射法处死实验动物，迅速摘除眼球，在0.1M PBS(pH 7.4)中快速取新鲜的近中央角膜组织，将角膜组织一分为二，其中一半迅速用OCT包埋剂包埋，液氮冷冻，制成冰冻切片，并贴于阳离子防脱玻片上，保存于-20℃冰箱，备用；另一半置于4％PFA(多聚甲醛溶液)中，4℃固定24h，行石蜡包埋，制成石蜡切片，并将蜡片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，经60℃烘片2-8h，室温放置，备用。

2.6术后活性氧簇(ROS，reactive oxygen species)测定

ROS是细胞线粒体氧化呼吸中产生的自由基活性的物质，参与细胞多种生理和病理形成机制。二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化。二氢乙啶在细胞内主要被超氧阴离子型ROS氧化，用荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的组织中ROS的经典检测方法。

用37℃0.1M PBS(pH 7.4)清洗各组角膜组织冰冻切片5min；接着用5μM DHE 37℃孵育30min后，再用37℃0.1M PBS清洗3次，每次5min；然后用封片剂封片，荧光显微镜下绿光激发；观察和拍摄角膜基质细胞红色发射图像；随机选取图像使用Image J软件测定角膜基质层的光密度；每组每个图像选取5个区域。测定结果如图3所示。

2.7苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色、免疫组织化学染色

将制备的术后角膜石蜡切片进行脱蜡及水化后，进行HE染色，然后显微镜下观察、拍照；

将制备的术后角膜石蜡切片进行脱蜡及水化后，进行免疫组织化学染色，按照通用二步法检测试剂盒及DAB试剂盒(二氨基联苯胺，Diaminobenzidine，DAB)说明书进行操作，其中，所用的一抗如下：rabbit polyclonal anti-Nox-2(兔源性多克隆抗Nox-2抗体)，rabbit polyclonal anti-Nox-4(兔源性多克隆抗Nox-4抗体)，rabbit polyclonal anti-Nrf-2(兔源性多克隆抗Nrf-2抗体)，rabbit polyclonal anti-HO-1(兔源性多克隆抗HO-1抗体)，然后在光学显微镜下观察和拍照。

2.8角膜组织总蛋白的提取和定量

2.8.1总蛋白提取

新西兰白兔过量5％戊巴比妥钠耳缘静脉注射法处死后，迅速摘除眼球并取角膜组织；液氮冷冻研磨后，用RIPA蛋白裂解液裂解角膜组织，匀浆后在冰上静置30-60min，并隔5min在漩涡混合器上振荡30s；观察EP管中待角膜组织基本裂解，4℃，13000g，离心10min，取上清，即得角膜组织总蛋白产物，-80℃保存。

2.8.2蛋白定量

用BCA蛋白定量试剂盒(P1511，普利莱基因技术有限公司)对提取的蛋白定量；以562nm为探测波长，用酶标仪测量吸光值；用Execl软件根据标准蛋白的吸光值绘制标准曲线，并计算出样品蛋白浓度。

2.9角膜组织蛋白电泳与杂交(Western Blotting)检测蛋白表达

2.9.1蛋白电泳及转膜

配制不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶，下层8％或12％分离胶，上层4％浓缩胶；以60V电泳至溴酚蓝至分离胶界面，以110V电泳至溴酚蓝至分离胶下缘；割取7×5cm大小的凝胶，以70V电转移80min，将蛋白转移到PVDF膜上。

2.9.2免疫杂交

PVDF膜在室温下用含5％BSA的TBST溶液室温封闭1h；分别与一抗：rabbitpolyclonal anti-Nox-2，rabbit polyclonal anti-Nox-4，rabbit polyclonal anti-Nrf-2，rabbit polyclonal anti-HO-1，mouse monoclonal anti-β-actin(鼠源性单克隆抗β-actin抗体)，4℃孵育振荡过夜；TBST等渗缓冲液洗膜；然后与二抗：Donkey anti-rabbit IgG-peroxidase(驴抗兔-过氧化物酶抗体)，Goat anti-mouse IgG-peroxidase(羊抗鼠-过氧化物酶抗体)，室温孵育1h；在用TBST等渗缓冲液洗膜。

2.9.3发光鉴定及图形分析

ECL超敏发光液以1:1比例混合A液和B液，配制工作液，使用凝胶图像分析系统进行发光及图像扫描，用软件Image J进行图像分析，以β-actin为内对照，计算相对含量。

2.10 RT-qPCR

2.10.1总RNA提取

取新鲜角膜组织块用液氮研磨成粉末；每50-100mg样品加1mL Trizol，移入玻璃匀浆器放置冰上匀浆；离心后上清液中加入氯仿，用力摇晃15s，室温放置5min后再离心，上清液加入500μL异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min，沉淀RNA；离心，弃上清后，向沉淀中加入75％乙醇，用移液器反复吸打乙醇，洗涤RNA沉淀；离心5min，弃去乙醇；用微型离心机将EP管内壁上的乙醇甩至管底，用枪头吸出，打开盖子置于超净台内晾至内壁无水珠；加入无Rnase水60-120μL，轻弹管壁，充分溶解RNA，混匀；采用紫外分光光度计测定RNA浓度值和OD₂₆₀/OD₂₈₀值。

2.10.2反转录cDNA

用TAKARA公司的PrimeScript RT reagent Kit转录试剂盒进行cDNA反转录。按照试剂盒说明书进行操作，反应条件：37℃15min，85℃5s。合成的cDNA保存于-80℃冰箱。

2.10.3Real-time PCR(在线PCR)

用Primer-BLAST在线设计用于聚合酶链反应(PCR)的特异性寡核苷酸引物如下：

使用TAKARA的SYBR Premis Ex Taq II(Perfect Real Time)试剂盒进行Real-time PCR。循环参数：50℃ 2min，94℃ 30s预变性；94℃ 30s，60℃ 34s，共40个循环；65℃延伸2min。

2.10.4△△Ct法计算样品的基因相对表达量

Comparative Delta-delta Ct法即△△Ct法，是一种常用的相对定量方法，导出数据后，根据相对定量公式(2^-ΔΔCt)计算每个样品基因的相对表达量。每个样品做3个重复。

本实验所有统计数据以均数±标准差表示。采用SPSS 17.0对数据进行分析，总体比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间比较采用post hoc Tukey多重比较检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3.实验结果

3.1动物眼前节情况

C1、K1、S1和Z1组在术前裂隙灯眼部检查未见异常；C1、K1、S1和Z1组在术后第1d均出现结膜充血，角膜上皮中央部缺损，未见明显前房炎症反应；术后7d、14d四组兔结膜均未见明显充血，角膜上皮完整，未见明显前房炎症反应。

3.2角膜组织结构变化(HE染色)

角膜组织HE染色观察结果如图1所示。术后四组角膜各层组织结构存在，细胞形态正常，部分组织因切片制作等原因导致角膜内皮细胞缺失。四组角膜上皮为5-6层复层扁平上皮，与基质连接紧密，表明上皮已基本恢复正常(图1a-d)。与C1组(如图1a,e,i)相比，K1组(图1b,j,f)的角膜基质纤维排列疏松，胶原纤维间隙增大；与K1组相比，S1组(图1c,g,k)和Z1组(图1d,h,l)的角膜组织结构均未有明显改变。

3.3角膜曲率、中央角膜厚度变化

表1角膜曲率、中央角膜厚度术前、术后测定结果(n＝14/组，均数±标准差)

注：F值和P值，四组间用one-way ANOVA单因素方差分析。D，屈光度。

从表1的实验结果可知：处理前各组角膜曲率和中央角膜厚度差异无统计学意义(F＝0.476，0.057；均P>0.05)；术后14d，各组角膜曲率和中央角膜厚度之间差异有统计学意义(F＝4.764，P＝0.005；F＝7.029，P<0.001)。

四个实验组中角膜曲率和中央角膜厚度的变化值均是术后第14d减去术前(即d14-d0)，如图2a、2b所示，其中：与C1相比，K1组角膜曲率的变化值显著增加(P<0.001)；与K1组相比，S1组角膜曲率的变化值显著降低(P<0.001)；与S1组相比，Z1组角膜曲率的变化值显著增加(P<0.001)；与C1组相比，K1组中央角膜厚度的变化值显著降低(P<0.001)；与K1组相比，S1组的中央角膜厚度变化值显著增加(P<0.001)；与S1组相比，Z1组的中央角膜厚度变化值显著降低(p<0.001)。

SF可以使K1组角膜曲率降低，中央角膜厚度增加，缓解圆锥角膜的进展，进而发挥保护效应；使用血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的抑制剂Znpp处理可以抑制SF的保护效应，提示此保护效应可能是通过HO-1的激活诱导的。

3.4SF下调圆锥角膜中ROS的产生

对所有实验组的新鲜角膜组织进行二氢乙啶染色检测其ROS的产生。检测结果如图3所示，免疫荧光染色表明，C1组角膜中仅有较低水平的ROS(图3a)，而K1组ROS的水平明显增加(图3b)，SF处理后明显降低了角膜中ROS(图3c)，Z1组角膜中ROS增加(图3d)。

使用4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)抗体染色角膜基质细胞核(图3e-h)，与ROS染色双标即得到合并图像(图3i-l)。

定位各组中角膜组织ROS的生成情况。用软件Image J定量分析四组角膜ROS的水平变化，与免疫荧光结果相一致(图4，n＝6，均数±标准差)。

3.5SF下调圆锥角膜中Nox-2和Nox-4的表达水平

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶家族(NADPH Oxidase,Nox)被认为是角膜中最重要的ROS来源之一，Nox-2和Nox-4蛋白在角膜基质细胞中均有表达，因此，通过免疫组化与Western blot法实验检测四组(C1、K1、S1、Z1)角膜中Nox-2和Nox-4蛋白的表达。Nox-2蛋白的表达的检测结如图5A、5B所示，K1组角膜中Nox-2的表达显著高于C1组(P<0.001)；S1组角膜中Nox-2的表达显著低于K1组(P<0.001)；Z1组角膜中Nox-2的表达显著高于S1组(P<0.001)。

图5A为不同实验条件下角膜石蜡切片的Nox-2染色结果图，黑色箭头代表Nox-2阳性细胞，a-d：10x物镜(放大100x)，bar＝100μm；e-h：20x物镜(放大200x)，bar＝50μm；i-l：40x物镜(放大400x)，bar＝25μm。图5B为Western blot法检测四个实验组角膜中Nox-2蛋白的表达水平，定量分析不同实验条件下Nox-2蛋白在整个角膜中的相对含量(均数±标准差，n＝5)。***代表与C1组相比P<0.001；###代表与K1组相比P<0.001；+代表与S1组相比P<0.05。

Nox-4蛋白的表达的检测结如图6A、6B所示，K1组角膜中Nox-4的表达显著高于C1组(P<0.05)；S1组角膜中Nox-4的表达显著低于K1组(P<0.001)；Z1组角膜中Nox-4的表达显著高于S1组(P<0.05)。

图6A为不同实验条件下角膜石蜡切片的Nox-4染色结果图，黑色箭头代表Nox-4阳性细胞，a-d：10x物镜(放大100x)，bar＝100μm；e-h：20x物镜(放大200x)，bar＝50μm；i-l：40x物镜(放大400x)，bar＝25μm。图6B为Western blot法检测四个实验组角膜中Nox-4蛋白的表达水平，定量分析不同实验条件下Nox-4蛋白在整个角膜中的相对含量(均数±标准差，n＝5)。***代表与C1组相比P<0.001；#代表与K1组相比P<0.05，###代表与K1组相比P<0.001；+代表与S1组相比P<0.05。

总之，圆锥角膜中Nox-2和Nox-4表达增加，SF处理可降低圆锥角膜中Nox-2和Nox-4的表达，而Znpp可以抑制SF的作用。

3.6SF上调圆锥角膜中Nrf-2的表达

核因子-E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2)易位到细胞核，并与编码抗氧化剂和II相解毒酶基因的启动子ARE区域结合，以减弱细胞氧化应激。SF可激活圆锥角膜中Nrf-2的表达，对圆锥角膜起到保护作用，测试结果如图7A、7B所示，K1组角膜中Nrf-2的表达显著高于C1组(P<0.01)；S1组角膜中Nrf-2的表达显著高于K1组(P<0.001)；Z1组角膜中Nrf-2的表达显著低于S1组(P<0.001)。由此表明，SF诱导的Nrf-2途径的激活为圆锥角膜氧化损伤提供了保护作用，HO-1的抑制剂Znpp降低了S1组角膜中Nrf-2的活性。

图7A为不同实验条件下角膜石蜡切片的Nrf-2染色结果图；其中黑色箭头代表Nrf-2阳性细胞。a-d：10x物镜(放大100x)，bar＝100μm；e-h：20x物镜(放大200x)，bar＝50μm；i-l：40x物镜(放大400x)，bar＝25μm。图7B为Western blot法检测四个实验组角膜中Nrf-2蛋白的表达水平；定量分析不同实验条件下Nrf-2蛋白在整个角膜中的相对含量(均数±标准差，n＝5)。**代表与C1组相比P<0.01，***代表与C1组相比P<0.001；#代表与K1组相比P<0.05，###代表与K1组相比P<0.001；+++代表与S1组相比P<0.001。

3.7SF上调HO-1在圆锥角膜中的表达

Nrf-2是调节HO-1表达的核转录因子。SF刺激并诱导圆锥角膜中HO-1蛋白的表达，实验测试结果如图8A、8B所示。K1组角膜中HO-1的表达显著高于C1组(P<0.01)；S1组角膜中HO-1的表达显著高于K1组(P<0.01)；Z1组角膜中HO-1的表达显著低于S1组(P<0.001)。结果表明，圆锥角膜中HO-1蛋白水平应激性增加，SF刺激并诱导圆锥角膜中HO-1蛋白的表达进一步增加，Znpp抑制S1组角膜中HO-1蛋白的表达。

图8A为不同实验条件下角膜石蜡切片的HO-1染色结果图。黑色箭头代表HO-1阳性细胞。a-d：10x物镜(放大100x)，bar＝100μm；e-h：20x物镜(放大200x)，bar＝50μm；i-l：40x物镜(放大400x)，bar＝25μm。图8B为Western blot法检测四个实验组角膜中HO-1蛋白的表达水平，定量分析不同实验条件下HO-1蛋白在整个角膜中的相对含量(均数±标准差，n＝5)。**代表与C1组相比P<0.01，***代表与C1组相比P<0.001；##代表与K1组相比P<0.01；+++代表与S1组相比P<0.001。

3.8SF下调圆锥角膜中Nox-2、Nox-4mRNA水平，上调Nrf-2、HO-1mRNA水平

实验组中Nox-2、Nox-4、Nrf-2和HO-1氧化应激相关基因mRNA的水平如图9所示。RT-qPCR定量分析结果显示，K1组Nox-2、Nox-4、Nrf-2和HO-1mRNA的水平显著高于C1组(n＝3，P<0.05)，与Western blot结果相符；与K1组比较，S1组Nox-2、Nox-4mRNA水平显著降低(n＝3，p<0.01)，Nrf-2、HO-1mRNA水平显著升高(n＝3，p<0.01)；与S1组相比，Z1组中Nox-2、Nox-4mRNA的水平显著增加(n＝3，p<0.05)，Nrf-2、HO-1mRNA水平显著降低(n＝3，p<0.05)。SF能降低K1组角膜氧化基因Nox-2、Nox-4mRNA水平，增加抗氧化基因Nrf-2、HO-1mRNA水平；Znpp削弱了SF对圆锥角膜的抗氧化作用。对照β-actin计算待测样品目的基因的相对表达量为2^-△△Ct(均数±标准差，n＝3)。*代表与C1组相比P<0.05，**代表与C1组相比P<0.01，***代表与C1组相比P<0.001；#代表与K1组相比P<0.05，##代表与K1组相比P<0.01，###代表与K1组相比P<0.001；+代表与S1组相比P<0.05，++代表与S1组相比P<0.01。

本发明研究结果表明圆锥角膜模型中莱菔硫烷(SF)具有抵抗角膜基质细胞发生氧化应激的作用，SF在许多组织中都发挥着有效的抗氧化应激保护作用，这些保护作用是通过Nrf-2介导的HO-1诱导产生。圆锥角膜模型中检测到活性氧簇(ROS)的产生显著增加，角膜曲率显著增加，中央角膜厚度显著降低；使用SF处理后，不仅降低了ROS的产生，而且降低了角膜曲率，增加了中央角膜厚度；同时，SF处理显著降低圆锥角膜中增加的Nox-2、Nox-4的表达水平，更加显著提高圆锥角膜中代偿性升高的Nrf-2、HO-1的表达水平；研究还发现，抑制HO-1的活性可以使SF对圆锥角膜的保护效应明显降低。

实施例1莱菔硫烷注射剂的制备

取纯度为98.5％莱菔硫烷5g，加入玉米油，拌使其溶解，至1000ml，然后用0.22μm微孔滤膜过滤，分装灌封，灭菌即可。制成注射剂，药理有效浓度为5mg/mL。

实施例2莱菔硫烷滴眼液的制备

在无菌条件下，称取纯度为98.5％莱菔硫烷5g，加入1000ml刻度烧瓶中，加经灭菌后的玉米油900ml，搅拌至全溶解，加玉米油至全量，搅匀，含量测定合格后，滤过，分装即得。制成滴眼液，药理有效浓度为5mg/mL。

Claims (10)

1.一种莱菔硫烷在制备用于缓解或/和治疗眼角膜扩张性疾病的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征是所述眼角膜扩张性疾病为圆锥角膜。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征是所述药物由莱菔硫烷和药学上可接受的载体组成。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是所述药物以注射剂、注射粉剂、滴眼液、凝胶剂、片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等形式存在。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是所述的莱菔硫烷的纯度≥50％。

6.一种用于缓解和/或治疗圆锥角膜疾病的药物，其特征是含有莱菔硫烷。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征是所述的莱菔硫烷的纯度为≥50％。

8.根据权利要求所述的药物，其特征是所述药物还包括药学上可接受的载体。

9.根据权利要求6所述的药物，其特征是所述莱菔硫烷的重量与所述药学上可接受的载体的体积之比为(1-10)：1。

10.一种莱菔硫烷在制备抑制圆锥角膜角膜组织中ROS生成抑制剂中的应用；在制备抑制圆锥角膜中Nox-2的表达的抑制剂中的应用；在制备抑制圆锥角膜中Nox-4的表达的抑制剂中的应用；在促进圆锥角膜中Nrf-2的表达的促进剂中的应用；在促进圆锥角膜中HO-1的表达的促进剂中的应用。