CN104203264A - 新型proNGF突变体及其在生产β-NGF中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及proNGF突变体及其用途，具体而言是proNGF突变体用于生产人β-NGF的用途。本发明公开了由无活性的不可溶的proNGF突变体制备生物活性的人β-NGF的方法。本发明的proNGF突变体在天然蛋白酶切割位点R1SK3R4处的至少位置R1和K3中被除了Arg或Lys以外的任何氨基酸取代，其中所述的位置R1和K3对应于所述的人野生型proNGF序列的位置101和103。

Description

新型proNGF突变体及其在生产β-NGF中的用途
技术领域
本发明涉及在天然蛋白酶切割位点处具有取代的新型proNGF突变体。本发明进一步公开了由无活性的不可溶的proNGF突变体来生产生物活性的人β-NGF的方法，及proNGF突变体用于生产人β-NGF的用途。
背景技术
神经生长因子(β-NGF)是在神经元(感知和交感的)的生长和存活中起关键作用的神经营养因子(Levi-Montalcini,R.,Science237(1987)1154；Thoenen,H.,etal.,Physiol.Rev.60(1980)1284；Yankner,B.A.,etal.,Annu.Rev.Biochem.51(1982)845)。β-NGF属于生长因子的半胱氨酸结超家族，假设其为稳定的二聚体蛋白质结构。此外，β-NGF促进中枢神经系统的类胆碱能神经元的生长、分化和活力(Hefti,F.J.,J.Neurobiol.25(1994)1418)。用于重组人神经生长因子的可行的治疗适应症包括外周感觉神经病变，例如与糖尿病有关或者在AIDS治疗中可能的副作用。用于β-NGF的其他适应症为中枢神经病变，例如Alzheimer病。在这种情况下，记忆丧失是类胆碱能神经元缺失的结果。此外，还发现β-NGF有效用于治疗人皮肤癌和角膜癌(Bernabeietal.Lancet1999；Lambiaseetal.NEJM1998)。此外，青光眼的试验动物模型中，β-NGF还显示保护视网膜细胞免于退化和细胞凋亡，以及在一些受青光眼影响的患者中改善视觉功能(LambiaseA,etal.PNAS2009)。
成熟的人β-NGF为118个氨基酸的蛋白质，其被翻译为前原蛋白由241个氨基酸组成。18个氨基酸的信号肽(前肽)在转移至内质网(ER)的过程中被切割。所得的前蛋白(proNGF)通过蛋白酶切割除去原序列而在其N-末端被加工。成熟的人NGF显示与啮齿动物(鼠科和大鼠)β-NGF具有高度的一致性(大约90％)。就临床研究或治疗用途而言，必须以高浓度提供β-NGF。小鼠的颌下腺是β-NGF的天然来源。但是，这些β-NGF的制备是不同二聚体的各种混合物，因此不适用于治疗用途。此外，理想的是给与患者人类形式的蛋白质。但是，在人类组织中，神经营养因子仅以低浓度存在。
原序列为区别于成熟蛋白质的结构域(参见图1中的序列数据，其中原序列以黑体表示)。这两个结构域通过暴露的蛋白酶切割位点而分离，其中所述的蛋白酶切割位点为位于人proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置101至104处的典型Arg-Ser-Lys-Arg的碱性氨基酸靶序列。该基元为丝氨酸内切蛋白酶成对碱性氨基酸蛋白酶的天然切割位点。此外，所述的切割位点可以通过其他合适的蛋白酶进行特异性的加工，优选的是在氨基酸精氨酸(Arg，R)之后具有底物切割特异性的蛋白酶。例如，蛋白酶胰蛋白酶在碱性氨基酸(例如赖氨酸(Lys，K)或精氨酸(Arg，R))之后进行切割。
用于由无活性原形式的β-NGF制备生物活性的β-NGF的方法是本领域公知的。例如，EP0994188Bl描述了由溶解度较低的无活性的原形式β-NGF制备生物活性的β-NGF的方法。根据该方法，β-NGF可由重组不可溶的无活性proNGF得到，其中所述的不可溶的无活性proNGF溶解于变性溶液中。之后，将溶解的proNGF转移至非或弱的变性溶液中。变性的proNGF假设为生物活性构造，这可通过天然β-NGF中存在的二硫键测定。随后，proNGF的原序列被切割，由此得到活性的β-NGF。
人proNGF包含天然蛋白酶(成对碱性氨基酸蛋白酶)切割位点Arg-Ser-Lys-Arg，因此具有以下序列基元：R1SK3R4。就特定的生产过程(例如需要“良好作业规范”(GMP)质量水平的那些)而言，诸如酶之类的材料必须以高品质提供。目前，蛋白酶成对碱性氨基酸蛋白酶并非为GMP级可利用的蛋白酶。
因此，选择备选的蛋白酶(胰蛋白酶(EC3.4.21.4))来切割proNGF，从而得到成熟的β-NGF蛋白质。丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶在碱性氨基酸精氨酸或赖氨酸的羧基一侧切割肽链。在人proNGF中，人proNGF中天然形成的切割位点包含具有碱性氨基酸的3个位置(SEQIDNO:1的位置101、103和104；在本文中备选地称为R1、K3和R4)。因此，通过胰蛋白酶切割proNGF可以根据切割发生的确切位点而得到多种不同的切割产物。典型的切割产物为SK3R4-β-NGF和R4-β-NGF、以及成熟的β-NGF。由于β-NGF蛋白质的二聚化将导致更多数量(至多达6种)的不均一的产物，这些产物必须在随后的步骤中纯化，所以该问题恶化(参见图2a)。
本发明潜在的技术问题及其解决方法
用于生产β-NGF的方法在现有技术中已经描述。但是，目前可利用的生产过程具有几个缺点，例如不均一的β-NGF产物和β-NGF的低产率。
使用胰蛋白酶切割野生型proNGF来生产β-NGF显示效率较低，这迫使使用极大量的酶以便得到足够产率的切割β-NGF。这具有多个缺点，它们都会影响随后的纯化过程。首先，其进一步降低了切割的选择性，这导致消化的多种产物。其次，必须将β-NGF由酶中纯化出来，这是因为所述的酶毫无疑问不能存在于最终的蛋白质样品中。这意味着多个纯化工序以除去大量的胰蛋白酶。因此，在现有技术的工序中将胰蛋白酶作为切割酶使用会导致β-NGF极低的产率或蛋白质的纯化问题。
本领域当然仍需要不具有上述缺点的生产β-NGF的方法。因此，本发明潜在的问题是提供以高品质、高效率和高产率来生产β-NGF的新方法。此外，本发明潜在的问题是提供β-NGF的生产过程，其得到高产率的β-NGF，并且是有效的、强力的、可升级的且可再生的。
本发明的优点是由新型的proNGF突变体来生产β-NGF。新型的突变体会得到产率良好的均一的β-NGF产物，这是因为新型的proNGF突变体会防止被蛋白酶不均一的消化并由此得到不均一的β-NGF产物。本发明的问题通过提供本发明的proNGF突变体以及通过本发明所述由该proNGF突变体来生产β-NGF的方法而得到解决。
与野生型相比，新型突变体使得在本发明的突变proNGF中的相关位点处，胰蛋白酶的切割效率意外且显著地增高。与野生型中使用的量相比，上述结果允许使用极低量的蛋白酶胰蛋白酶，结果使得由酶本身及由切割产物所产生的β-NGF的纯化问题减少。
上述问题得到解决并且优点通过独立权利要求的主题而取得。本发明的优选的实施方案包含在从属权利要求中，以及以下说明书、实施例和附图中。
上述概述不必描述本发明所解决的所有问题。其他问题以及解决方法在技术人员研究本申请之后可以是显而易见的。
发明概述
本发明的第一个方面涉及proNGF突变体，其中蛋白酶切割位点至少在R1和K3位置处被选自非碱性氨基酸和组氨酸的氨基酸所取代，其中所述的R1和K3位置对应于人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置101和103。
本发明的第二个方面涉及由无活性的不可溶的proNGF突变体来制备生物活性的人β-NGF的方法，其中所述的proNGF突变体至少在天然蛋白酶切割位点R1SK3R4的位置R1和K3处被取代，其中所述的位置R1和K3对应于人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置101和103，所述的额方法包括：(i)提供根据本发明的proNGF突变体；以及(ii)切割proNGF突变体，以得到活性的人β-NGF。
具体而言，本发明涉及以下过程：
a.将所述的proNGF突变体溶解于变性溶液中；
b.将proNGF突变体转移至重折叠溶液中，其中所述的变性proNGF假设为生物活性构造；
c.由所述的重折叠溶液纯化所述的proNGF突变体；
d.切割所述的proNGF突变体的原序列，从而得到活性的β-NGF。
本发明的第三个方面涉及proNGF突变体在制备人β-NGF中的用途，其中在人类野生型proNGF(SEQIDNO:1)的位置101至104处，至少天然蛋白酶切割位点R1SK3R4的位置101处的精氨酸和位置103处的赖氨酸被非碱性氨基酸取代。
本发明的另一个方面涉及药物组合物，其包含由proNGF突变体生产的β-NGF、以及可药用的载体或稀释剂，其中在人类野生型proNGF(SEQIDNO:1)的位置101至104处，至少天然蛋白酶切割位点R1SK3R4的位置101处的精氨酸和位置103处的赖氨酸被选自非碱性氨基酸和组氨酸的氨基酸取代。
本发明概述不必描述本发明所解决的所有特征。其他实施方案将通过随后的发明详述的观点变得显而易见。
发明详述
定义
在详细描述本发明之前，应该理解的是本发明不限于本文所描述的具体的方法学、方案和试剂，这些都是可以改变的。此外，应该理解的是本文使用的术语仅仅是为了描述具体的实施方案，并无意于限定本发明的范围，本发明的范围仅通过所附权利要求书来限定。除非另作说明，否则本文使用的技术和科学术语都具有本发明所属技术领域的任一普通技术人员通常理解的相同的含义。
在整个说明书及所附的权利要求书中，除非内容另外需要，否则词语“comprise”及其变体(例如“comprises”和“comprising”)都将被理解为暗示涵盖了所述的一个整数或步骤、或一组整数或步骤，但是不排除任何其他的整数或步骤、或一组整数或步骤。
在本说明书的整个内容中引用了多个文件(例如：专利、专利申请、科学出版物、说明书等)。本文所引用的这些文件均不能解释为承认本发明被之前现有技术所公开。
序列：本文所指的所有序列均在所附的序列表中公开，这些序列表及其全部内容和公开均为本说明书的一部分。
当术语“大约”与数值联合使用时，其是指涵盖了一定范围内的数值，所述范围的下限比所示的数值小5％，并且所述范围的上限比所示的数值大5％。
术语“proNGF”或“pro-NGF”是指原形式的人β-NGF。全部人proNGF序列在SEQIDNO:1中定义(图1a)。为了获得成熟的β-NGF，前肽proNGF必须被蛋白酶切割。β-NGF的原序列为区别于成熟的β-NGF的结构域。在这两个结构域之间，在SEQIDNO:1的位置101至104处具有天然的蛋白酶切割位点Arg-Ser-Lys-Arg(在本文中称为R1SK3R4，SEQIDNO:9)。可以通过合适的蛋白酶(具体为成对碱性氨基酸蛋白酶)特异性地加工切割位点。
术语“proNGF突变体”或“proNGF突变蛋白”是指通过氨基酸的取代对原形式的β-NGF进行的修饰。本发明的proNGF突变蛋白是至少在位置K3和R1(对应于野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置101和103)处，在天然蛋白酶切割位点R1SK3R4处(SEQIDNO:9)被选自非碱性氨基酸和组氨酸的氨基酸所取代。
在本发明优选的实施方案中，位置K3(对应于位置103)处的氨基酸赖氨酸被丙氨酸取代(参见图1d，SEQIDNO:4；图1e，SEQIDNO:5；图1g，SEQIDNO:8)。
在本发明的另一个优选的实施方案中，位置R1(对应于位置101)处的氨基酸精氨酸被缬氨酸取代(参见图1b，SEQIDNO:2；图1e，SEQIDNO:5；图1g，SEQIDNO:8)。
在本发明的另一个实施方案中，氨基酸精氨酸R4(对应于野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置104)还可以被任何氨基酸取代，其中所述的氨基酸允许通过蛋白水解切割对proNGF进行加工，从而得到β-NGF，优选的是碱性氨基酸，例如精氨酸或赖氨酸。例如，位置R4处丙氨酸的存在使proNGF免于被加工成β-NGF。因此，本发明的突变体不包含位置104处的丙氨酸。
表1.proNGF和proNGF突变蛋白的蛋白酶切割位点(x是指任何氨基酸，但是非Arg或Lys)
SEQIDNO: 蛋白酶切割位点(SEQIDNO:1的位置101和104)
1 RSKR(野生型)(SEQIDNO:9)
2 VSXR(SEQIDNO:10)
3 XSXR(SEQIDNO:11)
4 XSAR(SEQIDNO:12)
5 VSAR(SEQIDNO:13)
6 RXKR
7 XXXR(SEQIDNO:14)
8 VXAR(SEQIDNO15)
术语“非碱性氨基酸”是指不带正电荷的任何氨基酸。该术语是指除了碱性氨基酸以外的氨基酸残基。该术语排除了氨基酸赖氨酸或精氨酸，这两种氨基酸具有正电荷侧链。非碱性氨基酸为带负电荷的氨基酸谷氨酸和天冬氨酸、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)、具有疏水侧链的氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)、以及氨基酸半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸。
术语“生物活性的pro-NGF”或“具有生物活性构造的proNGF”等是指pro-NGF的生物活性。proNGF的生物活性构造是通过在天然β-NGF中形成的二硫化物桥而测定的。其活性可以根据例如Chevalieretal.1994,Blood83:1479-1485,1994所述的检测方法来测定，该文献以引用方式并入本文。实施例11描述了通过刺激TF1细胞的增殖来检测proNGF的生物活性的方法。
术语“β-NGF”是指成熟的β-神经生长因子，优选由人类获得。成熟的β-神经生长因子的序列示于图1中(SEQIDNO:1；SEQIDNO:2；SEQIDNO:3；SEQIDNO:4；SEQIDNO:5；SEQIDNO:7；和SEQIDNO:8)，由位置105处开始。
术语“β-NGF的活性”或“生物活性的β-NGF”等是指β-NGF的生物活性。生物活性的β-NGF以二聚体形式存在。β-NGF必须以二聚体形式存在以便具有生物活性的构造。β-NGF的生物活性构造的前提条件是与半胱氨酸结正确地形成二硫化物桥。其活性可以根据例如DRG检测方法(背根神经节检测方法)来测定，例如参见Levi-Montalcini,R.etal.,CancerRes.14(1954)49和Varon,S.etal.,Meth.inNeurochemistry3(1972)203。在这种检测方法中，通过轴突形成手段来监测由分散的背根神经节得到的感觉神经元的刺激和存活。
术语“取代”是指通过氨基酸的替代而对原形式的人β-NGF的修饰。该术语包括通过例如取代或将化学基团或残基加入到原始氨基酸中而对氨基酸进行的化学修饰。所选氨基酸的修饰步骤优选通过基因水平的诱变来进行。优选的是，就改变proNGF的DNA而言，通过基因工程改造方法来进行proNGF的修饰。该修饰为突变，其使得遗传物质的另一种核苷酸替代了单一的碱基核苷酸。点突变导致编码不同于野生型序列的氨基酸。优选的是，接着在原核或真核有机体(最优选的是在原核有机体中)中进行修饰proNGF蛋白质的表达。
术语动词形式的“变性”或名词形式的“变性”是指其中蛋白质的折叠结构被改变的过程。该术语是指proNGF或proNGF突变蛋白的未折叠的三级结构。折叠结构的改变是由于暴露于某些化学或物理因素。结果，蛋白质的一些原始性质，特别是其生物活性，被减弱或消除。由于变性过程，蛋白质变得无生物活性。此外，变性蛋白质可以展现出广泛的特征，包括生物功能的丧失、溶解度的丧失和/或发生聚集。
术语“重折叠”、动词形式的“复性”或名词形式的“复性”是指这样的过程，通过该过程，蛋白质的结构假设其天然功能折叠或构造。由于复性或重折叠过程，蛋白质变得具有生物活性。
术语“重组”是指将DNA克隆到载体中，以用于在合适的宿主中编码由该DNA编码的蛋白质。所述的宿主优选为原核生物，最优选的是细菌。如本文所用，“重组表达”是指在适用于表达重组蛋白的原核宿主细胞(例如E.coli菌株)中表达proNGF或proNGF突变蛋白。
术语“可溶的”是指易于溶解于一些溶剂中的蛋白质。
术语“不可溶的”是指不易于溶解于一些溶剂中的蛋白质。
发明描述
本发明的proNGF突变体
在本发明的第一个实施方案中，本发明提供了proNGF突变体，其中所述的蛋白酶切割位点R1SK3R4至少在位置R1和K3处被选自非碱性氨基酸和组氨酸的氨基酸取代，其中所述的位置R1和K3对应于人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置101和103。换言之，在人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置101至104处，至少天然蛋白酶割位点R1SK3R4的位置101处的精氨酸R1和位置103处的赖氨酸K3被除了精氨酸或赖氨酸意外的任何氨基酸取代。
在人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)中，天然蛋白酶切割位点是指氨基酸位置101至104(ArgSerLysArg，RSKR，SEQIDNO:9)。野生型proNGF序列的位置103处的氨基酸赖氨酸K3和位置101处的氨基酸精氨酸R1被除了Arg或Lys以外的任何氨基酸替代，从而得到性质改善的特别用于生产β-NGF的proNGF。为了实现上述确定的目标，即，产生特征改善的用于生产β-NGF的突变蛋白，可以通过所有天然形成的氨基酸、或人工氨基酸来取代精氨酸(R1)或赖氨酸(K3)，前提条件是它们不构成胰蛋白酶的切割位点。
根据本发明，对对应于残基101-103的一个或多个位置的氨基酸进行修饰可以是使用非碱性氨基酸替代碱性氨基酸的取代。这些取代可以用于创建根据本发明的特别用于生产β-NGF的proNGF突变体。突变体包括在至少位置Arg101和Lys103处的取代。氨基酸残基可以被非碱性氨基酸或组氨酸替代。具体而言，本发明的突变体可以具有取代Arg101Val和Lys103Ala。例如，所述的天然的非碱性氨基酸可以选自天然形成的氨基酸残基丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。
用于在位置101和103处进行取代的氨基酸并非选自碱性(正电荷)氨基酸精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)。此外，氨基酸异亮氨酸(He)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、半胱氨酸(Cys)、脯氨酸(Pro)或色氨酸(Trp)是不太优选的。丝氨酸(Ser)是在人proNGF野生型序列的位置102处天然形成的。位置102处的X(SEQIDNO:7和SEQIDNO:8)优选选自丝氨酸(Ser)，其是在人proNGF序列的位置102处天然形成的，但是还可以选自任何其他的氨基酸，其中所述的任何其他的氨基酸必须为非碱性氨基酸(即，非精氨酸或赖氨酸)。重要的是位置102处的氨基酸为非碱性的氨基酸(即，非Arg或Lys)。
野生型人proNGF序列的位置104处的氨基酸优选为精氨酸(Arg)，其是在人proNGF序列的位置104处天然形成的，但是还可以被允许通过蛋白水解切割对proNGF进行加工、从而得到β-NGF的任何其他的氨基酸取代，其中所述的任何其他的氨基酸优选为碱性氨基酸，更优选为赖氨酸。
例如，野生型人proNGF的位置104处丙氨酸的存在使proNGF免于被加工成β-NGF。因此，位置104处的Ala被排除。
表2概括了proNGF的蛋白酶切割位点使用的优选的取代。
表2A.野生型proNGF的位置101-104处的优选的氨基酸
星号(*)示出了在蛋白酶切割位点中天然形成的氨基酸(野生型proNGF，SEQIDNO:1)
在位置101、102和103处，氨基酸Cys,Pro,Phe,Trp,He和Leu是不太优选的取代。
表2B.野生型proNGF的位置101-104处的最优选的氨基酸
101 Val,Ala,Gly,Ser,Thr,Asn,Asp,Glu,Gin,Tyr,Met,His
102 Ser*,Val,Ala,Gly,Thr,Asn,Asp,Glu,Gin,Tyr,Met,His
103 Ala,Val,Gly,Ser,Thr,Asn,Asp,Glu,Gin,Tyr,Met,His
104 Arg*,Lys
必要的是在proNGF-突变蛋白的位置101、102和103处为除了Arg或Lys以外的任何氨基酸，并且在proNGF-突变蛋白的位置104处为碱性氨基酸(Arg或Lys)。令人惊奇显示在位置101和103处特异性的2种氨基酸的替代会高效率地生产β-NGF。
在本发明的最优选的proNGF突变体的序列(SEQIDNO:5)中，在人野生型proNGF的位置101处，最优选取代的氨基酸为Valin；在人野生型proNGF的位置103处，最优选取代的氨基酸为丙氨酸；在人野生型proNGF的位置102处，最优选取代的氨基酸为丝氨酸；以及在人野生型proNGF的位置104处，最优选取代的氨基酸为精氨酸。在本发明的特别优选的实施方案中，本发明提出的proNGF突变体具有对应于SEQIDNO:5的序列。
此外，本发明还涉及编码本文所述的proNGF突变体的核酸。
由本发明的proNGF突变体制备人β-NGF的方法
在第二个方面中，本发明涉及由无活性的不可溶的proNGF突变体制备生物活性的人β-NGF的方法，其中所述的突变体在人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置101和103(R1和K3)处的天然蛋白酶切割位点R1SK3R4中被取代(SEQIDNO:9)，所述的方法包括：提供在人野生型proNGF序列的位置101和103(R1和K3)处的天然蛋白酶切割位点R1SK3R4中被取代的proNGF突变体；以及切割所述的proNGF突变体，从而得到活性的人β-NGF。
优选的是，proNGF突变体是通过在原核细胞中重组表达而获得的。合适的细菌菌株是本领域公知的，例如E.coli、杆菌的菌种和沙门氏菌，并且用于此类表达系统的试剂盒是市售可得的。用于重组表达的优选的宿主细胞为E.coli，例如E.coliBL21、JM108/109(K12)、JM106、JM83和TBI或它们的衍生物。还可以使用适用于表达重组蛋白质的任何其他的E.coli菌株。
多核苷酸可操作地与表达控制序列连接，从而允许本发明的融合蛋白质在原核宿主细胞中表达。此类表达控制序列包括但不限于可诱导的及非诱导的启动子、操作子、阻抑物、以及本领域的技术人员已知的且驱动或以其他方式调节基因表达的其他元件。此类调节元件包括例如T7、TAC、PBAD、LAC启动子、Lacl、LacIQ阻抑物。
通过合适的载体，将proNGF突变体序列引入到原核宿主细胞中。合适的载体可以为但不包括例如：pBR322、pMAL、pUC19及所有衍生物。原核宿主细胞包括但不限于诸如细菌(例如E.coli或芽孢枯草杆菌(B.subtilis))之类的原核细胞，所述的宿主细胞可以被例如包含本发明的多核苷酸分子的质粒DNA、重组噬菌体DNA或cosminDNA表达载体转化。
在本发明的一个实施方案中，使用质粒载体。例如但绝不限于，可以使用EP1697523B1中所述的质粒载体(所述的文献以引用方式并入本文)。
为了表达proNGF突变蛋白，可以使用这样的表达载体，其包括：
a.指导转录的强启动子(例如tac或T7启动子)；
b.proNGF或proNGF突变蛋白的编码序列；
c.转录/翻译终止子(例如噬菌体λ的t0-终止子)；
d.第一选择标志物基因，例如编码抗生素抗性的基因(例如卡那霉素抗性，kan)；
e.第二选择标志物基因，例如编码proB和/或proA的基因；
f.阻抑物基因(例如lacI基因)；
g.高拷贝数的复制起点。
在本发明的一个实施方案中，专属表达载体(ScilProteinsGmbH，就合适的表达载体的结构而言，参见EP1697523B1)或市售可得的载体可以用于克隆。关于可以在本发明的方法中使用的载体的一般信息，优选的是上述提及的详述。但是，可以使用本领域已知的任何合适的载体。
作为转化原核宿主细胞使用的合适的载体的一个实例，专属表达载体pSCIL101的结构描绘如下：
proNGF突变体的制备方法包括以下原始步骤：
i.制备编码proNGF突变蛋白的核酸；
ii.将所述的核酸引入到原核表达载体中；
iii.将所述的表达载体引入到宿主细胞中；
iv.培养所述的宿主细胞；
v.使所述的宿主细胞经历合适的培养条件。
由于proNGF突变蛋白在原核宿主细胞中表达，所以该proNGF突变蛋白为无活性的不可溶的形式。
在优选的实施方案中，由根据本发明的proNGF突变体生产β-NGF的方法包括以下步骤：
a.通过包涵体的溶解作用，使proNGF突变体溶解于变性溶液中，其中所述的proNGF突变体在位置R1和K3处的天然蛋白酶切割位点R1SK3R4中被取代，其中所述的位置R1和K3对应于人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置101和103；
b.将proNGF突变体转移至重折叠溶液中，其中变性的proNGF假设为生物活性构造；
c.由重折叠溶液纯化出proNGF突变体；
d.切割proNGF突变体的原序列，从而得到活性的β-NGF。
在下文中，讨论由根据本发明的proNGF突变体生产β-NGF的方法的优选步骤。
步骤a：proNGF突变体的溶解作用
步骤a)对应于通过包涵体的溶解作用将proNGF突变体溶解于变性溶液中，其中所述的proNGF突变体在位置R1和K3处的天然蛋白酶切割位点R1SK3R4中被取代，其中所述的位置R1和K3对应于人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置101和103。注意步骤a)中的本发明的proNGF突变体由于在原核宿主中表达，所以为无活性的不可溶的形式。显示出较差的溶解度的无活性proNGF在原核细胞的胞质溶胶中的蛋白质的过表达过程中形成。在这种情况下，通过重组制备的proNGF以不可溶且聚集的形式保持在细胞质中。这些蛋白质聚集物、它们的分离以及纯化在例如Marston,F.A.,Biochem.J.240(1986)中有所描述。
为了分离这些无活性的蛋白质聚集物(包涵体)，发酵后将原核细胞破坏。细胞破坏可以通过常规方法实施，例如通过高压均化、超声波或溶菌酶的手段(Rudolph,R.,etal.(1997)；Foldingproteins.In:Creighton,T.E.(ed.):ProteinFunction:APracticalApproach.OxfordUniversityPress,pp.57-99)。
此外，包涵体被溶解。包涵体(IB)为普通缺陷或不完全折叠蛋白质的累积。在重组蛋白质过表达的情况下，包涵体在细胞内形成，例如细菌细胞，如E.coli。根据本发明使用的包含体优选包括proNGF突变蛋白。这意味着它们包含至少60、至少70、至少80或者至少90wt％pro-NGF(基于蛋白质的总量)。
本发明提供了生产pro突变蛋白的方法，其中作为非折叠的、无活性的不可溶的proNGF突变蛋白或其衍生物的包涵体溶解于变性缓冲剂(溶液)中。
步骤a)的变性溶液优选包含这样的溶液，该溶液包含(i)离散剂、(ii)螯合剂、(iii)缓冲剂和(iv)还原剂。
变性缓冲剂包含至少一种离散物质(试剂)。将有序的氢桥键溶解于水中的化学物质被称为离散的。由于氢桥键断裂开放，所以离散物质会干扰水结构并确保无序(熵增加)。其原因在于溶剂化所需的H2O笼结构的形成被阻止。在氨基酸的情况下，它们降低了疏水作用，并对蛋白质产生变性作用，这是由于蛋白质折叠的驱动力是将水中的疏水性氨基酸积聚在一起。通常，在溶解缓冲剂中赋予疏水作用并由此对蛋白质产生变性作用的任何物质都可以用作离散物质。离散物质通常为盐或低分子量化合物，例如尿素。离散物质完全不同于去垢剂，这是因为它们的分子中不含疏水性残基，例如烷基残基。通常，在凝血酶原的情况下，离散作用是通过改善蛋白质的溶解度而实现的。
在本发明的优选的实施方案中，离散化合物选自：胍盐(具体为盐酸胍和硫氰酸胍)、碘化物、钡盐、硫氰酸盐、尿素和高氯酸盐。
离散化合物以常规量使用。例如，可以使用4-8M盐酸胍或4-9尿素。
变性缓冲剂包含还原剂化合物，例如二硫化合物，如谷胱甘肽(GSH)。该二硫化合物能够与包涵体中多肽的半胱氨酸的巯基(-SH)形成混合的二硫化物。将二硫化物加入到所述的溶液中。二硫化物不能指明包涵体所包含的、且可能包含二硫化物桥的蛋白质。优选的是，二硫化物并非为真正的肽。优选的是，所述的二硫化物是低分子量的化合物。其分子量为例如低于2000g/mol或低于1000g/mol。可以使用浓度为例如5mM至1M、特别是10mM至0.5M的二硫化物。
在本发明优选的实施方案中，所述的二硫化物化合物为谷胱甘肽二硫化物。谷胱甘肽(GSH)也称为γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酰甘氨酸，是一种假三肽，其是由三种氨基酸(谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸)形成的。GSH存在于原核生物和真核生物的细胞质中，并与二硫化物桥的形成有关。其平衡形式为二聚体GSSG，该二聚体GSSG包含二硫化物桥。在二硫化物交换反应中，谷胱甘肽与得自两种多肽或得自单一多肽的半胱氨酸R-SH和R'-SH反应：
R-SH+GSSG→R-S-S-G+GSH。
RSSG被称为混合的二硫化物。其与多肽的其他半胱氨酸反应，结果在半胱氨酸之间得到二硫化物桥：
R-S-S-G+HS-R'→R-S-S-R'+GSH。
在胞质溶胶中，谷胱甘肽以还原形式(GSH)保持酶催化作用。因此，被称为胞质溶胶中的“还原条件”。在溶解缓冲剂中建立这样的条件下，使得其中所包含的二硫化物化合物根据上述反应催化二硫化物桥的形成。使用浓度例如为10mM至0.5M的GSSG。
备选地，可以使用半胱氨酸作为还原试剂(还原剂)。
在本发明优选的实施方案中，变性溶液为Tris缓冲剂。
变性溶液可以包含其他的常规添加剂，例如EDTA或盐。溶解缓冲剂的pH为例如7至10，优选为pH8。溶解作用优选地以机械方式协助，例如使用常规的均化仪器或通过超声波手段。在溶解作用后，优选的是将残余的固体分离出来。上清液包含溶解的pro-NGF。
在本发明的一个实施方案中，变性溶液包含：
i.胍盐-HCl，1-8M，优选为4-6M，最优选为4M；GSH或半胱氨酸，1-100mM，优选为5mM；
ii.Tris，0.01-1M，优选为0.1M；
iii.EDTA，1-50mM，优选为10mM；
iv.pH7.0-10.0，优选为pH8.0。
在多数情况下，浓度为4M的胍盐-HCl足以用于使proNGF突变蛋白完全变性。
步骤b：proNGF突变体的重折叠
在由包涵体得到的proNGF突变体溶解之后，必须使该蛋白质重折叠为其天然构造。就重折叠过程而言，重要的是使竞争反应、错误折叠和聚集最小。为了防止聚集，在极低的蛋白质浓度下进行重折叠，这是因为在高的蛋白质浓度下，蛋白质聚集是主要的。在步骤b)中，proNGF突变体被转移至重折叠缓冲剂中，其中变性的proNGF假设生物活性构造。可以通过在天然β-NGF中形成的二硫化物桥来测定生物活性构造。
在本发明优选的实施方案中，溶解的proNGF突变体在重折叠溶液中复性，其中所述的重折叠溶液包含至少一种分子伴侣、至少一种金属螯合剂和氧化还原改组系统。
在优选的实施方案中，根据本发明的方法在步骤b)中使用了重折叠溶液，该溶液包含：
i.分子伴侣，优选为精氨酸，0.5-1.0M，优选为0.75M；
ii.金属螯合剂，优选为EDTA，1-10mM，优选为5mM；
iii.氧化还原改组系统，为0.1-10mM，优选为1mML-半胱氨酸和5mML-半胱氨酸，或1mMGSSG(氧化的谷胱甘肽)和5mMGSH(还原的谷胱甘肽)；
iv.pH8.0-pH11.0，优选为pH9.5。
可以使用诸如Cystamin/Cysteamin之类的备选氧化还原改组系统。
在本发明优选的实施方案中，折叠助剂为精氨酸。促进蛋白质折叠的化合物通常可以用作“折叠助剂”。此类化合物是本领域的技术人员已知的。它们可以以多种方式帮助折叠。假设精氨酸会使不正确折叠的中间体不稳定，使得蛋白质至少部分再次解折叠(由热力学死端开始)，并由此可以再次正确地折叠。另一方面，甘油通常会稳定蛋白质。与未使用折叠助剂的方法相比，在根据本发明的方法中，将折叠的proNGF突变蛋白的绝对产率增加超过5、特别是超过10％或超过20％(基于折叠中使用的pro-NGF的总量)的化合物特别适于用作折叠助剂。
优选的是，在pH为8至11、特别是pH9.5的条件下进行重折叠。
为了增加折叠容器中蛋白质的浓度，进行脉冲复性。脉冲数量的限制是胍盐-HCl浓度，其不应该超过0.3M。与最终重折叠体积相关，蛋白质浓度/脉冲不应超过50μg/ml。
在本发明优选的实施方案中，将溶解物经过几天以多个级份或以连续的方式加入到折叠批次中。优选的是通过快速稀释于溶解物中，以“脉冲复性”的方式加入溶解物。就该内容而言，例如但不限于可以以例如24小时的时间间隔实施至少6次脉冲。设定脉冲数量，使得在加入溶解批次后，尚未折叠的蛋白质的浓度不太高，这是因为否则会得到聚集物。例如，各脉冲为0.05g/l至0.2g/l、优选为0.1g/l蛋白质最新转移至折叠批次中(基于加入溶解物后折叠批次中蛋白质的浓度)。例如，各重折叠步骤进行至少1-2h。
重折叠后，折叠反应物在加载到柱上之前，必须是澄清的。可以通过本领域已知的任何方法(例如过滤)来实现该目的。
在优选的实施方案中，用于生产正确折叠的pro-NGF突变体的方法包括以下步骤：a)将包含不可溶的proNGF突变体的包涵体溶解于上文所述的变性溶液中；以及b)然后，使溶解的pro-NGF在上文所述的重折叠溶液缓冲剂中复性。
在本发明优选的实施方案中，变性溶液和/或重折叠溶液最终不包含去垢剂。已经发现pro-NGF突变蛋白的溶解作用和/或折叠不必使用去垢剂。由于某些去垢剂是相对进攻性的化学物质，药物产物不应该包含或仅应该包含少量的去垢剂，并且必须以昂贵的方式除去，所以上述不使用去垢剂是有利的。因此，与Soejimaetal.,2001的方法相比，根据本发明的方法是有利的，在所述的文献中，所述的进攻性去垢剂(TritonX-100或Brij-58)用于折叠蛋白质。换言之，根据本发明的全部生产方法未使用去垢剂，因此本发明的生产方法不含去垢剂。
步骤c：通过层析方法纯化proNGF突变体
通过实施根据本发明的具有变性和随后的重折叠的方法，得到折叠的pro-NGF突变蛋白的水性溶液。接着，可以通过已知的方法进一步纯化折叠的pro-NGF突变蛋白。
在优选的实施方案中，通过层析纯化，具体通过混合模式的层析法，由重折叠(例如非或弱的变性)溶液纯化proNGF突变体(由本发明的proNGF突变体生产βNGF的方法的步骤c)。用于层析法的最优选的柱是具有合成亲和性配体(优选为4-巯基-乙基-吡啶，MEPHypercell；Pall)的柱。该介质的优点是结合与离子强度无关，盐堆积并非是必然的，并且加速所述过程的较高的流速是可行的。此外，通过pH-位移进行洗脱。
其他混合模式的材料柱是已知的并且可以使用。例如但不限于MEP(Pall；亲和配体为4-巯基乙基吡啶)、HEA(Pall；亲和配体：己基氨基)、PPA(Pall；亲和配体：苯丙氨基)、MBI(Pall；亲和配体：2-巯基-5苯并咪唑磺酸)、CaptoMMC(GEHC)、Captoadhere(GEHC；亲和配体：N-苯甲基-N-甲基乙醇胺)、CHT羟磷灰石(BioRad)、CHTfluoroapatide。MEP、HEA、PPA和MBI柱具有疏水结合，其中CaptoMMC为具有混合模式功能的阳离子交换剂，并且Captoadhere为具有混合模式功能的阴离子交换剂。BioRad柱为具有疏水成分的离子交换柱。此外，还可以使用此处未列出的任何其他混合模式的材料柱来纯化proNGF突变体。
步骤d：proNGF切割成β-NGF
ProNGF为β-NGF的前体。因此，在由本发明的proNGF突变体生产β-NGF的方法的步骤d)中，切割proNGF突变体的原序列，从而得到活性的β-NGF。
具有胰蛋白酶样底物特异性的蛋白酶会切割蛋白质，但不会消化蛋白质分子的活性部分。胰蛋白酶样蛋白酶会切割诸如精氨酸或赖氨酸之类的正电荷氨基酸之后的肽键。作为胰蛋白酶样蛋白酶，由多种丝氨酸蛋白酶(丝氨酸肽内切酶)被认为用于加工proNGF，而得到β-NGF。优选的是，色氨酸蛋白酶胰蛋白酶用于切割原序列，但是可以使用其他的蛋白酶。
注意切割不限于胰蛋白酶本身，而且还可以涉及具有胰蛋白酶样底物的其他蛋白酶。通常，如果对proNGF与胰蛋白酶(或其他蛋白酶)的比例适当地调整，则正确折叠的成熟的β-NGF将不会被该蛋白酶切割。相反，变性蛋白质及折叠中间体会暴露易于受到蛋白酶攻击的序列。
对于将proNGF突变体切割成β-NGF而言优选的是，胰蛋白酶(或其他蛋白酶)与proNGF突变体的比例为1:200-1:100.000，更优选的是1:5.000-1:20.000(根据重量)，最优选的比例是1:10.000(w/w)。在最优选的实施方案中，在室温下切割进行8-23小时，最优选的是18小时。在本发明使用的条件下，proNGF突变体被完全切割，并且几乎未形成副产物。未观察到聚集。
如实施例中清楚描述的那样，本发明人发现在本发明的proNGF突变体中引入的氨基酸修饰不仅避免了蛋白质在不需要切割位点处的切割，而且还意外地得到比野生型proNGF的胰蛋白酶大幅提高的切割效率，这允许在特定选择的条件下进行切割，从而得到非常纯的产物。
详细而言，试验数据清楚地显示在之前极低的胰蛋白酶/蛋白质比例(例如1:100.000)下，本发明的proNGF突变体(SEQIDNO:5)会以极高的切割产率(大约85％)得到极高纯度的重组人β-NGF。此外，在相同的胰蛋白酶/蛋白质比例下，野生型proNGF(SEQIDNO:1)显示较低的切割产率(大约5％)。满意的产率仅在非常高的胰蛋白酶/蛋白质比例(1/250)下火的，但是这是在低的选择性和高的产物降解(由于过度消化)下完成的。
步骤e：β-NGF的进一步纯化
例如通过多种层析方法进一步纯化由本发明的proNGF突变体生产的β-NGF。需要其他的纯化步骤将胰蛋白酶及胰蛋白酶消化的产物相关杂质与β-NGF分开。纯化步骤应该减少HCP、内毒素和DNA。可以使用本领域已知的用于蛋白质纯化的任何方法。最优选的是例如具有Sepharose柱(例如SPSepharoseHP、QSepharoseFF)的层析纯化。
就纯度而言，通过SDS-PAGE、rp-HPLC、SE-HPLC和IEX-HPLC分析由proNGF生产的终产物β-NGF。HPLC分析显示β-NGF的纯度为至少97％。
在本发明优选的实施方案中，适用于获得β-NGF的pro-NGF突变蛋白的生产方法包括以下步骤：
a)在原核细胞中表达具有取代的蛋白酶切割位点的重组pro-NGF突变体；
b)分离包含pro-NGF突变蛋白的包涵体；
c)将包涵体与合适的变性缓冲剂混合，其中所述的缓冲剂包含至少(i)离散物质，(ii)螯合剂，(iii)缓冲剂和(iv)还原剂；
d)在重折叠溶液中重折叠，其中所述的重折叠溶液包含至少分子伴侣、金属螯合剂和氧化还原改组系统；
e)纯化重折叠的pro-NGF突变体；
f)使用诸如胰蛋白酶之类的蛋白酶切割成活性形式的β-NGF；
g)β-NGF的分离和纯化。
用于生产β-NGF的proNGF的用途
在第三个方面中，本发明涉及本发明的用于生产人β-NGF的proNGF突变体的用途。
由本发明的proNGF突变体得到的β-NGF的药物组合物
在另一个方面中，本发明涉及包含β-NGF和可药用的载体的药物组合物，其中所述的β-NGF由proNGF突变体得到，所述的突变体在人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置101和103(K3和R1)处的天然蛋白酶切割位点R1SK3R4中被取代。
在本发明的一个实施方案中，通过基因治疗方法将药物活性的β-NGF给与患者。在基因治疗中，在编码β-NGF的基因存在的情况下，存在2种可利用的适用于将基因引入到患者中的基本方法。
在体外应用中，通过载体将编码β-NGF的药物活性基因引入到体细胞中，其中所述的体细胞优选为神经胶质细胞，接着通过例如微米粒子或纳米粒子将以这种方法处理的细胞再次引入到患者中。特别优选的是将β-NGF基因特定地整合到细胞基因组中。
在体内基因治疗中，通过载体(例如通过病毒)将β-NGF基因运输至肌体的靶细胞中，一方面，所述的载体可以影响靶细胞，由此能够引入药物活性的β-NGF基因，但是另一方面，所述的载体在靶细胞内不能复制它们。在该方法中，可以与细胞膜融合的纳米粒子或微米粒子(例如脂质体)也可以用作载体。
作为β-NGF基因的载体，其实例可以为能够特异性地感染宿主细胞或在靶细胞内与抗原发生免疫反应的病毒或抗体。作为病毒媒介，其实例可以为逆转录病毒。此外，可以使用基于腺病毒或牛痘的载体，例如经修饰的牛痘病毒Ankara(MVA)。
本领域的技术人员能够根据常规考虑选择合适的配方，并选择适用于将本发明的药物组合物给与患者的形式。例如，药物组合物可以包含一种或多种可药用的组分，例如载体或稀释剂。在这些种类的物质中，可以称为填料、盐、缓冲剂、稳定剂、渗透增强剂和其他公知的材料。用于配制本发明的药物组合物的技术可以在公知的标准教科书中找到，例如"Remington'sPharmaceuticalSciences",MackPublishingCo.,Easton,PA,最新版。
如果通过输注给药，则通过本发明所述的生产方法得到的β-NGF的剂量可以为0.1μg/kg至500μg/kg体重，如果通过注射给药，所述的剂量可以为2μg/kg至2mg/kg体重。
附图简述
图1示出了pro-NGF和本发明的pro-NGF突变体的序列。黑体字母所示的是原形式的人β-NGF的序列。黑体且下划线所示的是蛋白酶(胰蛋白酶)切割位点(SEQIDNO:1的氨基酸101-104；胰蛋白酶切割位点在氨基酸101-102(R1)、103-104(K3)和104-105(R4)之间)。序列中的X可以为任何的氨基酸。
图1a示出了具有蛋白酶切割位点RSKR(SEQIDNO:9)的人proNGF(SEQIDNO:1)的序列。
图1b示出了具有蛋白酶切割位点VSXR(SEQIDNO:10)的本发明的proNGF突变体(SEQIDNO:2)的序列。
图1c示出了具有突变为XSXR的蛋白酶切割位点(SEQIDNO:11)的本发明的proNGF突变体(SEQIDNO:3)的序列。
图1d示出了具有突变为XSAR的蛋白酶切割位点(SEQIDNO:12)的本发明的proNGF突变体(SEQIDNO:4)的序列。
图1e示出了具有突变为VSAR的蛋白酶切割位点(SEQIDNO:13)的本发明的proNGF突变体(SEQIDNO:5)的序列。
图1f示出了具有突变为XXXR的蛋白酶切割位点(SEQIDNO:14)的本发明的proNGF突变体(SEQIDNO:7)的序列。
图1g示出了具有突变为VXAR的蛋白酶切割位点(SEQIDNO:15)的本发明的proNGF突变体(SEQIDNO:8)的序列。
图1h示出了蛋白酶切割位点(SEQIDNO:6,9-15)的序列。
图2.proNGF或proNGF突变体加工成β-NGF。
图2a示出了野生型proNGF在胰蛋白酶切割之后的得到的6种β-NGF切割产物，其中所述的野生型proNGF具有天然的成对碱性氨基酸蛋白酶切割位点RSKR。附图清楚地示出野生型proNGF被切割成β-NGF，得到了多种不同切割产物的不均一混合物。
图2b示出了proNGF突变体SP174-101(SEQIDNO:5)在胰蛋白酶切割之后得到的天然β-NGF切割产物，其中所述的proNGF突变体SP174-101删除了天然的成对碱性氨基酸蛋白酶切割位点。蛋白酶切割位点RSKR(SEQIDNO:9)被2个氨基酸取代，得到位点VSAR(SEQIDNO:12)。该位点仅可以位置104处的氨基酸精氨酸之后由蛋白酶切割；胰蛋白酶仅可以切割1个切割位点(而非3个切割位点)。附图清楚地示出突变体proNGFSP174-101(SEQIDNO:5)被切割成β-NGF，得到了仅一种均匀的切割产物(β-NGF)。
图3示出了与野生型proNGF相比的proNGF突变体SP174-101(SEQIDNO:5)的重折叠。该附图比较了野生型proNGF(实线)及蛋白酶切割位点突变为VSAR的proNGF突变体(虚线)的重折叠产率。由该附图可以清楚地看出也生产和突变体proNGF的重折叠效率是相同的。
图4示出了通过MEPHyperCel柱对蛋白酶切割位点突变为VSAR(SEQIDNO:5)的proNGF突变体SP174-101的纯化。该附图示出了重折叠且过滤的proNGF突变体的MEPHyperCel纯化的洗脱概况。
图5示出了胰蛋白酶对蛋白酶切割位点突变为VSAR(SEQIDNO:5)的proNGF突变体SP174-101切割。该附图示出了胰蛋白酶切割级份的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶。在泳道4-7可以看到proNGF突变体的胰蛋白酶切割产物。该附图清楚地示出了经纯化的proNGF突变体得到仅一种切割产物(β-NGF)。
图6示出了β-NGF的纯化。该附图示出了在胰蛋白酶切割后SPSepharoseHP柱的概况。将胰蛋白酶消化反应物加载到SPSepharoseHP柱上。在3个步骤中进行洗脱(a.25％25mM磷酸钠，1MNaCl，pH6.5(缓冲剂B)；b.线性梯度的25-50％缓冲剂B；以及c.100％缓冲剂B(流速为60cm/h))。
实施例
提出以下实施例以便为本领域的普通技术人员提供本发明的组合物的制备和使用方法的完整公开和描述，并无意于限定本发明人所认定的范围。努力确保关于使用数目的准确性，但是一些试验误差和偏差应该被考虑在内。除非另作说明，否则分子量为平均分子量，温度为摄氏度，而压力为处于或接近大气压。
实施例1.野生型proNGF在位置101至104处的蛋白酶切割位点(R1SK3R4)中的取代
通过本领域的某些技术人员已知的方法，使用合成的基因在DNA水平上实现精氨酸R1和赖氨酸K3的取代，其对应于人pro-NGF(SEQIDNO:1)的位置101和103。位置102处的丝氨酸或者保持未变，或者通过本领域的某些技术人员已知的方法，使用合成的基因在DNA水平上实现人pro-NGF(SEQIDNO:1)的位置102上的取代。对应于位置104上的赖氨酸K4未被取代。序列示于图1中。
实施例2.proNGF突变体SP174-101(SEQIDNO:5)在原核细胞中的重组表达
用于表达r/i-proNGF(DSMZ5585；FthiA(lac-pwAB)endAlgyrA96relAXphxhsdRXlsupE44recA)的细菌宿主E.coliJM108是脯氨酸营养缺陷型，其通过使用命名为pSCIL101的质粒而被中和。质粒pSCIL101基于质粒pSCIL008(参见WO05061716)。所述的菌株不能合成硫胺(Vieira&Messing,1982Gene.Oct；19(3):259-68)。SEQIDNO:5中所示pro-NGF突变体在位于pSCIL101上的tac启动子的控制下表达。在此使用的载体pSCIL101为卡那霉素抗性的高拷贝质粒。在规定的矿物盐介质中进行表达，并通过加入IPTG进行诱导。pro-NGF突变体以包涵体(IB)形式沉积在胞质溶胶中。
细胞系：
·宿主菌株，例如E.coliHMS174(K12)或JM108(K12)；
·pro-NGF突变体SP174-101(SEQIDNO:5)；
·Tac启动子(IPTG诱导)；
·ColEl复制子；
·卡那霉素抗性；
·proBA选择；
·专属载体系统pSCIL101(例如参见WO05/061716)。
实施例3.发酵
该发酵的目的是获得用于随后工艺步骤的产物和生物质。为了监测靶蛋白在发酵过程中的过表达，在诱导前和诱导后通过SDS-PAGE来分析样品。
·不具有抗生素的矿物盐介质；
·批次期μ≈0.25h-1(ODend＝18)；
·批料阶段I：指数供料，μset＝0.18h-1；
·批料阶段II：常速供料；
·诱导时点Odind＝60±5；
·1.0mMIPTG；
·诱导时间5h；
·最终OD＝82±4；
·处理时间28.5±1.25；
·质粒稳定性10^％；
·产率：40mg/gproNGF；1,2g/L±0.2g/LproNGF。
实施例4.包含SP174-101的包涵体的初步回收
在细菌细胞中，重组蛋白质以聚集物的形式存在。pro-NGF突变蛋白的表达以IB形式进行。根据标准的方案进行细胞破裂和IB制备，并且可以在试验室规模发展至大约200g生物质下实施。根据Rudolph,R.,etal.(1987)；Foldingproteins.In:Creighton,T.E.(ed.):ProteinFunction:APracticalApproach.OxfordUniversityPress,pp.57-99,以及根据EP0994188B1，制备包含proNGF突变蛋白的那些“包涵体”。就细胞破裂而言，将细胞团重新悬浮于合适的缓冲剂中，随后使用高压均化，在50mM磷酸钠pH7.0、1mMEDTA中破裂细胞。
实施例5.将proNGF突变体SP174-101溶解于变性溶液中(包涵体溶解)
将包涵体溶解于变性溶液中，所述的变性溶液包含溶液(i)离散剂，(ii)螯合剂，(iii)缓冲剂，和(iv)还原剂。就溶解而言，在浓度范围为4.0-6.0M下测定胍盐HCl(GuaHCl)。将溶解缓冲剂以不同比例与包涵体浆料(IB浆料)混合。所有试验的最终半胱氨酸浓度均为5mM，并且均在室温下实施。通过SDS-PAGE分析结果(数据未示出)。本试验表明浓度为4M的GuaHCl足以用于完全溶解包涵体。包涵体浆料与缓冲剂的比例为1±1.25(v/v)(IB浆料:缓冲剂)。用于稳定包涵体的变性溶液的最终浓度为：
i.4M胍盐-HCl；
ii.0.1MTris；
iii.10mMEDTA；
iv.5mM半胱氨酸；
v.pH8.0。
根据标准的程序，通过滤床过滤使溶解物澄清。
接着，使用Bradford的方法(Bradford,M.M.,Anal.Biochem.72(1976)248)测定蛋白质的浓度。proNGF突变蛋白的蛋白质浓度为10-20mg/ml。
实施例6.将proNGF突变体SP174-101转移至重折叠缓冲剂中，其中变性proNGF假设生物活性构造
在溶解后，必须使蛋白质重折叠成为其天然的构造，并由此使错误折叠和聚集最小。为了由溶解的材料制备根据本发明的生物活性的proNGF突变蛋白，将它们稀释至重折叠溶液中，其中proNGF假设生物活性构造。
基于IB浆料的用于溶解物的最终重折叠溶液包含：
i.0.75M精氨酸；
ii.5mMEDTA；
iii.1mML-半胱氨酸和5mML-半胱氨酸；
iv.pH9.5。
通过成熟人β-NGF中形成的二硫化物桥的情况来证明活性构造的NGF的获得情况。
为了增加重折叠过程中蛋白质的浓度，进行脉冲复性。以每小时每50μg/mlproNGF突变体蛋白质给与脉冲。溶液中胍盐-HCl的浓度不应超过0.3M。为了达到上述目的，需要15次脉冲。将澄清的重折叠级份过滤，然后加载到其他的柱上。
通过rp-HPLC，在每次脉冲之后分析重折叠反应的进行情况。将所得的峰面积对脉冲数量绘制点图。对于rp-HPLC而言，使用具有保护柱(例如214GK54；300A；Vydac)的反相柱(例如214MS54，4.6x250mm；300A，5μιη，Vydac)。运行缓冲剂为具有0.05％三氟乙酸(TFA)的H2O和具有0.05％TFA的乙腈。流速为1ml/min。结果示于图3中。由图3可以看出野生型和突变体proNGF的重折叠效率是相同的。
实施例7.通过混合模式材料柱由重折叠溶液纯化出proNGF突变体SP174-101
可以使用具有合成亲和配体(4-巯基-乙基-吡啶(MEP))的柱。通过位移pH值而进行洗脱。此外，在低盐浓度下进行洗脱，这对于有效的工艺设计而言是有利的。
使用0.75MArginine、5mMEDTA,pH9.5平衡柱。将澄清的重折叠反应物加载到MEPHyperCel柱(Pall)上，其最大加载能力为5gproNGF突变体/L柱介质。在洗涤步骤中，通过使用缓冲剂2MGuaHCl、0.1MTris-HCl,pH8.0和10mMTris-HCl,pH8.0废弃大部分的杂质和未结合的蛋白质。由0-70％50mM乙酸盐,pH4.0(流速为120cm/h)以线性梯度进行洗脱。图4示出了其蛋白酶切割位点突变为本发明的VSAR(SEQIDNO:5)的、重折叠且过滤的proNGF突变体的MEPHyperCel纯化洗脱概况。在GuaHCl洗涤步骤中，许多杂质被除去。在“池”中，大约60-70％的proNGF突变体被回收。
实施例8.切割proNGF突变体SP174-101，从而得到活性的β-NGF
就proNGF突变体经胰蛋白酶消化成β-NGF而言，使用此类磷酸盐缓冲剂，其不会显示出蛋白酶活性。将磷酸钠缓冲剂加入到MEP洗脱液中，最终浓度为25mM磷酸钠。将pH值调节至pH6.5。就蛋白质水解而言，以1:10000(w/w)(胰蛋白酶:proNGF)的比例加入胰蛋白酶(Roche,GMP级)。在室温下，使用18h的温育时间进行蛋白质水解。通过SDS-PAGE、rp-HPLC和UV/VIS280nm分析胰蛋白酶消化的进行情况和产率。图5示出了胰蛋白酶切割级份的SDS-PAGE。使用4-12％Bis/Tris-Gel,1mm,lxMES作为运行缓冲剂(Invitrogen)。泳道5-7示出了与未切割的proNGF突变体(rhproNGF*，参见泳道3)和成熟β-NGF(NGF；参见泳道8)相比较的胰蛋白酶切割产物。该附图清楚地示出纯化的proNGF突变体会得到仅一种切割产物(β-NGF)。可以观察到proNGF完全消化成β-NGF。
实施例9.活性β-NGF的纯化
在胰蛋白酶消化后，将β-NGF加载到SPSepharoseHP柱上，以耗尽胰蛋白酶、切割副产物和其他杂质。SPSepharoseHP纯化示于图6中。
使用25mM磷酸钠缓冲剂(pH6.5)平衡柱。将胰蛋白酶消化反应物加载到SPSepharoseHP柱上(2gβ-NGF/L介质)，并使用平衡缓冲剂洗涤未结合的蛋白质。在3个步骤中进行洗脱(3cv25％25mM磷酸钠，pH6.5(缓冲剂B)；10cv线性梯度的25-50％缓冲剂B；以及3cv100％缓冲剂B(流速为60cm/h))。
图6示出了β-NGF的纯化。该附图示出了在胰蛋白酶切割后SPSepharoseHP柱的概况。β-NGF的产率为85-95％(峰为“样品洗脱”)。
实施例10.胰蛋白酶对突变体SP174-101和野生型proNGF的切割效率
对proNGF突变体SP174-101(SEQIDNO:5)和人野生型proNGF(SEQIDNO:1；rhProNGF)平行实施该程序。
针对25mM磷酸盐缓冲剂pH6.5透析5mL纯化的rhProNGF。透析后，
通过HPLC-UV测量蛋白质的浓度为0.08mg/mL。根据消化样品，使用80μgproNGF。在蛋白质水解后，通过HPLC-UV分析所有样品。
使用质量比为1/10.000w/w的胰蛋白酶/rhProNGF突变体，同时使用不同质量比的胰蛋白酶/rhProNGF野生型(参见表3)。按照1.0μg/mL和10μg/mL使用胰蛋白酶溶液。在室温下过夜温育(大约17小时)后，分析所有样品。此外，还温育未加入蛋白酶的鼠海豚rhProNGF突变体作为对照。
表3
使用Vydac214MSC4柱，通过HPLC-UV分析所有胰蛋白酶消化的进行情况和产率。
表4示出了胰蛋白酶消化后得到的切割产率。试验数据清楚显示使用极低的胰蛋白酶/蛋白质比例(1/10000)，使用胰蛋白酶切割proNGF突变体SEQIDNO:5以高的切割产率(大约85％)得到仅一种产物(β-NGF)。这可以与野生型proNGF(SEQIDNO:1)的切割相比，其显示在低的胰蛋白酶/蛋白质比例(1/10000)下，切割产率低(仅大约5％)，而在高的胰蛋白酶/蛋白质比例(1/250)下，产物降解高(过度消化)。
表4
实施例11.通过刺激TF1细胞的增殖来测定proNGF的生物活性
根据标准的程序培养TF1细胞(ATCC,目录nr.CRL2003)。将测定介质(90％RPMI1640培养基，10％胎牛血清FBS，50U/ml盘尼西林和50μg/ml链霉素)加入到细胞中并离心。在37℃下，将细胞团以1.5x105细胞/ml的密度重新悬浮于测定介质中。将细胞悬浮物与不同浓度(10-10M,3x10-10M,10-9M,3x10-9M,10-8M,3x10-8M,10-7M,3x10-7M,10-6M,3x10-6M,10-5M和3x10-5M)的proNGF蛋白质混合，并在96孔板中分析。在37℃下温育48h后，加入细胞增殖试剂(例如WST-1,RocheAppliedScience,catno.1644807)，并将平板在37℃下再次温育4h。在450nm下测量吸光度，并通过使用合适的程序测定Ecso值(z.Bsp.Sigma-Plot2000)。

Claims (36)

1.一种proNGF突变体，其中蛋白酶切割位点R1SK3R4至少在位置R1和K3被选自非碱性氨基酸和组氨酸的任何氨基酸取代，所述的位置R1和K3对应于人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置101和103。
2.根据权利要求1所述的proNGF突变体，其中所述的蛋白酶切割位点在位置101和103处被除了精氨酸或赖氨酸以外的任何氨基酸取代。
3.根据权利要求1所述的proNGF突变体，其中所述的蛋白酶切割位点在位置101和103处被选自以下的任何氨基酸取代：丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、组氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、半胱氨酸和脯氨酸。
4.根据权利要求1所述的proNGF突变体，其中所述的蛋白酶切割位点在位置101和103处被选自以下的任何氨基酸取代：丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、组氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸。
5.根据权利要求1所述的proNGF突变体，其中所述的天然蛋白酶切割位点在位置101和103处被选自丙氨酸和缬氨酸的任何氨基酸取代。
6.根据权利要求1至3所述的proNGF突变体，其中所述的蛋白酶切割位点在位置101处被缬氨酸取代。
7.根据权利要求1至6所述的proNGF突变体，其中所述的蛋白酶切割位点在位置103处被丙氨酸取代。
8.根据权利要求1至7所述的proNGF突变体，其中在所述的位置R4处的氨基酸选自精氨酸或赖氨酸，其中所述的位置R4对应于人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置104。
9.根据权利要求1至8所述的proNGF突变体，其中在所述的人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置102处的取代氨基酸选自丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、蛋氨酸。
10.根据权利要求1至9所述的proNGF突变体，其中在所述的人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置101处的氨基酸被缬氨酸取代，在所述的人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置102处的氨基酸被丝氨酸取代，在所述的人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置103处的氨基酸被丙氨酸取代，并且其中在所述的人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置104处的氨基酸被精氨酸取代。
11.根据权利要求1至10所述的具有SEQIDNO:5的proNGF突变体。
12.根据权利要求1至11所述的proNGF突变体，其中所述的突变体是通过在原核细胞中重组表达而获得的。
13.根据权利要求12所述的proNGF突变体，其中所述的突变体是通过在E.coli中重组表达而获得的。
14.一种制备生物活性的人β-NGF的方法，其包括：
(i)提供根据权利要求1至13的任意一项所述的proNGF突变体；以及
(ii)切割所述的proNGF突变体，以便得到活性的人β-NGF。
15.权利要求14所述的方法，其包括以下步骤：
a.通过包涵体溶解，将根据权利要求1-13的任意一项所述的proNGF突变体溶解于变性溶液中；
b.将所述的proNGF突变体转移至重折叠溶液中，其中所述的变性的proNGF假设生物活性构造；
c.纯化所述的重折叠proNGF突变体；
d.切割所述的proNGF突变体的原序列，从而得到所述的活性的β-NGF。
16.权利要求15所述的方法，其中所述的变性溶液包含：含有(i)离散物质、(ii)螯合剂、(iii)缓冲剂和(iv)还原剂的溶液。
17.权利要求16所述的方法，其中所述的变性溶液包含：
i.1-8M胍盐-HCl，优选为4-6M；
ii.0.01MTris；
iii.1-50mMEDTA；
iv.1-100mM，选自谷胱甘肽(GSH)或半胱氨酸；
v.pH7.0-10.0。
18.权利要求17所述的方法，其中所述的变性溶液包含：
i.4M胍盐-HCl；
ii.0.1MTris；
iii.10mMEDTA；
iv.5mMGSH或半胱氨酸；
v.pH8.0。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述的重折叠溶液包含：
i.0.5-1.0M的分子伴侣；
ii.1-10mM的金属螯合剂；
iii.0.1-10mM的氧化还原改组系统；
iv.pH8.0-pH11.0。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述的重折叠溶液包含：
i.0.75M精氨酸；
ii.5mMEDTA；
iii.1mML-半胱氨酸和5mML-Cysteine，或者1mMGSSG(氧化的谷胱甘肽)和5mMGSH(还原的谷胱甘肽)；
iv.pH9.5。
21.根据权利要求15和17-20所述的方法，其中所述的重折叠是以脉冲复性的形式进行的。
22.根据权利要求21所述的方法，其中与脉冲复性过程中所述的最终重折叠体积相关，所述的胍盐HCl的浓度不超过0.3M，所述的蛋白质的浓度/脉冲不应该超过50μg/ml。
23.根据权利要求15的任意一项所述的方法，其中所述的proNGF突变体是通过混合模式层析而纯化的。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述的层析柱为具有合成亲和配体的混合模式材料柱。
25.根据权利要求24所述的方法，其中混合模式材料柱为具有4-巯基-乙基-吡啶(MEP)、己基氨基(HEA)、苯丙氨基(PPA)、2-巯基-5苯并咪唑磺酸(MBI)、CaptoMMC(GEHC)、N-苯甲基-N-甲基乙醇胺(GEHC)、CHT羟磷灰石或CHTfluoroapatide的柱。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述的混合模式材料柱为具有4-巯基-乙基-吡啶(MEP)的柱。
27.根据权利要求14至26所述的方法，其中所述的原形式的proNGF突变体是通过蛋白酶切割的。
28.根据权利要求27所述的方法，其中其中所述的原形式的proNGF突变体是通过丝氨酸蛋白酶切割的。
29.根据权利要求28的任意一项所述的方法，其中所述的原形式的proNGF突变体是通过胰蛋白酶切割的。
30.权利要求27至29所述的方法，其中所述的胰蛋白酶与proNGF突变体的比例为1:200-1:100000。
31.根据权利要求30所述的方法，其中根据重量，所述的胰蛋白酶与proNGF突变体的比例为1:5000-1:20000。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述的胰蛋白酶与proNGF突变体的比例为1:10000(w/w)的比例。
33.权利要求14至32所述的方法，其进一步包括纯化β-NGF的额外步骤。
34.权利要求33所述的方法，其进一步包括通过柱层析纯化β-NGF的额外步骤。
35.权利要求34所述的方法，其进一步包括通过SPSepharoseHP柱纯化β-NGF的额外步骤。
36.根据权利要求1-14的任意一项所述的proNGF突变体在生产β-NGF中的用途。
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