CN1318443C - 含游离半胱氨酸残基的蛋白重折叠的方法 - Google Patents

含游离半胱氨酸残基的蛋白重折叠的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及制备具有游离半胱氨酸的重折叠不溶或聚集蛋白的新方法,其中宿主细胞表达的蛋白接触半胱氨酸阻断剂。然后,可修饰该新方法制备的可溶重折叠蛋白以增加它们的效力。这种修饰包括连接PEG部分以形成PEG化蛋白。

Description

含游离半胱氨酸残基的蛋白重折叠的方法

发明技术领域本发明一般涉及制备至少含有一个“游离”半胱氨酸残基,即不参与二硫键的半胱氨酸的蛋白,更特别地涉及重组蛋白的方法。

发明背景蛋白治疗剂通常应该通过注射给予患者。多数蛋白治疗剂从体内被快速清除,迫使频繁地注射,常常是每日注射。人们对发展延长蛋白治疗剂在体内的循环半衰期使得不必频繁注射蛋白的方法有很大的兴趣。已证明用聚乙二醇(PEG)共价修饰蛋白是延长蛋白在体内循环半衰期的有效方法(Abuchowski等1984;Hershfield,1987;Meyers等1991)。PEG与蛋白共价连接可增加蛋白的有效大小并降低其从体内的排除速率。商业上可得到几种大小的PEGs,允许在使用不同大小PEGs过程中根据个体征象制定PEG修饰蛋白的循环半衰期。其它引证的PEG修饰的体内益处是蛋白溶解度和稳定性增加,和蛋白免疫原性降低(Katre等1987;Katre,1990)。

一个已知的PEG化蛋白的方法是使用半胱氨酸反应性PEGs将PEG与半胱氨酸残基共价连接。商业上可获得大量带有不同反应基团(如马来酰亚胺、乙烯砜)高度特异、半胱氨酸反应性PEGs和不同大小PEGs(2-40kDa,单链或支链)。在中性pH下,这些PEG试剂选择性连接“游离”半胱氨酸残基,即不参与二硫键的半胱氨酸残基。大多数蛋白中的半胱氨酸残基参与二硫键,不能使用半胱氨酸反应性PEGs进行PEG化。通过使用重组DNA技术体外诱变,另外的半胱氨酸残基可引入蛋白的任何位置。新添加的“游离”或“非天然”半胱氨酸残基可用作采用半胱氨酸反应性PEG的PEG分子的特异性结合的位点。新添加的“游离”或“非天然”半胱氨酸残基可置换蛋白中现存的氨基酸,添加到成熟蛋白氨基末端之前或成熟蛋白羧基末端之后,或插入到蛋白中两个正常相邻的氨基酸之间。可供选择地,参与天然二硫键的两个半胱氨酸之一可以缺失或被另一个氨基酸置换,留下一个天然半胱氨酸(蛋白中正常将与被缺失或置换的半胱氨酸残基形成二硫键的半胱氨酸残基)游离并可利用进行化学修饰。优选置换半胱氨酸的氨基酸是中性氨基酸如丝氨酸或丙氨酸。例如,人生长激素(hGH)具有两个可用碘乙酰胺还原和烷基化而不影响生物活性的二硫键(Bewley等(1969))。四个半胱氨酸的每一个将是缺失或被另一个氨基酸置换的合理目标。

已知几个天然产生蛋白含有一个或多个“游离”半胱氨酸残基。这种天然产生蛋白的实例包括人白介素(IL)-2(Wang等1984),β干扰素(Mark等1984;1985),G-CSF(Lu等1989)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,Thompson,1992)。IL-2,粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和β干扰素(IFN-α)含奇数量半胱氨酸残基,而碱性成纤维细胞生长因子含有偶数量半胱氨酸残基。

由于游离巯基在生理条件下的反应性,含游离半胱氨酸残基的重组蛋白的表达已经成为问题。含游离半胱氨酸的几个重组蛋白已经在细胞质表达,即,如细胞内蛋白,在细菌如大肠杆菌中表达。实例包括天然蛋白如IL-2,β-干扰素,G-CSF和IL-2的工程化半胱氨酸突变蛋白(mutein)(Goodson and Katre,1990),IL-3(Shaw等1992),肿瘤坏死因子结合蛋白(Tuma等1995),胰岛素样生长因子-I(IGF-I,Cox andMcDermott,1994),胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1,Van Den Berg等1997)和蛋白酶连接蛋白和相关蛋白(Braxton,1998)的半胱氨酸突变蛋白。所有这些蛋白在大肠杆菌中细胞内表达时大多不溶解。不溶蛋白很多无活性,为了恢复有效的生物活性需要重折叠(refolding)。在有些情况下,还原剂二硫苏糖醇(DTT)用于辅助溶解和/或不溶蛋白的重折叠。纯化的重折叠的IL-2,G-CSF和β干扰素蛋白不稳定且在生理pH下失去活性,明显是由于涉及游离半胱氨酸残基的二硫键重排(Wang等1984;Mark等1984;1985;Oh-eda等1990;Arakawa等1992)。丝氨酸取代这些蛋白中的游离半胱氨酸残基产生在生理pH下更稳定的蛋白(Wang等1984;Mark等1984;1985;Arakawa等1993)。

第二个已知的在细菌中表达重组蛋白方法是将它们分泌到周质间隙(periplasmic space)或培养基中。已知某些重组蛋白如GH当分泌到大肠杆菌周质时,以可溶活性形式表达,而它们在大肠杆菌中细胞内表达时是不溶的。通过将编码GH或其它目的蛋白的DNA序列与编码细菌信号序列如来自stII(Fujimoto等1988)和ompA蛋白(Ghrayeb等1984)的DNA序列融合达到分泌。需要重组蛋白在细菌中分泌,因为可以保留重组蛋白的天然N末端。重组蛋白的细胞内表达需要重组蛋白的氨基末端存在N末端甲硫氨酸。许多成熟形式的人蛋白的氨基末端正常不存在甲硫氨酸。例如,成熟形式人GH的氨基末端氨基酸是苯丙氨酸。为了所述蛋白在细菌中有效表达,氨基末端甲硫氨酸应该添加到重组蛋白的氨基末端,如果这个位置不存在甲硫氨酸的话。典型添加氨基末端甲硫氨酸是通过在编码重组蛋白的DNA序列前添加ATG甲硫氨酸密码子完成的。添加的N末端甲硫氨酸常常不从重组蛋白中去除,特别是如果重组蛋白不溶的话。hGH是这种情况,其中当蛋白在大肠杆菌中细胞内表达时不去除N末端甲硫氨酸。添加的N末端甲硫氨酸产生在人中可潜在刺激免疫反应的“非天然”蛋白。相比之下,使用stII(Chang等1987)或ompA(Cheah等1994)信号序列分泌到周质间隙的hGH没有添加的甲硫氨酸;重组蛋白始于天然的氨基末端氨基酸苯丙氨酸。天然hGH蛋白序列被保留,因为细菌酶在stII(或ompA)信号序列和成熟hGH蛋白的起始点之间切割stII-hGH蛋白(或ompA-hGH蛋白)。

hGH具有形成二硫键的四个半胱氨酸。hGH可用stII或ompA信号序列分泌到大肠杆菌周质中。分泌的蛋白可溶且具有生物活性(Hsiung等1986)。主要分泌形式的hGH是十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定表观分子量为22kDa的单体。可使用渗透压休克(osmoticshock)方法从周质间隙分离重组hGH(Koshland and Botstein,1980),优选将周质而不是细胞内蛋白释放到渗透压休克缓冲液中。然后用柱层析纯化释放的hGH蛋白(Hsiung等1986)。大量GH突变体已经分泌到大肠杆菌周质中。分泌的突变蛋白可溶且可使用类似用于纯化野生型GH的步骤纯化(Cunningham and Wells,1989;Fuh等1992)。出乎意料的是,当用类似的步骤用于分泌含游离半胱氨酸残基的GH变体(五个半胱氨酸;2N+1)时,发现当使用标准渗透压休克分离和发展用于GH的纯化步骤时,某些重组GH变体不溶或形成多聚体或聚集。在渗透压休克裂解产物中,非还原型SDS-PAGE可检测到极少量的单体GH变体蛋白。不溶或聚集的GH变体与可溶的正确折叠的hGH相比,生物活性降低。没有描述含游离半胱氨酸残基的不溶的分泌的生长激素变异体重折叠为生物活性形式的方法。

α干扰素(IFN-α2)也含有形成两个二硫键的四个半胱氨酸残基。用stII信号序列,IFN-α2可分泌到大肠杆菌周质中(Voss等1994)。分泌蛋白的一部分可溶且具有生物活性(Voss等1994)。可用柱层析纯化分泌的可溶重组IFN-α2(Voss等1994)。当试图用相似步骤分泌含游离半胱氨酸残基的IFN-α2变异体(五个半胱氨酸;2N+1)时,发现当使用发展用于IFN-α2的标准纯化步骤分离时,某些重组IFN-α2变异体大多不溶或形成多聚体或聚集。不溶或聚集的IFN-α2变异体与可溶的正确折叠的IFN-α2相比,生物活性降低。没有描述含游离半胱氨酸残基的不溶分泌的IFN-α2变异体重折叠为生物活性形式的方法。

人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)含有形成两个二硫键的五个半胱氨酸残基。成熟蛋白序列的17位的半胱氨酸残基是游离的。Perez-Perez等(1995)报道了使用变异形式的ompA信号序列,G-CSF可分泌到大肠杆菌周质中。然而,极少量ompA-G-CSF融合蛋白被正确加工而产生成熟G-CSF。在表达ompA-G-CSF融合蛋白的宿主细胞中共表达大肠杆菌dnaK和dnaJ蛋白可提高正确加工的G-CSF的百分比(Perez-Perez等1995)。在所有检测的大肠杆菌株中,正确加工的分泌的G-CSF大多不溶(Perez-Perez等1995)。不溶G-CSF与可溶的正确折叠的G-CSF相比,生物活性降低。当尝试用stII信号序列用相似步骤分泌野生型G-CSF,用丝氨酸[G-CSF(C17S)]取代游离半胱氨酸残基的G-CSF变异体,和含游离半胱氨酸残基(五个半胱氨酸;2N+1)的G-CSF(C17S)时,发现重组G-CSF蛋白大多也不溶。没有描述不溶分泌的G-CSF蛋白重折叠为生物活性形式的方法。

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)含有形成两个二硫键的四个半胱氨酸残基。Libbey等(1987)和Greenberg等(1988)报道了用ompA信号序列,GM-CSF可分泌到大肠杆菌周质中。正确加工的分泌的GM-CSF不溶(Libbey等1987;Greenberg等1988)。不溶GM-CSF与可溶正确折叠GM-CSF相比,生物活性降低。当尝试用stII信号序列用相似步骤分泌含游离半胱氨酸残基(五个半胱氨酸;2N+1)的GM-CSF变异体时,发现重组GM-CSF蛋白大多也不溶。没有描述不溶分泌的GM-CSF蛋白重折叠为生物活性形式的方法。

美国专利号5,206,344和Goodson和Katre(1990)描述了IL-2半胱氨酸置换突变蛋白的表达和纯化。IL-2半胱氨酸突变蛋白在大肠杆菌中细胞内表达时不溶。用变性试剂[10%十二烷基磺酸钠(SDS)或8M尿素]和还原剂[100mM二硫苏糖醇(DTT)]处理,重折叠和用大小排阻层析和反相HPLC纯化后,蛋白可溶。美国专利号5,166,322描述了IL-3半胱氨酸突变蛋白的表达和纯化。IL-3半胱氨酸突变蛋白在大肠杆菌中细胞内表达时也不溶。用变性试剂(胍)和还原剂(DTT),重折叠和用反相HPLC纯化后,蛋白可溶。纯化的IL-3半胱氨酸突变蛋白在含DTT的保存缓冲液中保持部分还原状态。当发明人仅使用变性试剂和还原剂(DTT)变性和重折叠不溶GH和G-CSF的半胱氨酸突变蛋白时,发现重折叠蛋白是异源的,包含多个分子量种类。类似地,当发明人仅用变性试剂和还原剂(DTT)来变性和重折叠不溶的,分泌的IFN-α2半胱氨酸突变蛋白时,没有获得可检测水平的正确折叠的IFN-α2半胱氨酸突变蛋白。

Malik等(1992)和Knusli等(1992)描述了野生型GM-CSF与胺反应性PEG试剂的结合。胺-PEG化GM-CSF包含在多个氨基酸残基进行了修饰的不同分子量PEG-GM-CSF种的异源混合物(Malik等1992;Knusli等1992)。用常规层析方法不能将各种胺-PEG化GM-CSF种类(amine-PEGylatedGM-CSF species)彼此分开而纯化,或从非PEG化GM-CSF中纯化,常规层析方法妨碍被测的各种同工形式的特殊活性测定。Clark等(1996)描述了GH与胺反应性PEGs的结合。胺PEG化GH也是异源的,包含在多个氨基酸残基修饰的多个分子量种类的混合物。胺PEG化GH蛋白显示出明显降低的生物活性(Clark等1996)。Monkarsh等(1997)描述了胺PEG化α干扰素,它也包含在不同氨基酸残基修饰的多个分子量种类。胺PEG化α干扰素也显示出降低的生物活性。Tanaka等(1991)描述了胺PEG化G-CSF,它也包含在不同氨基酸残基修饰的不同分子量种类的异源混合物。胺PEG化G-CSF显示出降低的生物活性Tanaka等(1991)。Kinstler等(1996)描述了优选在非天然N末端甲硫氨酸残基修饰的PEG化G-CSF蛋白。这个蛋白也显示出降低的生物活性Kinstler等(1996)。

因此,尽管作了大量的努力,仍存在高产量地使含一个或多个游离半胱氨酸残基的不溶或聚集蛋白重折叠为允许可溶生物活性形式的需要。本发明满足了这个需要而且也提供了相关优点。类似地,也存在通过增长蛋白分子量如PEG化而产生长期作用重组蛋白的同源制剂的方法的需要。

发明概述本发明一般涉及获得具有一个或多个游离半胱氨酸残基和以不溶或聚集形式被宿主细胞表达的重折叠可溶形式的蛋白的方法。这种蛋白包括但不限于,生长激素超基因(supergene)家族成员,如GH、IFN-α2、G-CSF和GM-CSF蛋白,和抗血管生成因子,如endostatin和制管张素。这方法通常通过(a)使宿主细胞表达不溶或聚集形式的具有游离半胱氨酸残基的蛋白;(b)裂解该细胞;(c)在变性试剂、还原剂和半胱氨酸阻断剂存在下,溶解不溶或聚集的蛋白;和(d)通过使变性试剂和还原剂浓度降低到足以允许蛋白复性为生物活性形式的水平而重折叠蛋白来完成。可选择地,溶解的重折叠蛋白与重折叠混合物中的其它蛋白分离。

合适的宿主细胞包括细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。优选,宿主细胞是细菌细胞,尤其是大肠杆菌。

优选,由本发明的方法产生的可溶重折叠蛋白是重组蛋白,特别是蛋白的半胱氨酸变异体或半胱氨酸突变蛋白。这里使用的术语“半胱氨酸变异体”和“半胱氨酸突变蛋白”是指包括蛋白氨基酸序列中的任何下列改变:在成熟蛋白氨基末端前或成熟蛋白羧基末端后添加半胱氨酸残基;非天然半胱氨酸残基置换蛋白中现存氨基酸;在蛋白的正常相邻氨基酸之间引入非天然半胱氨酸残基;或另一个氨基酸置换蛋白中正常形成二硫键的天然产生半胱氨酸残基。所述方法有效产生的蛋白包括但不限于GH、G-CSF、GM-CSF和干扰素,特别是α干扰素,这些蛋白的半胱氨酸变异体,它们的衍生物或拮抗剂。该方法有效的其它蛋白包括GH超基因家族的其它成员,转化生长因子(TGF)-β超家族,血小板衍化生长因子B,神经生长因子,脑衍化神经营养因子、神经营养蛋白-3,神经营养蛋白-4,血管内皮生长因子,趋化因子、激素、endostatin,制管张素,这些蛋白的半胱氨酸突变蛋白,或其衍生物或拮抗剂。也包含免疫球蛋白重链或轻链的半胱氨酸突变蛋白或其衍生物。

这里使用的术语“半胱氨酸阻断剂”是指任何导致蛋白中可逆阻断游离半胱氨酸残基形成的试剂或试剂的组合。有效的半胱氨酸阻断剂的实例包括但不限于,二硫酚如胱氨酸、胱胺、氧化谷胱苷肽、乙二硫醇酸(dithioglycolic acid)等,或硫醇如半胱氨酸、半胱胺、巯基乙酸(thioglycolic acid)和还原型谷胱苷肽。优选,硫醇应该在氧化剂存在下使用。有效的氧化剂包括氧、碘、铁氰化物、过氧化氢、二氢抗坏血酸、连四硫酸盐和O-碘氧苯甲酸盐(O-iodosobenzoate)。可选择地,可加入金属离子如铜(Cu++)或钴(Co++)催化氧化反应。尽管不希望受任何特定理论的限制,发明人推测半胱氨酸阻断剂与蛋白中游离半胱氨酸残基形成混合二硫化物,从而限制半胱氨酸残基参与可发生的可能的二硫化物重排。混合二硫化物稳定了游离半胱氨酸残基,明显增加了正确折叠的有生物活性的可溶蛋白的产量。认为这里使用的还原剂如DTT和2-巯基乙醇不是半胱氨酸阻断剂,因为它们不能与蛋白中游离半胱氨酸残基形成可逆阻断混合的二硫化物。DTT典型地不与蛋白中半胱氨酸残基形成混合二硫化物,由于氧化时热力学优选形成分子内键。

两个或更多重折叠蛋白通过它们的游离半胱氨酸残基共价连接形成的高度有序二聚体和多聚体蛋白也在本发明之内。

本方法进一步包括半胱氨酸反应部分(moiety)与重折叠蛋白连接形成修饰蛋白的各种方法,其中半胱氨酸反应部分与重折叠蛋白通过游离半胱氨酸残基连接。可与重折叠蛋白连接的有效半胱氨酸反应部分的实例是半胱氨酸反应性PEG,它可用于形成PEG化蛋白。这种方法包括(a)将具有游离半胱氨酸残基的重折叠蛋白与重折叠混合物中的其它蛋白分离;(b)用二硫化物还原剂还原,至少部分还原,分离,重折叠蛋白和(c)使所述蛋白接触半胱氨酸反应部分如半胱氨酸反应性PEG。可选择地,修饰蛋白可与未修饰蛋白分离。其它有效的半胱氨酸反应部分的实例是半胱氨酸反应性右旋糖苷,半胱氨酸反应性碳水化合物,半胱氨酸反应性聚(N-乙烯吡咯烷酮),半胱氨酸反应性肽,半胱氨酸反应性脂类和半胱氨酸反应性多糖。

本发明进一步包括这里公开的方法制备的可溶重折叠蛋白及其衍生物,包括PEG化蛋白。这种PEG化蛋白包括GH,G-CSF,GM-CSF和α干扰素蛋白的单PEG化(monopegylated)半胱氨酸变异体。这种PEG化蛋白还包括两个或更多PEG分子修饰的GH,G-CSF,GM-CSF和α干扰素蛋白的半胱氨酸变异体,其中至少一个PEG分子通过游离半胱氨酸残基与所述蛋白连接。

发明详述本发明提供了制备具有至少一个游离半胱氨酸残基并且以不溶或聚集形式被宿主细胞表达的重折叠可溶形式GH、IFN-α2、G-CSF和GM-CSF蛋白的新方法。本发明可用于制备具有至少一个游离半胱氨酸残基并且以不溶或聚集形式被宿主细胞表达的重折叠可溶形式的GH超基因家族的其它成员。本发明也可用于制备具有至少一个游离半胱氨酸残基并且以不溶或聚集形式被宿主细胞表达的重折叠可溶形式的其它类型蛋白,包括但不限于,抗血管生成蛋白如endostatin和制管张素。本发明进一步提供了用这些新方法制备的新的蛋白,尤其是重组蛋白,以及这种重组蛋白的衍生物。制备这种蛋白的新方法通常通过下列完成:(a)使宿主细胞表达不溶或聚集形式的具有游离半胱氨酸的蛋白;(b)用化学方法、酶学或物理方法裂解该细胞;(c)蛋白接触变性试剂、还原剂和半胱氨酸阻断剂,溶解不溶或聚集的蛋白;和(d)通过使溶解混合物中变性试剂和还原剂的浓度降低到足以允许蛋白复性为可溶的生物活性形式的水平而重折叠蛋白。

可供选择地,重折叠可溶蛋白可与重折叠混合物中其它蛋白分离。本发明的方法和其它实施方案在2000年5月16日申请的美国临时申请系列号60/204,617中详细描述。美国临时申请系列号60/204,617以其完整形式引入这里作为参考。

如上鉴定,这些方法中的第一步是使宿主细胞表达不溶或聚集形式的具有游离半胱氨酸残基的蛋白。合适的宿主细胞可以是原核或真核。可用于表达重组蛋白的适当宿主细胞的实例包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。细菌细胞特别有效,尤其是大肠杆菌。使宿主细胞表达蛋白的方法是本领域熟知的,这里提供了实施例。

这里使用的术语“具有游离半胱氨酸残基的蛋白”是指含有2N+1半胱氨酸残基的任何天然或重组蛋白或肽,其中N可以是0或任何整数,和含有2N半胱氨酸的任何天然或重组蛋白或肽,其中两个或更多半胱氨酸不正常参与二硫键形成。因此,本发明的方法在增强表达、回收和纯化具有游离半胱氨酸的任何蛋白或肽中有效,尤其是具有一个或更多游离半胱氨酸的添加半胱氨酸的变异重组蛋白(这里称作“半胱氨酸突变蛋白”或“半胱氨酸变异体”)。尽管被其天然宿主细胞表达的具有一个游离半胱氨酸的天然蛋白的表达、回收和纯化可用本发明的方法来增强,这里的说明书主要涉及重组蛋白,仅仅是为了说明目的。此外,蛋白可以源自任何动物种,包括人、companion动物和畜牧动物。蛋白也可源自任何植物种或微生物。

因此,本发明包含广范围的重组蛋白和这些蛋白的半胱氨酸变异体。这些蛋白包括GH超基因家族的成员和这些蛋白的半胱氨酸变异体。下列蛋白(“集体称作GH超基因家族”)由GH超基因家族的基因编码(Bazan(1990;1991;1992);Mott and Campbell(1995);Silvennoinen and Ihle(1996);Martin等(1990);Hannum等(1994);Blumberg等2001):GH、催乳素、胎盘催乳素、红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白介素-2(IL-2),IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-9,IL-10,IL-11,IL-12(p35亚单位),IL-13,IL-15,IL-19,IL-20,IL-TIF,MDA-7,AK-155,制瘤素M、睫毛神经营养因子、白血病抑制因子、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、ω干扰素、τ干扰素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、心肌营养素-1(CT-1)、干细胞因子和flt3/flk2配体。预期将来通过基因克隆和测序会鉴定GH超基因家族的其它成员。GH超基因家族的成员具有相似的二级和三级结构,尽管它们通常具有有限的氨基酸或DNA序列同一性。GH超基因家族的成员共有结构特征,Bazan(1990;1991;1992),Mott和Campbell(1995)和Silvennoinen和Ihle(1996)描述,允许容易鉴定新的基因家族成员。这些蛋白的变异体如Shanafelt等(2000)描述的IL-2选择性拮抗剂也包含在本发明中。

本方法也可增强另外的重组蛋白的表达、回收和纯化,包括TGFβ超家族成员。TGFβ超家族包括但不限于,源自神经胶质的神经营养因子(GDNF),转化生长因子β1(TGF-β1),TGF-β2,TGF-β3,抑制素A,抑制素B,骨形态形成蛋白-2(BMP-2),BMP-4,抑制素α,Mullerian抑制物(MIS),和OP-1(成骨蛋白1)。TGF-β超家族单体亚单位共有允许这个家族其它成员容易鉴定的某些结构特性:它们通过含有形成4个分子内二硫键的8个高度保守的半胱氨酸残基。典型地,第九个保守半胱氨酸是蛋白的游离单体形式,但参与单体亚单位同源二聚化(homodimerization)或异源二聚化(heterodimerication)过程中分子内二硫键的形成。Massague(1990),Daopin等(1992),Kingsley(1994),Kutty等(1998)和Lawton等(1997)描述了TGF-β超家族其它成员,这里引入作为参考。

免疫球蛋白(Ig)重链和轻链单体也含有参与分子内二硫键的半胱氨酸残基以及游离半胱氨酸(Roitt等1989 and Paul,1989)。这些游离半胱氨酸正常仅参与作为多聚化事件结果的二硫键的形成如重链同源二聚化,重链-轻链异源二聚化,(重链-轻链)异源二聚体同源二聚化和其它高度有序装配如IgM的情况下,(重链-轻链)异源二聚体的五聚化。因此,可利用本发明的方法增强人免疫球蛋白重和/或轻链(或其各种结构域)的表达、回收和纯化,如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgM IgA1,IgA2,分泌型IgA,IgD和IgE,及这些蛋白的半胱氨酸变异体或其片段。来自其它物种的免疫球蛋白也可以类似地表达、回收和纯化。与免疫球蛋白或免疫球蛋白结构域融合的蛋白,如Chamow&Ashkenazi(1996)所述,也可以类似地表达、回收和纯化。

基于术语称作“胱氨酸结(knot)”的共有结构基元,一组蛋白分为结构超家族。胱氨酸结定义是形成拓扑“打结”的三个分子内二硫键的六个保守半胱氨酸残基(McDonald and Hendrickson,1993)。这些蛋白也形成同源或异源二聚体,且在有些情况不是所有情况下,二聚化包括分子内二硫键形成。这个家族的成员包括TGF-β超家族成员和其它蛋白如血小板化生长因子A(PDGF-A)、PDGF-B,神经生长因子(NGF),脑衍化神经营养因子(BDNF),神经营养蛋白-3,神经营养蛋白-4,血管内皮生长因子(VEGF)。半胱氨酸阻断剂也可增强具有这个结构基元的蛋白和这些蛋白的添加半胱氨酸变异体的表达、回收和纯化。

本方法也可增强其它重组蛋白和/或这些蛋白的添加半胱氨酸变异体的表达、回收和纯化。本方法有效的蛋白类别包括蛋白酶和其它酶、蛋白酶抑制剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、细胞因子“选择性激动剂”、变应原、趋化因子、促性腺激素、趋化素、脂质结合蛋白、垂体激素、生长因子、生长肽激素、免疫球蛋白、白介素、干扰素、可溶受体、细胞表面受体的细胞外结构域、疫苗、单链抗体和血红蛋白。蛋白的具体实例包括,例如,leptin、胰岛素、胰岛素样生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、过氧化物歧化酶、过氧化氢酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、成纤维细胞生长因子、精氨酸酶、制管张素、endostatin、因子VIII、因子IX、白介素1受体拮抗剂、甲状旁腺激素、生长激素释放因子、降钙素、VEGF受体细胞外结构域、蛋白酶连接蛋白和抗凝血酶III。

将从PEG化受益和因此将成为半胱氨酸添加修饰的合理候选者的其它蛋白变异体包括溶解度低或聚集倾向的蛋白或肽,容易蛋白水解的蛋白或肽,需要提高机械稳定性的蛋白或肽,快速从体内清除的蛋白或肽,或具有不期望的免疫原性或抗原特性的蛋白或肽。

如果希望,一般使用如下面实施例和PCT/US98/14497和PCT/US00/0093所述的基于PCR定点诱变来构建这些蛋白的半胱氨酸和其它氨基酸突变蛋白,每篇以其完整形式引入作为参考。Methods in MolecularBiology,Vol.15:PCR Protocols:Current Methods and Applicationsedited by White,B.A.(1993)Humana Press,Inc.,Totowa,NJ and PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications edited by Innis,M.A.等(1990)Academic Press,Inc.San Diego,CA也一般描述了使用基于PCR的PCR步骤构建突变蛋白的方法。

本领域已知的方法可用于诱导蛋白在细胞质的表达或指导蛋白分泌,根据细胞起源,例如,下面的实施例中描述的方法。广泛的信号肽已经成功用于将蛋白转运到大肠杆菌的周质间隙。这些信号肽的实例包括原核信号序列如ompA,stII,PhoA signal(Denefle等1989),OmpT(Johnson等1996),LamB和OmpF(Hoffman and Wright,1985),β-内酰胺酶(Kadonaga等1984),肠毒素LT-A,LT-B(Morioka-Fujimoto等1991),和来自S.aureus的蛋白A(Abrahmsen等1986)。利于某些蛋白分泌的大量非天然、合成的信号序列也是本领域技术人员已知的。

下一步,裂解宿主细胞。可在下面描述的溶解步骤之前或同时进行细胞裂解。细胞裂解可通过例如机械剪切如法式压迫细胞(French pressurecell)、酶消化、超声处理、匀浆化、玻璃珠涡流、洗涤剂处理、有机溶剂、冻融、氧化铝或沙研磨、下面定义的变性试剂处理等等来完成(Bollag等1996)。可选择地,可在变性试剂、二硫键还原剂或半胱氨酸阻断剂存在下裂解细胞。可选择地,可用各种方法如离心、过滤(包括超滤法)、沉淀、絮凝或固定使不溶或聚集物质与可溶蛋白分离。

接下来,不溶或聚集物质(或没有裂解前的整个细胞)接触变性试剂和也是半胱氨酸阻断剂的二硫键还原剂,使不溶或聚集物质(或没有裂解前的整个细胞)可溶或成为单体。有效的变性试剂包括尿素、胍、精氨酸、硫氰酸钠、极端pH(稀释酸或碱)、洗涤剂(SDS,sarkosyl)、盐(盐酸盐,硝酸盐,硫氰酸盐,十六烷基甲基铵盐,三氯乙酸盐),化学衍化(亚硫酸盐解,与柠康酸反应)、溶剂(2-氨基-2-甲基-1-丙醇或其它醇,DMSO,DMF)或强阴离子交换树脂如Q-Sepharose。尿素的有效浓度是1-8M,5-8M是优选的浓度。胍的有效浓度是1-8M,4-8M是优选的浓度。也是半胱氨酸阻断剂的有效的二硫键还原剂包括但不限于,硫醇如半胱氨酸、巯基乙酸、还原型谷胱苷肽和半胱胺。这些化合物可用0.5至200mM的范围,1-50mM是优选的浓度。半胱氨酸、还原型谷胱苷肽、巯基乙酸和半胱胺是优选的还原剂,因为它们也是半胱氨酸阻断剂,即它们与蛋白中游离半胱氨酸残基反应形成可逆阻断游离半胱氨酸残基。溶解步骤过程中使用也是半胱氨酸阻断剂的二硫键还原剂可减少不溶或聚集蛋白重折叠为可溶活性形式的这个过程所需化合物和步骤的数量。而且,使用半胱氨酸阻断剂产生下述的用各种半胱氨酸反应部分和程序适合在游离半胱氨酸残基衍化的重折叠蛋白的形式。优选,变性/还原混合物的pH在pH6和pH10之间。

程序的下一步是重折叠蛋白获得蛋白的天然构象和天然二硫键。重折叠通过使变性试剂和还原剂的浓度降至足以允许蛋白复性为可溶生物活性形式的水平而完成。这可以通过透析、稀释、凝胶过滤、蛋白沉淀或通过固定在树脂上后缓冲液洗涤而达到。选择这个步骤的条件允许蛋白天然二硫键重建。这可通过添加氧化剂,或氧化剂和还原剂的氧化还原混合物而裂解二硫键交换反应而完成。优选,选择试剂或试剂混合物可导致天然二硫键形成和可逆阻断游离半胱氨酸残基,即试剂或试剂混合物起半胱氨酸阻断剂的作用。有效氧化剂的实例包括氧、胱氨酸、氧化型谷胱苷肽、胱胺和乙二硫醇酸。有效的氧化还原混合物包括半胱氨酸/氧、半胱氨酸/胱氨酸、半胱氨酸/胱胺、半胱胺/胱胺、还原型谷胱苷肽/氧化型谷胱苷肽等等。可选择地,还原剂如DTT或2-巯基乙醇可加入重折叠混合物中以促进二硫键交换。可选择地,金属离子如铜(Cu++)或钴(Co++)可加入重折叠混合物中以促进蛋白氧化。混合物中金属离子的有效浓度是1iM至1mM,40iM是优选的浓度。优选,重折叠混合物的pH在pH6和pH10之间。

备选地,通过使用变性试剂和可以是也可以不是半胱氨酸阻断剂的二硫键还原剂,使不溶或聚集物质(或没有裂解前的整个细胞)可溶或成为单体。有效的变性试剂包括但不限于如上所述的那些。有效的二硫键还原剂包括但不限于,DTT、2-巯基乙醇、氢硼钠、三膦、硫醇如半胱氨酸、还原型谷胱苷肽、巯基乙酸和半胱胺。DTT和2-巯基乙醇可使用0.5-200mM的浓度,1-50mM是优选的浓度。然后,变性和还原的蛋白与当还原时可起半胱氨酸阻断剂作用的摩尔过量(相对于还原剂的浓度)的二巯酚试剂。当还原时可起半胱氨酸阻断剂作用的有效的二硫酚试剂的实例包括含有二硫键的化合物如胱氨酸、半胱氨酸、氧化型谷胱苷肽、二硫乙醇酸、5,5’-二硫基双(2-硝基苯酸(Ellman′s试剂))、二硫吡啶、R-S-S-CO-OCH3型化合物,其中R是有机化合物,胱氨酸的其它衍生物如二甲酰胱氨酸、二乙酰胱氨酸、二氨基乙酰基胱氨酸、二丙氨酰胱氨酸、二谷氨酰胱氨酸、胱氨酰二甘氨酸、胱氨酰二谷酰胺、二丙氨酰胱氨酸二酐、胱氨酸苯基乙内酰脲、高胱氨酸、二硫二丙酸、二甲基胱氨酸,或任何硫醇或能够经历二硫键交换反应的化学药品。蛋白的重折叠由降低变性试剂(使用上述方法)和添加还原剂如半胱氨酸、二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、还原性谷胱苷肽、巯基乙酸或其它硫醇来促进二硫键交换而启动。优选,选择试剂或试剂组合可引起天然二硫键形成和可逆阻断游离半胱氨酸残基。可选择地,金属离子如铜(Cu++)或钴(Co++)可加入重折叠混合物中以促进蛋白氧化。可选择地,甘油可加入重折叠混合物中以增加重折叠蛋白产量。重折叠混合物中甘油的有效浓度是1-50%(体积/体积),10-20%是优选范围。优选,重折叠混合物的pH是6-10。

尽管不希望受任何特殊理论的限制,据信用于本方法的半胱氨酸阻断剂共价连接“游离”半胱氨酸残基,形成混合二硫化物,因此稳定游离半胱氨酸残基并防止蛋白多聚化和聚集。大量硫醇反应化合物可用作半胱氨酸阻断剂来稳定含游离半胱氨酸的蛋白。除了半胱氨酸、半胱胺、巯基乙酸和还原型谷胱苷肽外,半胱氨酸阻断剂也可以包括含二硫键的试剂如胱氨酸、胱胺、二巯基乙酸、氧化型谷胱苷肽、5,5’-二硫基双(2-硝基苯酸(Ellman′s试剂))、二硫吡啶、R-S-S-CO-OCH3型化合物,胱氨酸的其它衍生物如二甲酰胱氨酸、二乙酰胱氨酸、二氨基乙酰基胱氨酸、二丙氨酰胱氨酸、二谷氨酰胱氨酸、胱氨酰二甘氨酸、胱氨酰二谷酰胺、二丙氨酰胱氨酸二酐、胱氨酸苯基乙内酰脲、高胱氨酸、二硫二丙酸、二甲基胱氨酸,或任何硫醇或能够经历二硫键交换反应的化学药品。亚磺酰卤化物也可以用于制备混合二硫化物。发现可用于稳定含游离半胱氨酸残基蛋白的其它硫醇阻断剂包括能够可逆与游离硫醇反应的化合物。这些试剂包括锌、汞和银的某些重金属盐或有机衍生物。Cecil和McPhee(1959)和Torchinskii(1971)描述了其它硫醇化物形成试剂或可逆硫醇反应化合物。

可选择地,从重折叠混合物可溶片段中其它蛋白中回收和分离含游离半胱氨酸残基的可溶蛋白。周质回收和纯化方法是本领域技术人员已知或容易确定的,包括,例如离心、过滤、透析、层析,包括大小排阻、离子交换、疏水交互作用和亲和层析程序等等。合适的回收和纯化期望蛋白的方法将部分依赖于蛋白特性和意欲的用途。

本发明也提供了制备生物活性G-CSF蛋白的新方法,尤其是野生型G-CSF,G-CSF(C17S),和G-CSF和G-CSF(C17S)变异体,包括半胱氨酸变异体,(集体称作“G-CSF蛋白”),它引起已正确加工和具有生物活性的回收G-CSF蛋白的百分比明显增加。这些新方法包括利用stII信号序列使G-CSF蛋白分泌到大肠杆菌周质中,变性和重折叠不溶或聚集G-CSF蛋白,并从复性/重折叠混合物的可溶片段中其它蛋白中纯化可溶重折叠G-CSF蛋白。回收的G-CSF蛋白,当G-CSF蛋白在大肠杆菌细胞内表达时,缺乏非天然N末端甲硫氨酸残基。出版的报道(Perez-Perez等1995)描述了使用修饰的ompA引导序列,G-CSF分泌到大肠杆菌周质中。然而,极少量的表达ompA-G-CSF融合蛋白被正确加工产生成熟G-CSF。通过大肠杆菌dnaJ和dnaK蛋白共表达,正确加工G-CSF蛋白的百分比可增加到总表达G-CSF蛋白的10-30%。在所有情况下,分泌的G-CSF蛋白大多不溶和无生物活性。本发明的方法产生了至少80-100%正确加工的G-CSF蛋白且不需要dnaJ和dnaK蛋白共表达。本发明也首次提供了不溶分泌G-CSF变性和重折叠为生物活性形式的方法。

如果期望,可进一步加工根据这些方法获得的纯化蛋白。例如,可用各种半胱氨酸反应部分在游离半胱氨酸残基修饰分离的蛋白。例如,可用各种半胱氨酸反应性PEG试剂在游离半胱氨酸残基PEG化蛋白,随后如单PEG化蛋白纯化。术语“单PEG化”定义是指单一PEG分子与蛋白共价连接修饰的蛋白。本领域技术人员已知的任何方法可用于从未修饰蛋白和未反应PEG试剂中纯化PEG化蛋白,包括,例如,下面实施例中所述的方法,和PCT/US98/14497和PCT/US00/00931。其它有效的半胱氨酸反应部分的实例是半胱氨酸反应性右旋糖苷、半胱氨酸反应性碳水化合物和半胱氨酸反应性聚(N-乙烯吡咯烷酮)。

本发明也提供了GH,G-CSF,GM-CSF,α干扰素和其它含2N+1半胱氨酸残基的蛋白,和其它含2N半胱氨酸残基的蛋白,其中两个或更多半胱氨酸残基是游离的半胱氨酸突变蛋白的PEG化方法,尤其是混合二硫化物阻断游离半胱氨酸残基的那些突变蛋白和蛋白的PEG化方法。

本发明进一步涉及这里公开的方法制备的纯化、单PEG化的蛋白变异体,它们不仅具有生物活性,而且在蛋白依赖性哺乳动物细胞增殖试验中保持高度特异活性。这种蛋白变异体包括,例如,G-CSF,GH,GM-CSF,IFN-α2的纯化、单PEG化半胱氨酸变异体。例如,这里描述的某些单PEG化G-CSF变异体的体外生物活性比用胺反应性NHS-PEG试剂PEG化的G-CSF的生物活性高3至50倍。

有25个以上不同的IFN-α基因(Pestka等1987)。IFN-α家族成员具有不同程度的氨基酸同源性并显示出重叠的生物活性。通过不同IFN-α蛋白区域连接在一起产生的非天然重组IFN-α处于临床发展的各个阶段(Horisberger and DiMarco,1995)。也描述了非天然“一致(consensus)”干扰素(Blatt等1996),它在IFN-α每个位置具有最普通的氨基酸。本发明的方法也对重折叠含游离半胱氨酸残基的其它α干扰素种和非天然α干扰素蛋白有效。PEG化IFN-α2的半胱氨酸突变蛋白的有效的位点和区域可直接适用于IFN-α基因家族的其它成员和非天然IFN-α。Kinstler等(1996)描述了单PEG化一致干扰素,其中优选在N末端,非天然甲硫氨酸残基通过胺或酰胺键单PEG化蛋白。PEG化蛋白的生物活性相对于未修饰一致干扰素降低大约5倍(Kinstler等1996)。

在单PEG化G-CSF的一个实施方案中,聚乙二醇与靠近G-CSF的螺旋A(HelixA)的区域连接,所得单PEG化G-CSF的EC50小于大约1000pg/ml(大约50pM),优选小于大约100pg/ml(大约5pM),更优选小于大约20pg/ml(大约1pM)和最优选小于大约15pg/ml(大约0.7pM)。可供选择地,聚乙二醇部分(moiety)可与G-CSF的C-D环连接,所得单PEG化G-CSF的EC50小于大约1000pg/ml(大约50pM),优选小于大约100pg/ml(大约5pM),更优选小于大约20pg/ml(大约1pM)和最优选小于大约15pg/ml(大约0.7pM)。可供选择地,聚乙二醇部分与远离G-CSF的螺旋D的区域连接,所得单PEG化G-CSF的EC50小于大约1000pg/ml(大约50pM),优选小于大约100pg/ml(大约5pM),更优选小于大约20pg/ml(大约1pM)和最优选大约15pg/ml(大约0.7pM)。Kinstler等(1996)描述了单PEG化野生型G-CSF,其中优选在N末端,非天然甲硫氨酸残基通过胺或胺键单PEG化蛋白。报道了单PEG化G-CSF蛋白的生物活性相对于未修饰G-CSF降低大约30%,尽管未提供EC50(Kinstler等1996)。Kinstler等(1996)没有确定pEG修饰G-CSF的螺旋A最近区域的其它氨基酸是否产生生物活性的G-CSF蛋白。本发明的一个目的是公开了螺旋A靠近区域(the region proximal to HelixA)的其它氨基酸位点,和G-CSF的其它区域,其中可连接PEG,产生有生物活性的单PEG G-CSF蛋白。

在单PEG化GM-CSF的一个实施方案中,聚乙二醇与GM-CSF螺旋A靠近区域连接,所得单PEG化GM-CSF的EC50小于大约14000pg/ml(大约1000pM),优选小于大约1400pg/ml(大约100pM),更优选小于大约280pg/ml(大约20pM)和最优选小于大约140pg/ml(大约10pM)。可供选择地,聚乙二醇部分与GM-CSF螺旋B-C环连接,所得单PEG化GM-CSF的EC50小于大约14000pg/ml(大约1000pM),优选小于大约1400pg/ml(大约100pM),更优选小于大约280pg/ml(大约20pM)和最优选小于大约140pg/ml(大约10pM)。可供选择地,聚乙二醇部分与GM-CSF螺旋C-D环连接,所得单PEG化GM-CSF的EC50小于大约14000pg/ml(大约1000pM),优选小于大约1400pg/ml(大约100pM),更优选小于大约280pg/ml(大约20pM)和最优选小于大约140pg/ml(大约10pM)。

在单PEG化GH的一个实施方案中,聚乙二醇与GH螺旋A靠近区域连接,所得单PEG化GH的EC50小于大约2000ng/ml(大约100nM),优选小于大约200ng/ml(大约10nM),更优选小于大约20ng/ml(大约1nM)和最优选小于大约2ng/ml(大约0.1nM)。

本发明进一步提供了可彼此共价连接或彼此结合或与化学基团结合的蛋白变异体而产生高度有序多聚体,如二聚体、三聚体和四聚体。这种高度有序多聚体(higher order multimer)可根据本领域技术人员已知的方法或如实施例2和20所述的方法制备。例如,这种结合物可产生比相应天然蛋白分子量更高的GH,G-CSF,GM-CSF或αIFN加合物。适合耦联的化学基团优选无毒和无免疫原性的。这些化学基团将包括碳水化合物或聚合物如多元醇。

有效用于连接本发明的半胱氨酸变异体形成“PEG化”蛋白的“PEG部分”包括任何合适的聚合物,例如,线性或支链多元醇。优选的多元醇是聚乙二醇,它是包含乙烯氧化单位的合成聚合物。乙烯氧化单位可变化使得可得到大小排阻层析测定表观分子量从大约10,000到大于500,000kDa的PEG化蛋白变异体。PEG部分的大小直接影响其循环半衰期(Yamaoka等1994)。因此,人们可通过改变PEG部分的大小和结构改造具有不同循环半衰期的蛋白变异体用于特殊治疗应用或优选的剂量方案。因此,本发明包含大小排阻层析测定表观分子量大于大约30kDa,更优选大于大约70kDa,EC50小于大约400ng/ml(18nM),优选小于100ng/ml(5nM),更优选小于大约10ng/ml(0.5nM)和甚至更优选小于大约2.2ng/ml(大约0.1nM)的GH蛋白变异体。本发明进一步包含大小排阻层析测定表观分子量大于大约30kDa,更优选大于大约70kDa,EC50小于大约100ng/ml(5nM),优选小于1000pg/ml(50pM),更优选小于100pg/ml(6pM)和甚至更优选小于大约15pg/ml(0.7pM)的G-CSF蛋白变异体。本发明进一步包含大小排阻层析测定表观分子量大于大约30kDa,更优选大于大约70kDa,EC50小于大约1900pg/ml(100pM),优选小于400pg/ml(210pM),更优选小于100pg/ml(5pM)和甚至更优选小于大约38pg/ml(2pM)的αIFN(IFN-α)蛋白变异体。本发明进一步包含大小排阻层析测定表观分子量大于大约30kDa,更优选大于大约70kDa,EC50小于大约14,000pg/ml(-1000pM),优选小于1400pg/ml(~100pM),更优选小于280pg/ml(20pM)和甚至更优选小于大约140pg/ml(~1pM)的GM-CSF蛋白变异体。

用于半胱氨酸修饰的反应性PEG末端基团包括但不限于乙烯砜、马来酰亚胺和吲哚乙酰部分(moiety)。PEG末端基团应该是硫醇特异性的,反应在对蛋白无害的条件下进行。

如PCT/US98/14497和PCT/US/00/00931描述用添加半胱氨酸变异体GH可制备拮抗剂hGH变异体。将从给予GH拮抗剂中受益的情况包括肢端肥大症、vascular eye diseases、糖尿病肾病、血管成形术后再狭窄和生长激素反应性恶性肿瘤。

这里使用的术语“衍生物”是指本方法表达和回收的任何蛋白变异体。这种变异体包括但不限于,PEG化类型(version)、二聚体和其它高度有序变异体、氨基酸变异体、截短变异体、融合蛋白、碳水化合物、磷酸化的改变或其它天然蛋白中发现的连接基团,和这里公开的任何变异体。

本方法制备的化合物可用于各种体外和体内应用。本发明的蛋白及其衍生物可用于已知的它们的野生型、天然或以前所知的修饰副本(counterpart)的研究、诊断或治疗目的。体外应用包括,例如,蛋白用于筛选、检测和/或纯化其它蛋白的用途。

对于治疗的目的,本领域技术人员容易确定合适的剂量、剂量频率和给药途径。做这种决定的因素包括但不限于,待给予的蛋白的性质、待治疗的情况、潜在患者适应性、患者的年龄和体重等等。本发明的化合物也可用作增加连接的治疗物循环半衰期或指导传递到体内特异目标的传递载体。

下列实施例不旨在限制本发明,只是本发明具体实施方案的示例。

实施例实施例1生长激素突变蛋白T3C的重折叠PCT/US98/14497和PCT/US/00/00931描述了表达、纯化和确定重组人生长激素(hGH)和hGH半胱氨酸突变蛋白体外和体内生物活性的方法。PCT/US98/14497和PCT/US/00/00931也描述了构建hGH半胱氨酸突变蛋白的方法。一个在大肠杆菌中表达hGH的优选方法是用STII引导序列将蛋白分泌到周质中。分泌的hGH是可溶的且可如PCT/US/00/00931所述用柱层析纯化。使用STII引导序列时,某些hGH半胱氨酸突变蛋白当分泌到大肠杆菌周质时保持不溶。重折叠不溶的分泌的hGH蛋白的方法以前没有描述。下列方案用于将不溶hGH半胱氨酸突变蛋白重折叠为生物活性形式。

不溶GH T3C突变蛋白(3位苏氨酸改变半胱氨酸;PCT/US98/14497和PCT/US/00/00931描述)在大肠杆菌中作为用如PCT/US/00/00931所述的stII引导序列而分泌到周质间隙的蛋白表达。用下列两个步骤溶解和重折叠T3C蛋白,其中两个都使用半胱氨酸作为还原剂和作为半胱氨酸阻断剂来稳定游离半胱氨酸残基。表达T3C突变蛋白的大肠杆菌株培养物(200ml)生长和T3C表达诱导如PCT/US/00/00931所述。细胞裂解和不溶部分离心分离如实施例14所述。含T3C的不溶物质溶于20mL 8M尿素、20mM半胱氨酸、20mM Tris pH9中并在室温振荡混合1小时。溶解混合物接下来分为两份,一半稀释于50mL 10%甘油,20mM Tris,pH8,另一半稀释于50mL 0.5%TWEEN 20,20mM Tris,pH8。重折叠物离心澄清前在4℃保存24小时并填入预先在20mM Tris,0.5%Tween 20,pH7.6中平衡的5mLQ-Sepharose Hi Trap柱中。在含0-300mM NaCl的0.5%Tween 20,20mMTris pH7.6的20柱体积梯度中从柱中洗脱重折叠可溶的T3C。用非还原型SDS-PAGE分析回收的柱级分。单体T3C在大约160mM NaCl洗脱。从复性缓冲液中含甘油重折叠物中回收大约790μg单体T3C。当复性缓冲液中存在Tween 20时,从重折叠物中回收大约284μg单体T3C。结果表明使用重折叠/复性步骤可得到可溶单体T3C蛋白。基于单体T3C蛋白较高的回收量,甘油在随后重折叠实验中用作稳定剂。

实施例2还原剂用于重折叠生长激素T3C突变蛋白的比较表达T3C突变蛋白的大肠杆菌株培养物(200ml)生长和T3C表达如PCT/US/00/00931所述。如实施例5和14所述用洗涤剂/溶菌酶处理细胞裂解细胞而分离不溶T3C。该物质重悬于20mL 8M尿素,  20mM Tris pH9并等分到3个管。第一个管中不加还原剂(“重折叠A”),第二个管加入5mM DTT(“重折叠B”)和第三个管加入20mM半胱氨酸(“重折叠C”)。室温混合一个小时后,溶解物稀释于30mL 10%甘油,20mM Tris,pH8中。重折叠物在4℃保持过夜。第二天,如PCT/US00/00931所述离心澄清重折叠物并填入5mL Q-Sepharose Hi Trap柱中。通过非还原SDS-PAGE分析回收的级分。从“重折叠A”(无还原剂)回收的T3C蛋白从Q-Sepharose柱中洗脱几个宽峰。用SDS-PAGE,回收的蛋白产物具有一些单体T3C蛋白存在,但主要由聚集的T3C二聚体(在210mM NaCl洗脱)和T3C多聚体(在300mM至1000mM NaCl之间洗脱)组成。表1显示单体和二聚体T3C蛋白的最终回收物。从“重折叠B”(5mM DTT)回收的T3C蛋白从Q-Sepharose柱中洗脱为单一宽峰,但用非还原型SDS-PAGE分析是非均质的(heterogeneous)。单体T3C带比垂体hGH带宽得多且包含大量不同分子量的单体种类,可能存在不同的T3C同工二硫化物。少量二聚体T3C蛋白也在几个级分中检测到。“重折叠C”(半胱氨酸作为还原剂)主要得到单体T3C蛋白,看来是单一均质种类,在Q-Sepharose柱160mM NaCl洗脱峰的精确度(sharpness)以及当用非还原型SDS-PAGE分析时,正确分子量(相对于标准垂体hGH)的蛋白带的精确度可证明。从每个重折叠物得到的单体和二聚体形式T3C的最终回收物在表1中给出。数据表明在半胱氨酸存在下溶解/重折叠T3C蛋白比在缺乏还原剂或在DTT存在下溶解/重折叠蛋白的溶解单体T3C蛋白的产量高。结果也表明在半胱氨酸存在下溶解/重折叠T3C蛋白产生比在缺乏还原剂或在DTT存在下溶解/重折叠蛋白更稳定、均质制剂的可溶单体T3C蛋白。

表1使用各种重折叠步骤制备的T3C蛋白的回收物

a每66ml大肠杆菌培养物中回收的蛋白从溶解混合物中含DTT的重折叠B回收的单体T3C蛋白,通过将该蛋白放置在允许形成二硫键的条件下,可转换为稳定的二硫键连接的同源二聚体T3C蛋白。这些条件包括向蛋白中加入氧化剂,或添加当pH接近中性或碱性时,能够进行二硫键重排的第二种二硫键试剂的条件。可使用的氧化剂的实例包括连四硫酸钠或氧。有效的二硫键化试剂包括胱氨酸、胱胺、氧化型谷胱苷肽、二硫羟乙酸盐或其它低分子量二硫酚。可供选择地,单体T3C蛋白可在酸性pH下保存以防止聚集和不期望的二硫键重排。

根据实施例1和2所述的步骤制备的可溶重折叠GH半胱氨酸突变蛋白可通过本领域技术人员所知的各种层析步骤来纯化。这些层析步骤包括离子交换,大小排阻、疏水相互作用(HIC),金属螯合亲和层析(IMAC),大小排阻层析(SEC),反相层析或这些技术的组合。作为一个实例,可使用在20mM Tris-HCl,pH8.0中平衡的Q-Sepharose快速流动树脂(Pharmacia)从重折叠混合物的可溶片段中捕获GH突变蛋白。用20mM Tris-HCI,pH8.0洗涤柱,用线性10-20体积含盐浓度从0至250mM NaCl不断增加的20mMTris-HCl,pH8.0洗脱结合蛋白。可选择地,甘油(10%终浓度)可加入到柱缓冲液中。可用SDS-PAGE和Western印迹鉴定含hGH突变蛋白的级分。可用于从重折叠/复性混合物的可溶片段中捕获hGH突变蛋白的可供选择的树脂包括HIC,其它离子交换树脂或亲和树脂。

可用疏水相互作用层析可进一步纯化半胱氨酸突变蛋白。可汇合含GH突变蛋白的Q-Sepharose柱级分,加入aCl至终浓度为2M。汇合物可填入在2M NaCI,20mM硫酸钠pH7.5中预先平衡的丁基Sepharose快速流动树脂。可使用含从2M至0M NaCl逆向盐梯度的20mM磷酸盐(phosphate)pH7.5从树脂中洗脱GH突变蛋白。可用SDS-PAGE和Western印迹鉴定含GH突变蛋白的级分。可供选择地,可汇合含GH突变蛋白的Q-Sepharose柱级分,并在加载到苯基Sepharose柱前,加入硫酸铵至终浓度为2M。可用含从2M至0M NaCl逆向盐梯度的20mM磷酸钠pH7.5从树脂中洗脱GH突变蛋白。可用SDS-PAGE和Western印迹鉴定含GH突变蛋白的级分,并汇合。

如果需要进一步纯化,含GH突变蛋白的HIC汇合物可直接填入在10mM磷酸钠,0.5M NaCI,pH7.5中平衡的镍螯合树脂(Qiagen)。洗涤步骤后,可使用含0-30mM imidizole梯度的10mM磷酸钠,0.5M NaGI,pH7.5回收GH突变蛋白。GH对镍有高亲和力,推测通过H18,H21和E174形成的二价金属结合位点。结果,可使用金属螯合柱得到高纯度形式的GH(Maisano等1989)。GH突变蛋白将与镍柱紧密结合并在相似的imidazole浓度(大约15mM)下以野生型GH洗脱。可供选择地,铜螯合柱可用于替换镍螯合柱。

可使用PCT/US00/00931描述的细胞增殖实验测定纯化GH半胱氨酸突变蛋白的生物活性。可使用Bradford染料结合实验(Bio-Rad Laboratories)确定蛋白浓度。

T3C突变蛋白纯化如下。600mL大肠杆菌培养物生长和诱导T3C蛋白表达如上所述。如实施例5和14所述用洗涤剂/溶菌酶混合物(B-PerTM,Pierce)处理细胞以分离不溶T3C。不溶物质悬浮于40mL 8M尿素,20mMTris,20mM半胱氨酸,pH9中。室温混合一个小时后,溶解混合物稀释至200mL 15%甘油,20mM Tris,pH8,40μM硫酸铜。重折叠物在4℃保存过夜。第二天,离心澄清重折叠物并填入在10%甘油,20mM Tris,pH8中平衡的5mL Q-Sepharose Hi Trap柱。用20柱体积含梯度从0-250mM NaCl的20mM Tris,pH8,10%甘油洗脱回收T3C。用非还原型SDS-PAGE分析回收的级分。汇合主要含正确表观分子量T3C蛋白的级分。混合的级分产生4.6mg纯化T3C蛋白。这种物质用于实施例3中所述的PEG化研究。如实施例1和2和PCT/US98/14497和PCT/US00/00931所述在GH-R4细胞增殖试验中测定纯化的T3C蛋白的生物活性。T3C蛋白刺激GH-R4细胞增殖,EC50为1.35ng/ml。

用这个方法制备的其它GH半胱氨酸突变蛋白包括*-1C,P2C,P5C,K38C,Q40C,K41C,S55C,S57C,T60C,Q69C,N72C,N99C,L101C,V102C,Y103C,D130C,S132C,P133C,R134C,T135C,Q137C,K140C,Q141C,T142C,Y143C,K145C,D147C,N149C,S150C,H151C,N152C,D153C,E186C和G187C。用PCT/US00/00931所述的GH-R4细胞增殖试验测定某些纯化的GH半胱氨酸突变蛋白的生物活性。观察到的突变蛋白*-1C,P2C,P5C,K38C,Q40C,S55C,N99C,L101C,V102C,Y103C,P133C,Q137C,K140C,Y143C,D147C,N149C,E186C,和G187C的EC50从0.7ng/ml至2.2ng/ml。这些值都接近等同于在这些试验中野生型GH对照观察到的EC50,它从0.3ng/ml至1.5ng/ml。

实施例3PEG化和纯化含游离半胱氨酸残基的蛋白的PEG化形式的一般方法可用商业可获得的各种半胱氨酸反应性PEG-马来酰亚胺(或PEG-乙烯砜)试剂PEG化含游离半胱氨酸残基的蛋白。为了达到游离半胱氨酸最佳的PEG化,通常用二硫苏糖醇(DTT),Tris(2-羧乙基)膦-HCl(TCEP)或一些其它还原剂部分还原重组蛋白。游离半胱氨酸对半胱氨酸反应性PEGs相对无反应性,除非进行这部分还原步骤。部分还原每个突变蛋白的还原剂量可凭经验确定,在不同pH和温度下使用一定范围的还原剂浓度。还原剂浓度典型地从0.5等摩尔至10倍摩尔过量变化。优选的温度是4℃至37℃。pH可从从6.5至9.0变化,但优选7.5至8.5。最佳的条件也将依赖还原剂和接触时间而变化。在正确条件下,首先破坏最不稳定的二硫化物(disulfides)(典型的是分子间二硫化物和混合二硫化物)而不是热力学较稳定的天然二硫化物。典型地,室温下5-10倍摩尔过量的DTT进行30分钟是有效的。逆向柱的蛋白洗脱图轻微移动(shift)可检测部分还原。非还原型SDS-PAGE分析蛋白样品的表观分子量轻微移动也可检测部分还原。应当小心不要“过度还原”蛋白和暴露另外的半胱氨酸残基。逆向HPLC(过度还原蛋白将具有与完全还原和变性蛋白类似的保留时间)和PEG化反应后出现含两个PEGs的蛋白分子(可用SDS-PAGE上表观分子量改变检测)可检测过度还原。在半胱氨酸突变蛋白的情况下,相应的野生型蛋白可作为对照,因为它在不还原天然分子内二硫化物的条件下不应该PEG化。PEG化前,用大小排阻层析或透析去除过量的还原剂。在加入PEG化试剂前,不需要去除TCEP,因为它不合游离硫醇基团。部分还原蛋白可与各种浓度PEG-马来酰亚胺或PEG-乙烯砜(典型地,PEG∶蛋白摩尔比是1∶1,5∶1,10∶1和50∶1)反应以确定两种试剂的最佳比例。通过分子量移动例如使用SDS-PAGE可监测蛋白PEG化。给出相当数量但PEG化产物而不给出二PEG化产物的最低量PEG是认为典型最好的。在有些情况下,某些添加剂可增加PEG化产量。这些添加剂包括但不限于,EDTA,硼酸盐、chaotropes(尿素、胍、有机溶剂)、洗涤剂、渗压稳定剂(多元醇、糖、聚合物、氨基酸及其衍生物)和其它离子化合物(柠檬酸盐、硫酸盐、磷酸盐、季胺盐、硝酸盐氯化盐、硫氰酸盐等)。EDTA的有效浓度是0.01-10mM,0.5-1mM是优选的浓度。通常,可用大小排阻、离子交换、亲和、逆向或疏水相互作用层析从未PEG化蛋白和未反应的PEG中纯化单PEG化蛋白。可用SDS-PAGE和/或Western印迹鉴定富含单PEG化蛋白的级分(与半胱氨酸突变蛋白连接的单一PEG分子)。这些级分可汇合并冰冻保存。PEG部分的存在通常改变了蛋白对树脂的亲和力,允许PEG化蛋白从非PEG化蛋白中分离。也可以使用其它纯化方案如2相有机提取法或盐沉淀法。在如这里所述的各种实施例和PCT/US98/14497和PCT/US00/00931中描述的细胞增殖/抑制试验中可检测纯化PEG化蛋白来确定其特异活性。如这里提供的实施例和PCT/US98/14497和PCT/US00/00931中描述可确定PEG化蛋白在体内的功效。可进行实验确定PEG分子在正确位点连接蛋白。这可以通过化学和蛋白水解消化蛋白,大小排阻,离子交换或逆向层析纯化PEG化肽(将具有大分子量),随后氨基酸测序来完成。PEG耦联氨基酸在氨基酸测序中将以空白出现。

下列条件用于PEG化GH突变蛋白T3C和纯化PEG化T3C蛋白。用如实施例2(使用半胱氨酸作为还原剂和半胱氨酸阻断剂以稳定重折叠蛋白)所述的等分重折叠T3C蛋白,TCEP[Tris(2-羧乙基)膦]-HCI作为还原剂和来自Shearwater Polymers(Huntsville,Alabama)的5kDa半胱氨酸反应性PEGs确定起始PEG化反应条件。在100mM Tris,pH8.5中,不同量过量5kDa马来酰亚胺-PEG或5kDa乙烯砜-PEG存在下,室温下,2μg等分纯化T3C与浓度不断增加的TCEP共同温育。120分钟后,立即用非还原型SDS-PAGE分析等分反应物。在pH8.5,5倍摩尔过量TCEP和15倍过量摩尔的5kDa马来酰亚胺或5kDa乙烯砜PEG可产生相当量的单PEG化T3C蛋白,两个小时后没有可检测到的二或三PEG化蛋白。为了PEG化,需要用还原剂如TCEP处理使T3C突变蛋白部分还原。在相同部分还原条件下,野生型GH不PEG化,表明PEG部分与引入突变蛋白中的半胱氨酸残基连接。这些条件用于按比例放大纯化和估计生物活性的PEG化反应。在室温进行2小时更大PEG化反应(300μg),使用5倍过量TCEP和15倍10kDa马来酰亚胺PEG。反应时间末,PEG化混合物用冰冷20mM Tris,15%甘油,pH8.0稀释2X并立即填入Q-Sepharose柱(1mL,HiTrap)。通过在20mL含梯度从0-0.2M NaCl的20mM Tris,15%甘油,pH8中进行,从柱中洗脱PEG化T3C。PEG部分的存在降低蛋白对树脂的亲和力,允许PEG蛋白化与非PEG化蛋白分离。用SDS-PAGE鉴定富含单PEG化T3C(连接T3C单体的单一PEG分子)的级分,汇合并冰冻。在大约80mM NaCl洗脱单PEG化T3C蛋白,用SDS-PAGE测定其表观分子量大约30kDa。

也用上述方法制备10K PEG-T3C,20K PEG-T3C和40K PEG-T3C。实施例1和2和PCT/US98/14497和PCT/US/00/00931所述的细胞增殖试验中测定纯化PEG-T3C蛋白生物活性以确定其特异活性。类似于野生型GH和非PEG化T3C蛋白,PEG-T3C蛋白刺激GH-R4细胞。5K PEG-T3C蛋白的EC50是1.2ng/ml,10K PEG T3C的EC50是1.2ng/ml,20K PEG T3C的EC50是3-4ng/ml。可使用实施例1和2和PCT/US98/14497和PCT/US/00/00931所述的细胞增殖试验确定40K PEG-T3C的EC50。可如PCT/US98/14497和PCT/US/00/00931和实施例4所述确定PEG-T3C和其它PEG化GH半胱氨酸突变蛋白的体内功效。

根据上面略述的的步骤PEG化和纯化的GH其它半胱氨酸突变蛋白包括P2C,P5C,S132C,P133C和R134C。使用实施例1和2和PCT/US98/14497和PCT/US/00/00931所述的细胞增殖试验确定用20kDaPEG部分修饰的这些突变蛋白的生物活性。观察到这些PEG化突变蛋白的EC50从1.7ng/ml至6.0ng/ml。这些值都相似于,但略高于并列进行的野生型GH对照试验观察到的EC50。这些野生型GH对照的EC50从0.6ng/ml至1.2ng/ml。

实施例4PEG-T3C生长激素刺激生长激素不足大鼠的体细胞生长

A.PEG-T3C刺激体细胞生长的能力在垂体切除(HYPOX)的大鼠中确定,由于其垂体被去除,它不能合成生长激素。HYPOX雄性Sprague-Dawley大鼠购自商业卖主,重量大约90g。大鼠适应环境13天。在适应环境期间增长4g的动物从研究中挑除。每天同一时间(9:30AM)测定体重。按体重将大鼠随机分为各个检测组。每组5只大鼠,除了每天接受20kDa-PEG-T3C的组仅有四只大鼠。每天称重大鼠,每天或每隔一天皮下注射安慰剂(含200μg/ml大鼠血清白蛋白(Sigma化学药品公司)的磷酸缓冲盐(PBS)),商业重组人生长激素,Nutropin_,或如实施例3中所述制备的各种剂量的20kDa-PEG-T3C。所有蛋白溶液在含200μg/ml大鼠血清白蛋白的PBS中制备。动物连续处理9天。在第10天,杀死动物并收集它们的胫骨。胫骨固定于10%中性缓冲福尔马林中。在5%甲酸中去除固定的胫骨中的石灰质,在额状面的近末端切开。用石蜡包埋加工胫骨并以8微米切片和甲苯胺蓝染色。在左侧胫骨上测定胫骨骨垢宽度(每个胫骨5个测定值)。不同检测组的累积获得体重和胫骨骨垢测定值在表2中显示。结果表明20kDa-PEG-T3C刺激生长激素不足大鼠的体重增加和骨生长。

表2每天或每隔一天给予安慰剂、Nutropin或20kDa-PEG-T3C对垂体切除大鼠的体重增加和胫骨骨垢宽度的作用

a使用双侧T检验p<0.05:每天安慰剂b使用双侧T检验p<0.05:每隔一天安慰剂c使用双侧T检验p<0.05:每隔一天NutropinB.如实施例4.A.所述进行第二个实验,除了检测化合物每天或每三天皮下注射给予。此外,检测一个剂量的用40kDa-PEG修饰的T3C。HYPOX雄性Sprague-Dawley大鼠购自商业卖主,体重大约100g。每天同一时间测定体重。按体重将大鼠随机分为各个检测组。每组5只大鼠,除了每天接受40kDa-PEG-T3C的组。每天称重大鼠,每天或每三天皮下注射安慰剂(含200μg/ml大鼠血清白蛋白(Sigma化学药品公司)的磷酸缓冲盐(PBS)),商业重组人生长激素,Nutropin_,各种剂量的20kDa-PEG-T3C或40kDa-PEG-T3C。如实施例3所述制备PEG-T3C蛋白。所有蛋白溶液在含200μg/ml大鼠血清白蛋白的PBS中制备。动物连续处理9天。在第10天,杀死动物并收集它们的胫骨并如实施例4.A.所述准备切片。不同检测组的累积获得体重和胫骨骨垢测定值在表3中显示。结果表明20kDa-PEG-T3C和40kDa-PEG-T3C刺激生长激素不足大鼠的体重增加和骨生长。

表3每天或每三天给予安慰剂、Nutropin、20kDa-PEG-T3C或40kDa-PEG-T3C对垂体切除大鼠的体重增加和胫骨骨垢宽度的作用

实施例5重折叠和纯化IFN-α2半胱氨酸突变蛋白PCT/US00/00931描述了表达、纯化和确定重组人α干扰素(IFN-α2)和IFN-α2半胱氨酸突变蛋白的体外和体内生物活性的方法。PCT/US98/14497和PCT/US00/00931中也描述了构建IFN-α2半胱氨酸突变蛋白的方法和IFN-α2蛋白内放添加的半胱氨酸残基的优选位点。使用那些方法已经在大肠杆菌中构建了下列突变蛋白:C1S,Q5C,43C44,N45C,Q46C,F47C,Q48C,A50C,D77C,C98S,Q101C,T106C,E107C,T108C,S163C,E165C,*166C,D2C,L3C,T6C,S8C,T52C,G102C,V103C,G104C,V105C,P109C,L110C,M111C,S160C,L161C,R162C和K164C。在大肠杆菌中表达IFN-α2的一个优选方法是用STII引导序列将蛋白分泌到周质中。分泌的IFN-α2片段可溶且可用柱层析纯化如PCT/US00/00931所述。使用STII引导序列,某些IFN-α2半胱氨酸突变蛋白当分泌到大肠杆菌周质时,保持不溶。SDS-PAGE分析突变蛋白的渗透压休克上清显示多数已经降到(与野生型相比)19kDa rIFN-α2带的水平。整个细胞溶解产物和渗透压休克的不溶物质的SDS-PAGE分析揭示这些突变蛋白以相对高水平表达,但主要以不溶形式蓄积,推测在周质中。在还原条件下,这些蛋白与野生型rIFN-α2标准共同迁移(comigrated),表明STII引导子已经去除。表4中总结了突变蛋白相对表达水平的定性价。重折叠不溶分泌的IFN-α2蛋白的步骤以前没有描述。实施下列方案(这里称作“方案I”)表达和重折叠IFN-α2半胱氨酸突变蛋白为生物活性形式。

对于IFN-α2半胱氨酸突变蛋白和IFN-α2的表达,325ml培养物置于2升振荡瓶中,或500ml培养物置于2升有挡板振荡瓶中,在旋转式摇床振荡仪水浴中以-170-220rpm在37℃生长。培养物生长、诱导、收获和接受渗透压休克如PCT/US00/00931所述。所得上清和沉淀立即处理或保存在-80℃。

使用重折叠步骤对在渗透压休克沉淀中以不溶蛋白回收的IFN-α2半胱氨酸突变蛋白进行变性、降低和重折叠为其正确构象。首先用制造商(Pierce)描述的B-PERTM细菌蛋白提取试剂处理来自渗透压休克裂解液的沉淀。B-PER是破裂大肠杆菌膜并释放细胞的细胞质内容的温和洗涤剂混合物。离心回收不溶物质,重悬于水中,再次离心。所得沉淀溶于5mL含6M胍,50mM半胱氨酸的20mM Tris碱中。允许混合物搅拌30分钟后在4℃用400mL的40mM磷酸钠,150mM NaCl,pH8.0透析过夜。第二天,将重折叠混合物的pH调到3.0,混合物离心后填入S-Sepharose柱,随后是Cu++IMAC柱,如PCT/US00/00931所述的用于从渗透压休克上清中纯化IFN-α2。用这些步骤重折叠和纯化了六个IFN-α2半胱氨酸突变蛋白:Q5C,C98S,Q101C,T106C,E107C和*166C。相似的步骤可用于重折叠和纯化不溶野生型IFN-α2。

纯化的Q5C,C98S,Q101C,T106C,E107C和*166C半胱氨酸突变蛋白的非还原型SDS-PAGE分析表明突变蛋白主要以单体回收,在期望的~19kDa分子量迁移。由于缺乏天然Cys1-Cys-98二硫键,C98S比其它rIFN-α2突变蛋白迁移的分子量稍高。有些纯化突变蛋白含有少量二硫键连接的rIFN-α2二聚体。二聚体种的分子量大约37-38kDa。

当加工大量IFN-α2半胱氨酸突变蛋白时,发现某些半胱氨酸突变蛋白在细胞裂解后看来存在于可溶和不溶部分中。可溶与不可溶IFN-α2蛋白的比率在不同突变体之间变化。因此,进行包含整个细胞溶解步骤的可供选择的溶解/重折叠步骤(这里称作“步骤II”)来增加IFN-α2半胱氨酸突变蛋白回收。发现培养方法的改进可提高加工STII引导序列的效率并利用之来表达重折叠和纯化的IFN-α2半胱氨酸突变蛋白,如下详述。在改进方法中,325-400ml培养物在含100mM MES,pH5.0和100μg/ml氨苄西林的LB培养基中生长,37℃有力振荡,如在New Brunswick C25KC环境振荡器中220-250rpm,至细胞密度在600nm下为0.5-0.7OD。然后,添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为0.5mM诱导培养物,诱导时温度降至28℃,振荡器速度降至140rpm。诱导的培养物培养过夜(14-18小时)并离心收集。细胞沉淀立即处理或保存在-20℃或-80℃直到处理前。325-400ml诱导培养物得到的细胞沉淀首先悬浮于10ml的8M胍,20mM半胱氨酸,20mM Mes,2%Tween 20,pH 3并混合直到出现均质悬液。然后pH增加到pH8-9之间,溶解混合物搅拌3小时。下一步,用冰冷复性缓冲液(20mM Tris,pH0.3M胍,1M尿素,40μm硫酸铜,pH8)稀释细胞裂解液。允许云絮状悬液在4℃放置1-2天。离心澄清重折叠,随后pH调整到3并进行第二轮离心。上清用冷水1∶4稀释并填入5mL S-Seph Hi Trap。用100mL 0-70%梯度的缓冲液B和20mM Mes,pH5的缓冲液A洗脱离子交换柱,缓冲液B是10%乙二醇500mM NaCI,20mM Mes pH5。可供选择地,可使用HIC柱,如苯基-Sepharose柱从重折叠混合物中捕获重折叠IFN-a半胱氨酸突变蛋白。重折叠混合物首先离心,硫酸铵加入上清中至终浓度10%,混合物再次离心,上清填入在10%硫酸铵、20mM Tris,pH8中平衡的10mL苯基-Sepharose柱中。用100mL从10%硫酸铵、20mM Tris pH8至30%乙二醇、20mM Tris,pH8的线性梯度从柱中洗脱IFN-a半胱氨酸突变蛋白。可进一步用铜螯合柱,S-Sepharose柱或二者皆有进一步纯化来自苯基-Sepharose柱的干扰素汇合物。

也可以用也起半胱氨酸阻断剂作用的其它还原剂溶解和重折叠干扰素半胱氨酸突变蛋白。还原型谷胱苷肽、巯基乙酸或半胱胺置换溶解/重折叠混合物中的半胱氨酸产生可在实施例7所述步骤后纯化和PEG化的重折叠、可溶IFN半胱氨酸变异体。当没有还原剂或20mM DTT置换溶解/重折叠混合物中的半胱氨酸时,重折叠可溶IFN半胱氨酸突变蛋白产物降低到用逆向HPLC分析重折叠混合物时不可检测的水平。另外,当没有还原剂或20mMDTT置换溶解/重折叠混合物中的半胱氨酸时,重折叠混合物S-Sepharose层析后没有回收到重折叠可溶IFN半胱氨酸突变蛋白。

用方案II使下列突变蛋白在大肠杆菌中表达、重折叠和纯化:C1S,Q5C,43C44,N45C,F47C,Q48C,A50C,C98S,Q101C,T106C,E107C,S163C,E165C,*166C,D2C,L3C,T6C,S8C,T52C,G102C,V103C,G104C,V105C,P109C,L110C,M111C,S160C,L161C,R162C和K164C。这些重折叠物在pH8或有些情况下在pH7.5下进行。

实施例6IFN-α2半胱氨酸突变蛋白的生物活性PCT/US00/00931描述的Daudi生长抑制试验测定用实施例5的方案I纯化的纯化Q5C,C98S,Q101C,T106C,E107C和*166C IFN-α2半胱氨酸突变蛋白的生物活性。用Bradford或BCA蛋白检测试剂盒(Bio-RadLaboratories and Pierce)确定蛋白浓度。在实验中,在同一天,如PCT/US00/00931描述制备的商业上的野生型rIFN-α2和rIFN-α2与作为一天内变异性的对照并列分析。突变蛋白抑制Daudi细胞的增殖程度与野生型rIFN-α2对照蛋白相同,在试验误差内。五个突变蛋白(Q5C,Q101C,T106C,E107C和*166C)的平均IC50s与野生型rIFN-α2蛋白的IC50s平均数相似,范围从15-18pg/ml。C98S蛋白的IC50是28pg/ml。表4总结了这些数据。

表4.

IFN-α2半胱氨酸突变蛋白的表达和体外生物活性

1IFN-α2蛋白在整个细胞提取物中的相对蓄积2IFN-α2蛋白在渗透压休克上清的部分,由SDS-PAGE凝胶确定3各个实验的IC50值。当N>5时,显示范围。

4商业上的野生型rIFN-α2(Endogen,Inc.)5Bolder BioTechnology,Inc.制备的野生型rIFN-α2

6C螺旋产生游离半胱氨酸(C98)突变7N末端区产生游离半胱氨酸(C1)突变如PCT/US00/00931描述的Daudi生长抑制试验测定用实施例5的方案II纯化的下列突变蛋白的生物活性:CIS,D2C,L3C,S8C,N45C,F47C,C98S,V103C,V105C,E107C,M111C,R162C,S163C,K164C,E165C和*166C。观察的IC50s在表5中列出,在相同的实验中使用野生型rIFN-α2蛋白对照。

表5.

由方案II带和不带PEG化而纯化的IFN-α2半胱氨酸突变蛋白的体外生物活性

1各个实验得到的IC50值。当N>5时,显示范围。

2商业上的野生型rIFN-α2(Endogen,Inc.)3Bolder BioTechnology,Inc.制备的野生型rIFN-α24突变在C螺旋产生游离半胱氨酸(C98)5突变在N末端区产生游离半胱氨酸(C1)实施例7IFN-α2半胱氨酸突变蛋白的PEG化用实施例3和PCT/US98/14497和PCT/US00/00931描述的步骤可PEG化纯化的IFN-α2半胱氨酸突变蛋白。用纯化的rIFN-α2半胱氨酸突变蛋白中的两个进行小规模PEG化实验以鉴定允许蛋白在游离半胱氨酸残基单PEG化的条件。非还原型SDS-PAGE监测过度还原的蛋白,寻找由于蛋白未重折叠而比期望表观分子量更高的迁移,或天然二硫化物还原产生多个PEG化种的出现。1μg等分纯化的野生型和rIFN-α2突变蛋白T106C和E107C与10倍摩尔过量TCEP和20倍摩尔过量5kDa马来酰亚胺PEG在pH8.5,室温下温育1小时。60分钟后,停止反应并立即用非还原型SDS-PAGE分析。基于反应混合物的SDS-PAGE分析,在这些条件下,两种突变蛋白均产生单PEG化蛋白。非还原型SDS-PAGE测定单PEG化蛋白的表观分子量大约28kDa。在这些条件下,野生型rIFN-α2显示没有可检测到的PEG化。对照实验表明T106C和E107C半胱氨酸突变蛋白需要被还原剂如TCEP部分还原进行PEG化。这些数据表明PEG分子与引入T106C和E107C蛋白中的半胱氨酸残基连接。

大量IFN-α2半胱氨酸突变蛋白可用各种大小的半胱氨酸反应性PEGs修饰并纯化得到进行生物活性测定的足够物质。对于PEG化蛋白的纯化,应该如上述在室温下进行1小时的较大PEG化反应,用20mM MES,pH5.0稀释10X,调节到pH3.0,然后快速填入S-Sepharose柱,使用与最初纯化rIFN-α2突变蛋白所述的那些条件相似的条件。PEG部分的存在降低了蛋白对树脂的亲和力,允许PEG化蛋白与未PEG化蛋白分离。S-Sepharose柱的层析图谱应该显示两个蛋白主峰。早期的洗脱主峰(在NaCl浓度低于230mM时洗脱)应该是单PEG化IFN-α2蛋白,非还原型SDS-PAGE分析可证实。SDS-PAGE测定已经用5kDa半胱氨酸反应性pEG修饰的单PEG化IFN-α2的表观分子量大约28kDa。随后的洗脱主峰(在大约230mM NaCl洗脱)应该是未反应的IFN-α2蛋白。主要含PEG-IFN-α2的早期洗脱峰的级分可以混合并用于生物活性测定。可如PCT/US00/00931所述Daudi细胞试验测定纯化的PEG-IFN-α2蛋白的生物活性。可用Bradford染料结合试验确定蛋白的浓度。可如PCT/US98/14497和PCT/US/US00/00931所述确定PEG化IFN-α2半胱氨酸突变蛋白的体内生物活性。

对于Q5C突变蛋白的PEG化,用100mM Tris,pH8将纯化蛋白稀释为100μg/ml的蛋白。加入15倍过量的5Kda马来酰亚胺PEG,随后加入10-15倍摩尔过量TCEP。一旦蛋白被部分还原,也加入EDTA(0.5mM终浓度)抑制二硫化物形成。混合物在室温下保持2小时。也得到好的PEG效率的可供选择的方法包括重复添加PEG和TCEP试剂。我们已经发现添加3轮10×摩尔过量PEG试剂和10×摩尔过量TCEP超过2小时得到大于80%PEG化效率。重复添加PEG和TCEP试剂的这个随后步骤用于成功制备10kDa,20kDa和40kDa-PEGs的修饰的Q5C。用离子交换层析,使用实施例5所述的S-Sepharose使PEG化蛋白和未反应Q5C起始材料和PEG化试剂分离。可以使用可供选择的方法如其它离子交换仪(Q,DEAE,CM),HIC树脂(苯基、丁基),亲和柱,大小排阻柱或螯合树脂纯化PEG化蛋白。

如PCT/US00/00931所述的Daudi细胞试验测定纯化的10kDa,20kDa和40kDa-PEG-Q5C蛋白的生物活性。用Bradford染料结合试验确定蛋白浓度。确定10kDa,20kDa和40kDa-PEG-Q5C蛋白的平均IC50s分别是70pg/ml(N=2试验),100pg/ml(N=8试验),和108pg/ml(N=8试验)。

实施例8野生型G-CSF和G-CSF(C17S)的克隆、表达和纯化A.克隆编码G-CSF的DNA序列.用PCR从人膀胱癌细胞系5637(美国典型培养物保藏中心)分离的总RNA扩增编码G-CSF的cDNA。所述细胞在补充了10%FBS,50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中生长。用购自Qiagen,Inc.(Santa Clarita,CA)的RNeasy Mini RNA分离试剂盒根据制造商的指导从细胞中分离RNA。用Boehringer MannheimCorp的RT-PCR的第一条链cDNA合成试剂盒(AMV)和随机六聚体用作引物,完成单链cDNA的第一条链合成。用正向引物BB91(5>CGCAAGCTTGCCACCATGGCTGGACC TGCCACCCAG>3;SEQ ID NO:1)和反向引物BB92(5>CGCGGATCCTCCGGAGGGCTGGGCAAGGT GGCGTAG>3;SEQ ID NO:2)进行用第一条链合成产物作为模板的后续PCR反应。引物BB91与G-CSF分泌信号编码序列的5’末端退火,和反向引物BB92与G-CSF编码序列3’末端退火。用Hind III和Bam HI消化所得~640bp PCR产物,凝胶纯化并克隆到已用Hind III和Bam HI消化的pCDNA3.1(+)载体,碱性磷酸酶处理,凝胶纯化。正确DNA序列的克隆(Souza等1986;Nagata等1986a,b)记做pCDNA3.1(+)::-CSFfus或pBBT165。

用PCR修饰这个G-CSF克隆用于野生型G-CSF(野生型)和丝氨酸取代17位天然产生游离半胱氨酸的变异体(C17S)在大肠杆菌中周质和细胞质中的表达。野生型G-CSF蛋白含有5个半胱氨酸,其中两个参与关键的二硫键,一个游离半胱氨酸(C17)被部分遮掩,不是活性所需(Ishikawa等1992,Kuga等1989,Lu等1992,Wingfield等1988)。为了避免未配对半胱氨酸引起的潜在困难,我们构建了含17位Cys置换为Ser(C17S)的变异体作为我们的平台分子(platform molecule)。制备存在C17S置换的所有后来的半胱氨酸突变蛋白。已经报道G-CSF(C17S)具有与野生型G-CSF等同的生物活性(Ishikawa等1992,Lu等1992)。

分泌的G-CSF不含有添加的N末端甲硫氨酸且具有与天然产生G-CSF等同的氨基酸序列(Souza等1986)。为了表达分泌形式的G-CSF,用PCR将大肠杆菌热稳定肠毒素(STII)基因的引导序列(Picken等1983)与成熟G-CSF的编码序列融合,TAA终止密码子加到羧基末端残基P174后。同时,也修饰G-CSF编码序列氨基末端。脯氨酸2,5和10位的密码子全部变为CCG,为了利于后续诱变步骤,将L18密码子由TTA变为CTC引入Xho I限制性位点。

野生型和C17S基因并列进行这些构建并利用三个后续PCR反应。对于C17S构建体,第一个反应使用正向引物BB116(5>GGCCCGGCCAGCTCCCTGCCGCAGAGCTTCCTGCTGAAGAGCCTCGAGCAAGTGCGTAAGATCCAG>3;SEQ ID NO:3)和反向引物BB114(5>CGCGAATTCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG>3;SEQ ID NO:4)和克隆G-CSF cDNA作为模板。BB116与成熟G-CSF编码序列5’末端退火并引入在P2,P5,P10上标记的密码子改变,不改变编码的氨基酸的L18。也引入C17S突变(TGC=>AGC)并将15位亮氨酸变为优选的CTG三联体。BB114与G-CSF编码序列3’末端(18bp)退火并就在羧基末端残基P174后引入TAA翻译终止密码子。BB114也含有为克隆目的的Eco RI位点。对于野生型构建体,第一个反应使用正向引物BB117(5>GGCCCGGCCAGCTCCCTGCCGCAGAGCTTCCTGCTTAAGTGCCTCGAGCAAGTGCGTAAGATCCAG>3;SEQ ID NO:5)和反向引物BB114(上述序列),克隆G-CSF cDNA作为模板。BB117除了两个例外,与BB116等同;存在天然产生的C17密码子,TGC和使用L15密码子是CTT。为了提供区别野生型C17克隆和C17S变异体的快速和方便方法,这个CTT产生AflII限制性位点。C17S克隆在15位携带CTG密码子,因此缺乏AflII限制性位点。凝胶纯化每个反应得到的~530bp PCR产物并用作第二个PCR反应的模板。

对于第二个反应,使用正向引物BB115(5>ATGTTCGTTTTCTCTATCGCTACCAACGCGTACGCAACCCCGCTGGGCCCGGCCAGCTCCCTG>3;SEQ ID NO:6)和反向引物BB114(上述)扩增每个~530bp凝胶纯化产物。BB115的3’部分(27个核苷酸)与在野生型和C17S PCR产物等同的修饰的成熟G-CSF编码序列的5’末端退火。BB115的5’片段(36个核苷酸)编码STII引导肽的一部分。凝胶纯化每个这些第二级反应的~550bp PCR产物并用作第三个和最后一轮PCR的模板。

在第三个反应中,用正向引物BB11(5>CCCCCTCTAGACATATGAAGAAGAACATCGCATTCCTGCTGGCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCG>3;SEQ ID NO:7)和反向引物BB114(上述)扩增每个~550bp凝胶纯化产物。BB11添加STII引导肽的剩余物并含有用于克隆目的覆盖STII引导肽起始ATG的Nde I位点以及Xba I位点。用Eco RI和Xba I消化这些反应的~620bp产物并克隆到类似消化的质粒载体pBC-SK(+)(Stratagene)中进行测序。

对于野生型构建体,发现一个克隆,消化的pBBT187,含有620bp的含STII-G-CSF编码序列的NdeI-EcoRI片段的正确序列。然后,这个片段亚克隆到(Nde I+Eco RI)切割表达载体pCYB 1(New England BioLabs)。所得质粒术语称作pBBT188。对于C17S构建体,发现测序的三个克隆无一含有正确序列;全部都有一个或多个错误。一个克隆在STII引导肽A10位含单一错义突变;620bpNdeI-EcoRi片段的剩余序列是正确的。这个克隆和质粒pBBT188之间的体外重组用于产生pCYB1中序列正确STII-G-CSF(C17S)构建体。在STII引导肽A10位含单一错义突变的pBBT188和C17S都用BsiWI和Eco RI消化。两个质粒任何一个存在的唯一Eco RI位点位于G-CSF翻译终止密码子。Bsi WI也仅在STII引导肽编码序列内的位点中切割一次,从成熟G-CSF编码序列开始的7bp。因此,用具有正确C17S构建序列的~535bp Bsi WI-Eco RI片段取代pBBT188的~535bp Bsi WI-Eco RI片段,我们得到了表达STII-G-CSF(C17S)编码序列的pCYB1衍生物。这个质粒记做pBBT223。

对于在大肠杆菌细胞质中的表达,用PCR修饰克隆的STII-G-CSF野生型和STII-G-CSF(C17S)基因以消除STII引导序列并就在成熟G-CSF氨基末端氨基酸(T1)密码子之前添加起始甲硫氨酸密码子(ATG)。用引物BB166(5>CGCCATATGACCCCGCTGGGCCCGGCCAG>3;SEQ ID NO:8)和BB114(上述)扩增序列证实的STII-G-CSF野生型和STII-G-CSF(C17S)克隆。BB166与成熟G-CSF的编码序列5’末端退火且编码成熟G-CSF第一个氨基酸前的起始甲硫氨酸。为了克隆目的,包含一个覆盖ATG的Nde I位点。用Nde I加在Nde I位点上游~400bp切割的Aat II消化这些PCR反应的~540bp产物。凝胶纯化这些~400bp片段并克隆进入已经用Nde I加Aat II切割的上述pBC-SK(+)::STII-G-CSF,pBBT187,用碱性磷酸酶处理并凝胶纯化。一个Met-G-CSF野生型和一个Met-G-CSF(C17S)克隆进行测序,发现都含有正确序列。这些Met-G-CSF野生型和Met-G-CSF(C17S)基因以NdeI-Eco RI片段亚克隆进入上述的Nde I-Eco RI切割表达载体pCYB1。所得质粒消化:pBBT225=pCYB1::Met-G-CSF和pBBT226=pCYB1::Met-G-CSF(C17S)。

B.野生型G-CSF和G-CSF(C17S)在大肠杆菌中的表达.编码Met-G-CSF野生型的pBBT225,编码Met-G-CSF(C17S)的pBBT226和pCYB1亲本载体转化大肠杆菌JM109。这些株的实验引起G-CSF蛋白表达。优选分泌的G-CSF,野生型和C17S形式的,因为它们在细胞质中表达的Met-G-CSF蛋白的N末端缺乏非天然甲硫氨酸残基。

对于分泌的G-CSF表达,pBBT188[pCYB1::STII-G-CSF],pBBT223[pCYB1::STII-G-CSF(C17S)]和亲本载体pCYB1转化大肠杆菌W3110。所得株记做BOB130:W3110(pCYB1),BOB213:W3110(pBBT188)和BOB268:W3110(pBBT223)。在初步筛选实验中,菌株在滚动管(roll tube)中,含100μg/ml氨苄西林的Luria肉汤培养基(LB培养基)中37℃过夜生长。饱和的过夜培养物在含100μg/ml氨苄西林的LB培养基稀释到在A600为0.025O.D.,并在振荡瓶中28,37或42℃培养。典型地,25ml培养物在250ml振荡瓶中生长。当培养物的O.D.达到~0.3-0.5时,加入IPTG使终浓度为0.5mM,以诱导G-CSF表达。对于最初实验,0,1,3,5和~16h诱导后,抽样检查培养物。用预制的14%Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯兰染色分析诱导和未诱导培养物的样品。BOB213(野生型)和BOB268(C17S)的诱导培养物在大约19kDa出现条带,与成熟G-CSF分子量一致。在BOB213和BOB268的未诱导培养物或仅是对照载体的BOB130的诱导或未诱导培养物中没有检测到这条带。Western印迹分析表明在BOB213和BOB268溶菌产物中的这个~19kDa条带与抗人G-CSF抗血清(R&D Systems)强烈反应。这个抗体不识别BOB213和BOB268未诱导培养物或仅是对照载体的BOB130的诱导或未诱导培养物中的蛋白。这些Western印迹也显示这个~19kDa条带与购自R&D Systems的商业上的人G-CSF标准共同迁移。这个结果提示STII引导肽已经被去除,与已经分泌到周质中的蛋白一致。实施例10提出的N末端测序研究表明STII信号序列被正确加工。

来自28℃和37℃诱导后16小时的培养物也接受基于Koshland和Botstein(1980)步骤的渗透压休克。这个步骤破裂大肠杆菌外膜并将周质内容释放到周围培养基中。随后离心将可溶周质成分(上清中回收)与细胞质的不溶周质和细胞相关成分(沉淀中回收)分离。在两种温度下,对两个野生型,合成的一些G-CSF蛋白,BOB213合成的和BOB268合成的C17S在上清中回收,但大量G-CSF蛋白保持与沉淀相连。这表明尽管蛋白看来被加工和分泌到周质,它以不溶形式蓄积在那里。

G-CSF野生型和C17S变异体表达条件的最初筛选表明两种蛋白在各种条件下相对较好地表达。对于大规模表达和纯化培养物在28℃生长并诱导~16小时。

C.野生型G-CSF和G-CSF(C17S)的纯化.用相同方案大规模表达和纯化野生型和G-CSF(C17S)。新鲜饱和BOB213(野生型)和BOB268(C17S)培养物在含100μg/ml氨苄西林的LB中在~0.05OD@A600接种。典型地,400ml培养物培养在2L有挡板振荡瓶中,在旋转式摇床振荡仪水浴中以250rpm 28℃培养。当培养物达到~0.5-0.7OD的密度,加入IPTG至终浓度0.5mM。然后,诱导培养物过夜培养~16小时。离心沉淀细胞并在-80℃冰冻。消融细胞沉淀并根据制造商(Pierce)方案用5mL B PERTM细菌蛋白提取试剂处理。离心回收含大量G-CSF蛋白的不溶物质并重悬于B-PER。这个混合物用溶菌酶(200μg/ml)处理10分钟以进一步破坏细胞壁,加入MgCl2(终浓度10mM)和无蛋白酶DNAse(2μg/ml)。离心收集不溶G-CSF,并重悬于水中洗涤和再次离心,以去除大部分溶解的细胞杂质。所得含不溶G-CSF的沉淀溶于含20ml 8M尿素、25mM半胱氨酸的20mM Tris碱(Tris Base)中。这个混合物在室温搅拌30分钟,然后稀释到100ml 40mM磷酸钠,40μM硫酸铜,15%甘油,pH8.0。这个重折叠混合物4℃保存2天。然后用稀释HCl将重折叠混合物的pH调节到4.0,混合物离心后填入在40mM磷酸钠pH4.0(缓冲液A)中平衡的5ml S-Sepharose柱(Pharmacia HiTrap)中。用从0-100%缓冲液B(500mM NaCl,40mM磷酸钠,pH4.0)的线性盐梯度洗脱结合蛋白。从S-Sepharose柱洗脱的野生型G-CSF和G-CSF(C17S)在大约300-325mM NaCl的盐浓度下洗脱到单一主峰。非还原型SDS-PAGE分析柱级分。含G-CSF的级分和无可见的杂质混合。Bradford分析确定,在400ml培养物中G-CSF野生型和G-CSF(C17S)的最终产物分别是大约1.1mg和3.3mg。纯化野生型G-CSF和G-CSF(C17S)在还原型和非还原型SDS-PAGE条件下共同迁移。还原型和非还原型G-CSF和G-CSF(C17S)的表观分子量分别是大约19和17kDa。

D.野生型G-CSF和G-CSF(C17S)的体外生物活性。使用鼠NFS60细胞系的细胞增殖试验测定野生型G-CSF和G-CSF(C17S)的生物活性。NFS60细胞系得自田纳西州孟菲斯的田纳西州医科大学的J.Ihle博士。这个细胞系对人或小鼠G-CSF或IL-3产生增殖应答(Weinstein等1986)。细胞保存在补充10%FBS,50单位/ml青霉素,50μg/ml链霉素和17-170单位/ml小鼠IL-3(R&D Systems)的RPMI 1640培养基中。在不含IL-3的细胞维持培养基中进行生物试验。通常,生物试验的建立是通过用RPMI培养基(无添加剂)洗涤NFS60细胞三次并将细胞以0.5-1×105个/ml的浓度重悬于不含IL-3的细胞维持培养基中。50μl(2.5-5×103个细胞)细胞悬液均分到平底96孔组织培养板的每个检测孔中。在不合IL-3的细胞维持培养基中制备待检测蛋白样品的系列稀释物。并列分析重组人G-CSF(大肠杆菌表达的;R&D Systems)的系列稀释物。50μl稀释蛋白样品加入到检测孔中,板在37℃潮湿的5%CO2组织培养温箱中温育。在一式三份的三个孔中检测蛋白样品。大约48-72小时后,每孔中加入20μl Cell Titer 96 AQueous One溶液(Promega公司),板在组织培养温箱中37℃温育1-4小时。用微板阅读器在490nm读出孔的吸光度。对照孔含培养基但不含细胞。从检测孔得到的平均值减去三个对照孔的平均吸光度值。计算每个样品的半数最大刺激浓度EC50s。

NFS60细胞系对G-CSF显示强烈增殖反应,如细胞数量和吸光度值剂量依赖性增加所证明。在生物试验中,商业上的G-CSF和我们制备的G-CSF的平均EC50s分别是19和10pg/ml(表6)。意外的是,在生物试验中,G-CSF(C17S)的平均EC50是7pg/ml且可再生到比我们野生型G-CSF标准强1.5至2.0倍和比商业上野生型G-CSF标准强~3倍(表3)。G-CSF(C17S)的超级活性是惊人的,因为其他人报道了野生型G-CSF和G-CSF(C17S)具有等同活性(Lu等1992)。

实施例9G-CSF(C17S)半胱氨酸突变蛋白的构建、表达、纯化和生物活性A.G-CSF半胱氨酸突变蛋白的构建.

用类似于PCT/US00/00931和Innis等(1990)和White(1993)所述的基于PCR的定点诱变构建十五个突变G-CSF基因。我们构建立在螺旋A最近的氨基末端区的五个突变蛋白[*-1C(将半胱氨酸残基添加到天然氨基末端),TIC,L3C,A6C和S7C];B-C环的两个突变蛋白[E93C和S96C];C-D环的六个突变蛋白[A129C,T133C,A136,A139C,A141C和S142C];和螺旋D远端的羧基末端区的两个突变蛋白[Q173C和*175C(将半胱氨酸残基添加到天然羧基末端)]。为了避免正常存在于野生型G-CSF17位的未配对半胱氨酸引起的潜在困难和/或不确定,均在C17S背景下构建G-CSF半胱氨酸突变蛋白。以前已经报道G-CSF(C17S)具有完全生物活性(Ishikawa等1992;Lu等1992),和在我们的大肠杆菌分泌系统中,我们发现纯化C17S产量高于纯化野生型G-CSF。此外,在体外试验中,我们的重组C17S比我们制备的野生型G-CSF和得自商业卖主(R&D Systems,Inc.)的第二个大肠杆菌产生的重组野生型G-CSF更有活力。

用于诱变PCR反应的模板是pBBT223的STII-G-CSF(C17S)基因(实施例8中描述)以Nde I-Eco RI片段克隆到Nde I-Eco RI切割的pUC18的质粒pBBT227。用适当的限制性内切酶消化PCR产物,凝胶纯化并与已经用那些相同的限制性酶切割的pBBT227载体DNA连接,碱性磷酸酶处理并凝胶纯化。这些连接物的转化体生长并分离质粒DNAs和测序。确定完整克隆诱变PCR片段的序列以证实存在感兴趣的突变,和不存在PCR反应或合成寡核苷酸引物潜在可能引入的任何另外突变。

半胱氨酸置换突变L3C构建如下。设计诱变正向寡核苷酸BB172(5>ACCAACGCGTACGCAACCCCGTGTGGCCCGGCCAGC>3;SEQ ID NO:9)以将成熟G-CSF3位的亮氨酸密码子CTG改变为编码半胱氨酸的TGT并跨越Mlu I位点附近。这个寡核苷酸用于PCR,使用与pBBT227中编码成熟G-CSF氨基酸残基21-27的DNA序列退火的反向非诱变的引物BB188(5>GCCATCGCCCTGGATCTTACG>3;SEQ ID NO:10)。在含1.5mM mM MgCl2,每种引物0.4μM,每种dATP,dGTP,dTTP和dCTP 200μM,3ng模板质粒pBBT227(上述),2.5单位Taq聚合酶(Promega),和0.5单位Pfu聚合酶(Stratagene)的1×Promega PCR缓冲液中进行100μl PCR发应。反应在Perkin-Elmer GeneAmp_PCR System 2400热力循环仪中进行。反应程序需要:96℃3分钟,25个循环的『 95℃ 60秒,60℃ 30秒,72℃ 45秒』和4℃保持。琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应的10μl等分,发现产生期望大小~100bp的单一片段。用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)根据卖主方案“清除”反应剩余物,并根据卖主方案用Mlu I和Xho I(New EnglandBioLabs)消化。用QIAquick PCR纯化试剂盒另外的清除步骤后,消化产物与已用Mlu I和Xho I消化的pBBT227连接,牛小肠碱性磷酸酶(New EnglandBioLabs)处理并凝胶纯化。连接反应用于转化大肠杆菌并对所得转化体的质粒进行测序。鉴定了具有L3C突变和全部~70bp Mlu I-Xho I片段的正确序列的克隆。

使用有下列不同的用于L3C的上述详细方案构建置换突变T1C并证实序列。将T1的ACC密码子改变为半胱氨酸的密码子TGC并跨越附近的Mlu I位点诱变寡核苷酸BB171(5>ACCAACGCG TACGCATGCCCGCTGGGCCCGGCCAGC>3;SEQ ID NO:11)用于PCR反应取代BB172。

使用有下列不同的用于L3C的上述详细方案构建置换突变Q173C并证实序列。将Q173的密码子CAG改变为半胱氨酸的密码子TGT并跨越Eco RI位点附近的诱变反向寡核苷酸BB185(5>CGCGAATTCTTAGGGACAGGCAAGGTGGCG>3;SEQ ID NO:12)用于PCR反应取代BB172。使用与pBBT227中编码成熟G-CSF的氨基酸残基78-84的DNA序列退火的非诱变引物BB187(5>GCCATCGCCCTGGATCTTACG>3;SEQ ID NO:13)取代BB188。琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应的10μl等分,发现产生期望大小~300bp的单一片段。用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)根据卖主方案“清除”反应剩余物,并根据卖主方案用Sty I和Eco RI(New EnglandBioLabs)消化。用QIAquick PCR纯化试剂盒另外的清除步骤后,消化产物在1.5%琼脂糖凝胶中泳动并用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen)根据卖主方案凝胶纯化感兴趣的~220bp Sty I和Eco RI片段。凝胶纯化片段与已用Sty I和Eco RI消化的pBBT227连接,牛小肠碱性磷酸酶(New EnglandBioLabs)处理并凝胶纯化。连接反应用于转化大肠杆菌并对所得转化体的质粒进行测序。鉴定了具有Q173C突变和全部~220bp Sty I-Eco RI片段的正确序列的克隆。

构建在G-CSF编码序列羧基末端氨基酸序列后添加半胱氨酸的突变。使用具有下列不同的上述构建Q173C突变体的方案构建这个突变体,术语称作*175C。在P174的CCC密码子和终止密码子TAA之间插入半胱氨酸密码子TGT并跨越附近的Eco RI位点诱变寡核苷酸BB186(5>CGCGAATTCTTAACAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAG>3;SEQ ID NO:14)用于PCR反应取代BB185。

使用如Horton等(1993)和PCT/US00/00931所述的“重叠延伸(overlap extension)诱变”技术构建A6C置换突变。在含1.5mM MgCl2,每种引物0.4μM,dATP,dGTP,dTTP和dCTP每种200μM,1ng模板质粒pBBT227,1.5单位Taq聚合酶(Promega),和0.25单位Pfu聚合酶(Stratagene)的1×Promega PCR缓冲液的50μl反应体积中进行构建A6C的原始或“最初”PCR反应。在Perkin-Elmer GeneAmp_PCR System 2400热力循环仪中进行反应。反应程序需要:96℃3分钟,25个循环的[95℃60秒,60℃30秒,72℃45秒]和4℃保持。使用的引物对是[BB173xBB188]和[BB174xBB125]。BB188(5>GCCATCGCCCTGGATCTT ACG>3;SEQ ID N0:10)与pBBT227中编码成熟G-CSF的氨基酸残基21-27的DNA序列退火。BB125(5>CTATGCGGCATCAGAGCAGATA>3;SEQ ID NO:17)与pUC18载体序列克隆的G-CSF序列上游~20bp退火。BB173和BB174是A6的GCC密码子变为半胱氨酸TGC密码子的互补突变寡核苷酸。BB173的序列是(5>CCGCTGGGCCCGTGCAGCTCCCTGCCG>3;SEQ ID NO:15)  和BB174的序列是(5>CGGCAGGGAGCTGCACGGGCCCAGCGG>3;SEQ ID NO:16)。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中泳动,表明[BB173xBB188]和[BB174xBB125]PCR反应给出期望大小的产物:对于[BB173xBB188],~80bp和对于[BB174xBB125],~140bp。从凝胶中切下这些片段,汇合并用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen),根据卖主方案一起从琼脂糖凝胶片中洗脱并回收于30μl10mM TrisHCl(pH8.5)。然后,这两个突变片段随后或 “第二次”PCR反应中“接合(splice)”在一起。在这个反应中,3μl最初反应的凝胶纯化PCR产物用作模板,BB125和BB188用作引物。反应体积是100μl,使用2.5单位Taq聚合酶和0.5单位Pfu聚合酶。否则,反应条件与在最初反应中使用的那些等同。琼脂糖凝胶电泳分析等分第二次PCR且观察到期望的~190bp片段。使用QIA快速PCR纯化(Qiagen)“清除”大量二级PCR反应,根据卖主方案用Nde I和Xho I(New England BioLabs)消化。使用QIA快速PCR纯化试剂盒另外清除后,消化产物与已经用Nde I和Xho I切割的pBBT227连接,牛小肠碱性磷酸酶(New England BioLabs)处理并凝胶纯化。连接反应用于转化大肠杆菌并对所得转化体的质粒测序以鉴定含A6C突变和全部~130bp Nde I-Xho I片段的正确序列的克隆。

使用具有下列不同的用于A6C的上面详述方案构建S7C置换突变并证实序列:互补诱变引物BB175(5>CTGGGCCCGGCCTGCTCCCTGCCGCAG>3;SEQID NO:18)和BB176(5>CTGCGGCAGGGAGCAGGCCGGGCCCAG>3;SEQ ID NO:19),其中S7的AGC密码子变为半胱氨酸TGC密码子,分别取代最初PCR反应中的BB173和BB174。

构建成熟G-CSF的氨基末端残基密码子前添加半胱氨酸密码子的突变T1并证实序列。使用具有下列不同的上述用于构建A6C的方案构建这个突变,术语称作*-1C。互补诱变引物BB206(5>AACCCGTACGCATGTACCCCGCTGGGC>3;SEQ ID NO:20)和BB207(5>GCC CAGCGGGGTACATGCGTACGCGTT>3;SEQ ID NO:21),在pBBT227中的STII引导序列羧基末端残基的GCA密码子和成熟G-CSF氨基末端残基的ACC密码子之间插入半胱氨酸的TGC密码子,分别取代最初PCR反应中BB173和BB174。最初PCR反应以20il反应体积进行。每种引物以0.5μM存持。反应包括0.5ng模板质粒pBBT227,2单位Taq聚合酶和0.25单位Pfu聚合酶。反应程序需要:95℃3分钟,25个循环的[94℃60秒,60℃30秒,72℃45秒]和4℃保持。最初反应产物直接加样到制备型2%琼脂糖凝胶。最初反应得到期望大小的产物:对于[BB206xBB188],~100bp和对于[BB207xBB125],~125bp。第二次PCR反应中,反应体积是100μl,5μl最初反应的凝胶纯化PCR产物用作模板,BB187和BB126用作引物,和利用4单位Taq聚合酶和0.25单位Pfu聚合酶。否则,反应条件与最初反应使用的那些相同。

使用具有下列不同的上面详述用于A6C的方案构建置换突变A129C并证实序列。最初PCR反应利用引物对[BB177xBB126]和[BB178xBB187]。反向非诱变引物BB126(5>TGTGGAATTGTGAGCGGATAAC>3;SEQ ID NO:22)与pUC18载体序列克隆G-CSF序列下游~40bp退火。正向非诱变引物BB187(5>GCCATCGCCCTGGATCTTACG>3;SEQ ID NO:13)与pBBT227中的编码成熟G-CSF的氨基酸残基78-84的DNA序列退火。BB177和BB178是将A129C的GCC密码子变为半胱氨酸的TGC密码子的互补诱变寡核苷酸。BB177是(5>GGAATGGCCCCTTGCCTGCAGCCCACC>3;SEQ ID NO:23)和BB178的序列是(5>GGTGGGCTGCAGGCAAGGGGCCATTCC>3;SEQ ID NO:24)。最初反应产物得到期望大小的产物:对于[BB177xBB126],~220bp,和对于[BB178xBB187],~170bp。第二次PCR利用BB187和BB126作为引物并产生期望大小的产物:~360bp。根据卖主方案,用Sty I和Eco RI(New EnglandBioLabs)消化这个产物。另外用QIAquick PCR纯化试剂盒清除后,消化产物与已经被Sty I和Eco RI消化的pBBT227连接,用牛小肠碱性磷酸酶(NewEngland BioLabs)处理并凝胶纯化。连接反应用于转化大肠杆菌,并且对得自转化体的质粒进行测序证实含有A129C突变并具有~230bp Sty I-EcoRI部分的正确序列的克隆使用具有下列不同的上面详述用于A129C的方案构建置换突变T133C并证实序列。互补诱变引物BB179(5>GCCCTGCAGCCCTGCCAGGGTGCCATG>3;SEQ ID NO:25)和BB180(5>CATGGCACCCTGGCAGGGCTGCAG GGC>3;SEQID NO:26),它将T133的ACC密码子变为半胱氨酸的TGC密码子,分别取代最初PCR反应中的BB173和BB174。最初反应的产物得到期望大小的片段:对于[BB179xBB126],~205bp和对于[BB180xBB187],~180bp。

使用具有下列不同的上面详述用于A129C的方案构建置换突变A139C并证实序列。互补诱变引物BB181(5>GGTGCCATGCCGTGCTTCGCCTCTGCT>3;SEQ ID NO:27)和BB182(5>AGCAGAGGCGAAGCACGGCATGGCACC>3;SEQ IDNO:28),它将A139的GCC密码子变为半胱氨酸的TGC密码子,分别取代最初PCR反应中的BB173和BB174。最初反应的产物得到期望大小的片段:对于[BB181xBB126],~185bp和对于[BB182xBB187],~200bp。

使用具有下列不同的上面详述用于A129C的方案构建置换突变S142C并证实序列。互补诱变引物BB183(5>CCGGCCTTCGCCTGTGCTTTCCAGCGC>3;SEQ ID NO:29)和BB184(5>GCGCTGGAAAGCACAGGCGAAGGCCGG>3;SEQID NO:30),它将S142的TCT密码子变为半胱氨酸的TGT密码子,分别取代最初PCR反应中的BB173和BB174。最初反应的产物得到期望大小的片段:对于[BB183xBB126],~180bp和对于[BB184xBB187],~210bp。

使用具有下列不同的上面详述用于A129C的方案构建置换突变A136C并证实序列。互补诱变引物BB224(5>CCCACCCAGGGTTGCATGCCGGCCTTC>3;SEQ ID NO:31)和BB225(5>GAAGGCCGGCATGCAACCCTGGGTGGG>3;SEQID NO:32),它将A136的GCC密码子变为半胱氨酸的TGC密码子,分别取代最初PCR反应中BB173和BB174。最初PCR反应以20μl反应体积进行。每种引物以0.5iM存在。反应包括0.5ng模板质粒pBBT227,2单位Taq聚合酶和0.25单位Pfu聚合酶。反应在Perkin-Elmer GeneAmp_PCR System2400热力循环仪中进行。反应程序需要:95℃3分钟,25个循环的[94℃60秒,60℃30秒,72℃45秒]和4℃保持。最初反应产物直接加样到制备型2%琼脂糖凝胶中。最初反应得到期望大小的产物:对于[BB224xBB126],~195bp和对于[BB225xBB187],~190bp。第二次PCR反应中,反应体积是100μl,5μl最初反应的凝胶纯化PCR产物用作模板,BB187和BB126用作引物,和利用4单位Taq聚合酶和0.25单位Pfu聚合酶。否则,反应条件与最初反应使用的那些等同。

使用具有下列不同的上面详述用于A136C的方案构建置换突变A141C并证实序列。互补诱变引物BB226(5>ATGCCGGCCTTCTGCTCTGCTTTCCAG>3;SEQ ID NO:33)和BB227(5>CTGGAAAGCAGAGCAGAAGGCCGGCAT>3;SEQID NO:34),它将A141的GCC密码子变为半胱氨酸的TGC密码子,分别取代最初PCR反应中的BB224和BB225。最初反应的产物得到期望大小的片段:对于[BB226xBB126],~180bp和对于[BB227xBB187],~205bp。

使用“重叠延伸诱变”技术构建E93C置换突变。在含1.5mM MgCl2,每种引物0.4μM,dATP,dGTP,dTTP和dCTP每种200μM,0.5ng模板质粒pBBT227,2单位Taq聚合酶 (Promega),和0.25单位Pfu聚合酶(Stratagene)的1×Promega PCR缓冲液的20μl反应体积中进行构建E93C的最初PCR反应。在Perkin-Elmer GeneAmp_PCR System 2400热力循环仪中进行反应。反应程序需要:95℃3分钟,25个循环的[94℃60秒,60℃30秒,72℃45秒]和4℃保持。使用的引物对是[BB218xBB211]和[BB219xBB210]。反向非诱变引物BB211(5>GGCCATTCCCAGTTCTTCCAT>3;SEQ IDNO:35)与pBBT227中编码成熟G-CSF的氨基酸残基121-127的DNA序列退火。正向非诱变引物BB210(5>TTC GTTTTCTCTATCGCTACCAAC>3;SEQ IDNO:36)  与pBBT227中编码STII引导肽的氨基酸残基13-20的DNA序列退火。BB218和BB219是将E93的GAA密码子变为半胱氨酸TGT密码子的互补突变寡核苷酸。BB218的序列是(5>CTGCAGGCCCTGTGTGGGATCTCCCCC>3;SEQ ID NO:37)和BB219的序列是(5>GGGGGAGATCCCACACAGGGCCTGCAG>3;SEQ ID NO:38)。最初反应产物直接加样到制备型2%琼脂糖凝胶中,显示PCR反应得到期望大小的产物:对于[BB218xBB211],~115bp和对于[BB219xBB210],~325bp。从凝胶中切下这些片段,混合并用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen),根据卖主方案一起从琼脂糖凝胶片中洗脱并回收于30μl 10mM Tris HCl(pH8.5)。在第二次PCR反应中,5μl最初反应的凝胶纯化PCR产物混合物用作模板,BB211和BB210用作引物。反应体积是100μl,使用4单位Taq聚合酶和0.25单位Pfu聚合酶。否则,反应条件与在最初反应中使用的那些等同。琼脂糖凝胶电泳分析等份的第二次PCR且观察到期望的~415bp条带。使用QIA快速PCR纯化(Qiagen)“清除”大量第二次PCR反应,根据卖主方案用Sty I和Xho I(New England BioLabs)消化。使用QIA快速PCR纯化试剂盒另外清除后,消化产物与已经用Sty I和Xho I切割的pBBT227连接,牛小肠碱性磷酸酶(New England BioLabs)处理并凝胶纯化。连接反应用于转化大肠杆菌并对所得转化体的质粒测序以鉴定含A6C突变和全部~260bp Sty I-Xho I片段的正确序列的克隆。

使用具有下列不同的上面详述用于E93C的方案构建置换突变S96C并证实序列。互补诱变引物BB220(5>CTG GAAGGG ATC TGC CCC GAG TTG GGT>3;SEQ ID NO:39)和BB221(5>ACC CAA CTC GGG GCAGAT CCC TTC GAG>3;SEQ ID NO:40),它将S96的TCC密码子变为半胱氨酸的TGC密码子,分别取代最初PCR反应中的BB218和BB219。最初反应的产物得到期望大小的片段:对于[BB220xBB211],~110bp和对于[BB221xBB210],~330bp。

对于大肠杆菌中蛋白分泌到周质间隙的表达,从基于pUC18的pBBT227衍生物中切除作为~600bp的Nde I-Eco RI片段的编码突变蛋白的STII-G-CSF(C17S)基因,亚克隆进入pCYB1表达载体并转化大肠杆菌W3110。

使用与这里描述的那些类似的步骤,人们可构建其它G-CSF和G-CSF(C17S)半胱氨酸突变蛋白。半胱氨酸突变蛋白可以是半胱氨酸置换G-CSF编码序列中天然氨基酸残基的置换突变,在G-CSF编码序列的两个天然发生的氨基酸之间插入半胱氨酸残基的插入突变,或在G-CSF编码序列的第一个氨基酸前添加半胱氨酸残基的添加突变T1,或在G-CSF编码序列的末端氨基酸残基后添加半胱氨酸残基的添加突变P174。半胱氨酸残基可以置换G-CSF编码序列任何位置中的任何氨基酸,或插入在任何两个氨基酸之间。在G-CSF中置换或插入半胱氨酸残基的优选位点是螺旋A、A-B环、B-C环、C-D环前区域和螺旋D远端区。其它优选位点是A,B,C和D螺旋的最先和最后三个氨基酸。除了上述突变,在这些区域其它优选残基产生半胱氨酸置换的是P2,G4,P5,S8,L9,P10,Q11,S12,T38,K40,S53,G55,I56,W58,A59,P60,L61,S62,S63,P65,S66,Q67,A68,Q70,A72,Q90,A91,L92,G94,I95,S96,E98,G100,G125,M126,A127,Q131,Q134,G135,S142,A143,Q145和P174。这个实施例中描述的所有变异体在天然蛋白或天然产生“游离”半胱氨酸残基(半胱氨酸-17)已经变为另一个氨基酸优选丝氨酸或丙氨酸的突变蛋白序列内容中提供。

人们也可以通过另一个氨基酸置换G-CSF中天然产生的正常形成二硫键的半胱氨酸残基之一,构建含有游离半胱氨酸的G-CSF和G-CSF(C17S)。正常与被置换的半胱氨酸残基形成二硫键的天然产生的半胱氨酸残基现在游离了。半胱氨酸残基可以被任何其它19个氨基酸取代,但优选丝氨酸或丙氨酸残基。天然蛋白序列或天然产生的“游离”半胱氨酸残基(半胱氨酸-17)已经变为另一个氨基酸,优选丝氨酸或丙氨酸的变异蛋白的内容中提供了这些变异体。也可以用如Sytkowdki等(1998)所述的步骤化学修饰天然产生的氨基酸,将游离半胱氨酸残基引入G-CSF。

使用类似实施例8,9,10,11和13所述的步骤,人们可在大肠杆菌中表达蛋白、纯化蛋白、PEG化蛋白和测定它们在体外和体内生物试验中的生物活性。蛋白可在大肠杆菌细胞质中表达或以分泌到周质间隙的蛋白而表达。使用类似PCT/US00/00931中所述的步骤,或本领域技术人员熟知的相关步骤,突变蛋白也可在真核细胞如昆虫或哺乳动物细胞中表达。如果希望从真核细胞分泌,也可以用天然G-CSF信号序列或另一个信号序列从真核细胞在分泌蛋白。

B.G-CSF(C17S)半胱氨酸突变蛋白的表达和纯化.用实施例8所述的用于BOB213(野生型)和BOB268(C17S)的方案,培养、诱导和收集表达13G-CSF(C17S)突变蛋白(*-1C,T1C,L3C,A6C,S7C,E93C,A129C,T133C,A136C,A139C,A141C,Q173C和*175C)的大肠杆菌株。所有突变蛋白大多不可溶。用上述实施例8所述的用于G-CSF野生型和G-CSF(C17S)的方案,重折叠和纯化突变蛋白。非还原型SDS-PAGE分析显示13个纯化半胱氨酸突变蛋白主要以单体形式回收,迁移在大约17kDa。纯化突变蛋白与野生型G-CSF和G-CSF(C17S)共同迁移,除了*-1C突变蛋白,它比野生型G-CSF迁移稍慢。除了一个突变蛋白,所有突变蛋白在类似于野生型G-CSF和G-CSF(C17S)的盐浓度下从离子交换柱中洗脱。一个例外E93C,在梯度(NaCl浓度大约400mM)较晚洗脱,可能由于半胱氨酸置换带电荷氨基酸谷氨酸。

C.G-CSF(C17S)半胱氨酸突变蛋白的生物活性.如实施例8所述的NFS60细胞增殖试验检测13个纯化G-CSF(C17S)半胱氨酸突变蛋白。用Bradford蛋白检测试剂盒(Bio-Rad Laboratories)确定蛋白浓度。在同一天并列分析商业上的野生型G-CSF和我们制备的野生型G-CSF和G-CSF(C17S),以对照试验中一天内的变异。在试验误差内,所有13个突变蛋白刺激NFS60细胞增殖的程度与野生型G-CSF对照蛋白相同。13个突变蛋白的平均EC50s范围5-9pg/ml。半胱氨酸突变蛋白的平均EC50s与G-CSF(C17S)对照蛋白相似,比我们的野生型G-CSF对照蛋白的平均EC50s低1.5至2倍和商业上的野生型G-CSF蛋白的平均EC50s低3倍,即更有效力。表6总结了这些数据。

表6野生型G-CSF、G-CSF(C17S)和G-CSF(C17S)半胱氨酸突变蛋白的生物活性

1各个实验的EC50值;当N>5时,显示范围

2商业上的野生型G-CSF(R&D Systems)3Bolder BioTechnology,Inc.制备的野生型G-CSFD.G-CSF双半胱氨酸突变体的构建用实施例9,14和15所述的步骤循序诱变循环,或可供选择地通过将各个突变体体外重组以构建编码含两个或更多游离半胱氨酸残基的突变蛋白的重组表达质粒,可以构建含两个或更多添加的游离半胱氨酸残基的多变异体。优选的多变异体将是两个或更多半胱氨酸突变蛋白组合的那些,其中每个在PEG化时保持高活性。实施例将是L3C加T133C,L3C加*175C,和T133C加*175C。其它优选多变异体可以基于表3和表4的数据推出,将包括含两个和更多选自组L3C,T133C,A141C和*175C的突变的组合。

我们构建了下列G-CSF双半胱氨酸突变体:L3C/T133C,L3C/*175C,和T133C/*175C。为了制备L3C/T133C,用Xho I和Eco RI消化pBBT227的L3C衍生物(G-CSF C17S在pUC18中),牛小肠碱性磷酸酶处理。用QiagenPCR清除试剂盒提取DNA,称作G-CSF L3C X-R1-Cip载体。接下来,用XhoI和Eco RI消化pBBT227的L3C衍生物,凝胶纯化~480bp片段并与G-CSFL3C X-R1-Cip载体连接。连接反应转化大肠杆菌JM109并鉴定具有正确序列的克隆。

为了制备L3C/*175C,用Xho I和Eco RI消化pBBT227的*175C衍生物,凝胶纯化~480bp片段并与G-CSF L3C X-R1-Cip载体(见上)连接。连接反应转化大肠杆菌JM109并鉴定具有正确序列的克隆。

为了制备T133C/*175C,pBBT227的L3C衍生物用作PCR反应中的模板,使用反向诱变寡核苷酸引物BB186(5>CGG GAA TTC TTA ACA GGGCTG GGCAAG GTG GCG TAG>3;SEQ ID NO:14)和正向非诱变寡核苷酸引物BB125,它与G-CSF插入体上游pUC18载体序列退火连接。PGR是50μl反应,在含1.5mM MgCl2,每种引物0.4μM,dATP,dGTP,dTTP和dCTP每种200μM,0.5ng模板片段,1单位Taq聚合酶(Promega),和0.1单位Pfu聚合酶(Stratagene)的1×Promega PCR缓冲液中进行。在Perkin-ElmerGeneAmp_PCR System 2400热力循环仪中进行反应。反应程序需要:95℃5分钟,22个循环的[94℃30秒,55℃30秒,72℃45秒],72℃保持7分钟和4℃保持。琼脂糖凝胶电泳分析20μl PCR,从凝胶中分离~630bp片段。用Xho I和EcoR I消化这个片段,用Qiagen PCR清除试剂盒(cleanup kit)提取。这个DNA与用Xho I和Eco RI消化的pBBT227的T133C衍生物制备的载体连接,牛小肠碱性磷酸酶处理并用Qiagen PCR清除试剂盒提取。连接反应转化大肠杆菌JM109并鉴定具有正确序列的克隆。

实施例10G-CSF半胱氨酸突变蛋白的PEG化、纯化和生物活性A.PEG化初步研究。用T1C作为检测蛋白,TCEP[Tris(2-羧乙基)膦1-HCl作为还原剂和来自Shearwater Polymers,Inc.的5kDa半胱氨酸反应性PEGs确定最初PEG化反应条件。用非还原型SDS-PAGE监测蛋白过度还原,寻找蛋白未重折叠后期望表观分子量更高转换,或天然二硫键还原产生多PEG化种的出现。1μg等分纯化的T1C与浓度不断增加的TCEP在室温下,100mM Tris,pH8.5中,在不同量过量5kDa马来酰亚胺-PEG或5kDa乙烯砜-PEG存在下温育1小时。60分钟后,立即用非还原型SDS-PAGE分析。产生大量单PEG化T1C蛋白而不修饰野生型G-CSF的TCEP量和特定PEG试剂用于进一步实验。滴定实验表明在pH8.5,10倍摩尔过量TCEP和20倍过量5kDa马来酰亚胺-PEG产生大量单PEG化T1C蛋白(SDS-PAGE测定表观分子量28kDa),没有可检测到的双或三PEG化蛋白。在等同PEG化条件下,野生型G-CSF和G-CSF(C17S)没有被修饰。这些反应条件用于按比例放大其它G-CSF突变蛋白的PEG化。对照实验表明为了PEG化,T1C蛋白需要用还原剂如TCEP处理而部分还原。

B.PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白的制备和纯化:用5kDa马来酰亚胺PEG,PEG化等份200至300μg 13个纯化的G-CSF半胱氨酸突变蛋白,以提供纯化和特性描述足够的原料。较大PEG化反应也在室温进行1小时,使用上述条件。这些反应条件产生所有突变蛋白的单PEG蛋白。用下述步骤已经纯化了11个单PEG化突变蛋白。在反应时间末,用40mM磷酸钠(单碱基)10×稀释PEG化混合物,pH调节至4.0后快速填入S-Sepharose柱(1mL,HiTrap),使用类似于上述用于G-CSF突变蛋白初次纯化条件(20 mL梯度,0-0.5M NaCI的40mM磷酸钠pH4)。PEG部分的存在降低了蛋白对树脂的亲和力,允许PEG化蛋白与非PEG化蛋白分离。S-Sepharose柱的层析图谱显示对于大多数突变蛋白,在大约275mM NaCl和300-325mM NaCl洗脱两个主蛋白峰。SDS-PAGE确定较早的洗脱主峰是单PEG化G-CSF(C17S)突变蛋白。确定较晚洗脱主峰是未反应的G-CSF(C17S)突变蛋白。PEG-E93C突变蛋白在大约325mM NaCl对未反应E93C蛋白在大约400mM NaCl洗脱。汇合主要含单PEG化G-CSF(C17S)突变蛋白的较早洗脱峰的级分并用于生物活性测定。也用20kDa PEG-马来酰亚胺PEG化五个半胱氨酸突变蛋白(L3C,T133C,A141C,Q173C和*175C),PEG化和纯化步骤如上所述。20kDa PEG化蛋白在S-Sepharose柱大约250mM NaCl洗脱。SDS-PAGE分析表明纯化PEG化蛋白含有低于10%,可能低于5%的未PEG化蛋白。为了PEG化,半胱氨酸突变蛋白需要用还原剂如TCEP处理而部分还原。在等同部分还原条件下,野生型G-CSF和G-CSF(C17S)不PEG化,表明PEG部分与引入突变蛋白中的半胱氨酸残基连接。

C.L3C G-CSF半胱氨酸突变蛋白的纯化和PEG化:对L3C实施重折叠和PEG化反应的时间过程。发现4个小时完成这个特定突变蛋白的重折叠。反相HPLC(C4柱)检测重折叠反应进展。产物是如实施例8所述生长的~10mg/400mL的培养物。用10kDa,20kDa和40kDa PEGs对L3C突变蛋白进行PEG化的时间过程。PEG化条件如实施例10所述,除了PEG化缓冲液中包含0.5mM EDTA。对于0.5-1mg反应,在室温2-4小时的更长时间反应产生更大量PEG化产物。延长时间PEG化的效率是~80%。相等效率进行更大(达到5mg)PEG化反应。用前述实施例10的纯化方法,在5mL S-Sepharose柱中从非PEG化蛋白中纯化PEG化蛋白。20kDa PEG化蛋白在~200mM NaCl洗脱,而40kDa PEG蛋白和10kDa PEG蛋白分别在~150mM和~200mM洗脱。未PEG化G-CSF L3C突变蛋白在~260mM洗脱。EDTA的存在显著降低了PEG化反应中蛋白二聚体的形成。

D.20kDa-PEG-L3C的N末端测序.天然G-CSF的N末端是苏氨酸(Souza等1986)。用自动Edman降解化学法测序纯化的20kDa-PEG-L3C的N末端,得到序列TPXGPAS,表明N末端被正确加工和与PEG化的第三个残基一致;PEG化氨基酸在序列中以空白显示,如X.指出。

E.圆二色性(CD)分析确定PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白的结构:在Jasco 720 CD分光偏振计上1cm通路长度300μl细胞中室温进行CD分析。从260nm-200nm以50m°灵敏度和32积聚(accumulations)收集数据。对L3C突变蛋白和10K PEG-L3C蛋白进行最初实验。两者具有与野生型G-CSF的文献中发现的非常类似的CD光谱。可对其它G-CSF半胱氨酸突变蛋白和它们的PEG化衍生物进行类似分析。

F.PEG化G-CSF(C17S)半胱氨酸突变蛋白的生物活性:如实施例8所述的NFS60细胞增殖试验测定11个纯化的5kDa-PEG-G-CSF(C17S)半胱氨酸突变蛋白和5个纯化的20kDa-PEG-G-CSF(C17S)半胱氨酸突变蛋白的生物活性。用Bradford染料结合试验确定蛋白浓度。在试验误差内,所有PEG化G-CSF(C17S)半胱氨酸突变蛋白显示与G-CSF(C17S)类似的剂量反应曲线(dose-response curves)并达到相同水平的最大生长刺激。5kDa-PEG修饰的半胱氨酸突变蛋白的平均EC50s范围2-11pg/ml。在生物试验中,这些PEG化突变蛋白比我们的野生型G-CSF效力强1.5至2倍,比商业上野生型G-CSF的效力强3倍。20kDa修饰的半胱氨酸突变蛋白的EC50S范围9至14pg/ml。PEG化G-CSF(C17S)半胱氨酸突变蛋白的生物活性等于或超过野生型G-CSF。单克隆抗体中和G-CSF(R&D Systems,Inc.)可消除5kDa-PEG-L3C的全部NFS60细胞刺激活性,表明促进生长活性是由于PEG-L3CG-CSF蛋白而不是蛋白制剂中的污染物。表7总结了生物活性数据。用NFS60细胞增殖试验确定40kDa-PEG修饰的L3C的EC50S是30-50pg/ml。

这里描述的PEG化G-CSF(C17S)半胱氨酸突变蛋白的生物活性高于以前描述的PEG化G-CSF蛋白的活性,以前描述的全部相对于野生型G-CSF生物活性降低(Tanaka等1991;Kinstler等1996a;Bowen等1999)。Tanaka等(1991)报道了多个分子量种组成的胺反应性(amine-reactive)10kDa NHS-PEG修饰的G-CSF和在不同赖氨酸基团或N末端氨基酸修饰的多个同工型。确定这个NHS-PEG混合物的生物活性相对于未修饰G-CSF降低大约3倍(Tanaka等1991;Satake-Ishikawa等1992)。Bowen等(1999)报道了5kDa-,10kDa-和20kDa-胺-反应性PEGs修饰的G-CSF变异体相对于未修饰的G-CSF,降低大约6倍、10倍和20倍。Bowen等(1999)纯化了20kDa-胺-反应性PEGs修饰的G-CSF变异体的单一分子量种,发现其生物活性相对于未修饰G-CSF降低大约4倍。尽管Bowen等(1999)分离的单一分子量种相当于单一PEG分子修饰的G-CSF变异体,由于PEG分子在多个位点连接蛋白,PEG蛋白制剂是异种的。Kinstler等(1996)纯化了优选在大肠杆菌表达的Met-G-CSF(细胞质中表达)的非天然氨基末端甲硫氨酸残基通过胺或酰胺键修饰的PEG化Met-G-CSF种。这个PEG化Met-G-CSF蛋白仅具有野生型Met-G-CSF(Kinstler等1996)体外生物活性的68%。

表7PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白的生物活性

a各个实验的EC50值实施例11

使用半胱氨酸阻断剂提高正确折叠的G-CSF半胱氨酸突变蛋白的回收率通过量和类型变化的还原剂和存在和不存在催化量硫酸铜的步骤重折叠不溶的大肠杆菌表达的野生型G-CSF和G-CSF(C17S/Q173C)。基于描述它在最佳化重折叠G-CSF步骤中的应用的参考文献(Kuga等1989),选择5mM二硫苏糖醇(DTT)作为标准还原剂。Lu等(1992)描述了在溶解步骤没有还原剂存在,但复性缓冲液中含有40μM硫酸铜的重折叠/复性不溶G-CSF的步骤。

如实施例8所述使大肠杆菌培养物(400mL)生长并诱导每一G-CSF蛋白表达。如实施例8所述裂解细胞并离心分离不溶部分。含大部分不溶G-CSF蛋白的不溶物质悬浮于20mL 8M urea,20mM Tris,pH8中并搅拌直到均质。混合物等分到6个管中。如表6所述向某些管中加入5mM DTT或25mM半胱氨酸。一小时后,溶解混合物稀释于25mL 40mM磷酸钠,15%甘油,pH8,含或不合40μM硫酸铜中。允许重折叠物在4℃放置两天。此时,每管的pH调至4。如实施例8所述离心重折叠物,上清填入S-Sepharose柱以及纯化G-CSF野生型和Q173C蛋白。基于非还原型SDS-PAGE分析,混合柱级分,如实施例8所述。表5显示了层析后回收的每种蛋白的量。

表8在不同还原剂存在和不存在下,重折叠/复性G-CSF蛋白的回收

a从67ml大肠杆菌培养物中回收的蛋白如表8所示,溶解步骤中,半胱氨酸用作还原剂时,G-CSF野生型和G-CSF半胱氨酸突变蛋白的产量达到最大。当与还原剂联合使用时,硫酸铜(40μM)的存在看来少量增加回收率。非还原型SDS-PAGE分析使用重折叠步骤A-F回收的野生型G-CSF蛋白,显示每种主要含期望大小(非还原条件下,大约17kDa)单体G-CSF的单一分子量种。相比之下,当非还原型SDS-PAGE分析来自G-CSF(C17S/Q173C)重折叠A-D的S-Sepharose柱汇合物,最终产物条带宽且在单体范围内含有大量不同表观分子量的种。推测不同的分子量单体种代表不同的G-CSF(C17S/Q173C)蛋白的二硫化物同工型。重折叠E和F回收的G-CSF(C17S/Q173C)蛋白以与野生型G-CSF共同迁移的单一锐利条带迁移,表明已经回收了单一的大部分重叠的种类。数据显示在溶解和重折叠步骤中添加半胱氨酸显著增加正确重叠G-CSF(C17S/Q173C)蛋白的产量。尽管不希望受任何理论的限制,我们推测添加的半胱氨酸与突变蛋白中游离半胱氨酸残基形成混合二硫化物。混合的二硫化物限制了含游离半胱氨酸可发生的可能的二硫化物重排。半胱氨酸可能比DTT更有效,因为典型的DTT不形成混合二硫化物,由于氧化时形成的热力学优选分子内键。

实施例12存在和不存在半胱氨酸而制备的G-CSF蛋白稳定性比较如实施例11所述使用重折叠步骤A(无还原剂,无硫酸铜)和重折叠步骤F(25mM半胱氨酸,40μM硫酸铜)制备的野生型G-CSF和G-CSF(C17S/Q173C)蛋白置于50℃,pH4和pH8中。在时间0,5分钟,30分钟,1,2,3,4,5和20小时,蛋白样品离心去除任何变性的蛋白沉淀。从上清中移出等分试样并冰冻。实验末,用非还原型SDS-PAGE分析所有等分试样以确定原始G-CSF蛋白样品的什么部分保留在溶液中且是单体。基于凝胶中可见的条带相对亮度确定每种蛋白的溶解半衰期。表9显示了结果。

表9使用不同的重折叠/复性步骤制备的G-CSF蛋白的稳定性

结果显示野生型G-CSF在pH4的溶解半衰期比pH8长,与Arakawa等(1993)以前报道的结果一致。野生型G-CSF的溶解半衰期基本没有差异,无论使用重折叠步骤A或F重折叠蛋白。相比之下,当用步骤F(>20小时)重折叠蛋白时,G-CSF(C17S/Q173C)的溶解半衰期大大长于步骤A(<30分钟)。因此,除了增加正确折叠G-CSF半胱氨酸突变蛋白的回收率外,溶解/重折叠方法中使用半胱氨酸可增加最终产物的热稳定性。

进行另外的研究比较G-CSF半胱氨酸突变蛋白与野生型G-CSF的稳定性。例如,使蛋白暴露在各种pH、温度和血清浓度下,进行多种(amatrixof)实验。在各个时间点,可使用试验例如,但不限于实施例8所述的体外细胞增殖生物活性试验、大小排阻层析、圆二色性、ELISA试验和Western印迹分析,来监测蛋白的完整性。

实施例13PEG-G-CSF半胱氨酸突变蛋白的体内功效每组三只雄性Sprague Dawley大鼠,每只体重~320g,接受单一静脉内注射(侧尾静脉)100μg/kg野生型重组G-CSF(Bolder BioTechnology制备),Neupogen_Amgen,Inc.销售的重组G-CSF)或PEG-L3C。使用Bradford染料结合试验确定蛋白浓度。在选择的时间点,从大鼠中抽取血液样品(0.3至0.4ml)到EDTA抗凝管中。等分血液样品交送商业厂商进行全部血细胞(CBC)计数。剩余血液样品离心并在-80℃血浆冰冻。在注射后0.25,1.5,4,8,12,16,24,48,72,96,120和144小时,抽取血液样品。测试化合物注射前~24小时,获得0小时的基线样品。表10和11显示不同时间不同测试组的血液中性白细胞平均值和总白细胞数。所有三个测试化合物刺激外周血白细胞和中性白细胞增加超过基线值。接受野生型重组和Neupogen_的测试组计算的白细胞和中性白细胞在注射后~24小时达到高峰并在~48小时返回到基线值。相比之下,接受PEG-L3C的大鼠计数的白细胞和中性白细胞在注射后~48-72小时达到高峰且在注射后~120小时不返回到基线值。在接受PEG-L3C的大鼠观察到的白细胞和中性白细胞水平峰值高于接受野生型重组或Neupogen_的组p<0.05)。数据表明PEG-L3C能够刺激循环中性白细胞和白细胞增加,外周血白细胞计数和中性白细胞绝对增加比野生型G-CSF或Neupogen_更高和持续更长。进行类似实验证明其它PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白(C17或C17S型)的功效。也用皮下给予蛋白的途径进行类似的研究。

表10一次静脉内给予蛋白(100μg/kg)后,G-CSF、Neupogen_和PEG-L3C对中性白细胞数量的作用

aBolder BioTechnology,Inc.制备的野生型G-CSFb对0小时中性白细胞水平的P<0.05c同一时间点,对G-CSF和Neupogen的P<0.05

表11一次静脉内给予蛋白(100μg/kg)后,G-CSF、Neupogen_和PEG-L3C对白细胞数量的作用

aBolder BioTechno1ogy,Inc.制备的野生型G-CSFb对0小时白细胞水平的P<0.05c在同一时间点,对G-CSF和Neupogen的P<0.05可使用商业可得到的G-CSF ELISA试剂盒(R&D Systems,Inc.)定量血浆G-CSF和PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白水平。可进行滴定实验确定ELISA检测野生型G-CSF,未修饰G-CSF半胱氨酸突变蛋白和PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白的相对敏感性。也可以皮下途径给予蛋白进行类似的研究。

上面实施例13总结的功效实验得到的血浆蛋白浓度是用购自R&DSystems,Inc.的人G-CSF ELISA试剂盒测定的。结果在表12中显示。结果表明蛋白静脉内给予大鼠后,20kDa-PEG-L3C的循环半衰期明显高于野生型G-CSF或Neupogen_。

表12一次静脉内给予蛋白(100μg/ml)后,G-CSF、Neupogen__和20kDa-PEG-L3C的血浆浓度

aBolder BioTechnology,Inc.制备的野生型G-CSF可测定正常或中性白细胞缺乏(neutropenic)啮齿动物如小鼠或大鼠中,证明蛋白刺激循环中性白细胞水平和中性白细胞生成相对于载体处理动物发生增加,从而测定PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白(C17或C17S型)的体内功效。G-CSF在100μg/kg时,刺激正常和中性白细胞缺乏啮齿动物的中性白细胞水平(Kubota等1990;Kang等1995)。为证明在正常小鼠中的功效,5只小鼠的组(每只体重~20g)接受皮下注射G-CSF、PEG-G-CSF半胱氨酸突变蛋白或安慰剂(载体溶液),以特定的间隔给予5天。正常小鼠如ICR小鼠可购自商业卖主。在第6天,杀死动物并收集血液样品进行全部血细胞计数(CBC)分析。可收集造血组织(肝和脾),称重并用福尔马林固定用于组织病理学分析,寻找中性白细胞生成增加的证据。可从各种长骨和胸骨中取出骨髓进行单位微粒制备和组织病理学分析,寻找中性白细胞生成增加的证据。组间的比较应该用Students T检验进行单一比较和用单因素方差分析(one-way analysis of variance)进行多个比较。P<0.05应该认为具有显著性。PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白应该刺激这种小鼠循环中性白细胞水平和中性白细胞生成的增加比载体处理小鼠更高。可检测给予一次、每天一次、隔天一次或每三天一次时,用5kDa,10kDa,20kDa或40kDa PEGs修饰的PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白的功效。在最初的实验中,不同组的小鼠可接受每次注射0.0032,0.016,0.08,0.4和2μg的PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白的皮下注射。对照小鼠可仅接受载体溶液。另外的对照组可接受野生型G-CSF(2μg/每天(ED),5天)和2μg野生型G-CSF,使用与PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白相同的剂量方案。

也可证明中性白细胞缺乏小鼠中PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白的功效。用环磷酰胺(CPA;100mg/kg)处理诱导中性白细胞减少症,环磷酰胺通常用作骨髓抑制化疗制剂和涉及人临床处置。G-CSF可加速环磷酰胺处理动物正常中性白细胞水平恢复(Kubota等1990;Kang等1995;Matsuzaki等1996)。小鼠(~20g)可在0天接受腹膜内注射环磷酰胺以诱导中性白细胞减少症。动物应该分为不同的组,应该以特定间隔接受皮下注射G-CSF、PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白或安慰剂,达到5天。一个对照组不应该接受环磷酰胺,但应该接受安慰剂注射。可检测给予一次、隔天一次或每三天一次时,用5kDa,10kDa,20kDa或40kDa PEGs修饰的PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白的功效。在最初实验中,不同组的小鼠可接受每次注射0.0032,0.016,0.08,0.4和2μg的PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白的皮下注射。对照小鼠可仅接受载体溶液。另外的对照组可接受野生型G-CSF(2μg/每天(ED),5天)和2μg/注射的野生型G-CSF,使用与PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白相同的剂量体制。在第0-10天,可杀死每组五只小鼠,血液和组织样品分析如上面实验所述的正常小鼠。与载体注射、CPA注射对照组相比,PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白应该加速这种小鼠循环中性白细胞水平和中性白细胞生成增加。

可供选择地,可以使用大鼠模型,中性白细胞减少症研究证明PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白的功效。G-CSF加速骨髓抑制化疗制剂处理的大鼠中性白细胞水平正常恢复。在这种情况下,在0天,Spague Dawley大鼠组(每只体重~300g)可接受腹膜内CPA剂量(100mg/kg)以诱导中性白细胞减少症。然后,动物可分为三组,它们以特定间隔接受皮下注射G-CSF、PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白或安慰剂,达到10天。一个对照组可接受安慰剂注射而不是环磷酰胺。在最初实验中,通过实施皮下剂量~0.1μg-500μg/kg(优选范围是1-100μg/kg),一次、每天、每隔一天或每三天给予剂量,测定用10kDa,20kDa和40kDa PEGs修饰的PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白的功效。一个另外的对照组可每天接受商业上可获得的野生型G-CSF(100μg/kg),共5天,另一个对照组可接受与PEG化G-CSF半胱氨酸突变体相同的剂量和剂量体制的野生型G-CSF。对照大鼠可仅接受载体溶液。在第0-6,8,10,12和14天,收集血液样品进行CBC分析。在时间过程完成时,可杀死大鼠收集造血组织和骨髓以调查中性白细胞生成增加的证据。与载体注射、CPA注射对照组相比,PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白应该刺激这种小鼠循环中性白细胞水平和中性白细胞生成增加加速。

实施例14

野生型GM-CSF的克隆、表达、纯化和生物活性A.克隆编码GM-CSF的DNA序列.我们用从人膀胱癌细胞系5637(美国典型培养物保藏中心)分离的总RNA进行RT-PCR,克隆并测序了编码人GM-CSF的cDNA。用PCR从人膀胱癌细胞系5637(美国典型培养物保藏中心)分离的总RNA扩增编码G-CSF的cDNA。细胞在补充了10%FBS,50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中生长。用购自Qiagen,Inc.(Santa Clarita,CA)的RNeasy Mini RNA分离试剂盒根据制造商的指导从细胞中分离RNA。用Boehringer Mannheim Corp的RT-PCR的第一条链cDNA合成试剂盒(AMV)和随机六聚体(random hexamers)用作引物,完成单链cDNA的第一条链合成。用正向引物BB267(5>GAC ACT GCT GCT GAG ATG AAT G>3;SEQ ID NO:75)和反向引物BB268(5>CTT GTA GTG GCT GGC CAT CATG>3;SEQ ID NO:76)进行用第一条链合成产物作为模板的后续PCR反应。引物BB268与GM-CSF分泌信号的编码序列5’末端退火,BB268与GM-CSF编码序列3’末端退火。用Hind III和Bam HI消化所得~450bp PCR产物,凝胶纯化并克隆到已用Hind III和Bam HI消化的pCDNA3.1(+)载体,碱性磷酸酶处理,凝胶纯化。正确DNA序列的克隆记做pCDNA3.1(+)::GM-CSFfus或PBBT267。我们用PCR修饰这个GM-CSF克隆用于在大肠杆菌周质中表达。当在大肠杆菌中表达时,通过分泌到周质,分泌的GM-CSF不含有添加的N末端甲硫氨酸且具有与天然产生GM-CSF等同的氨基酸序列(Lee等1985)。为了表达分泌形式的GM-CSF,用PCR将大肠杆菌热稳定肠毒素(STII)基因的引导序列(Picken等1983),在Nde I限制性位点前,与成熟GM-CSF的氨基末端编码序列融合。此外,紧接其后是Eco RI限制性位点的TAA终止密码子加到羧基末端残基E127后。同时,脯氨酸2,6,8,12,117和124位的密码子全部变为CCG,114位亮氨酸的密码子变为CTG。PCR反应使用正向引物BB300(5>CGC AAC GCG TAC GCA GCA CCG GCC CGC TCG CCG AGC CCGAGC ACG GAG CCG TGG GAG>3;SEQ ID NO:77)和反向引物BB301(5>CGCGAA TTC TTA CTC CTG GAG CGG CTC CCA GCA GTC AAA CGG GAT GAC CAG CAGAAA>3;SEQ ID NO:78)与pBBT267作为模板。用Mlu I和Eco RI消化~400 bp PCR产物,凝胶纯化并克隆进入上面实施例9所述的pBBT227。用Mlu I和Eco RI消化PBBT227 DNA,碱性磷酸酶处理,并在1%琼脂糖凝胶中泳动。纯化~2.4 kb载体片段并用于连接。所得重组体携带与GM-CSF融合的完整stII引导子,这个“stII-GM-CSF”构建体可被Nde I-EcoRI切割为~450bp的片段。一个正确序列的克隆记做pUC18::stII-GM-CSF。为了表达研究,这个质粒的Nde I-EcoRI片段亚克隆进入表达载体pBBT257,在下面描述。所得质粒,pBBT257;stII-muGM-CSF,或pBBT271引入大肠杆菌W3110进行表达。

质粒pBBT257源自表达载体pCYB1(New England BioLabs),通过删除pCYB1的抗氨苄西林基因和在pBBT257和pCYB1中用来自经典克隆载体pBR322(Bolivar etal,1977)的抗四环素基因取代,克隆基因的表达在tac启动子的控制之下,它由质粒携带(plasmid-borne)lacIq基因产物调节。这些载体允许基因以非融合蛋白表达或以与几丁质结合域融合而表达;我们的构建体如此构建使得蛋白以非融合蛋白表达。质粒pBBT257构建如下。使用引物BB228(5>CGC GCT GCA GTT CTC ATG TTT GAC AGC TTA TCA TC>3;SEQ ID NO:41)和BB229(5>CGC GCT GCA G AT TTA AAT TAG CGA GGTGCC GCC GGC TTC CAT>3;SEQ ID NO:42),用PCR扩增质粒pBR322(购自New England bioLabs)的抗四环素基因(TcR基因)。正向引物BB228与pBR322序列(GenBank登记号#J01749)的核苷酸1至25退火,其位于TcR基因上游且包括TcR基因启动子的“-35”部分。寡核苷酸BB228含有添加克隆目的的Pst I位点。反向引物BB229与核苷酸1277至1300退火,其紧接TcR基因编码序列后的翻译终止密码子下游。BB229含有克隆目的添加的Dra I位点。40μl PCR反应在50 mM KCl,10mM Tris-HCl(pH 9.0@25℃),0.1%Triton_X-100,1.5mM MgCl2并包括dNTPs每种200μM,每种引物20pmole,0.5 ng pBR322 DNA,2.5单位Taq聚合酶(Promega),和0.5单位PFU聚合酶(Stratagene)中进行。PCR反应组成:95℃3分钟,25个循环[94℃30秒,60℃30秒,72℃90秒]后,4℃保持。所得~1300bp的产物凝胶纯化,用Pst I和Dra I消化并用于如下所述的连接反应。用Pst I和Swa I消化纯化的pCYB1 DNA并根据卖主(New England BioLabs)方案用牛小肠碱性磷酸酶处理。Pst I和Swa I每种切割载体一次并与抗氨苄西林(ApR)基因侧接。用Qiaquick PCR cleanup kit(Qiagen)根据卖主方案清除消化的产物,随后在1%琼脂糖凝胶中泳动。~5.3kb载体片段,缺失ApR基因,凝胶纯化并与含TcR基因的Pst I-Dra I切割PCR产物连接。Dra I和Swa I都产生可连接在一起的钝末端消化产物。连接反应用于转化大肠杆菌DH5α并选择抗四环素的转化体。随后分析三分离株,发现全部对氨苄西林敏感。这些株得到的限制性内切酶消化产物与缺失含ApR基因的~1500bpPst I和Swa I片段和被携带TcR基因的~1300bp Pst I-Dra I片段取代相一致。选择一个分离株,记做pBBT257,用于重组蛋白的表达。

B.野生型GM-CSF在大肠杆菌中表达.为了分泌型GM-CSF表达,pBBT271[pBBT257::STII-GM-CSF]和pBBT257亲本载体转化大肠杆菌W3110。所得株记做BOB340:W3110(pBBT257)和BOB350:W3110(pBBT271)。新鲜饱和的过夜培养物在含10μg/ml四环素的LB培养基在A600为0.025O.D.中接种。这些100ml培养物生长在500ml有挡板振荡瓶中28℃,在旋转式振荡器水浴中以~250rpm。当培养物密度达到~0.6O.D.,加入IPTG使终浓度为0.5mM,诱导的培养物接着过夜培养~16小时。用预制的(precast)14%Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯兰染色分析诱导和未诱导培养物的样品。BOB350(GM-CSF)的诱导培养物在大约14kDa出现条带,与成熟GM-CSF分子量一致。在BOB350的未诱导培养物或仅是对照载体的BOB340的诱导或未诱导培养物中没有检测到这条带。Western印迹分析表明这个~14kDa条带与抗人G-CSF抗血清(R&D Systems)强烈反应。这个抗血清不识别BOB340和BOB350的未诱导培养物或仅是对照载体的BOB340的诱导培养物中的蛋白。这些Western印迹也显示这个~14kDa条带与购自R&D Systems的商业上来源于大肠杆菌的人GM-CSF标准共同迁移。这个结果提示STII引导肽已经被去除,与已经分泌到周质中的蛋白一致。下面提供的N末端测序研究表明STII信号序列被正确加工。

这些培养物诱导16小时后也接受基于Koshland和Botstein(1980)步骤的渗透压休克。这个步骤破裂大肠杆菌外膜并将周质内容释放到周围培养基中。随后离心将可溶周质成分(上清中回收)与细胞质的不溶周质和细胞相关成分(沉淀中回收)分离。少量合成的GM-CSF蛋白从上清中回收。大量GM-CSF保持与沉淀相连。这表明尽管蛋白看来被加工和分泌到周质,它主要以不溶形式蓄积在那里。其他人已经报道了分泌到大肠杆菌周质的GM-CSF的类似结果(Libby等1987;Greenberg等1988)。

C.野生型GM-CSF的纯化.用下列方案大规模表达和纯化野生型GM-CSF。新鲜饱和BOB350(野生型)过夜培养物在含10μg/ml四环素的LB中在~0.05 OD@A600中接种。400ml培养物在2L有挡板振荡瓶中,28℃,在旋转式摇床振荡仪水浴中以250rpm生长。当培养物达到~0.6OD的密度,加入IPTG至终浓度0.5mM。然后,诱导培养物过夜培养~16小时。离心沉淀细胞并在-80℃冰冻。消融细胞沉淀并根据制造商(Pierce)方案用5mL B-PERTM细菌蛋白提取试剂处理。离心回收不溶物质,大量GM-CSF蛋白,并重悬于B-PER。这个混合物用溶菌酶(200μg/ml)处理10分钟以进一步破坏细胞壁,加入MgCl2(终浓度10mM)和无蛋白酶DNAse(2μg/ml)。离心收集不溶GM-CSF,并重悬于水中洗涤和再次离心,以去除大部分溶解的细胞杂质。为了重折叠,所得含不溶GM-CSF的沉淀溶于含10ml 8M尿素、25mM半胱氨酸的20mM Tris碱中。这个混合物在室温搅拌30分钟,然后稀释到100ml 20mM Tris,40μM硫酸铜,15%甘油,pH 8.0。这个重折叠混合物4℃保存2天。然后离心后填入在20mM Tris,pH8.0(缓冲液A)中平衡的5ml Q-Sepharose柱(Pharmacia HiTrap)中。用从0-35%缓冲液B(1M NaCl,20mM Tris,pH8)的线性盐梯度洗脱结合蛋白。非还原型SDS-PAGE分析柱级分。GM-CSF在大约230mM NaCl洗脱。汇合主要含GM-CSF的级分。

用等体积30%硫酸铵稀释Q-Sepharose汇合物并加温至室温后填入预先用含15%硫酸铵的20mM磷酸钠,pH7.5中平衡的1mL苯基HP柱(PharmaciaHiTrap)。用逆向盐梯度(含15%硫酸铵至0%硫酸铵的20mM磷酸钠,pH7.5)从柱中洗脱纯化的GM-CSF。GM-CSF的苯基HP柱洗脱图谱显示单一主峰,在大约6.5%硫酸铵处洗脱。非还原型SDS-PAGE分析所述峰的柱级分。汇合含GM-CSF的级分和未见污染物。Bradford分析确定野生型GM-CSF的最终产量是400ml培养物中大约2.6mg。使用自动Edman降解化学法的野生型GM-CSF的N末端测序得到序列APARSPS,它与成熟人GM-CSF前七个氨基酸同一匹配,表明N末端被正确加工(Lee等1985)。在还原型和非还原型条件下,纯化的野生型GM-CSF和商业上可获得GM-CSF(大肠杆菌表达的;R&DSystems)共同迁移,如Western印迹分析显示。在还原条件下,两种蛋白均显示所期望的迁移率转换到更高表观分子量,因为分子内二硫键的破坏。

D.野生型GM-CSF的体外生物活性.使用人TF-1真核细胞系(Kitamura等1989)的细胞增殖试验测定野生型GM-CSF的生物活性。人TF-1细胞系得自美国典型培养物保藏中心。细胞保存在补充10%FBS,50单位/ml青霉素,50μg/ml链霉素和2ng/ml重组人GM-CSF(得自大肠杆菌;R&D Systems)的RPMI 1640培养基中。通常,生物试验的建立是通过用RPMI 1640培养基(无添加剂)洗涤TF-1细胞三次并将细胞以1×105个/ml的浓度重悬于含10%FBS,50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素(试验培养基)的RPMI 1640培养基中。50μl(5 × 103个细胞)细胞悬液均分到平底96孔组织培养板的每个检测孔中。在试验培养基中制备待检测蛋白样品的系列稀释物。并列分析商业上重组人GM-CSF(大肠杆菌表达的;R&D Systems)的系列稀释物。50μl稀释蛋白样品加入到检测孔中,板在37℃潮湿的5%CO2组织培养温箱中温育。在一式三份的三个孔中检测蛋白样品。~3天后,每孔中加入20i1MTS/PMS混合物(细胞滴定96 AQueous One Solution,Promega),板在组织培养温箱中37℃温育1-4小时。用微板阅读器在490nm读出孔的吸光度。对照孔含培养基但不含细胞。从检测孔得到的平均值减去三个对照孔的平均吸光度值。计算每个样品的半数最大刺激浓度EC50s以比较蛋白的生物活性。

TF-1细胞系对GM-CSF显示强烈增殖反应,如细胞数量和吸光度值剂量依赖性增加所证明。在生物试验中,商业上的GM-CSF和我们制备的GM-CSF的平均EC50s分别是97和105pg/ml(表13)。

实施例15GM-CSF半胱氨酸突变蛋白的构建、表达、纯化和生物活性A.GM-CSF半胱氨酸突变蛋白的构建.用如Innis等(1990)和Horton等(1993)和实施例9所述的采用基于PCR的定点诱变构建十三个突变GM-CSF基因。我们构建立在螺旋A最近的(proximal to)氨基末端区的五个突变蛋白[*-1C(将半胱氨酸残基添加到天然氨基末端),A1C,A3C,S5C和S7C];B-C环的一个突变蛋白[S96C];C-D环的三个突变蛋白[E93C,T94C和T102C];和螺旋D远端羧基末端区的三个突变蛋白[V125 C,Q126C和*128C(将半胱氨酸残基添加到天然羧基末端)]。我们也构建了在位于螺旋A远端的推定的N连接的糖基化位点[N27C]的一个突变蛋白。用于诱变PCR反应的模板是质粒pBBT268,其中STII-GM-CSF基因如pUC18中Nde I-Eco RI片段克隆。用适当的限制性内切酶消化PCR产物,凝胶纯化并与已经用那些相同限制性酶切割的pBBT268载体DNA连接,所述载体DNA已用同样的那些限制酶切割,经碱性磷酸酶处理和凝胶纯化。来自这些连接体的转化体生长,分离质粒DNA并测序。确定克隆的完整诱变PCR片段的序列以证实存在目的突变,和不存在PCR反应或合成寡核苷酸引物潜在可能引入的任何另外突变。

对于在大肠杆菌中,蛋白分泌倒周质间隙的表达,从基于pUC18的pBBT268衍生物中~450bp的Nde I-Eco RI片段切割编码13个突变蛋白的STII-GM-CSF基因,亚克隆进入pBBT257表达载体并转化大肠杆菌W3110。

使用类似这里所述的那些步骤,人们可构建GM-CSF的其它半胱氨酸突变蛋白。半胱氨酸突变蛋白可以是半胱氨酸置换GM-CSF编码序列中的天然氨基残基的置换突变,在GM-CSF编码序列的两个天然发生的氨基酸之间插入半胱氨酸残基的插入突变,或在GM-CSF编码序列的第一个氨基酸A1前添加半胱氨酸残基的添加突变,或在GM-CSF编码序列的末端氨基酸残基E127后添加半胱氨酸残基的添加突变。半胱氨酸残基可以置换GM-CSF编码序列任何位置中的任何氨基酸,或插入在任何两个氨基酸之间。在GM-CSF中置换或插入半胱氨酸残基的优选位点是螺旋A前区域、A-B环、B-C环、C-D环和螺旋D远端区。其它优选位点是A,B,C和D螺旋的最先和最后三个氨基酸。一些优选的半胱氨酸突变位点在表13中描述。其它优选的位点包括R67C,G68C,L70C,R30C,T32C,A33C,E35C,N37C,T39C,E45C,D48C,Q50C,E51C,Q99C,T98C,E113C和E127C。除了上述突变外,在这些区域产生半胱氨酸置换的其它优选残基在PCT/US98/14497中描述。

人们也可以通过另一个氨基酸置换GM-CSF中天然产生的正常形成二硫键的半胱氨酸残基之一,构建含有游离半胱氨酸的GM-CSF。正常与被置换的半胱氨酸残基形成二硫键的天然产生的半胱氨酸残基现在游离了。半胱氨酸残基可以被任何其它19个氨基酸取代,但优选丝氨酸或丙氨酸残基。也可以用如Sytkowdki等(1998)所述的步骤化学修饰天然产生的氨基酸,将游离半胱氨酸残基引入GM-CSF。

也可以使用实施例8,9,14和15的步骤通过循序诱变循环(sequentialrounds of mutagenesis)或可供选择地通过将各个突变体体外重组以构建编码含两个或更多游离半胱氨酸残基的突变蛋白的重组表达质粒,构建含两个或更多添加的游离半胱氨酸残基的多变异体。优选的多变异体将是组合两个或更多半胱氨酸突变蛋白的那些,其中每个在PEG化时保持高活性,如A3C加S69C,S69C加E93C,和A3C加E93C。其它优选多突变体可以基于表9和表10的数据推出,将包括含两个和更多选自组*-1C,A1C,A3C,S5C,S7C,S69C和E93C的突变的组合。

使用类似实施例14-16描述的步骤,人们可在大肠杆菌中表达蛋白、纯化蛋白、PEG化蛋白和测定它们在体外生物试验中的生物活性。蛋白可在大肠杆菌细胞质中表达或以分泌到周质间隙的蛋白表达。使用类似PCT/US00/00931中所述的步骤,或本领域技术人员熟知的相关步骤,突变蛋白也可在真核细胞如昆虫或哺乳动物细胞中表达。如果希望从真核细胞分泌,也可以用天然GM-CSF信号序列或另一个信号序列从真核细胞中分泌蛋白。

B.GM-CSF半胱氨酸突变蛋白的表达和纯化.用实施例14所述的用于野生型GM-CSF的方案,生长、诱导和收集表达13GM-CSF半胱氨酸突变蛋白的大肠杆菌株。用实施例14所述的用于野生型GM-CSF的方案,重折叠和纯化突变蛋白。从Q-Sepharose柱在大约200-230mM NaCl和Phenyl HP柱在大约6-8%硫酸铵中洗脱突变蛋白。突变蛋白主要以单体回收,非还原型SDS-PAGE测定表观分子量~14kDa。

C.GM-CSF半胱氨酸突变蛋白的生物活性.TF-1细胞增殖试验检测13个纯化GM-CSF半胱氨酸突变蛋白。用Bradford蛋白检测试剂盒(Bio-RadLaboratories)确定蛋白浓度。在同一天并列分析商业上的野生型GM-CSF和我们制备的野生型GM-CSF,以对照试验中一天内的变异。所有13个突变蛋白刺激TF-1细胞增殖的程度与野生型GM-CSF对照蛋白相同。13个突变蛋白的平均EC50s范围80-134pg/ml(表13)。

表13GM-CSF半胱氨酸突变蛋白的性能

a观察到的EC50值范围;试验数量在括号中。

b商业上的野生型GM-CSF(R&D Systems)cBolder BioTechnology制备的野生型GM-CSF实施例16GM-CSF半胱氨酸突变蛋白的PEG化、纯化和生物活性A.PEG化初步研究。用A1C,S7Ch S69C作为检测蛋白,TCEP[Tris(2-羧乙基)膦]-HCl作为还原剂和来自Shearwater Polymers的5kDa半胱氨酸反应性PEGs确定最初PEG化反应条件。3μg等分试样纯化的半胱氨酸突变蛋白或野生型GM-CSF与浓度不断增加的TCEP在室温下,100mM Tris,pH8.5中,在过量5kDa马来酰亚胺-PEG或5kDa乙烯砜-PEG(分子量平均5kDa组成的聚乙二醇聚合体与反应性马来酰亚胺或乙烯砜基团在聚合体一个末端形成的线性形式)存在下温育。马来酰亚胺和乙烯砜基团与Michael亲核试剂(nucleophiles)反应,对硫醇基团如半胱氨酸侧链所含的那些具有高选择性。90分钟后,立即用非还原型SDS-PAGE分析。选择产生大量单PEG化半胱氨酸蛋白而不修饰野生型GM-CSF的TCEP量和特定PEG试剂用于后续实验。滴定实验表明在pH8.5,15倍摩尔过量TCEP和20倍过量5kDa马来酰亚胺-PEG产生大量单PEG化A1C蛋白和单PEG化S7C蛋白,没有可检测到的双或三PEG化蛋白。在GM-CSF S69C的情况下,优选5kDa乙烯砜-PEG超过5kDa马来酰亚胺-PEG,并产生大量单PEG化S69C蛋白。重组野生型GM-CSF与PEGs不反应,甚至在50倍摩尔过量TCEP存在下。对照实验表明为了PEG化,突变蛋白需要部分还原。

B.PEG化GM-CSF半胱氨酸突变蛋白的制备和纯化:PEG化等分试样200至300g10个纯化的GM-CSF半胱氨酸突变蛋白,以提供纯化和特性描述足够的原料。较大PEG化反应也在室温进行1.5小时。对于每个突变体,使用15倍过量TCEP和20倍过量5kDa马来酰亚胺。唯一的例外是S69C使用5kDa乙烯砜-PEG。这些反应条件产生所有十个突变体的单PEG蛋白。在反应时间末,用冰冷20m MTris,pH8.0稀释20×PEG化混合物后快速填入Q-Sepharose柱(1mL,HiTrap),使用类似于上述用于GM-CSF突变蛋白初次纯化条件(25mL梯度,0-0.35M NaCI的20mM Tris pH8.0)。PEG部分的存在降低了蛋白对树脂的亲和力,允许PEG化蛋白与非PEG化蛋白分离。非还原型SDS-PAGE分析PEG化反应显示唯一可检测到的PEG化种类是PEG-GM-CSF半胱氨酸突变蛋白单体,它与表观分子量~26kDa迁移。Q-Sepharose柱的层析图谱显示两个主蛋白峰。SDS-PAGE确定较早的洗脱主峰(160-200mM NaCl)是单PEG化GM-CSF蛋白。第二个主峰(200-230mMNaCl)确定是未反应的GM-CSF蛋白。汇合主要含单PEG化GM-CSF突变蛋白的较早洗脱峰的级分并用于生物活性测定。用等同方案PEG化和纯化所有GM-CSF突变蛋白。SDS-PAGE分析PEG化蛋白显示相似的表观分子量,除了PEG-E93C和PEG-T94C突变蛋白显示稍小的表观分子量。使用10和20kDa马来酰亚胺PEGs,也在N末端区小规模PEG化四个半胱氨酸突变蛋白(*-1C,A1C,A3C和S7C)。使用上述条件,用3μg每种突变蛋白进行这些反应,用SDS-PAGE分析。这些蛋白的每种容易与10kDa和20kDaPEG试剂反应,产生单PEG化蛋白。也用上述方案制备40kDa-PEG-A3C。这个方案按比例放大以提供大量10kDa,20kDa和40kDa-PEG-A3C蛋白。

C.PEG化GM-CSF半胱氨酸突变蛋白的生物活性:我们纯化了足量的用5kDa PEG修饰的7种突变蛋白(*-1C,A1C,A3C,S5C,S7C,S69C和E93C)进行准确蛋白浓度和特异生物活性测定。TF-1细胞增殖试验测定7个纯化的5kDa-PEG-GM-CSF半胱氨酸突变蛋白。用Bradford染料结合试验确定蛋白浓度。所有PEG化GM-CSF半胱氨酸突变蛋白显示与野生型GM-CSF类似的剂量反应曲线并达到相同水平的最大生长刺激。PEG-GM-CSF半胱氨酸突变蛋白的平均EC50s范围80-123pg/ml(表14)。

表14

PEG化GM-CSF半胱氨酸突变蛋白的生物活性

a观察到的EC50范围,试验数在括号中。

TF-1细胞增殖试验测定10kDa,20kDa和40kDa-PEG分子修饰的A3C突变蛋白的生物活性。用Bradford染料结合试验确定蛋白浓度。每种PEG-A3C蛋白刺激TH-1细胞增殖。10kDa,20kDa和40kDa-PEG A3C半胱氨酸突变蛋白的平均EC50分别是78+/-3pg/ml,113+/-5pg/ml和300+/-50pg/ml(对于每个蛋白,N=4个试验)。

D. 10kDa,20kDa和40kDa-PEGs修饰的A3C表观分子量:用大小排阻HPLC(SEC),使用Biorad Bio-Sil SEC-400-5柱在Beckman System GlodHPLC上确定PEG化GM-CSF A3C蛋白的表观分子量。磷酸缓冲盐组成的等梯度(isocratic gradient)用作洗脱剂。基于凝胶过滤蛋白标准(BioRadLaboraories,Richmond,CA)的标准曲线,每个蛋白的停留时间用于计算分子量。PEG化蛋白相对于非PEG化GM-CSF,表观分子量显著增加(表15)。较大PEG比较小PEG提高了蛋白的表观分子量。记录PEG化GH、IFN-α2和G-CSF半胱氨酸突变蛋白的相似数据。

表15大小排阻层析测定的PEG化GM-CSF半胱氨酸突变蛋白的表观分子量

实施例17野生型鼠GM-CSF和鼠GM-CSF半胱氨酸突变蛋白的克隆、表达、纯化和生物活性我们从美国典型培养物保藏中心得到的小鼠EL4.IL-2细胞系(目录号#TIB-181)分离的总RNA进行RT-PCR,克隆并测序了编码成熟小鼠GM-CSF的cDNA。所述细胞在补充了10%FBS,50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM培养基中生长。RNA分离前,用1μg/ml PHA-L(Sigma-AldrichChemical Company,目录#L-4144)和10ng/ml PMA(Sigma-AldrichChemical Company,目录#P-1585),在10%FBS,50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM培养基中,37℃诱导所述细胞6或24小时。用购自Qiagen,Inc.(Santa Clarita,CA)的RNeasy Mini RNA分离试剂盒根据制造商的指导从细胞中分离RNA。用Boehringer Mannheim Corp的RT-PCR的第一条链cDNA合成试剂盒(AMV)和随机六聚体用作引物,完成单链cDNA的第一条链合成。用正向引物BB481[5>GCG AC GCG TAC GCA GCA CCC ACCCGC TCA CCC ATC ACT>3;SEQ ID NO:43]和反向引物BB482进行用第一条链合成产物作为模板的后续PCR反应。BB481与编码成熟小鼠GM-CSF前八个氨基酸的24个核苷酸退火,BB481也就在这个序列的5’端添加重叠编码上述实施例7和Picken等(1983)所述的大肠杆菌stII信号序列的羧基末端4个氨基酸的核苷酸。这11个核苷酸包括Mlu I限制性位点。BB482[5>GCG GAA TTC TTA TTT TTG GAC TGG TTT TTT GCA TTC AAA GGG>3;SEQ ID NO:44]与编码小鼠GM-CSF羧基末端十个氨基酸的核苷酸退火并紧接在编码序列后添加TAA翻译终止密码子和Eco RI限制性位点。6小时和24小时RNA样品产生GM-CSF RT-PCR产物。用Mlu I和Eco RI消化6小时RNA样品所得~400bp PCR产物,凝胶纯化并克隆到上面实施例8所述的pBBT227[pUC18::stII-G-CSF(C17S)]。用M1u I和Eco RI消化pBBT227DNA,碱性磷酸酶处理并在1%琼脂糖凝胶中泳动。纯化~2.4kb载体片段并用于连接。所得重组体携带与鼠GM-CSF融合的完整stII引导子,这个“stII-muGM-CSF”构建体可切割为~450bp的Nde I-Eco RI片段。具有正确序列的一个克隆(Gough等,1984)记做pUC18::stII-muGM-CSF或pBBT435。对于表达研究,pBBT435的Nde I-Eco RI片段亚克隆到上面实施例14所述的表达载体pBBT257。所得质粒pBBT257::stII-muGM-CSF或pBBT456导入大肠杆菌W3110进行表达。使用上面实施例14中所述的用于表达和纯化人GM-CSF的方案表达和纯化野生型小鼠GM-CSF。

使用如Innis等1990和Horton等(1993)和在上面其它实施例中一般所述的基于PCR的定点诱变可构建突变小鼠GM-CSF基因。在螺旋A最近的氨基末端区构建一个突变蛋白T3C。使用质粒pBBT435(实施例17所述)作为模板和正向引物BB504[5>GCG AC GCG TAC GCA GCA CCC TGC CGC TCA CCCATC ACT>3;SEQ ID NO:45]和反向引物BB482[5>GCG GAA TTC TTATTT TTG GAC TGG TTT TTT GCA TTCAAA GGG>3;SEQ ID NO:46],进行诱变PCR反应。BB504将成熟小鼠GM-CSF的3位苏氨酸ACC密码子变为半胱氨酸的TGC密码子。用Mlu I和Eco RI消化所得~400bp PCR产物,凝胶纯化并克隆进入用Mlu I和Eco RI消化的pBBT435,碱性磷酸酶处理并凝胶纯化。具有正确序列的一个克隆记做pUC18::stII-muGM-CSF(T3C)。对于表达研究,这个质粒的Nde I-Eco RI片段亚克隆到上面实施例14所述的表达载体pBBT257。所得质粒pBBT257::stII-muGM-CSF(T3C)或pBBT469导入大肠杆菌JM109进行表达。使用上面实施例14中所述的用于表达和纯化人GM-CSF的方案表达和纯化小鼠GM-CSF的T3C突变蛋白。

使用类似这里所述的和上面实施例9和15所述的步骤,人们可构建小鼠GM-CSF的其它半胱氨酸突变蛋白。半胱氨酸突变蛋白可以是半胱氨酸置换GM-CSF编码序列中天然氨基残基的置换突变,在小鼠GM-CSF编码序列的两个天然发生的氨基酸之间插入半胱氨酸残基的插入突变,或在小鼠GM-CSF编码序列的第一个氨基酸前添加半胱氨酸残基的添加突变,或在小鼠GM-CSF编码序列的末端氨基酸残基后添加半胱氨酸残基的添加突变。半胱氨酸残基可以置换小鼠GM-CSF编码序列任何位置中的任何氨基酸,或插入在任何两个氨基酸之间。置换或插入半胱氨酸残基的优选位点是螺旋A前区域、A-B环、B-C环、C-D环和螺旋D远端区。其它优选位点是A,B,C和D螺旋的最先和最后三个氨基酸。人们也可以通过另一个氨基酸置换GM-CSF中天然产生的正常形成二硫键的半胱氨酸残基之一,构建含有游离半胱氨酸的GM-CSF。正常与被置换的半胱氨酸残基形成二硫键的天然产生的半胱氨酸残基现在游离了。半胱氨酸残基可以被任何其它19个氨基酸取代,但优选丝氨酸或丙氨酸残基。也可以用如Sytkowdki等(1998)所述的步骤化学修饰天然产生的氨基酸,将游离半胱氨酸残基引入GM-CSF。

也可以使用实施例9和15所述步骤循序诱变循环或可供选择地通过将各个突变体体外重组以构建编码含两个或更多游离半胱氨酸残基的突变蛋白的重组表达质粒,可以构建含两个或更多添加的游离半胱氨酸残基的多变异体。优选的多变异体将是在PEG化时保持高,或完整,特异活性的两个或更多半胱氨酸突变蛋白组合。

使用类似实施例12-14,15和16描述的步骤,人们可表达、纯化、和PEG化小鼠GM-CSF突变蛋白并测定这些蛋白在体外生物试验和体内功效模型中的生物活性。蛋白可在大肠杆菌细胞质中表达或以分泌到周质间隙的蛋白表达。使用类似PCT/US00/00931中所述的步骤,或本领域技术人员熟知的相关步骤,突变蛋白也可在真核细胞如昆虫或哺乳动物细胞中表达。如果希望从真核细胞分泌,也可以用天然GM-CSF信号序列或另一个信号序列从真核细胞中分泌蛋白。

如上面实施例8和9所述可用NFS60细胞系,用细胞增殖试验检测纯化的小鼠GM-CSF野生型蛋白、半胱氨酸突变蛋白和PEG化形式半胱氨酸突变蛋白的生物活性。

用人WT-GM-CSF(实施例14-16)所述步骤,从大肠杆菌分离小鼠野生型GM-CSF和鼠T3C GM-CSF半胱氨酸突变蛋白,除了用30%硫酸铵使鼠蛋白结合在苯基Sepharose柱,而不是如人GM-CSF所述的15%。用上述用于人GM-CSF A3C半胱氨酸突变蛋白的步骤,小鼠T3C半胱氨酸突变体容易与10kDa,20kDa和40kDa PEG马来酰亚胺试剂PEG化。可如实施例8和9所述NFS60细胞增殖试验测定这些PEG化蛋白的生物活性。

实施例18野生型人红细胞生成素在大肠杆菌中的表达和纯化A.在大肠杆菌中通过分泌而表达红细胞生成素.用PCR从质粒pBBT358(见下)扩增编码野生型人红细胞生成素(Epo)的DNA,该质粒含有载体pBlueBac4.5(Invitrogen)中Epo基因,已经用于在昆虫细胞中表达Epo。PBBT358中的Epo基因与天然cDNA类似,除了在氨基酸84和85(成熟Epo的)密码子处有三个沉默突变,产生Xho I限制性位点利于诱变过程。

使用Horton等(1993)和PCT/US00/00931所述的“重叠延伸诱变”技术引入产生Xho I位点的三个突变。Xho I构建的原始或“最初”PCR反应在含1.5 mM MgCl2,每种引物0.4μM,dATP,dGTP,dTTP和dCTP每种200μM,1ng模板质粒pBBT132(野生型Epo-Flag基因克隆作为pUC19的BamHI-EcoR I片段,(PCT/US00/00931所述),2单位Taq铂(BRL),和0.25单位Pfu聚合酶(Stratagene)的1×Promega PCR缓冲液的50μl反应体积中进行Xho I构建的最初PCR反应。在Per kin-Elmer GeneAmp_PCR System 2400热力循环仪中进行反应。反应程序需要:95℃5分钟,25个循环的[94℃30秒,56℃30秒,72℃45秒],72℃保持7分钟和4℃保持。使用的引物对是[BB361xBB125]和[BB362xBB126]。BB361(5>GTTGGTCAAC TCGAGCCAGCCGTGGGAG>3;SEQ ID NO:79]与编码成熟Epo的氨基酸残基81-89的DNA序列退火。BB125(5>CTATGC GGCATCAGAGCAGATA>3;SEQ ID NO:17)与克隆的Epo序列下游pUC19载体序列~20bp退火。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中泳动,从胶中切除,使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen),根据卖主方案分离。接着,这两个诱变片段在随后或在第二次PCR反应中被“连接”在一起。在这个反应中,最初反应的凝胶纯化PCR产物每种0.3μl用作模板,BB125和BB126用作引物。反应体积是50μl,使用2.5单位Taq聚合酶和0.5单位Pfu聚合酶。否则,反应条件与在最初反应中使用的那些等同。琼脂糖凝胶电泳分析等份的第二次PCR且观察到期望的~190bp条带。根据卖主方案,使用QIA快速PCR纯化(Qiagen)“清除(clean-up)”第二次PCR反应的大部分,用Kpn I和Stu I(New England BioLabs)消化。使用QIA快速PCR纯化试剂盒另外清除后,消化产物与已经用Kpn I和StuI切割的pBBT138(野生型Epo-Flag基因作为pBlueBac 4.5中的BamH I-EcoRI片段克隆,(PCT/US00/00931))连接,牛小肠碱性磷酸酶(New EnglandBioLabs)处理并凝胶纯化。连接反应用于转化大肠杆菌并对所得转化体的质粒测序以鉴定含Xho I位点和全部~433bp Kpn I-Stu I片段的正确序列的克隆。这个克隆记做pBBT358。

对于与STII信号肽(指导成熟蛋白分泌到大肠杆菌周质的肽序列)融合的Epo的表达,用于PCR反应的寡核苷酸是BB583(5>CCAACGCGTACGCAGCCCCA CCACGCCTCATC3>;SEQ ID NO:46),它与基因N末端编码区退火。BB585(5>CCGGAATTCT TAACGGTCAC CTGTGCGGCAGGC>3;SEQ IDNO:47)或BB586(5>CCGGAATTCT TAGTCACCTG TGCGGCAGGC>3;SEQ IDNO:48),它与基因C末端编码区退火。BB585包括Arg166的密码子,由cDNA序列预测的C末端氨基酸,而BB586删除了Arg166密码子,编码C末端氨基酸Asp165。用Mlu I和Eco RI消化所得~600bp PCR产物并克隆进入类似消化的pBBT227(实施例9)载体以使得STII引导序列和野生型Epo的氨基末端编码序列融合。使用BB583和BB585的PCR形成的基因术语称作全长STII-Epo(STII-Epo-FL),使用BBS83和BB586的PCR形成的基因术语称作STII-Epo  des Arg(STII-Epo-dR)。具有正确序列的STII-Epo-FL和STII-Epo-dR克隆接着以Nde I-Eco RI片段亚克隆进入pBBT257(实施例14中描述)以分别产生pBBT477和pBBT478。

pBBT477和pBBT478转化JM109以产生株BOB578和BOB579。这些株,连同BOB490(pBBT257/JM109)在含10μg/ml四环素的Luria肉汤培养基(LB培养基)中,37℃在滚动管中过夜生长。饱和的过夜培养物在含10μg/ml四环素的LB培养基在A600稀释到~0.025O.D.,并在振荡瓶中37℃培养。典型地,25ml培养物在250ml振荡瓶中生长。当培养物的O.D.达到~0.3-0.5,加入IPTG使终浓度为0.5mM,以诱导Epo野生型或Epo des Arg166表达。对于最初实验,4和~19小时诱导后,抽样检查培养物。用预制的(precast)14%Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯兰染色分析样品。BOB578和BOB579的诱导培养物在大约20kDa出现条带,与野生型Epo分子量一致。在仅作为对照载体的BOB490的诱导培养物中没有检测到这条带。

B.Met-红细胞生成素在大肠杆菌细胞质中表达.如实施例18.A.所述,用PCR从含野生型Epo基因的质粒pBBT358中扩增编码野生型人红细胞生成素(Epo)的DNA。对于met-Epo在大肠杆菌周质中的表达,用于PCR反应中的寡核苷酸是BB584(5>TTCGCT AGCATG CAT GAC CTG CAG GAG GAA ATTTAA ATG GCC CCA CCA CGC CTC ATC 3>;SEQ ID NO:49),它与基因N末端的编码区退火,和上述的BB585(5>CCGGAATTCT TAACGGTCACCTGTGCGGCA GGC>3;SEQ ID NO:47)或BB586(5>CCGGAATTCT TAGTCACCTGTGCGGCAGGC>3;SEQ ID NO:48)。用Mlu I和Eco RI消化所得~600bpPCR产物并克隆进入类似消化的pBBT227(实施例9)载体以产生编码甲硫氨酰Epo的基因。使用BB583和BB585的PCR形成的基因术语称作全长met-Epo(met-Epo-FL),和使用BB583和BB586的PCR形成的基因术语称作met-Epo

des Arg(met-Epo-dR)。具有正确序列的met-Epo-FL和met-Epo-dR克隆接着以Nde I-Eco RI片段亚克隆进入pBBT257(实施例14中描述)以分别产生pBBT479和pBBT480。

pBBT479和pBBT480转化JM109以产生株BOB580和BOB581。这些株的表达实验连同BOB490(pBBT257/JM109)与上述用于STII-Epo构建体的相同。BOB580和BOB581的诱导培养物在大约20kDa出现条带,与野生型Epo分子量一致。在仅作为对照载体的BOB490的诱导培养物中没有检测到这条带。

实施例19红细胞生成素半胱氨酸突变蛋白的构建、大肠杆菌表达、纯化和生物活性A.Epo半胱氨酸突变蛋白的构建.在PCT/US00/00931,PCT/US98/14497和Innis等(1990)和White(1993)和这里提供的各个实施例中描述了使用基于PCR的定点诱变步骤的构建半胱氨酸突变蛋白的方法和半胱氨酸突变蛋白在EPO中的优选位点。此外,L80是半胱氨酸置换突变蛋白的另一个优选位点。

使用实施例18中所述的用于野生型EPO的步骤,可在大肠杆菌中表达重组红细胞生成素和红细胞生成素半胱氨酸突变蛋白。根据制造商指导,用B-per(Pierce)裂解细胞,离心分离不溶部分。用20mM半胱氨酸,6M胍,20mM Tris溶解沉淀。室温搅拌混合物1-2小时后用20m Tris,pH8,40μm硫酸铜,2%月桂酰肌氨醇1∶20(v/v)稀释。在4℃放置复性24-48小时。用在20mM Mes,pH5,0.01%Tween和20%甘油(缓冲液A)中平衡的S-Sepharose柱纯化重折叠EPO和EPO半胱氨酸突变蛋白。可用含线性梯度0-1M NaCl的缓冲液A从S-Sepharose柱洗脱EPO。如果需要,进一步纯化重组EPO的第二个柱包括SEC、Blue-sepharose、羟磷灰石或HIC树脂(苯基,丁基)。

实施例20二硫键连接的三聚体和二硫键连接的高度有序半胱氨酸突变蛋白多聚体的构建可如PCTIUS00/00931所述构建含一个以上“游离”半胱氨酸的GH变异体并用于产生高度有序二硫键连接的hGH多聚体。这种突变体可如实施例1和2和PCTIUS00/00931公开的在大肠杆菌中表达,重折叠和纯化。然后可如实施例1和2和PCTIUS00/00931所述利用后续加工步骤诱导二硫键形成。在这种条件下,有些具有一个游离半胱氨酸的hGH变异体,如T 3C,事实上定量转变为二硫键连接的二聚体。在相同或相似条件下,具有两个游离半胱氨酸的hGH变异体,如T3C和另一个半胱氨酸突变蛋白组合的双突变体,形成的分子间二硫键,将引起hGH分子聚合,这种聚合物链的长度原则上不受限制。仅具有一个游离半胱氨酸的hGH分子如T3C变异体和/或其它半胱氨酸突变蛋白到添加聚合反应可限制和在一定程度上控制链长度。增长的聚合物和仅具有一个游离半胱氨酸的分子之间二硫键形成将“覆盖(cap)”或防止新生的聚合物中两个聚合位点之一的进一步延伸。仅具有一个游离半胱氨酸的第二个hGH分子与新生的聚合物的另一聚合位点间的后续反应终止了聚合并锁定聚合分子的长度。反应物的化学计量法可控制聚合物平均长度,即含两个游离半胱氨酸的hGH分子与具有一个游离半胱氨酸的hGH分子的比率。比率较低对平均较短的聚合物有利和比率较高对平均较长的聚合物有利。从包含3个或更多游离半胱氨酸的hGH变异体与仅含一个游离半胱氨酸的hGH变异体的反应可构建更复杂的“支链”聚合物。

可用层析方法如大小排阻层析、离子交换层析、疏水相互作用层析等等随后纯化大小离散(discrete size classes)的某些聚合物。所述的用于GH的类似步骤可用于产生G-CSF、α干扰素、GM-CSF和其它蛋白的二硫键连接的二聚体和高度有序的多聚体。

实施例21野生型人Endostatin的克隆、表达和纯化A.克隆编码Endostatin的DNA序列.用PCR从人胎肝cDNA文库(Clontech)扩增编码Endostatin的cDNA。用正向引物BB383(5>GCTAACGCGTACGCACACAGCCACCGCGACTTCCAGCCG>3;SEQ ID NO:50)和反向引物BB384(5>CGGAATTCCTCGAGCTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCT>3;SEQ IDNO:51)进行PCR反应。引物BB383与人Endostatin的5’末端编码序列退火,反向引物BB92与Endostatin的3’末端编码序列退火。用Mlu I和Eco RI消化所得~600bp PCR产物并克隆进入类似消化的pBBT227(实施例9)载体以使得STII引导序列和人Endostatin氨基末端编码序列间融合。证实其序列后,用正向引物BB434(5′>GTGCACCATATGAAGAAGAACATCGCATTCCTGCTGGCTA GCATGCATGA CCTGCAGGAG GAAATTTAAA TGCACAGCCACCGCGACTTC>3′;SEQ ID NO:52)和BB384(SEQ ID NO:51)PCR扩增修饰基因进行细胞内表达。BB434融合甲硫氨酸(met)密码子到Endostatin氨基末端。用Nde I和Sac II消化所得630bp片段并克隆进入类似消化的上述STII-Endostatin-pUC18质粒。接着,具正确序列的met-Endoststin克隆(pBBT370)以Nde I-Eco RI片段亚克隆进入pBBT257(实施例14所述)产生pBBT371。

B.野生型met-Endostatin在大肠杆菌中表达.编码met-Endostatin野生型的pBBT371和亲本载体pBBT257转化大肠杆菌JM109产生株BOB460和BOB490,和转化W3110产生株BOB461和BOB340。这些株在含10μg/ml四环素的Luria肉汤培养基(LB培养基)中,37℃在滚动管中过夜生长。饱和的过夜培养物在含10μg/ml四环素的LB培养基稀释到A600为~0.025O.D.,并在振荡瓶中37℃培养。典型地,25ml培养物在250ml振荡瓶中生长。当培养物的O.D.达到~0.3-0.5,加入IPTG使终浓度为0.5mM,以诱导人met-endostatin表达。对于最初实验,诱导后0,4和~19小时,抽样检查培养物。用预制的14%Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯兰染色分析样品。BOB460和BOB461的诱导培养物在大约20kDa出现条带,与成熟人Endostatin的分子量一致。在BOB460和BOB461的未诱导培养物或仅作为对照载体的BOB490和BOB340的未诱导培养物中没有检测到这条带。~20kDa条带与购自Calbiochem的商业上制备的人Endostatin共同迁移。

实施例22人Endostatin半胱氨酸突变蛋白的构建、表达、纯化和生物活性A.Endostatin半胱氨酸突变蛋白的构建.用类似PCT/US00/00931,PCT/US98/14497和Innis等(1990)和White(1993)所述的基于PCR的定点诱变步骤构建十一个突变体人Endostatin基因。在氨基末端区(在Hoenester等(1998)中氨基酸残基计数是从计数的残基中减去130)构建四个突变蛋白[*-1C,H2C,R5C和F7C];和在编码基因中心周围序列编码残基的三个突变蛋白[G90C,G98C,和H112C];和在羧基末端区的三个突变蛋白[L154C,R157C和S162C]。在Endostatin活性位点内的残基构建一个另外的突变蛋白[R28C]。这在生物试验中可用作对照蛋白。

用于诱变PCR反应的模板片段来源是质粒pBBT370。用适当的限制性核酸内切酶消化PCR产物,用Qiagen PCR清除试剂盒提取并与已经用那些相同的限制性酶切割的pBBT370载体DNA连接,碱性磷酸酶处理和用QiagenPCR清除试剂盒提取。培养来自这些连接体的转化体,分离质粒DNAs并测序。确定完整克隆的诱变PCR片段的序列以证实存在目的突变和不存在PCR反应或合成寡核苷酸引物潜在可能引入的任何另外突变。

使用三个PCR扩增如下构建半胱氨酸置换突变*-1C。设计诱变的正向寡核苷酸BB531(5>GAGGAAATTT AAATGTGCCA CAGCCATCGC GACTTCC>3;SEQID NO:53)在N末端ATG甲硫氨酸密码子和第一个CAC组氨酸密码子之间插入TGC半胱氨酸密码子。这个寡核苷酸用于PCR#1中,还有编码Endostatin编码序列上游60bp内的pUC18载体序列退火的反向非诱变引物BB126(5>TGTGGAATTG TGAGCGGATA AC>3;SEQ ID NO:54)。这个PCR的模板是来自pBBT370的纯化的1264bp Nhe I-ApaL I片段。这个片段含有完整Endostatin编码序列和Endostatin基因上游670bp的pUC18序列,包括与BB126退火的序列。PCR#1是含1.5mM mM MgCl2,每种引物0.4μM,每种dATP,dGTP,dTTP和dCTP 200μM,0.5ng模板片段,1单位Taq聚合酶(Promega),和0.1单位Pfu聚合酶(Stratagene)的1×Promega PCR缓冲液的50μl PCR反应。反应在Perkin-Elmer GeneAmp_PCR System 2400热力循环仪中进行。反应程序需要:95℃5分钟,22个循环的『94℃30秒,55℃30秒,72℃45秒』,72℃保持7分钟和4℃保持。

使用与BB531反向互补的诱变反向寡核苷酸BB532(5>GGAAGTCGCGATGGCTGTGG CACATTTAAA TTTCCTC>3;SEQ ID NO:55),和与Nde I位点上游40bp的pUC18序列退火的非诱变引物BB125(5>CTATGCGGCA TCAGAGCAGAT>3;SEQ ID NO:17)进行PCR#2。PCR#2的模板是来自含完整Endostatin编码序列的pBBT370中纯化的990bp Ssp I-EcoRI片段和Endostatin基因片段5’末端Nde I位点上游的pUC18序列的367bp,包括与BB125退火的序列。PCR#2的成分和程序与PCR#1相同。琼脂糖凝胶电泳分析10μl等分试样PCR#1和PCR#2,发现每个都产生期望大小的单一片段。

PCR#3是使用非诱变引物BB125和BB126进行的50μl反应。这个PCR的模板是1μl PCR#1和0.3μl PCR#2。PCR#3的成分与反应1和2相同。反应程序需要:95℃5分钟,23个循环的『94℃30秒,56℃30秒,72℃1分钟』,72℃保持7分钟和4℃保持。琼脂糖凝胶电泳分析10μl等份PCR#3,发现产生了期望的740bp片段。用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)根据卖主方案“清除”反应剩余物,并根据卖主方案用Nhe I和BsrG I(New England BioLabs)消化。用QIAquick PCR纯化试剂盒另外的清除步骤后,消化产物与已用Nhe I和BsrG I消化的pBBT370连接,牛小肠碱性磷酸酶(New England BioLabs)处理并用QIAquick PCR纯化试剂盒“清除”。连接反应用于转化大肠杆菌JM109并对所得转化体的质粒进行测序。鉴定具有*-1C突变和全部~205bp Nhe I和BsrG I片段的正确序列的克隆。

使用用于*-1C的上述详细方案,除了使用不同的诱变寡核苷酸(表16),构建置换突变H2C,R5C,F7C和R28C(即将2位组氨酸变为半胱氨酸等)并证实序列。正向诱变寡核苷酸一直用于和反向非诱变引物BB126结合,1264bp的Nhe I-ApaL I片段作为模板,和反向诱变寡核苷酸一直用于和正向非诱变引物BB125结合,纯化的990bpSsp I-EcoRI片段作为模板。

表16用于构建Endostatin半胱氨酸突变蛋白的寡核苷酸突变  寡核苷酸方向  序列(5’>3’);粗体显示Cys密码子H2C   BB533   正向  GAGGAAATTTAAATTGCAGCCATCGCGACTTCCAGSEQ ID NO:56H2C   BB534   反向  CTGGAAGTCGCGATGGCTGCACATTTAAATTTCCTCSEQ ID NO:57R5C   BB535   正向  ATGCACAGCCACTGCGACTTCCAGCCGSEQ ID NO:58R5C   BB536   反向  CGGCTGGAAGTCGCAGTGGCTGTGCATSEQ ID NO:59F7C   BB537   正向  GCCACCGCGACTGTCAACCGGTGCTCCACSEQ ID NO:60

F7C   BB538  反向  GTGGAGCACCGGTTGACAGTCGCGGTGGCSEQ ID NO:61R28C  BB539  正向  CATGCGGGGCATCTGCGGCGCCGACTTCCAGSEQ ID NO:62R28C  BB540  反向  CTGGAAGTCGGCGCCGCAGATGCCCCGCATGSEQ ID NO:63G90C  BB543  正向  GGCTCTGTTCTCGTGCTCTGAGGGTCCSEQ ID NO:64G90C  BB544  反向  GGACCCTCAGAGCACGAGAACAGAGCCSEQ ID NO:65G98C  BB545  正向  CCGCTGAAGCCCTGCGCACGCATCTTCSEQ ID NO:66G98C  BB546  反向  GAAGATGCGTGCGCAGGGCTTCAGCGGSEQ ID NO:67H112C BB547  正向  GACGTCCTGAGGTGCCCGACCTGGCCCCAGSEQ ID NO:68L154C BB548  正向  GGCCAGGCCTCCAGCCTCTGCGGGGGCAGGCTCSEQ ID NO:69L154C BB549  反向  GAGCCTGCCCCCGCAGAGGCTGGAGGCCTGGCCSEQ ID NO:70R157C BB550  正向CTGCTGGGGGGCTGCCTCCTGGGCCAGAGTGCCGCGSEQ ID NO:71R157C BB551  反向  CGCGGCACTCTGGCCCAGGAGGCAGCCCCCCAGCAGSEQ ID NO:72S162C BB552  正向  CTCCTGGGGCAGTGCGCAGCGAGCTGCCATCSEQ ID NO:73S162C BB553  反向  GATGGCAGCTCGCTGCGCACTGCCCCAGGAGSEQ ID NO:74用类似*-1C所述的那些方法构建突变蛋白G90C和G98C,除了诱变寡核苷酸不同(表16)和PCR#3的模板是0.5μl PCR#1和0.5μl PCR#2.此外,“清除”后,用BsrG I和Bsu36 I(New England BioLabs)消化PCR#3,和另外的清除步骤后,消化产物与已经用BsrG I和Bsu36 I切割的pBBT370连接,牛小肠碱性磷酸酶(New England BioLabs)处理并用QIA快速PCR纯化试剂盒“清除”。

用类似*-1C所述的那些方法构建突变蛋白L154C,R157C和S162C,除了诱变寡核苷酸不同(表16)和PCR#3的模板是0.3μl PCR#1和1μl PCR#2.此外,“清除”后,用Bsu36 I和Eco RI消化PCR#3,和另外的清除步骤后,消化产物与已经用Bsu36 I和Eco RI切割的pBBT370连接,牛小肠碱性磷酸酶(New England BioLabs)处理并用QIA快速PCR纯化试剂盒“清除”。

用在几个方面与*-1C所述不同的方法构建突变蛋白H112C。首先,用于PCR#1的诱变正向寡核苷酸序列不同(表16)且反应体积是50μl而不是25μl。不进行PCR#2和PCR#3,因为它们不是必需的。反而,凝胶电泳分析10μl等份后,用与pCR#3正常处理非常相似的方法处理这个反应。就是说,根据卖主方案,用QIA快速PCR纯化“清除”反应剩余物并用Bsu36I和Eco RI(New England BioLabs)消化。用QIA快速PCR纯化试剂盒进行另外的“清除”步骤后,消化产物与已经用Bsu36 I和Eco RI切割的pBBT370连接,牛小肠碱性磷酸酶(New England BioLabs)处理并用QIA快速PCR纯化试剂盒“清除”。连接反应用于转化大肠杆菌JM109并对所得转化体的质粒进行测序。

B.Met-Endostatin的半胱氨酸突变蛋白在大肠杆菌中表达:每种具有正确序列的met-Endostatin半胱氨酸突变蛋白克隆以Nde I-EcoRI片段亚克隆进入pBBT257(实施例14所述)产生一组转化JM109产生用于表达研究株的表达质粒。

这些株在含10μg/ml四环素的Luria肉汤培养基(LB培养基)中,37℃在滚动管中过夜生长。饱和的过夜培养物在含10μg/ml四环素的LB培养基稀释到A600为~0.025O.D.,并在振荡瓶中37℃培养。典型地,25ml培养物在250ml振荡瓶中生长。当培养物的O.D.达到~0.3-0.5,加入IPTG使终浓度为0.5mM,以诱导该株特异性的Endostatin半胱氨酸突变蛋白表达。诱导前,诱导后4小时,和诱导后16小时,收集样品。用预制的14%Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯兰染色分析样品。每种Endostatin半胱氨酸突变蛋白的诱导培养物在大约20kDa出现条带,与成熟人Endostatin一致。在未诱导培养物和仅作为对照载体的BOB490的诱导和未诱导培养物中没有检测到这条带。~20kDa条带与购自Calbiochem的商业上制备的人Endostatin共同迁移。

C.endotatin和endostatin半胱氨酸突变蛋白的表达和纯化:离心使含表达野生型endostatin和endostatin半胱氨酸突变蛋白R5C的大肠杆菌沉淀并在-80℃冰冻。消融细胞沉淀并根据制造商(Pierce)方案用5mLB-PERTM细菌蛋白提取试剂处理。离心回收含大量endostatin蛋白的不溶物质并重悬于B-PER。用溶菌酶(200μg/ml)处理这个混合物10分钟以进一步破坏细胞壁,加入MgCl2(终浓度10mM)和无蛋白酶DNAse(2μg/ml)。离心收集不溶endostatin,并重悬于水中洗涤和再次离心,以去除大部分可溶的细胞杂质。为了重折叠,所得含不溶endostatin的沉淀溶于含20ml 8M尿素、10mM半胱氨酸的20mM Tris碱中。这个混合物在室温搅拌120分钟。加入半胱氨酸至终浓度10mM后,溶解物稀释到200ml冰冷3M尿素,40μM硫酸铜,20mM Tris,pH7.5。这个重折叠混合物在4℃缓慢搅拌3天。然后用稀释HCl将重折叠混合物的pH调至5.0并离心后填入在40mM磷酸钠pH5.0(缓冲液A)中平衡的5ml S-Sepharose柱(Pharmacia HiTrap)中。用从0-100%缓冲液B(500mM NaCl,20 mM磷酸钠,pH5.0)的线性盐梯度洗脱结合蛋白。混合主要含endostatin的S-Sepharose柱级分,其pH调至7.4后填入在20mM Tris,pH7.4中先平衡的肝素-Sepharose(Hitrap)柱。用0-1MNaCl盐梯度洗脱这个柱。混合并冰冻含纯endostatin的肝素柱级分。使用上述方案也已经部分纯化Endostatin半胱氨酸突变体G90C,G98C,H112C和R157C,省略肝素柱步骤。

用15×过量的5kDa PEG马来酰亚胺和10-15倍过量TCEP PEG化R5Cendostatin半胱氨酸突变蛋白。反应产生单PEG化R5C蛋白。

D.Endostatin生物活性:使用Kim等(2000)所述的MMP-2抑制试验,重折叠野生型重组endostatin和重折叠R5C endostatin半胱氨酸突变蛋白也显示出生物活性。

也可用内皮细胞增殖抑制试验测定蛋白的生物活性。内皮细胞增殖体外抑制可如下实施。五千个HMVEC-L细胞(Clonetics)可铺在凝胶化96孔培养板中并在100μl含bFGF的HMVEC-L培养基中培养(37℃,5%CO2)24小时。然后用20μl含endostatin、endostatin半胱氨酸突变蛋白或PEG化endostatin半胱氨酸突变蛋白的系列稀释物的培养基替换培养基,并培养20分钟。接着向孔中加入80μl含bFGF的新鲜HMVEC-L培养基。72小时后,可确定细胞数量。各种endostatin蛋白将抑制endostatin细胞增殖,如试验末内皮细胞数量的剂量依赖性降低所证明。

实施例23重组制管张素半胱氨酸突变蛋白的重折叠制管张素非糖基化时活性完全,因此不需要真核表达系统进行生产。可从人纤溶酶原cDNA模板(可从美国典型培养物保藏中心获得,Rockville,MD)PCR扩增由人纤溶酶原前四个kringle亚单位组成的人制管张素的编码序列。为了将蛋白转运到周质间隙,通过将细菌信号序列如来自STII或ompA蛋白的那些融合到成熟制管张素N末端,野生型制管张素和制管张素半胱氨酸突变蛋白可从大肠杆菌分泌。这个方法也已经成功用于制管张素的片段(Kringle(K)1,K2,K3,and K2-3,(Cao等(1996))。可供选择地,制管张素和制管张素半胱氨酸突变蛋白可在大肠杆菌或其它宿主细胞的细胞质中表达。制管张素具有形成13个二硫键的26个半胱氨酸。因此,不添加半胱氨酸阻断的常规重折叠方案将可能不能成功用于象制管张素的富含半胱氨酸的蛋白。半胱氨酸残基引入制管张素的优选位点包括K97C(半胱氨酸残基添加到成熟制管张素N末端),T365C,371C,S460C,A463C和*466C(半胱氨酸残基添加到成熟制管张素蛋白的C末端)。

如制造商方案(Poerce)用B-per可裂解表达重组制管张素或制管张素半胱氨酸突变蛋白的细菌细胞。可离心分离不溶部分。沉淀可用20mM半胱氨酸,6M胍,20mM Tρισ碱的混合物溶解。可在室温搅拌混合物2小时后用20mM Tris稀释10倍,重折叠物可在4℃保持1-2天。在这段时间末,可离心重折叠物并可使用赖氨酸-sepharose柱纯化制管张素蛋白(或半胱氨酸突变蛋白),重折叠物可直接填入先在20mM Hepes,0.15M NaCl,pH7.4中平衡的柱中。使用0-12mM E-氨基乙酸梯度,制管张素(或制管张素半胱氨酸突变蛋白)可从树脂中释放。如果需要,可使用各种离子交换或HIC树脂完成进一步纯化。

实施例24PEG化蛋白的肽作图(mapping)在很多情况下,肽图可用于证实PEG化位点。典型地,特异性消化PEG化蛋白,使得半胱氨酸突变蛋白以不含其它半胱氨酸残基的肽存在。PEG与肽共价连接的存在将显著地改变反相HPLC检测消化混合物时的截留时间。当使用文献中的条件(Clark等,1996),用胰蛋白酶消化GH时,可分离21个可能的胰蛋白酶肽(T1-T21,连续计数)。T1,代表包括突变T3C的残基1-8,半胱氨酸突变蛋白(61分钟)对野生型(64分钟)或垂体生长激素,截留时间稍提前。当用5K PEG PEG化时,T1肽移至层析图谱末,截留时间超过100分钟。当用内切蛋白酶Lys-C消化GH时,其代表残基1-38的10肽(L1-L10,连续计数)L1,对于野生型GH在大约59分钟和对于突变蛋白T3C在大约61分钟洗脱。当用20K PEG PEG化时,L1从层析图谱中消失。这些数据证明如预知的PEG部分确实是与3位半胱氨酸残基连接,而非天然半胱氨酸。PEG化前后,酶消化和RP HPLC分析IFN(胰蛋白酶和内切蛋白酶Glu-C),GM-CSF(内切蛋白酶Glu-C)和G-CSF(内切蛋白酶Lys-C)的半胱氨酸突变蛋白,也显示与在新引入的半胱氨酸残基PEG化的单一位点一致的数据。

实施例25PEG-G-CSF和PEG-GM-CSF半胱氨酸突变蛋白启动外周血祖先(progenitor)细胞活动(mobilization)已经表明用重组G-CSF和重组GM-CSF处理可使化疗后外周血祖先细胞(PBPC)活动,引起中性白细胞和血小板更快产生和移入(engraftment)。在PEG化G-CSF和PEG化GM-CSF存在下,估计PBPC活动(和潜在的移入速度)增强。一只一天或每天(达7天)静脉内或皮下给予髓细胞框架和增殖动力学已经很好定义的Spleenectomized小鼠株G-CSF(野生型或Neupogen_)或PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白。每个实验也可含一组仅用由小鼠血清白蛋白重悬于等渗盐水的载体处理的小鼠。处理后,心穿刺收集外周血并收集到含EDTA的管中。可进行CBC分析。冲洗股骨和骨髓内容收集骨髓细胞。用水晶紫罗兰(crystal violet)染色和血细胞计数器(enumeration)确定白细胞数量。用血密度梯度分级分离低密度细胞并用于祖先细胞试验。Briddwll等(1993)概述了祖先细胞试验方案。基本上,基于双层琼脂的系统(Bradley et al,1978)可用于估计原始(高增殖潜力集落形成细胞)和成熟(粒细胞-巨噬细胞集落形成细胞)祖先细胞。Iscove等(1974)开发的基于甲基纤维素的试验系统可用于估计类红细胞(erythroid)集落形成。PEG化G-CSF半胱氨酸突变蛋白将增加祖先和干细胞活动。可用PEG化GM-CSF半胱氨酸突变蛋白和野生型GM-CSF进行类似研究。最终,可研究在PEG化G-CSF和PEG化GM-CSF半胱氨酸突变存在下,致死照射小鼠的移植效率和加快移植过程的能力。

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尽管已经详细描述了本发明的各个实施例,很明显,本领域技术人员可进行那些实施例的变型和改动。然而,可以清楚地理解,这种变型和改动在本发明的范围内。

序列表<110>玛丽.罗森达尔(Rosendahl,Mary)乔治.考克斯(Cox,George)丹尼尔.多尔蒂(Doherty,Daniel)<120>含游离半胱氨酸残基的蛋白重折叠的方法<130>4152-4-PCT<150>60/204,617<151>2000-05-16<160>79<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>36<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>1cgcaagcttg ccaccatggc tggacctgcc acccag    36<210>2<211>36<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>2cgcggatcct ccggagggct gggcaaggtg gcgtag    36<210>3<211>66<212>DNA<213>人工的

<220>

<223>引物<400>3ggcccggcca gctccctgcc gcagagcttc ctgctgaaga gcctcgagca agtgcgtaag    60atccag                                                               66<210>4<211>30<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>4cgcgaattct tagggctggg caaggtggcg                                     30<210>5<211>66<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>5ggcccggcca gctccctgcc gcagagcttc ctgcttaagt gcctcgagca agtgcgtaag    60atccag                                                               66<210>6<211>63<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>6atgttcgttt tctctatcgc taccaacgcg tacgcaaccc cgctgggccc ggccagctcc    60ctg                                                                  63<210>7<211>66<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>7ccccctctag acatatgaag aagaacatcg cattcctgct ggcatctatg ttcgttttct    60ctatcg                                                               66<210>8<211>29<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>8cgccatatga ccccgctggg cccggccag                                      29<210>9<211>36<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>9accaacgcgt acgcaacccc gtgtggcccg gccagc                              36

<210>10<211>21<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>10gccatcgccc tggatcttac g                               21<210>11<211>36<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>11accaacgcgt acgcatgccc gctgggcccg gccagc               36<210>12<211>30<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>12cgcgaattct tagggacagg caaggtggcg                      30<210>13<211>21<212>DNA<213>人工的

<220>

<223>引物<400>13gccatcgccc tggatcttac g                      21<210>14<211>36<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>14cgcgaattct taacagggct gggcaaggtg gcgtag      36<210>15<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>15ccgctgggcc cgtgcagctc cctgccg                27<210>16<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>16cggcagggag ctgcacgggc ccagcgg                27

<210>17<211>22<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>17ctatgcggca tcagagcaga ta                      22<210>18<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>18ctgggcccgg cctgctccct gccgcag                 27<210>19<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>19ctgcggcagg gagcaggccg ggcccag                 27<210>20<211>27<212>DNA<213>人工的

<220>

<223>引物<400>20aacccgtacg catgtacccc gctgggc              27<210>21<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>21gcccagcggg gtacatgcgt acgcgtt              27<210>22<211>22<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>22tgtggaattg tgagcggata ac                   22<210>23<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>23ggaatggccc cttgcctgca gcccacc              27

<210>24<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>24ggtgggctgc aggcaagggg ccattcc                27<210>25<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>25gccctgcagc cctgccaggg tgccatg                27<210>26<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>26catggcaccc tggcagggct gcagggc                27<210>27<211>27<212>DNA

<213>人工的<220>

<223>引物<400>27ggtgccatgc cgtgcttcgc ctctgct                                         27<210>28<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>28agcagaggcg aagcacggca tggcacc                                         27<210>29<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>29ccggccttcg cctgtgcttt ccagcgc                                         27<210>30<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>30

gcgctggaaa gcacaggcga aggccgg                        27<210>31<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>31cccacccagg gttgcatgcc ggccttc                        27<210>32<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>32gaaggccggc atgcaaccct gggtggg                        27<210>33<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>33atgccggcct tctgctctgc tttccag                       27<210>34<211>27<212>DNA

<213>人工的<220>

<223>引物<400>34ctggaaagca gagcagaagg ccggcat                         27<210>35<211>21<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>35ggccattccc agttcttcca t                               21<210>36<211>24<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>36ttcgttttct ctatcgctac caac                            24<210>37<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物

<400>37ctgcaggccc tgtgtgggat ctccccc                  27<210>38<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>38gggggagatc ccacacaggg cctgcag                  27<210>39<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>39ctggaaggga tctgccccga gttgggt                  27<210>40<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>40acccaactcg gggcagatcc cttccag                  27<210>41<211>35<212>DNA

<213>人工的<220>

<223>引物<400>41cgcgctgcag ttctcatgtt tgacagctta tcatc                35<210>42<211>42<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>42cgcgctgcag atttaaatta gcgaggtgcc gccggcttcc at        42<210>43<211>38<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>43gcgacgcgta cgcagcaccc acccgctcac ccatcact             38<210>44<211>42<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物

<400>44gcggaattct tatttttgga ctggtttttt gcattcaaag gg           42<210>45<211>38<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>45gcgacgcgta cgcagcaccc tgccgctcac ccatcact                38<210>46<211>32<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>46ccaacgcgta cgcagcccca ccacgcctca tc                      32<210>47<211>33<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>47ccggaattct taacggtcac ctgtgcggca ggc                     33<210>48<211>30<212>DNA

<213>人工的<220>

<223>引物<400>48ccggaattct tagtcacctg tgcggcaggc                                     30<210>49<211>57<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>49ttcgctagca tgcatgacct gcaggaggaa atttaaatgg ccccaccacg cctcatc      57<210>50<211>39<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>50gctaacgcgt acgcacacag ccaccgcgac ttccagccg                          39<210>51<211>38<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物

<400>51cggaattcct cgagctactt ggaggcagtc atgaagct                            38<210>52<211>90<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>52gtgcaccata tgaagaagaa catcgcattc ctgctggcta gcatgcatga cctgcaggag    60gaaatttaaa tgcacagcca ccgcgacttc                                     90<210>53<211>37<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>53gaggaaattt aaatgtgcca cagccatcgc gacttcc                             37<210>54<211>22<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>54tgtggaattg tgagcggata ac                                           22<210>55

<211>37<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>55ggaagtcgcg atggctgtgg cacatttaaa tttcctc                 37<210>56<211>35<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>56gaggaaattt aaattgcagc catcgcgact tccag                   35<210>57<211>36<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>57ctggaagtcg cgatggctgc acatttaaat ttcctc                  36<210>58<211>27<212>DNA<213>人工的

<220>

<223>引物<400>58atgcacagcc actgcgactt ccagccg                        27<210>59<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>59cggctggaag tcgcagtggc tgtgcat                        27<210>60<211>29<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>60gccaccgcga ctgtcaaccg gtgctccac                      29<210>61<211>29<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>61gtggagcacc ggttgacagt cgcggtggc                      29

<210>62<211>31<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>62catgcggggc atctgcggcg ccgacttcca g                  31<210>63<211>31<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>63ctggaagtcg gcgccgcaga tgccccgcat g                  31<210>64<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>64ggctctgttc tcgtgctctg agggtcc                       27<210>65<211>27<212>DNA<213>人工的

<220>

<223>引物<400>65ggaccctcag agcacgagaa cagagcc                     27<210>66<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>66ccgctgaagc cctgcgcacg catcttc                     27<210>67<211>27<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>67gaagatgcgt gcgcagggct tcagcgg                     27<210>68<211>30<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>68gacgtcctga  ggtgcccgac ctggccccag                 30

<210>69<211>33<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>69ggccaggcct ccagcctctg cgggggcagg ctc                  33<210>70<211>33<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>70gagcctgccc ccgcagaggc tggaggcctg gcc                 33<210>71<211>36<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>71ctgctggggg gctgcctcct gggccagagt gccgcg              36<210>72<211>36<212>DNA<213>人工的

<220>

<223>引物<400>72cgcggcactc tggcccagga ggcagccccc cagcag                36<210>73<211>31<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>73ctcctggggc agtgcgcagc gagctgccat c                     31<210>74<211>31<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>74gatggcagct cgctgcgcac tgccccagga g                     31<210>75<211>21<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>75gacactgctg ctgagatgaa t                                21

<210>76<211>22<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>76cttgtagtgg ctggccatca tg                                           22<210>77<211>57<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>77cgcaacgcgt acgcagcacc ggcccgctcg ccgagcccga gcacgcagcc gtgggag    57<210>78<211>57<212>DNA<213>人工的<220>

<223>引物<400>78cgcgaattct tactcctgga ccggctccca gcagtcaaac gggatgacca gcagaaa    57<210>79<211>28<212>DNA<213>人工的

<220>

<223>引物<400>79gttggtcaac  tcgagccagc cgtgggag                  28

Claims (55)

1.制备不溶或聚集蛋白的重折叠可溶形式的方法,其中所述蛋白是生长激素超基因家族成员且含一个或多个添加的游离半胱氨酸残基,所述方法包括步骤:a.使宿主细胞表达含一个或多个添加的游离半胱氨酸残基的蛋白,所述蛋白是不溶或聚集形式的生长激素超基因家族成员;b.用化学方法、酶学或物理方法裂解细胞;c.使不溶或聚集的蛋白接触变性试剂、还原剂和半胱氨酸阻断剂而溶解和还原不溶或聚集的蛋白;和d.通过使变性试剂和还原剂的浓度降低到足以允许蛋白复性为可溶的生物活性形式的水平而重折叠蛋白,其中所述半胱氨酸阻断剂与该蛋白中的至少一个游离半胱氨酸残基形成可逆混合二硫化物。
2.权利要求1的方法,其中所述的生长激素超基因家族的成员由所述宿主细胞分泌。
3.权利要求1的方法,其中所述的生长激素超基因家族的成员由所述宿主细胞以细胞内蛋白表达。
4.权利要求1的方法,其中所述的裂解步骤(b)包括在步骤(c)所用的半胱氨酸阻断剂存在下裂解所述宿主细胞。
5.权利要求1的方法,其中所述的裂解步骤(b)包括在变性试剂存在下裂解所述宿主细胞。
6.权利要求1的方法,其中所述的裂解步骤(b)包括在变性试剂和步骤(c)所用的还原剂存在下裂解宿主细胞。
7.权利要求1的方法,其中所述的裂解步骤(b)包括:(1)裂解宿主细胞;和(2)将可溶蛋白与不溶或聚集蛋白分离。
8.权利要求1的方法,其中所述的半胱氨酸阻断剂选自:半胱氨酸、半胱胺、还原型谷胱苷肽或巯基乙酸。
9.权利要求1的方法,其中所述的半胱氨酸阻断剂是半胱氨酸。
10.权利要求1的方法,其中所述步骤(c)中所述的还原剂和所述的半胱氨酸阻断剂是同一种化合物。
11.权利要求10的方法,其中所述的半胱氨酸阻断剂选自:半胱氨酸、半胱胺、还原型谷胱苷肽或巯基乙酸。
12.权利要求1的方法,其中步骤(c)中所述的半胱氨酸阻断剂是当还原时作为半胱氨酸阻断剂的二硫酚。
13.权利要求12的方法,其中所述的二硫酚选自:胱氨酸、胱胺、氧化型谷胱苷肽或乙二硫醇酸。
14.权利要求1的方法,其中还原剂是二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇。
15.权利要求1的方法,其中所述步骤(d)中的重折叠包括在甘油存在下重折叠蛋白。
16.权利要求1的方法,其中重折叠的所述步骤(d)中包括在选自:氧、二硫酚、碘、过氧化氢、二氢抗坏血酸、连四硫酸盐或O-氧碘苯甲酸盐的氧化剂存在下重折叠蛋白。
17.权利要求1的方法,其中步骤(d)中的重折叠包括在金属离子存在下重折叠蛋白。
18.权利要求17的方法,其中所述的金属离子是Cu++或Co++。
19.权利要求1的方法,其中重折叠的所述步骤(d)中包括在步骤(c)所用的半胱氨酸阻断剂存在下重折叠蛋白。
20.权利要求1的方法,其中重折叠的所述步骤(d)中包括在变性试剂存在下重折叠蛋白。
21.权利要求1的方法,其中重折叠的所述步骤(d)中包括在二硫酚存在下重折叠蛋白。
22.权利要求21的方法,其中所述的二硫酚选自胱氨酸、胱胺、乙二硫醇酸或氧化型谷胱苷肽。
23.权利要求1的方法,其中所述步骤(d)中的重折叠发生在还原剂存在下。
24.权利要求23的方法,其中所述的还原剂是硫醇。
25.权利要求24的方法,其中所述硫醇选自半胱氨酸、DTT、2-巯基乙醇、还原型谷胱苷肽、半胱胺和乙二硫醇酸。
26.权利要求1的方法,其中所述的不溶或聚集蛋白是重组蛋白。
27.权利要求1的方法,其中所述的不溶或聚集蛋白是生长激素超基因家族成员的半胱氨酸变异体。
28.权利要求1的方法,其中所述的不溶或聚集蛋`是生长激素超基因家族成员的衍生物。
29.权利要求1的方法,其中所述的不溶或聚集蛋白是生长激素超基因家族成员的拮抗剂。
30.权利要求1的方法,其中生长激素超基因家族的成员选自:生长激素、催乳素、胎盘催乳素、红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12(p35亚单位),白介素-13、白介素-15、IL-19、IL-20、制瘤素M、睫毛神经营养因子、白血病抑制因子、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、ω干扰素、τ干扰素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、心肌营养素-1、巨噬细胞集落刺激因子、干细胞因子和flt-3配体,其中所述成员包括一或多个添加的游离半胱氨酸。
31.权利要求1的方法,其中所述的生长激素超基因家族的成员是生长激素。
32.权利要求1的方法,其中所述蛋白是生长激素的半胱氨酸变异体。
33.权利要求1的方法,其中所述的生长激素超基因家族的成员是α干扰素。
34.权利要求1的方法,其中所述蛋白是α干扰素的半胱氨酸变异体。
35.权利要求33或34任一项的方法,其中α干扰素蛋白是α干扰素α2。
36.权利要求1的方法,其中所述的生长激素超基因家族的成员是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
37.权利要求1的方法,其中所述蛋白是GM-CSF的半胱氨酸变异体。
38.权利要求1的方法,其中所述的生长激素超基因家族的成员是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
39.权利要求1的方法,其中所述蛋白是G-CSF的半胱氨酸变异体。
40.权利要求39的方法,其中所述的G-CSF半胱氨酸变异体含有置换半胱氨酸-17的非半胱氨酸的氨基酸。
41.权利要求40的方法,其中在所述G-CSF半胱氨酸变异体中置换半胱氨酸-17的氨基酸是丝氨酸或丙氨酸。
42.权利要求1的方法,其中所述生长激素超基因家族的成员是红细胞生成素。
43.权利要求1的方法,其中所述蛋白是红细胞生成素的半胱氨酸变异体。
44.权利要求1的方法,其中所述的生长激素超基因家族的成员是β干扰素。
45.权利要求1的方法,其中所述蛋白是β干扰素的半胱氨酸变异体。
46.权利要求45的方法,其中所述的β干扰素半胱氨酸变异体含有置换半胱氨酸-17的非半胱氨酸的氨基酸。
47.权利要求46的方法,其中在所述β干扰素半胱氨酸变异体中置换半胱氨酸-17的氨基酸是丝氨酸或丙氨酸。
48.权利要求1的方法,进一步包括将半胱氨酸反应部分与所述分离的蛋白中的至少一个添加的游离半胱氨酸连接形成半胱氨酸修饰的蛋白。
49.权利要求48的方法,其中半胱氨酸反应部分选自聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、碳水化合物或右旋糖苷。
50.权利要求1的方法,进一步包括将半胱氨酸反应性聚乙二醇部分与所述分离蛋白中至少一个添加的游离的半胱氨酸残基连接形成PEG化蛋白。
51.权利要求1的方法,进一步包括步骤:(e)将重折叠可溶蛋白与步骤(d)中的重折叠混合物中的其它蛋白分离。
52.共价修饰所述的根据权利要求51的方法制备的分离的重折叠可溶蛋白的方法,进一步包括步骤:(f)使分离的蛋白接触二硫化物还原剂;和(g)使所述蛋白接触半胱氨酸反应部分以得到半胱氨酸修饰的蛋白,其中所述半胱氨酸反应部分连接到所述分离蛋白中至少一个添加的游离的半胱氨酸。
53.权利要求52的方法,其中所述的半胱氨酸反应部分选自聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖苷或碳水化合物。
54.权利要求52的方法,进一步包括将半胱氨酸修饰的蛋白与未修饰蛋白分离。
55.根据权利要求1的方法制备的多聚体蛋白,包括至少两个蛋白,每个都具有至少一个添加的游离半胱氨酸且其中所述蛋白中至少两个通过所述添加的游离半胱氨酸彼此连接。
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