EA031333B1 - Новые мутантные про-нрф и их применение для получения бета-нрф - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к мутантным про-НРФ и их применению, в частности применению мутантного про-НРФ для получения человеческого бета-НРФ. В изобретении раскрывается способ получения биологически активного человеческого бета-НРФ из неактивного нерастворимого мутантного про-НРФ. Мутантный про-НРФ замещен любой аминокислотой, кроме Arg или Lys нативного участка RSKR, по меньшей мере, в позициях Rи K, соответствующих позициям 101 и 103 человеческой про-НРФ последовательности.

Description

Изобретение относится к мутантным про-НРФ и их применению, в частности применению мутантного про-НРФ для получения человеческого бета-НРФ. В изобретении раскрывается способ получения биологически активного человеческого бета-НРФ из неактивного нерастворимого мутантного про-НРФ. Мутантный про-НРФ замещен любой аминокислотой, кроме Arg или Lys нативного участка R'SK’Rпо меньшей мере, в позициях R¹ и К³, соответствующих позициям 101 и 103 человеческой про-НРФ последовательности.

031333 Bl

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новым мутантным про-НРФ с замещениями в нативном участке расщепления протеазы. В настоящем изобретении раскрывается способ получения биологически активного человеческого бета-НРФ из неактивного нерастворимого мутантного про-НРФ и использование мутантного про-НРФ для получения человеческого бета-НРФ.

Область применения изобретения

Нейрональный ростовой фактор (бета-НРФ) - это нейротрофический фактор, играющий критически важную роль для роста и выживания нейронов (сенсорных и симпатических) (Levi-Montalcini, R., Science 237 (1987) 1154; Thoenen, H., et al., Physiol. Rev. 60 (1980) 1284; Yankner, B.A., et al., Annu. Rev. Biochem. 51 (1982) 845). Бета-НРФ принадлежит к цистеин-узловому суперсемейству факторов роста, который принимает стабильную димерную белковую структуру. Кроме того, бета-НРФ способствует росту, дифференциации и жизнеспособности холинэргических нейронов центральной нервной системы (Hefti, F.J., J. Neurobiol. 25 (1994) 1418). Возможные терапевтические показания для применения рекомбинантного человеческого нейронального ростового фактора включают в себя периферические сенсорные нейропатии, например, в связи с диабетом или возможным побочным эффектом при лечении СПИД. Прочие показания для применения бета-НРФ связаны с центральной нейропатией, например, при болезни Альцгеймера. В таком случае, потеря памяти - это результат потери холинэргических нейронов. Бета-НРФ также оказался эффективным при лечении человеческой кожной и роговичный язвы (Bernabei et al. Lancet 1999; Lambiase et al. NEJM 1998). К тому же, бета-НРФ защитил ретинальные клетки от дегенерации и апоптоза во время эксперимента с глаукомой животных и улучшил зрение некоторых пациентов с глаукомой (Lambiase A., et al. PNAS 2009).

Зрелый человеческий бета-НРФ - это 118 аминокислый протеин, который переводится, как пре-пропротеин, состоящий из 241 аминокислоты. Сигнальный пептид (пре-пептид) из 18 аминокислот расщепляется во время перехода в эндоплазменную сетку (ER). Получаемый про-протеин (про-НРФ) обрабатывается на N-терминале удалением про-последовательности расщеплением протеазы. Зрелый человеческий НРФ характеризуется высокой степенью схожести (около 90%) с бета-НРФ грызунов (мышей, крыс). Для клинических исследований или терапевтического применения бета-НРФ должен быть в высоких концентрациях. Подчелюстные железы мышей - это естественный источник бета-НРФ. Однако эти бета-НРФ препараты являются разнородными смесями разных димеров и поэтому не подходят для терапевтического применения. Кроме того, к пациентам желательно применять человеческую форму протеина. Однако в человеческой ткани нейротрофические факторы присутствуют только в низких концентрациях.

Про-последовательность - это область, отдельная от зрелого протеина (см. последовательности на фиг. 1, где про-последовательность показана жирным шрифтом). Эти две области отделены открытым участком расщепления протеазы с базовой аминокислотной целевой последовательностью типа Arg-SerLys-Arg, расположенной в позициях 101-104 человеческой про-НРФ последовательности (SEQ ID NO: 1). Это естественно является участком расщепления сериновой эндопротеазы - фурина. К тому же, участок расщепления может быть отдельно обработан прочими подходящими протеазами, предпочтительно протеазами с субстратной специфичностью расщепления после аминокислоты аргинин (Arg, R). Например, протеаза трипсин расщепляется после базовой аминокислоты, например лизина (Lys, K) или аргинина (Arg, R).

Способы получения биологически активного бета-НРФ из неактивной проформы хорошо известны в науке. Например, в публикации ЕР 0994188 В1 описывается способ получения биологически активного бета-НРФ из неактивной проформы с низкой растворимостью. В соответствии с этим способом бетаНРФ можно получить из рекомбинантного нерастворимого неактивного про-НРФ, растворенного в денатурирующем растворе. После этого, растворенный про-НРФ переводится в не-денатурирующий или слабо-денатурирующий раствор. Денатурированный про-НРФ принимает биологически активную форму, определенную дисульфидными связями, присутствующими в нативном бета-НРФ. Затем пропоследовательность про-НРФ отщепляется, тем самым образуя активный бета-НРФ.

Человеческий про-НРФ содержит участок расщепления нативной протеазы (фурин) Arg-Ser-LysArg, таким образом создавая фигуру последовательности: R'SK/’R⁴. В конкретных производственных процессах, например в процессах, в которых требуется соблюдение качества, соответствующего Надлежащей производственной практике (Good Manufacturing Practice (GMP)), сырье, т.е. энзимы должны быть высокого качества. Протеаза фурин в настоящее время не используется в качестве протеазы, соответствующей требованиям GMP.

Следовательно, была выбрана альтернативная протеаза, трипсин (ЕС 3.4.21.4) для расщепления про-НРФ, с целью получения зрелого бета-НРФ протеина. Сериновая протеаза трипсин расщепляет пептидные цепи на карбоксилововой стороне базовой аминокислоты аргинин или лизин. В человеческом про-НРФ естественный участок расщепления содержит три позиции с базовыми аминокислотами (позиции 101, 103, и 104 SEQ ID NO: 1; также называемые R¹, K³ и R⁴ в настоящем описании). Таким образом, расщепление про-НРФ трипсином может привести к образованию многочисленных расщепленных продуктов в зависимости от точного месторасположения расщепления. Типичные продукты расщепления

- 1 031333 это SK³R⁴-6eTa-HPO и R⁴-6eTa-HPO и зрелый бета-НРФ. Эта проблема ухудшается тем, что димеризация бета-НРФ протеина приводит к получению еще большего количества (до шести) неоднородных продуктов, которые приходится вычищать с помощью следующих шагов (см. фиг. 2а).

Технические проблемы, связанные с настоящим изобретением, и решения

Способы получения бета-НРФ были описаны в ранних работах. Однако в настоящее время существующие процессы имеют некоторые недостатки, например неоднородность продуктов бета-НРФ и низкие концентрации бета-НРФ.

Расщепление немутантного про-НРФ трипсином для получения бета-НРФ оказалось низкоэффективным, что приводит к необходимости использовать очень высокое количество энзима для получения достаточного количества расщепленных бета-НРФ. Это обладает некоторыми недостатками, которые отражаются на последующем процессе очистки. Прежде всего, происходит дальнейшее снижение селективности расщепления, что приводит к получению некоторых продуктов переваривания. Во-вторых, очистка бета-НРФ от энзима необходимо, т.к. энзим не должен присутствовать в конечном образце протеина. Это подразумевает проведение некоторых процедур очистки для удаления избыточного трипсина. Таким образом, использование трипсина в качестве расщепляющего энзима в процедурах, описанных в ранних работах, приводит либо к очень низким концентрациям бета-НРФ, либо к проблемам очистки протеина.

Сомнению не подлежит, что остается актуальной задача разработки способа получения бета-НРФ, лишенного недостатков, описанных выше. Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в разработке нового способа получения бета-НРФ высокого качества, высокой эффективности и в больших количествах. Кроме того, задача настоящего изобретения - показать процесс производства бета-НРФ, позволяющий получать бета-НРФ в больших количествах, который является эффективным, стабильным, управляемым и воспроизводимым.

Сильная сторона изобретения заключается в получении бета-НРФ из нового мутантного про-НРФ. Новый мутант позволяет получать однородные бета-НРФ продукты в достаточных количествах, т.к. новый мутантный про-НРФ не позволяет произойти неоднородному перевариванию протеазами и, таким образом, исключается неоднородность получаемых бета-НРФ. Задача изобретения решается путем применения мутантного про-НРФ для получения бета-НРФ из мутантного про-НРФ, как описано в настоящем изобретении.

Новый мутант позволяет добиться беспрецедентного повышения эффективности расщепления трипсина в нужном участке мутированного про-НРФ, описанного в изобретении, по сравнению с немутированным про-НРФ. Это позволяет использовать крайне низкое количество протеазы трипсин по сравнению с количеством, когда используется немутированный энзим и, в результате, снижаются проблемы очистки бета-НРФ от самого энзима и от продуктов расщепления.

Вышеописанные задачи решаются и преимущества достигаются с помощью способов, описанных в пунктах изобретения. Рекомендуемые воплощения изобретения включены в соответствующие пункты изобретения, приведены в описании, примерах и чертежах настоящего документа.

Вышеприведенный обзор возможно не описывает всех проблем, которые можно решить с помощью настоящего изобретения. Дополнительные проблемы и как их можно решить будут очевидны для специалиста после прочтения настоящего описания.

Краткое описание сущности изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение относится к мутантному про-НРФ, где участок расщепления протеазы R¹ SK³R⁴ заменяется, по меньшей мере, в позициях R¹ и K³, которые соответствуют позициям 101 и 103 человеческой немутантной про-НРФ последовательности (SEQ ID NO: 1) аминокислотой из ряда небазовых аминокислот и гистидином.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения биологически активного человеческого бета-НРФ из неактивного нерастворимого мутантного про-НРФ, замещенного на нативном участке расщепления протеазы R¹ SK3R⁴, по меньшей мере, в позициях R¹ и K³, которые соответствуют позициям 101 и 103 человеческой немутантной про-НРФ последовательности (SEQ ID NO: 1), посредством (i) получения мутантного про-НРФ в соответствии с настоящим изобретением и (ii) расщепления мутантного про-НРФ для получения активного человеческого бета-НРФ.

В частности, изобретение относится к следующему процессу:

a) растворение мутантного про-НРФ в денатурирующем растворе;

b) помещение мутантного про-НРФ в пересворачивающий раствор, в котором денатурированный про-НРФ принимает биологически активную форму;

c) очищение мутантного про-НРФ от пересворачивающего раствора;

d) расщепление про-последовательности мутантного про-НРФ с целью получения активного бетаНРФ.

Третий аспект изобретения относится к использованию мутантного про-НРФ, в котором, по меньшей мере, аргинин в позиции 101 и лизин в позиции 103 нативного участка расщепления протеазы R^!SK³R⁴ в позициях 101-104 человеческого немутантного про-НРФ (SEQ ID NO: 1) заменяется небазовой аминокислотой для получения человеческого бета-НРФ.

- 2 031333

Следующий аспект настоящего изобретения относится к фармацевтическим композициям, состоящий в том, что бета-НРФ, получаемый из мутантного про-НРФ, в котором, по меньшей мере, аргинин в позиции 101 и лизин в позиции 103 нативного участка расщепления протеазы R^ISK³R'¹ в позициях 101104 человеческого немутантного про-НРФ (SEQ ID NO: 1), замещаются аминокислотой из ряда небазовых аминокислот и гистидином и фармацевтически приемлемым носителем или растворителем.

Это краткое описание изобретения не обязательно описывает все характеристики настоящего изобретения. Прочие воплощения станут понятны из обзора, содержащего детальное описание.

Детальное описание изобретения

Определения.

Перед детальным описанием настоящего изобретения необходимо обратить внимание на том, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными способами, протоколами и реагентами, описанными в настоящем документе, т.к. они могут варьировать. Также, необходимо обратить внимание, что терминология, используемая в настоящем описании, предназначена только для целей описания конкретных воплощений, и не должна ограничивать сферу настоящего изобретения, которая ограничивается исключительно прилагаемыми пунктами формулы изобретения. Если не определено иное, все технические и научные термины в настоящем описании имеют такое же значение, как они обычно понимаются специалистом, разбирающимся в сфере настоящего изобретения.

В настоящем изложении и пунктах изобретения, следующих ниже, если из контекста не следует иное, слово включать в себя, и такие вариации, как включает в себя и включающий в себя, подразумевают включение заявленного числа или этапа, или группы чисел или этапов, но не исключение прочего числа или этапа, или группы чисел или этапов.

В настоящем изложении цитируются некоторые документы (например, патенты, патентные заявки, научные работы, инструкции и т.д.). Ничто в настоящем описании не подразумевает невозможность для изобретения ссылаться к таким документам на основании предыдущих изобретений.

Последовательности (SEQ ID NO:): все последовательности, указанные в настоящем описании, раскрыты в прилагаемом списке последовательностей, который полностью является частью настоящего изложения.

Термин около или примерно, используемый с числовым значением, означает включение числовых значений в пределах, охватывающих дополнительно 5% от указываемого числа в нижнем пороге, 5% от указываемого числа в верхнем пороге.

Термин про-НРФ означает проформу человеческого бета-НРФ. Человеческая про-НРФ последовательность полностью показана в SEQ ID NO: 1 (фиг. 1а). Для получения полноценного бета-НРФ, пропептид про-НРФ должен быть расщеплен протеазами. Про-последовательность бета-НРФ - это область, отдельная от полноценного бета-НРФ. Между этими двумя областями находится нативный участок расщепления протеазы Arg-Ser-Lys-Arg (называемый в настоящем описании R'sK’R'¹. SEQ ID NO: 9) в позициях 101-104 SEQ ID NO: 1. Участок расщепления может быть отдельно обработан подходящей протеазой, в частности протеазой фурин.

Термин мутантный про-НРФ или мутеин про-НРФ означает модификации проформы человеческого бета-НРФ, сделанные замещением аминокислот. Мутеин про-НРФ настоящего изобретения заменяется на нативном участке расщепления протеазы R'SK'R⁴ (SEQ ID NO: 9) по меньшей мере в двух позициях K³ и R¹, которые соответствуют позициям 101 и 103 человеческой немутантной про-НРФ последовательности (SEQ ID NO: 1) аминокислотой из ряда небазовых аминокислот и гистидином.

В предпочитаемом воплощении изобретения, аминокислота лизин в позиции K³ (которая соответствует позиции 103) заменяется аланином (см. фиг. 1d, SEQ ID NO: 4, фиг. 1e, SEQ ID NO: 5, фиг. 1g, SEQ ID NO: 8).

В другом предпочитаемом воплощении изобретения, аминокислота аргинин в позиции R¹ (которая соответствует позиции 101) заменяется валином (см. фиг. 1b, SEQ ID NO: 2, фиг. 1e, SEQ ID NO: 5, фиг. 1g, SEQ ID NO: 8).

В другом воплощении изобретения аминокислота аргинин R⁴, которая соответствует позиции 104 немутантной про-НРФ последовательности (SEQ ID NO: 1), может также быть замещена любой аминокислотой, которая позволяет обработать про-НРФ протеолитическим расщеплением для получения бетаНРФ, предпочтительно базовой аминокислотой, например аргинином или лизином. Например, присутствие аланина в позиции R⁴ предотвращает превращение про-НРФ в бета-НРФ. Следовательно, мутант, описанный в изобретении, не может содержать аланин в позиции 104.

- 3 031333

Таблица 1

Участок расщепления протеаз про-НРФ и мутеинов про-НРФ (X означает любую аминокислоту, кроме Arg или Lys)

Послед- Участки расщепления протеазы (поз. 101-104 SEQ ID NO:

ность 1) №

RSKR (немутантный) (SEQ ID NO: 9)

VSXR (SEQ ID N0:10)

XSXR (SEQ ID N0:11)

XSAR (SEQ ID N0:12)

VSAR (SEQ ID N0:13)

RXKR

XXXR (SEQ ID N0:14)

VXAR (SEQ ID N0:15)

Термин небазовая аминокислота означает любую аминокислоту, который не заряжена положительно. Термин означает любой аминокислотный остаток, кроме базовой аминокислоты. Термин исключает аминокислоты лизин или аргинин, являющиеся аминокислотами с положительно заряженными цепями. Небазовые аминокислоты - это отрицательно заряженные аминокислоты глутаминовая кислота и аспаргиновая кислота, аминокислоты с полярно незаряженными цепями (серин, треонин, аспаргин, глутамин), аминокислоты с гидрофобными цепями (аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, тирозин, триптофан) и аминокислоты цистеин, глицин и пролин.

Термин биологически активный про-НРФ или про-НРФ в биологически активной форме относится к биологической активности про-НРФ. Биологически активная форма про-НРФ определяется присутствием дисульфидных мостов, возникающих в естественном бета-НРФ. Активность может быть, например, определена с помощью анализа, описанного в Chevalier et al. 1994, Blood 83: 1479-1485, 1994, ссылочно включаемого в настоящее описание. В примере 11 описывается анализ биологической активности про-НРФ с помощью стимулирования пролиферации клеток TF1.

Термин бета-НРФ означает зрелый бета-нейрональный ростовой фактор предпочтительно человеческого происхождения. Последовательность зрелого бета-нейронального ростового фактора показан на фиг. 1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8), начиная с позиции 105.

Термин активность бета-НРФ или биологически активный бета-НРФ означает биологическую активность бета-НРФ. Биологически активный бета-НРФ существует в форме димера. Бета-НРФ должен присутствовать в димерной форме, чтобы обладать биологической активностью. Требование к биологически активной форме бета-НРФ заключается в правильном формировании дисульфидных мостов к цистиновому узлу. Активность может быть, например, определена с помощью анализа dRG (анализ спинномозгового чувствительного нервного узла), см., например, Levi-Montalcini, R. et al., Cancer Res. 14 (1954) 49 и Varon, S. et al., Meth. in Neurochemistry 3 (1972) 203. В этом анализе стимулирование и выживание сенсорных нейронов из диссоциированных спинномозговых ганглий куриных эмбрионов отслеживается по формированию неврита.

Термин замещение или замещения означает модификации проформы человеческого бета-НРФ с помощью замещения аминокислот. Этот термин включает в себя химическую модификацию аминокислот, например, замещением или добавлением химических групп или остатков в исходную аминокислоту. Этап модификации избранных аминокислот осуществляется предпочтительно мутагенезом на генетическом уровне. Предпочтительно модификацию про-НРФ проводить с помощью способов генной инженерии для изменения ДНК, принадлежащей про-НРФ. Модификации - это мутации, которые вызывают замещение единичного базового нуклеотида другим нуклеотидом генетического материала. Точечные мутации приводят к кодированию других аминокислот, относительно немутантной последовательности. Предпочтительно осуществлять последующую экспрессию модифицированного про-НРФ протеина в прокариотических или эукариотических организмах, особенно предпочтительно в прокариотических организмах.

Термин денатурирование или денатурация означает процесс, в котором меняется свертываемая структура протеина. Термин означает развертывание третичной структуры про-НРФ или мутеина проНРФ. Изменение свертываемой структуры происходит из-за подверженности некоторым химическим или физическим факторам. В результате, некоторые из исходных свойств протеина, особенно его биологическая активность, снижаются или исключаются. С помощью процесса денатурации протеины становятся биологически неактивными. Кроме того, денатурированные протеины могут обладать целым рядом характеристик, включая потерю биологической функции, потерю растворимости и/или агрегации.

Термин пересворачиваниве или ренатурирование или ренатурация относится к процессу, с помощью которого белковая структура принимает свое нативное функциональное сворачивание или форму. С помощью ренатурации или пересворачивающих процессов, протеин становится биологически

- 4 031333 активным.

Термин рекомбинантный означает клонирование ДНК в векторы для экспрессии протеина, закодированного ДНК, в подходящем хозяине. В качестве хозяина предпочтительно использовать прокариот, лучше всего бактерию. Термин рекомбинантная экспрессия, используемый в настоящем описании, означает экспрессию про-НРФ или мутеина про-НРФ в прокариотических клетках-хозяинах, например для экспрессии рекомбинантных протеинов подходят штаммы Е. coli.

Термин растворимый относится к протеину, который может быть растворен в каком-нибудь растворителе.

Термин нерастворимый означает протеин, который не может быть растворенным в растворителе.

Описание изобретения

Мутантные про-НРФ, описываемые в изобретении.

В первом воплощении настоящее изобретение раскрывает мутантный про-НРФ, где участок расщепления протеазы R¹SK³R⁴ заменяется, по меньшей мере, в позициях R¹ и K³ которые соответствуют позициям 101 и 103 человеческой немутантной про-НРФ последовательности (SEQ ID NO: 1), аминокислотой из ряда небазовых аминокислот и гистидином. Другими словами, по меньшей мере, аргинин R¹ в позиции 101 и лизин K³ в позиции 103 нативного участка расщепления протеазы R¹SK³R⁴ в позициях 101-104 человеческой немутантной про-НРФ последовательности (SEQ ID NO: 1) замещаются любой аминокислотой, кроме аргинина или лизина.

В человеческом немутантном про-НРФ (SEQ ID NO: 1) расщепление нативной протеазы относится к позициям аминокислоты 101-104 (ArgSerLysArg, RSKR, SEQ ID NO: 9). Аминокислота лизин K³ в позиции 103 немутантной про-НРФ последовательности и аминокислота аргинин R¹ в позиции замещаются любой аминокислотой, кроме Arg или Lys, для получения про-НРФ с улучшенными свойствами, в частности, для получения бета-НРФ. Для получения вышеуказанного объекта, т.е. для генерации мутеина с улучшенными свойствами с целью получения бета-НРФ, аргинин (R¹) или лизин (K³) могут быть замещены всеми естественными аминокислотами, или также искусственными аминокислотами, при условии, что они являются участком расщепления трипсином.

В соответствии с изобретением модификации аминокислот в одной или более позициях 101-103, соответствующих остаткам, могут быть сделаны замещением базовых аминокислот небазовыми аминокислотами. Эти замещения могут использоваться для создания мутантных про-НРФ в соответствии с изобретением, в частности, для получения бета-НРФ. Мутанты включают в себя замещения, по меньшей мере, в позициях Arg 101 и Lys 103. Аминокислотные остатки замещаются небазовой аминокислотой или гистидином.

В частности, мутанты изобретения имеют замещения Arg101Val и Lys103Ala. Например, указанные естественные небазовые аминокислоты могут относиться к естественным аминокислотным остаткам аланин, аспаргин, аспаргиновая кислота, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин, валин.

Аминокислоты для замещения в позициях 101 и 103 не должны относиться к базовым (положительно заряженным) аминокислотам аргинин (Arg) и лизин (Lys). Также менее предпочтительны аминокислоты изолейцин (Не), лейцин (Leu) или фенилаланин (Phe), цистеин (Cys), пролин (Pro) или триптофан (Trp). Серин (Ser) в естественной среде находится в позиции 102 человеческой про-НРФ немутантной последовательности. В качестве X в позиции 102 (SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8) предпочтительно взять серин (Ser), который естественно находится в позиции 102 человеческой про-НРФ последовательности, но можно также взять любую прочую небазовую аминокислоту (т.е. не аргинин, и не лизин). Важно, чтобы аминокислота в позиции 102 была небазовой аминокислотой (т.е. не Arg, и не Lys).

В качестве аминокислоты в позиции 104 немутантной человеческой про-НРФ последовательности предпочтительно брать аргинин (Arg), который естественно находится в позиции 104 человеческой проНРФ последовательности, но может также быть замещен любой другой аминокислотой, предпочтительно базовой аминокислотой, и лучше всего, лизином, который позволяет обработать про-НРФ протеолитическим расщеплением для получения бета-НРФ.

Например, присутствие аланина в позиции 104 немутантного человеческого про-НРФ предотвращает превращение про-НРФ в бета-НРФ. Таким образом, Ala в позиции 104 исключается.

В табл. 2 описывается предпочтительное замещение в участке расщепления протеазы про-НРФ. Таблица 2А

Предпочтительные аминокислоты в позиции 101-104 немутантного про-НРФ

101 Val, Ala, Asn, Asp, Glu, Gin, Gly, Ser, Thr, Tyr, Met, His, Cys, Pro, Phe, Trp, He, Leu

102 Ser*, Gly, Asp, Tyr, Thr, Asn, Glu, Ala, Val, Gin, His, Met, Cys, Pro, Phe, Trp, He, Leu

103 Ala, Val, Asp, Asn, Glu, Gin, Gly, Ser, Thr, Tyr, Met, His, Cys, Pro, Phe, Trp, He, Leu

104 Arg*, Lys

Звездочкой (*) обозначена естественная аминокислота в участке расщепления протеазы (немутантного про-НРФ, SEQ ID NO: 1).

- 5 031333

Аминокислоты Cys, Pro, Phe, Trp, Ile и Leu менее предпочтительны для замещения в позициях 101, 102 и 103.

Таблица 2В

Самые предпочтительные аминокислоты в позиции 101-104 немутантного про-НРФ

101 Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, Gin, Tyr, Met, His

102 Ser*, Val, Ala, Gly, Thr, Asn, Asp, Glu, Gin, Tyr, Met, His

103 Ala, Val, Gly, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, Gin, Tyr, Met, His

104 Arg*, Lys

Важно, чтобы была любая аминокислота, кроме Arg или Lys, в позициях 101, 102 и 103 про-НРФмутеина, и чтобы была базовая аминокислота (Arg или Lys) в позиции 104 про-НРФ-мутеина. Было продемонстрировано, что конкретно замещение двух аминокислот в позициях 101 и 103 приводят к повышению эффективности получения бета-НРФ.

В последовательности самого предпочтительного мутантного про-НРФ, описанного в изобретении (SEQ ID NO: 5), предпочтительная замещенная аминокислота в позиции 101 человеческого немутантного про-НРФ - это валин, в позиции 103 человеческого немутантного про-НРФ - это аланин, в позиции 102 человеческого немутантного про-НРФ - это серин, а в позиции 104 человеческого немутантного проНРФ - это аргинин. В частности, в предпочтительном воплощении изобретения мутантный про-НРФ настоящего изобретения имеет последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 5.

Настоящее изобретение также относится к кодированию нуклеиновыми кислотами, для получения мутантных про-НРФ, описанных в настоящем изобретении.

Способ получения человеческого бета-НРФ из мутантного про-НРФ, описываемого в изобретении.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к получению биологически активного человеческого бета-НРФ из неактивного нерастворимого мутантного про-НРФ, замещением на нативном участке расщепления протеазы R¹SK³R⁴ (SEQ ID NO: 9) в позициях 101 и 103 (R¹ и K³) человеческой немутантный про-НРФ последовательности (SEQ ID NO: 1), включая получение мутантного про-НРФ, заменяемого на нативном участке расщепления протеазы R¹SK³R⁴ в позициях 101 и 103 (R¹ и K³) человеческой немутантной про-НРФ последовательности, и расщепление мутантного про-НРФ для получения активного человеческого бета-НРФ.

Предпочтительно получать мутантный про-НРФ с помощью рекомбинантной экспрессии в прокариотических клетках. Подходящие бактериальные штаммы хорошо известны науке, например Е. coli, Bacillus sp. и Salmonella, и наборы для осуществления таких экспрессий доступны в коммерческих источниках. Предпочтительные клетки-хозяева для осуществления рекомбинантной экспрессии - это Е. coli, например Е. coli BL21, JM 108/109 (K12), JM106, JM83 и ТВ1 или их производные. Можно использовать любые другие подходящие штаммы Е. coli.

Полинуклеотиды оперативно связываются с последовательностями, контролирующими экспрессию, позволяя экспрессировать внедрение протеинов изобретения в прокариотические клетки-хозяева. Эти последовательности, контролирующие экспрессию, включают в себя, но не ограничиваясь, индуцибельные и неиндуцибельные промоторы, операторы, репрессоры и прочие элементы, известные специалистам, которые ведут или иначе регулируют генную экспрессию. Такие регулирующие элементы включают в себя, например, Т7, ТАС, PBAD, LAC промоторы, LacI, LacI^Q репрессоры.

Последовательность мутантного про-НРФ вводится в прокариотическую клетку-хозяина с помощью подходящего вектора. Подходящие векторы могут быть, например, но не ограничиваясь : pBR322, pMAL, pUC19 и все производные. Прокариотические клетки-хозяева включают в себя, но не ограничиваясь, прокариотические клетки, например бактерии (например, Е. coli или В. subtilis), которые могут трансформироваться, например, векторами экспрессии плазмидного ДНК, рекомбинантного бактериофагового ДНК, или космидного ДНК, содержащего полинуклеотидные молекулы изобретения. В одном воплощении изобретения используются плазмидные векторы. Например, но ни в коем случае этим не ограничиваясь, можно использовать плазмидные векторы, описанные в ЕР1697523В1 (который ссылочно включен в настоящее описание).

Для экспрессирования мутеиновых про-НРФ используется вектор экспрессии, который содержит:

a) сильный промотор для направления транскрипции (например, промотор tac или Т7);

b) кодирующая последовательность для про-НРФ или мутеина про-НРФ;

c) терминатор транскрипции/трансляции (например, Ю-терминатор бактериофаговой лямбды);

d) первый выбираемый маркерный ген, например кодирующий ген для антибитической сопротивляемости (например, сопротивление канамицину, kan);

e) второй выбираемый маркерный ген, например кодирующий ген для proB и/или proA;

f) ген-репрессор (например, ген 1acI);

g) происхождение репликации с высоким числом копирования.

В одном воплощении изобретения для клонирования могут использоваться запатентованные векторы экспрессии (от Scil Proteins GmbH, см. публикацию EP1697523B1, чтобы узнать структуру подходящего вектора экспрессии) или коммерческие векторы. Общая информация по векторам, которые могут

- 6 031333 использоваться в настоящем изобретении, содержится в вышеуказанных документах. Однако можно использовать любой известный подходящий вектор.

Структура запатентованного вектора экспрессии pSCIL101, приведенного тут в качестве примера вектора, подходящего для трансформирования прокариотических клеток-хозяев, изображена ниже:

tac promoter

proNGF mutein tO-Terminator

proA

Способ получения мутантного про-НРФ состоит из следующих начальных этапов:

i) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей мутеин про-НРФ;

ii) введение указанной нуклеиновой кислоты в прокариотический вектор экспрессии;

iii) введение указанного вектора экспрессии в клетку-хозяин;

iv) выращивание клетки-хозяина;

v) помещение клетки-хозяина в подходящие условия культивации.

Благодаря своей экспрессии в прокариотических клетках-хозяевах, мутеин про-НРФ находится в неактивной, нерастворимой форма.

В предпочитаемом воплощении способ получения бета-НРФ из мутантного про-НРФ в соответствии с настоящим изобретением включает в себя следующие этапы:

a) растворение мутантного про-НРФ, с замещенной на нативном участке расщепления протеазы R¹SK³R⁴ в позициях R¹ и K³, которая соответствует позициям 101 и 103 человеческой немутантной проНРФ последовательности (SEQ ID NO: 1), солюбилизацией включаемых тел в денатурирующем растворе;

b) помещение мутантного про-НРФ в пересворачивающий раствор, где денатурированный про-НРФ принимает биологически активную форму;

c) очищение мутантного про-НРФ от пересворачивающего раствора;

d) расщепление про-последовательности мутантного про-НРФ для получения активного бета-НРФ.

Далее описаны предпочтительные этапы получения бета-НРФ из мутантного про-НРФ в соответствии с настоящим изобретением.

Этап а. Солюбилизация мутантного про-НРФ.

Этап а) относится к растворению мутантного про-НРФ, с замещенным на нативном участке расщепления протеазы R¹SK³R⁴ в позициях R¹ и K³, которая соответствует позиции 101 и 103 человеческой немутантной про-НРФ последовательности (SEQ ID NO: 1), солюбилизацией включаемых тел в денатурирующем растворе. Следует обратить внимание, что мутантный про-НРФ, описанный в изобретении, в этапе а), как правило, находится в неактивной, нерастворимой форме благодаря его экспрессии в прокариотических клетках-хозяевах. Неактивный про-НРФ с низкой растворимостью образуется во время сверхэкспрессии протеина в цитозоле прокариотов. В таком случае, про-НРФ, полученный рекомбинацией, остается в цитоплазме в нерастворимой и агрегированной форме. Эти протеиновые агрегаты, их изоляция, а также их очистка описаны, например, в Marston, F.A., Biochem. J. 240 (1986).

Для изоляции этих неактивных протеиновых агрегатов (включаемые тела) прокариотические клетки разрываются последующей ферментацией. Разрушение клеток может осуществляться традиционными способами, например, с помощью гомогенизации высоким давлением, ультразвуком или лизоцимами (Rudolph, R., et al. (1997); Folding Proteins. В: Creighton, Т.Е. (ed.): протеин Function: A Practical Approach. Oxford University Press, p. 57-99).

Далее, включаемые тела растворяются. Включаемые тела (ВТ) - это скопления, как правило, дефектных или не полностью сворачиваемых протеинов. Они формируются внутри клеток, например клеток бактерий, например Е. coli, в случае чрезмерной экспрессии рекомбинантных протеинов. Предпочтительно использовать в качестве включаемых тел, в соответствии с изобретением, мутеин про-НРФ. Это значит, что они содержат по меньшей мере 60, 70, 80 или 90 вес.% про-НРФ (относительно всего количества протеина).

В изобретении описывается способ получения мутеина про-НРФ, где включаемые тела, т.е. несворачиваемые, неактивные, нерастворимые мутеины про-НРФ или их производные, растворяются в денатурирующем буфере (растворе).

- 7 031333

Рекомендуется, чтобы денатурирующий раствор, описанный в этапе а), состоял из раствора, содержащего (i) хаотропный агент, (ii) хелатор, (iii) буфер и (iv) агент восстановитель.

Денатурирующий буфер включает в себя по меньшей мере одно хаотропное вещество (агент). Химические вещества, которые растворяют упорядоченные водородные мостиковые связи в воде, называются хаотропными, т.к. водородные мостиковые связи разбиваются, хаотропные вещества вмешиваются в структуру воды и приводят к беспорядку (увеличение энтропии). Причина этого заключается в том, что формирование клеточных структур H₂O, необходимых для растворения, предотвращается. В отношении аминокислот, они снижают гидрофобные свойства и обладают денатурирующим действием на протеины, т.к. сила сворачивания протеина собирает гидрофобные аминокислоты в воде. В общем, любое вещество, которое обладает гидрофобным эффектом в буфере солюбилизации и, следовательно, имеет денатурирующие действие в отношении протеинов, может использоваться в качестве хаотропного вещества. Хаотропные вещества, как правило, представляют собой соли или соединения с низким молекулярным весом, например мочевина. Хаотропные вещества отчетливо отличаются от детергентов, т.к. они не содержат гидрофобные радикалы, например алкиловые радикалы, в молекуле. В общем, хаотропное действие сопровождается улучшением растворимости протеина, в таком случае претромбина.

В предпочитаемом воплощении изобретения хаотропное соединение - это гуанидиниевые соли, в частности гуанидиний гидрохлорид и гуанидиний тиоцианат, йодиды, бариевые соли, тиоцианаты, мочевина и перхлораты.

Хаотропные соединения используются в обычных количествах. Например, может использоваться 48 М гуанидиния гидрохлорида или 4-9 М мочевины.

Денатурирующий буфер состоит из агента восстановителя, например дисульфидного соединения (например, глутатион (GSH)). Дисульфидное соединение способно образовывать смешанные дисульфиды с тиоловыми группами (-SH) цистеинов полипептидов в включаемых телах. Дисульфид добавляется в раствор. Дисульфид не означает протеины, которые входят во включаемые тела и которые возможно имеют дисульфидные мосты. Рекомендуется использовать дисульфид, не являющийся настоящим пептидом, с низким молекулярным весом. Молекулярный вес может быть, например, ниже 2.000 или 1.000 г/моль. Дисульфид используется, например, в концентрации от 5 мМ до 1 М, в частности от 10 мМ до 0.5 М.

В предпочитаемом воплощении изобретения, в качестве дисульфидного соединения может быть глутатион дисульфид. Глутатион (GSH), или y-L-глутамил-L-цистеинилглицин, - это псевдо-трипептид, который образуется из трех аминокислот: глутаминовой кислоты, цистеина и глицина. GSH содержится в цитоплазме как прокариотов, так и эукариотов и участвует в образование дисульфидных мостов. Он находится в равновесии с димером GSSG, который содержит дисульфидный мост. Глутатион реагирует с цистеинами R-SH и R'-SH из двух полипептидов или из одиночного полипептида в реакции дисульфидного обмена:

R-SH + GSSG - R-S-S-G + GSH.

RSSG называется смешанным дисульфидом. Он реагирует с последующим цистеином полипептида, и в результате образуется дисульфидный мост между двумя цистеинами:

R-S-S-G + HS-R' - R-S-S-R' + GSH.

Глутатион остается энзиматически в редуцированной форме (GSH) в цитозоле. Поэтому указываются условия редуцирования в цитозоль. В буфере солюбилизации создаются условия, чтобы дисульфидное соединение, входящее в него, катализировало формирование дисульфидных мостов в соответствии с реакциями, описанными выше. GSSG используется, например, в концентрации 10 мМ-0.5 М.

Альтернативно, в качестве редуцирующего агента (редуктанта) можно использовать цистеин.

В предпочитаемом воплощении изобретения денатурирующий раствор - это Трис-буфер.

Денатурирующий раствор может содержать следующие традиционные добавки, например EDTA или соли. рН буфера солюбилизации, например, равен 7-10, предпочтительно pH 8. Солюбилизации предпочтительно способствовать механически, например с помощью традиционных аппаратов гомогенизации или с помощью ультразвука. После солюбилизации остаточные твердые частицы предпочтительно отделить. Супернатант включает в себя растворенный про-НРФ.

В одном воплощении изобретения денатурирующий раствор включает в себя:

i) гуанидиний-HCl, 1-8 М, предпочтительно 4-6 М, самые предпочтительные 4 М, GSH или цистеин, 1-100 мМ, предпочтительно 5 мМ;

ii) Tris, 0.01-1 М, предпочтительно 0.1 М;

iii) EDTA, 1-50 мМ, предпочтительно 10 мМ;

iv) pH 7.0-10.0, предпочтительно pH 8.0.

Концентрация 4 М гуанидиния-HCl в большинстве случаев достаточна для полной денатурации мутеина про-НРФ.

Этап b. Пересворачивающий мутантный про-НРФ.

После солюбилизация мутантного про-НРФ из включаемых тел необходимо провести пересворачивание протеина в его нативную форму. В процессе пересворачивания очень важно минимизировать конкурирующие реакции разворачивания и агрегации. Чтобы предотвратить агрегацию, пересворачивание

- 8 031333 осуществляется при очень низких концентрациях протеина, т.к. агрегация протеина превалирует при высоких концентрациях протеина. В этапе b) помещение мутантного про-НРФ в пересворачивающий буфер происходит тогда, когда денатурированный про-НРФ принимает биологически активную форму. Биологически активная форма может быть определена присутствием дисульфидных мостов, возникающих в естественном бета-НРФ.

В предпочитаемом воплощении изобретения растворенный мутантный про-НРФ ренатурируется в пересворачивающий раствор, который содержит по меньшей мере один шаперон, по меньшей мере один металлический хелатор и окислительно-восстановительную перетасовочную систему.

В предпочитаемом воплощении способ в соответствии с настоящим изобретением использует пересворачивающий раствор в этапе b), который состоит из следующего:

i) шаперон, предпочтительно аргинин, 0.5-1.0 М, предпочтительно 0.75 М;

ii) металлический хелатор, предпочтительно EDTA, 1-10 мМ, предпочтительно 5 мМ;

iii) окислительно-восстановительная перетасовочная система, 0.1-10 мМ, предпочтительно 1 мМ Lцистин и 5 мМ L-цистеин или 1 мМ GSSG (окисленный глутатион) и 5 мМ GSH (редуцированный глутатион);

iv) pH 8.0-11.0, предпочтительно pH 9.5.

Можно использовать альтернативные окислительно-восстановительные перетасовочные системы, например могут использоваться цистамин/цистеамин.

В предпочитаемом воплощении изобретения вспомогательное вещество сворачивания - это аргинин. Соединения, которые улучшают сворачивание протеинов, можно, как правило, использовать в качестве вспомогательных веществ сворачивания. Такие соединения известны специалисту. Они могут способствовать сворачиванию разными способами. Считается, что аргинин дестабилизирует сворачиваемые промежуточные вещества, которые, по меньшей мере, частично разворачиваются (из термодинамического тупика) и, следовательно, могут заново корректно свернуться. С другой стороны, глицерол, как правило, стабилизирует протеины. Соединения, которые увеличивают абсолютное увеличение получаемого сворачиваемого мутеина про-НРФ, при использовании способа, описанного в настоящем изобретении, более чем на 5%, в частности более чем на 10 или более чем 20% (на основе общего количества проНРФ, используемого для сворачивания), по сравнению со способом, в котором не используется вспомогательное вещество сворачивания, применимы, в частности, в качестве вспомогательных веществ сворачивания.

Пересворачивание предпочтительно проводится при pH, равном от 8 до 11, в частности pH 9.5.

Чтобы увеличить концентрацию протеина в резервуаре пересворачивания, проводится пульсовая ренатурация. Ограничение количество пульсаций достигается гуанидинием-HCl, концентрация которого не должна превышать 0.3 М. Концентрация протеина на каждую пульсацию не должна превышать 50 мг/мл относительно конечного объем пересворачивания.

В предпочитаемом воплощении изобретения солюбилизат добавляется в партии сворачивания в несколько долей или непрерывно в течение нескольких дней. Предпочтительно солюбилизат добавляется в пульсовую ренатурацию быстрым разведением. В этом контексте, например, но ни в коем случае этим не ограничиваясь, по меньшей мере 6 пульсаций могут осуществляться в определенный временной промежуток, например 24 ч. Количество пульсаций устанавливается таким, чтобы после добавления солюбилизирующей партии концентрация протеина, еще не свернувшегося, была не слишком высокой, т.к. иначе будут получены агрегаты. Например, с каждой пульсацией, 0,05-0,2 g/1, предпочтительно 0.1 g/1 протеина заново передавать в партии сворачивания (на основании концентрации протеина в партиях сворачивания после добавления солюбилизата). Например, каждый этап пересворачивания занимает по меньшей мере 1-2 ч.

После пересворачивания должна быть уточнена реакция пересворачивания перед загрузкой в колонку. Это может быть сделано любым известным способом, например фильтрацией.

В предпочитаемом воплощении способ получения корректно сворачиваемого мутантного про-НРФ состоит из следующих этапов: а) включаемые тела, содержащие нерастворимый мутантный про-НРФ, растворяются в денатурирующем растворе, описанном выше, и b) растворенный про-НРФ затем ренатурируется в буфере с пересворачивающим раствором, описанным выше.

В предпочитаемом воплощении изобретения денатурирующий раствор и/или пересворачивающий раствор в последствии не содержит детергент. Было обнаружено, что использование детергентов не нужно для солюбилизации и/или сворачивания мутеина про-НРФ. Это создает преимущество, т.к. некоторые детергенты являются относительно агрессивными химическими веществами, которые должны входить в фармацевтические продукты или должны входить только в малых количествах и, следовательно, должны быть удалены дорогостоящим способом. Способ в соответствии с изобретением, следовательно, имеет преимущества по сравнению со способом, описанным в Soejima et al., 2001, в котором такие агрессивные детергенты (Triton Х-100 или Brij-58) используются для сворачивания протеина. Другими словами, детергенты не используются в течение всего процесса, описанного в соответствии с изобретением, и, следовательно, это способ получения без детергента.

Этап с. Очистка мутантного про-НРФ хроматографией.

- 9 031333

Осуществляя способ, описанный в изобретении, с денатурацией и последующим пересворачиванием, получается водянистый раствор свернутого мутеина про-НРФ. Свернутый мутеин про-НРФ можно затем очистить известными способами.

В предпочитаемом воплощении мутантный про-НРФ очищается от пересворачивающего (например, неденатурирующего или слабо денатурирующего) раствора с помощью хроматографической очистки, в частности с помощью хроматографии смешанного режима (этап с способа получения бета-НРФ из мутантного про-НРФ, описанного в изобретении). Самые предпочтительные колонка хроматографии это колонка с синтетическим аффинным лигандом, предпочтительно 4-меркапто-этилпиридин (МЕР Hypercell; Pall). Преимущества этой среды заключается в том, что связывание зависит от ионной силы, не нужен стэкинг соли и возможен более высокий уровень потока для ускорения процесса. Затем элюция осуществляется pH-сдвигом.

Известны и могут быть использованы другие колонки смешанного режима. Например, но не ограничиваясь, МЕР (Pall; аффинный лиганд - 4-меркапто-этилпиридин), НЕА (Pall; аффинный лиганд: гексиламино), РРА (Pall, аффинный лиганд: фенилпропиламино), MBI (Pall; аффинный лиганд: 2-меркапто5-бензамидазол-сульфокислота), Capto MMC (GEHC), Capto adhere (GEHC; аффинный лиганд: N-бензилN-метил этаноламин), СНТ гидроксиапатит (BioRad), СНТ фтор-апатид). Колонки МЕР, НЕА, РРА и MBI имеют гидрофобные связывания, в которых Capto MMC - это катионный обменник с функционалом смешанного режима и Capto adhere - это анионный обменник с функционалом смешанного режима. Колонки BioRad - колонки ионного обмена с гидрофобными компонентами. Могут также использоваться любые прочие колонки смешанного режима, не перечисленные в настоящем документе, для очистки мутантного про-НРФ.

Этап c1. Расщепление про-НРФ с получением бета-НРФ.

Про-НРФ - это прекурсор для бета-НРФ. Таким образом, в этапе d) способа получения бета-НРФ из мутантного про-НРФ, описанного в изобретении, про-последовательность мутантного про-НРФ расщепляется для получения активного бета-НРФ.

Протеазы, трипсино-подобной субстратной специфичностью, расщепляют протеин, не переваривая активную часть молекулы протеина. Трипсино-подобные протеазы расщепляют пептидные связи вслед за положительно-заряженной аминокислотой, например аргинином или лизином. Как и трипсиноподобные протеазы, можно рассмотреть некоторые сериновые протеазы (сериновые эндопептидазы) для обработки про-НРФ, чтобы получить бета-НРФ. Предпочтительно использовать сериновую протеазу трипсин для расщепления про-последовательности, но можно использовать и другие протеазы.

Следует обратить внимание, что расщепление не ограничивается только трипсином, и можно также использовать другие протеазы, имеющие трипсино-подобные субстраты. В общем, если соотношение про-НРФ к трипсину (или прочей протеазе) установлено надлежащим образом, корректно сворачиваемые, зрелые бета-НРФ не будут расщеплены этой протеазой. И наоборот, денатурированные протеины, а также сворачивающие промежуточные вещества, создают последовательности, которые подвержены атаке со стороны протеазы.

Предпочтительно для расщепления мутантного про-НРФ с получением бета-НРФ, соотношение трипсина (или прочей протеазы) к мутантному про-НРФ от 1:200 до 1:100.000 и лучше всего от 1:5.000 до 1:20.000 по весу, самое предпочтительное соотношение - 1:10.000 (вес./вес.). В самом предпочтительном воплощении расщепление происходит в течение 8-23 ч при комнатной температуре, самое предпочтительное - 18 ч. При условиях, применимых в настоящем изобретении, мутантный про-НРФ расщепляется полностью и почти не образуются сопутствующие продукты. Агрегация не наблюдалась.

Как четко отмечено в примерах, изобретатели настоящего изобретения обнаружили, что модификация аминокислот, вводимых в мутантный про-НРФ, описанного в изобретении, не только предотвращает расщепление протеина в нежелательных участках расщепления, но также неожиданно приводят к существенному увеличению эффективности расщепления трипсина относительно эффективности немутированного про-НРФ, что позволяет проводить расщепление в очень селективных условиях для получения очень чистого продукта.

В деталях экспериментные данные четко показывают, что при уже очень низком соотношении трипсин/протеин, например 1:100.000, мутантный про-НРФ, описанный в изобретении, (SEQ ID NO: 5) становится очень чистым рекомбинантным человеческим бета-НРФ с высоким увеличением расщеплений (около 85%). Кроме того, немутированный про-НРФ (SEQ ID NO: 1) при таком же соотношении трипсин/протеин показывает низкое увеличение расщеплений (около 5%). Удовлетворительное увеличение достижимо только при намного более высоких соотношениях трипсин/протеин (1/250), но это сопровождается низкой селективностью и высокой деградацией продукта в связи с чрезмерным сварением.

Этап е. Дальнейшая очистка бета-НРФ.

Бета-НРФ, получаемый из мутантного про-НРФ, описанного в изобретении, далее очищается, например, некоторыми хроматографическими способами. Дальнейшие этапы очистки требуются для отделения трипсина и примесей, связанных с продуктом, триптического переваривания из бета-НРФ. Этапы очистки должны снизить НСР, эндотоксины и ДНК. Могут использоваться любые известные способы очистки протеина. Самые предпочтительные - это хроматографические очистки, например, с сефарозо

- 10 031333 выми колонками (например, SP-сефарозовый HP, Q-сефарозовый FF).

Конечный продукт бета-НРФ, полученный из про-НРФ, был проанализирован в отношении чистоты с помощью SDS-PAGE, rp-HPLC, SE-HPLC и IEX-HPLC. Анализы HPLC показали чистоту бета-НРФ по меньшей мере 97%.

В предпочитаемом воплощении изобретения способ для получения мутеина про-НРФ, подходящего для получения бета-НРФ, включает в себя следующие этапы:

a) экспрессия рекомбинантного мутантного про-НРФ с замещенным участком расщепления протеазы в прокариотических клетках;

b) изоляция включаемых тел, содержащих мутеин про-НРФ;

c) смешивание включаемых тел с подходящим денатурирующим буфером, состоящим по меньшей мере из (i) хаотропного вещества, (ii) хелатора, (iii) буфера и (iv) агента-восстановителя;

d) пересворачивание в пересворачивающем растворе, состоящем, по меньшей мере, из шаперона, металлического хелатора и окислительно-восстановительной перетасовочной системы;

e) очистка пересвернутого мутантного про-НРФ;

f) расщепление с получением активной формы бета-НРФ протеазой, например трипсином;

g) изоляция и очистка бета-НРФ.

Использование про-НРФ для получения бета-НРФ.

В третьем аспекте в изобретении описывается использование мутантного про-НРФ настоящего изобретения для получения человеческого бета-НРФ.

Фармацевтический состав бета-НРФ, получаемого из мутантных про-НРФ, описанных в изобретении.

В следующем аспекте в изобретении описывается фармацевтический состав, включающий бетаНРФ, получаемых из про-НРФ-мутанта, с замещением на нативном участке расщепления протеазы R^!SK³R⁴ в позициях 101 и 103 (K³ и R¹) человеческой немутантной про-НРФ последовательности (SEQ ID NO: 1), как описано выше, а также фармацевтически приемлемый носитель.

В одном воплощении изобретения фармацевтически активный бета-НРФ применяется к пациенту с помощью генно-терапевтических способов. В генной терапии применяются два базовых способа, которые подходят для введения в пациента гена, в настоящем случаем кодирующего гена для получения бета-НРФ.

В применении ex vivo фармацевтически активный ген, кодирующий бета-НРФ, вводится в соматическую клетку с помощью вектора, где соматическая клетка предпочтительно является глиальной клеткой, и клетка, обработанная таким образом, затем заново вводится в пациента, например, микро- или наночастицами. В частности, предпочтительно использовать специфичную интеграцию гена бета-НРФ в клеточный геном.

В генной терапии in vivo ген бета-НРФ транспортируется в целевые соматические клетки с помощью векторов, например с помощью вирусов, которые, с одной стороны, могут инфицировать целевую клетку и, таким образом, смогут ввести фармацевтически активный ген бета-НРФ, но, с другой стороны, не смогут воспроизводиться внутри целевой клетки. В этом способе нано- или микрочастицы, например липосомы, которые могут соединяться с клеточной мембраной, могут также использоваться в качестве векторов.

В качестве вектора для гена бета-НРФ можно, например, использовать вирус или антитело, которое способно специфично инфицировать клетку-хозяин или которое входит в иммунную реакцию с антигеном в целевой клетке. В качестве вирусоносителя можно, например, использовать ретровирусы. Кроме того, можно использовать векторы на основе аденовирусов или Вакцинии, например модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA).

Специалист может выбрать подходящую формулу на основе практических соображений и подходящий способ применения настоящего фармацевтического состава на пациенте. Например, фармацевтический состав может содержать один или несколько фармацевтически приемлемых ингредиентов, например носители или растворители. В качестве примеров таких веществ можно привести наполнители, соли, буферы, стабилизаторы, усилители впитываемости и прочие известные материалы. Способы составления формулы фармацевтической композиции настоящего изобретения можно найти в известных стандартных справочниках, например Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, последнее издание.

Дозы бета-НРФ, получаемые способом, описанным в настоящем изобретении, могут быть в диапазоне 0,1-500 мг/кг веса тела при инфузионном применении и от 2-2 мг/кг веса тела при введении инъекции.

- 11 031333

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана последовательность про-НРФ и мутантных про-НРФ, описанных в изобретении.

Жирным шрифтом показана последовательность проформы человеческого бета-НРФ. Жирным и подчеркнутым шрифтом показан участок расщепления протеазы (трипсин) (аминокислоты 101-104 SEQ ID NO: 1; трипсиновые участки расщепления находятся между аминокислотами 101-102 (R¹), 103-104 (K³) и 104-105 (R⁴)). X в последовательности означает любую аминокислоту.

На фиг. 1а показана последовательность человеческого про-НРФ (SEQ ID NO: 1) с участком расщепления протеазы RSKR (SEQ ID NO: 9).

На фиг. 1b показана последовательность мутантного про-НРФ, описанного в изобретении (SEQ ID NO: 2), с участком расщепления протеазы VSXR (SEQ ID NO: 10).

На фиг. 1с показана последовательность мутантного про-НРФ, описанного в изобретении (SEQ ID NO: 3), с участком расщепления протеазы, мутированного в XSXR (SEQ ID NO: 11).

На фиг. 1d показана последовательность мутантного про-НРФ, описанного в изобретении (SEQ ID NO: 4), с участком расщепления протеазы, мутированного в XSAR (SEQ ID NO: 12).

На фиг. 1е показана последовательность мутантного про-НРФ, описанного в изобретении (SEQ ID NO: 5), с участком расщепления протеазы, мутированного в VSAR (SEQ ID NO: 13).

На фиг. 1f показана последовательность мутантного про-НРФ, описанного в изобретении (SEQ ID NO: 7), с участком расщепления протеазы, мутированного в XXXR (SEQ ID NO: 14).

На фиг. 1g показана последовательность мутантного про-НРФ, описанного в изобретении (SEQ ID NO: 8), с участком расщепления протеазы, мутированного в VXAR (SEQ ID NO: 15).

На фиг. 1h показаны последовательности участков расщепления протеазы (SEQ ID NOs: 6, 9-15).

Фиг. 2. Обработка про-НРФ или мутантов про-НРФ с получением бета-НРФ.

На фиг. 2а показаны шесть бета-НРФ продуктов расщепления, после трипсинового расщепления, с использованием немутированного про-НРФ, в котором нативный фуриновый участок расщепления RSKR. На чертеже четко показано, что расщепление немутированного про-НРФ с получением бета-НРФ приводит к неоднородной смеси множества разных продуктов расщепления.

На фиг. 2b показаны нативные бета-НРФ продукты расщепления после трипсинового расщепления с использованием мутантного про-НРФ SP174-101 (SEQ ID NO: 5) с удалением нативного фуринового участка расщепления. Участок расщепления протеазы RSKR (SEQ ID NO: 9) был замещен двумя аминокислотами, с получением участка VSAR (SEQ ID NO: 12). Этот участок может быть расщеплен только протеазой после аминокислоты аргинин в позиции 104; трипсин можно расщепить только в одном участке расщепления (вместо трех). На чертеже четко показано, что расщепление мутантного про-НРФ SP174101 (SEQ ID NO: 5) с получением бета-НРФ приводит только к одному однородному продукту расщепления (бета-НРФ).

На фиг. 3 показан пересворачивающийся мутантный про-НРФ SP174-101 (SEQ ID NO: 5) в сравнении с немутированным про-НРФ. На чертеже сравнивается увеличение пересворачивания немутированного про-НРФ (непрерывная линия) и мутантного про-НРФ (прерывистая линия) с участком расщепления протеазы, мутированного в VSAR. На чертеже отчетливо видно, что эффективность пересворачивания немутированного и мутантного про-НРФ идентична.

На фиг. 4 показана очистка мутантного про-НРФ SP174-101 с участком расщепления протеазы, мутированного в VSAR (SEQ ID NO: 5) с помощью колонки МЕР HyperCel. На чертеже показан профиль элюции очистки МЕР HyperCel пересвернутого и отфильтрованного мутантного про-НРФ.

На фиг. 5 показано расщепление мутантного про-НРФ SP174-101 с участком расщепления протеазы, мутированного в VSAR (SEQ ID NO: 5) с помощью трипсина. На чертеже показан окрашенный кумасси гель SDS-PAGE фракций триптического расщепления. Продукт триптического расщепления мутантного про-НРФ можно увидеть на дорожках 4-7. На чертежах четко показано, что с очищенным мутантным про-НРФ получается только один продукт расщепления (бета-НРФ).

На фиг. 6 показана очистка бета-НРФ. На чертеже показан профиль SP-сефарозовый HP колонки после триптического расщепления. Реакция триптического переваривания была загружена в SPсефарозовую HP колонку. Элюция проводилась в три этапа: (а) 25% 25 мМ натрий фосфат, 1 М NaCl, pH 6.5 (буфер В), b) в линейном градиенте от 25-50% буфера В и с) 100% буфер В (скорость течения 60 см/h)).

Примеры

Следующие примеры приведены для ознакомления специалистов с полным раскрытием и описанием способов реализации и применения способов и композиций изобретения, и не предназначены ограничения сферы того, что изобретатели рассматривают в качестве своего изобретения. Были приложены усилия для обеспечения точности в отношении используемых чисел, но необходимо допустить некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, молекулярный вес - это средний молекулярный вес, температура указана в градусах Цельсия, и давление означает атмосферное давление или давление, близкое к атмосферному.

- 12 031333

Пример 1. Замещение немутантного про-НРФ на участке расщепления протеазы в позициях 100-104 (R¹SK³R⁴).

Замещение аргинина R¹ и лизина K³, которые соответствуют позициям 101 и 103 человеческого про-НРФ (SEQ ID NO: 1), осуществлялось на уровне ДНК с помощью синтезированного гена способами, известными специалистам. Серин в позиции 102 либо остается неизменным, либо замещение позиции 102 человеческого про-НРФ (SEQ ID NO: 1) было также осуществлено на уровне ДНК с помощью синтезированного гена способами, известными специалистам. Лизин K⁴, который соответствует позиции 104, не был замещен. Последовательности показаны на фиг. 1.

Пример 2. Рекомбинантная экспрессия мутантного про-НРФ SP174-101 (SEQ ID NO: 5) в прокариотических клетках.

Бактериальный хозяин Е. coli JM108, используемый для экспрессии rh-про-НРФ (DSMZ 5585; F thi A (lac-proAB) end Al gyrA96 relAl phx hsdRYl supEA-A-recA) - пролин-ауксотроф, который был нейтрализован с помощью плазмида с обозначением pSCIL101. Плазмид pSCIL101 основан на плазмиде pSCIL008 (см. публикацию W005061716). Штамм не может синтезировать тиамин (Vieira & Messing, 1982 Gen. Oct; 19(3):259-68). Мутантный про-НРФ, показанный в SEQ ID NO: 5, экспрессируется под контролем tac-промотор, расположенный на pSCIL101. Вектор pSCIL101, используемый в настоящем изобретении, - это многокопийный плазмид с канамициновой резистентностью. Экспрессия проводится в определенной минеральной солевой среде и индуцируется добавлением IPTG. Мутантный про-НРФ откладывается в цитозоль в форме включаемых тел (IBs).

Клеточная линия:

хозяин штамм, например Е. coli HMS174 (K12) или JM108 (K12), мутантный про-НРФ SP174-101 (SEQ ID NO: 5), tac-промотор (индукция с помощью IPTG), репликон ColEl, канамициновая резистентность, отбор proBA, запатентованная векторная система pSCIL101 (например, см. WO005/061716). Пример 3. Ферментация.

Цель ферментации была получить продукт и биомассу для реализации последующих этапов процесса. Для отслеживания сверхэкспрессии целевого протеина во время процесса ферментации анализировались образцы с помощью SDS-PAGE до и после индукции:

минеральная соленая среда без антибиотиков, серийная фаза μ ® 0.25 ч^-1 (OD^^^), фаза подачи партии I: экспоненциальная подача с μ _сет=0.18 ч^-1, фаза подачи партии II: подача с постоянной скоростью, точка индукции OD_[I[|;|=60±5.

1.0 мМ IPTG, время индукции 5 ч, конечный OD=82±4, время процесса 28.5 ч±1.25, стабильность плазмиды 100%, увеличение: 40 мг/g про-НРФ; 1,2 g/L±0.2 g/L про-НРФ. Пример 4. Первичное восстановление включаемых тел, содержащих SP174-101.

В бактериальных клетках рекомбинантный протеин присутствует в форме агрегатов. Экспрессия мутеинового про-НРФ произошла в форме включаемых тел. Разбивка клеток и получение включаемых тел проводились в соответствии со стандартными протоколами и могут быть проведены в лабораторном масштабе с выработкой примерно 200 г биомассы. Получение этих включаемых тел, содержащих мутеин про-НРФ, было осуществлено в соответствии с Rudolph, R., et al. (1987); Folding proteins. В: Creighton, Т.Е. (ed.): Protein Function: A Practical Approach. Oxford University Press, p. 57-99, и в соответствии с ЕР0994188В1. Для разрушения клеток клеточные гранулы были заново суспензированы в подходящем буфере и затем клетки были разрушены с помощью гомогенизации высоким давлением в 50 мМ Натрийфосфат pH 7.0, 1 мМ EDTA.

Пример 5. Растворение мутантного про-НРФ SP174-101 в денатурирующем растворе (солюбилизация включаемых тел).

Включаемые тела были растворены в денатурирующем растворе, содержащем раствор, состоящий из (i) хаотропного агента, (ii) хелатора, (iii) буфера и (iv) агента-восстановителя. Для солюбилизации гуанидиний HCl (GuaHCl) был протестирован в диапазоне концентрации 4.0-6.0 М. Буфер солюбилизации был смешан в разных пропорциях с раствором включаемых тел (раствор IB). Во всех экспериментах, проводимых при комнатной температуре, была получена конечная концентрация цистеина 5 мМ. Результаты были проанализированы с помощью SDS-PAGE (данные не приведены). Эксперименты показали, что концентрация 4 М GuaHCl была достаточной для полной солюбилизации включаемых тел. Соотно

- 13 031333 шение раствора включаемых тел с буфером составляет 1 + 1.25 (v/v) (раствор включаемых тел:буфер). Конечные условия в денатурирующем растворе для солюбилизации включаемых тел были следующими:

i) 4 M гуанидиний-HCl, ii) 0.1 M Tris, iii) 10 мМ EDTA, iv) 5 мМ цистеин,

v) pH 8.0.

Солюбилизат очищается глубокой фильтрацией в соответствии со стандартными процедурами.

Концентрация протеина была затем определена с помощью способа, описанного у Bradford (Bradford, M.M., Anal. Biochem. 72 (1976) 248). Протеиновая концентрация мутеина про-НРФ была 10-20 мг/мл.

Пример 6. Помещение мутантного про-НРФ SP174-101 в пересворачивающий буфер, в котором денатурированный про-НРФ принимает биологически активную форму.

После солюбилизации необходимо провести пересворачивание протеина в его нативную форму, тем самым минимизируя разворачивание и агрегацию. Чтобы получить биологически активный мутеин про-НРФ, описанный в изобретении, из растворенных материалов, эти материалы были растворены в пересворачивающем растворе, где про-НРФ принимает биологически активную форму.

Конечный состав пересворачивающего раствора для получения солюбилизата, основанного на растворе включаемых тел:

i) 0.75 М аргинин, ii) 5 мМ EDTA, iii) 1 мМ L-цистин и 5 мМ L-цистеин, iv) pH 9.5.

Получение НРФ в активной форме было подтверждено присутствием дисульфидных мостов, возникающих в зрелом человеческом бета-НРФ.

Чтобы увеличить концентрацию протеина в процессе пересворачивания, проводилась пульсовая ренатурация. Пульсация осуществлялась каждый 1 ч на 50 мг/мл мутантного про-НРФ протеина. Концентрация гуанидиния-HCl в растворе не должна превышать 0,3 М. Для достижения этого, необходимо было провести 15 пульсаций. Очищенная пересвернутая фракция была отфильтрована перед дальнейшей загрузкой в колонки.

Эффективность реакции пересворачивания был проанализирована после каждой пульсации с помощью rp-HPLC. Пиковая зона была отмечена относительно количества пульсаций. Для rp-HPLC использовалась колонка реверсной фазы (например, 214MS54, 4.6x250 мм; 300 А, 5 мкм, Vydac) с предохранительной колонкой (например, 214GK54; 300 А; Vydac). Буферы течения были H₂O с 0.05% трифтор-уксусной кислотой (TFA) и ацетонитрил с 0.05% TFA. Скорость течения была 1 мл/мин. Результаты показаны на фиг. 3. На фиг. 3 видно, что эффективность пересворачивания немутированного и мутантного про-НРФ идентична.

Пример 7. Очищение мутантного про-НРФ SP174-101 от пересворачивающего раствора с помощью колонки смешанного режима.

Использовалась колонка с синтетическим аффинным лигандом, 4-меркапто-этилпиридин (МЕР). Элюция проводилась сдвигом значения pH. Далее, элюция проводилась в низкосолевом растворе, который благоприятен для эффективной реализации процесса.

Колонка был уравновешена с помощью 0.75 М аргинина, 5 мМ EDTA, pH 9.5. Очищенный продукт реакции пересворачивания был загружен в колонку МЕР HyperCel (Pall) с максимальной вместимостью 5 g мутантного про-НРФ на одну L-колонку со средой. На этапе вымывания большинство примесей и несвязанные протеины были удалены с помощью буфера 2 М GuaHCl, 0.1 М Tris-HCl, pH 8.0 и 10 мМ TrisHCl, pH 8.0. Элюция проводилась в линейном градиенте от 0-70% 50 мМ ацетат, pH 4.0 (скорость течения 120 см/h). На фиг. 4 показан профиль элюции очистки МЕР HyperCel пересвернутого и отфильтрованного мутантного про-НРФ с участком расщепления протеазы, мутированного в VSAR (SEQ ID NO: 5), описанного в изобретении. На этапе промывания guaHCL были удалены многие примеси. В пуле было восстановлено около 60-70% мутантного про-НРФ.

Пример 8. Расщепление мутантного про-НРФ SP174-101 для получения активного бета-НРФ.

Для триптического переваривания мутантного про-НРФ с получением бета-НРФ использовался фосфатный буфер, который не блокирует активность протеазы. Натрий-фосфатный буфер был добавлен в элюат mEP до получения конечной концентрации 25 мМ натрий фосфата. Значение pH было откорректировано до 6.5. Для протеолиза был добавлен трипсин (Roche, класс GMP) в соотношении 1:10.000 (по весу) (трипсин:про-НРФ). Протеолиз проводился инкубацией в течение 18 ч при комнатной температуре. Эффективность и увеличение триптического переваривания были проанализированы с помощью SDSPAGE, rp-HPLC и UV/VIS280hm. На фиг. 5 показаны SDS-PAGE фракции триптического расщепления. Использовался в качестве буфера 4-12% Bis/Tris-Gel, 1 мм, 1x MES (Invitrogen). На дорожках 5-7 показаны триптические продукты расщепления в сравнении с нерасщепленным мутантным про-НРФ (rh-проНРФ*, см. дорожку 3), вплоть до получения зрелого бета-НРФ (НРФ; см. дорожку 8). На чертеже четко

- 14 031333 показано, что с очищенным мутантным про-НРФ получается только один продукт расщепления (бетаНРФ). Можно было наблюдать полное переваривание мутантного про-НРФ с получением бета-НРФ.

После триптического переваривания бета-НРФ был загружен в SP-сефарозовую HP колонку для удаления трипсина, сопутствующих продуктов расщепления и прочих примесей. SP-Сефарозовая HP очистка показана на фиг. 6.

Колонка был уравновешена с помощью буфера 25 мМ Na-фосфат (pH 6.5). Продукт реакции триптического переваривания был загружен в SP-сефарозовую HP колонку (2 g бета-НРФ/L среда) и несвязанные протеины были вымыты с помощью буфера уравновешивания. Элюция проводилась в три этапа (3 cv 25% 25 мМ Na-фосфат pH 6.5/1 М NaCl (буфер В), 10 cv в линейном градиенте из 25-50% буфера В и 3 cv 100% буфер В (скорость течения 60 см/h)).

На фиг. 6 показана очистка бета-НРФ. На чертеже показан профиль SP-сефарозовой HP колонки после триптического расщепления. Увеличение бета-НРФ составило 85-95% (пиковый образец элюции).

Пример 10. Эффективность расщепление трипсина в мутанте SP174-101 и немутированном проНРФ.

Это процедура применялась параллельно с мутантным про-НРФ SP174-101 (SEQ ID NO: 5) и человеческим немутантным про-НРФ (SEQ ID NO: 1; rh-про-НРФ). 5 мл очищенного rh-про-НРФ подверглись диализу в 25 мМ фосфатного буфера, pH 6.5. После диализа концентрация протеина 0.08 мг/мл была измерена с помощью HPLC-UV. Для каждого образца переваривания использовалось 80 мг про-НРФ. После протеолиза все образцы были проанализированы с помощью HPLC-UV.

Применялись трипсин и мутантный rh-про-НРФ в массовом соотношении 1/10000 (по весу) при разном массовое соотношении трипсина/немутированного rh-про-НРФ (см. табл. 3). Раствор трипсина использовался в концентрации 1.0 и 10 мг/мл. После одноразовой инкубации (около 17 ч) при комнатной температуре все образцы были проанализированы. Для целей контроля также инкубировался мутантный rh-про-НРФ без добавления протеазы.

Таблица 3

Соотношен ие Трипсин / rhпро-НРФ	Трипсин Объем (pL)	Колво Трипсина (мг)	Тип rh-проНРФ	Объем rh-Προ-ΗΡΦ (pL)	Количест во rh-Προ-ΗΡΦ (мг)
Контроль			Мутант	1000	80
1/10000	8(1	0,00	Мутант	1000	80
	мг/мл)	8
1/10000	8(1	0,00	Немутирован	1000	80
	мг/мл)	8	ный
1/5000	16(1	0,01	Немутирован	1000	80
	мг/мл)	6	ный
1/1000	8 (10	0,08	Немутирован	1000	80
	мг/мл)		ный
1/250	32(10	0,32	Немутирован	1000	80
	мг/мл)		ный

Эффективность и увеличение всех триптических перевариваний были проанализированы с помощью HPLC-UV, используя колонку Vydac 214MS С4.

В табл. 4 показано увеличение расщепления, получаемое после триптического переваривания. Экспериментные данные ясно показывают, что расщепление мутантного про-НРФ (SEQ ID NO: 5) трипсином дает только один продукт (бета-НРФ) при высоком увеличении расщепления (около 85%) и очень низком соотношении трипсина к протеину (1/10.000). Это можно сравнить с расщеплением немутантного про-НРФ (SEQ ID NO: 1), которое показало низкое увеличение расщепления (только около 5%) при низком соотношении трипсина к протеину (1/10.000) и высокой деградации продукта (излишнее переваривание) при высоком соотношении трипсина к протеину (1/250).

- 15 031333

Таблица 4

	Ко л-во мг	Соотн оше-ние Трипсин/ Про-НРФ	% Про-НРФ	% бетаНРФ	% излишен переваренных бета-НРФ
Про-	Стандартный	80		100
НРФ
НРФ	Стандартный SEQ ГО NO: :	42			100,0
Про-	5	80	1/1000	1,9	84,5
НРФ			0
Про-	Немутированный	80	1/1000	67,1	4,6	-
НРФ			0
Про-	Немутированный	80	1/5000	21,5	18,6	6,6
НРФ
Про-	Немутированный	80	1/1000	0,0	77,9	12,9
НРФ
Про-	Немутированный	80	1/250	0,0	67,9	25,7
НРФ

Пример 11. Тест биологической активности про-НРФ, проводимый с помощью стимулирования пролиферации клеток TF1.

Клетки TF1 (АТСС, каталог № CRL2003) выращивались стандартными способами. В клетки была добавлена тестовая среда (90% среда RPMI 1640, 10% сыворотка эмбриона теленка FBS, 50 U/мл пенициллин и 50 мг/мл стрептомицин) и было проведено центрифугирование. Гранулы были заново суспендированы с плотностью 1,5-10⁵ клеток/мл в тестовой среде при 37°C. Клеточная суспензия была смешана с разными концентрациями протеина про-НРФ (10^-10 М, 3· 10^-10 М, 10^-9 М, 3· 10^-9 М, 10^-8 М, 3· 10^-8 М, 10^-7 М, 3· 10^-1 М, 10^-6 М, 3· 10^-6 М, 10^-5 М и 3-10^-5 М) и проанализирована в 96 чашках. После инкубации в течение 48 ч при 37°C был добавлен реагент клеточной пролиферации (например, WST-1, Roche Applied Science, кат. № 1644807) и чашки снова инкубировались в течение 4 ч при 37°C. Абсорбция была измерена при 450 нм, и было определено значение eCso с помощью подходящей программы (z. Bsp. SigmaPlot 2000).

- 16 031333

Список последовательностей

SEQUENCE LISTING <110> ВОКЕРХЕМИЕ АГ <120> НОВЫЕ МУТАНТНЫЕ ПРО-НРФ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ

БЕТА-НРФ <130> Р32092-ЕР <160> 7 <170> Patentin version 3.5 <210> 1 <211> 222 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1

Met Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro

1015

Gln Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg

2530

Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly

4045

Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg

- 17 031333

5560

Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala

70 7580

Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe

9095

Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His

100 105110

Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp

115 120125

Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly

130 135140

Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr

145 150 155160

Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp

165 170175

Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys

- 18 031333

180 185190

Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile

195 200205

Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg

210 215220 <210> 2 <211> 222 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> proNGF mutant <220>

<221> misc_feature <222> (102)..(102) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2

Met Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro

10 15

Gln Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg

- 19 031333

2530

Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly

4045

Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg

5560

Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala

70 7580

Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe

9095

Asn Arg Thr His Arg Xaa Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His

100 105110

Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp

115 120125

Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly

130 135140

Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr

- 20 031333

145 150 155160

Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp

165 170175

Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys

180 185190

Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile

195 200205

Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg

210 215220 <210> 3 <211> 222 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> proNGF mutant <220>

<221> misc_feature <222> (101)..(101) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

- 21 031333 <220>

<221> misc_feature <222> (103)..(103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 3

Met Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro

1015

Gln Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg

2530

Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly

4045

Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg

5560

Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala

70 7580

Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe

9095

- 22 031333

Asn Arg Thr His Xaa Ser Xaa Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His

100 105110

Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp

115 120125

Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly

130 135140

Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr

145 150 155160

Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp

165 170175

Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys

180 185190

Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile

195 200205

Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg

210 215220

- 23 031333 <210> 4 <211> 222 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> proNGF mutant <220>

<221> misc_feature <222> (101)..(101) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 4

Met Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro

1015

Gln Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg

2530

Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly

4045

Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg

5560

- 24 031333

Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala

70 7580

Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe

9095

Asn Arg Thr His Xaa Ser Ala Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His

100 105110

Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp

115 120125

Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly

130 135140

Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr

145 150 155160

Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp

165 170175

Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys

180 185190

- 25 031333

Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile

195 200 205

Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg

210 215 220 <210> 5 <211> 222 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> proNGF mutant SP174-101 <400> 5

Met Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro

1015

Gln Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg

2530

Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly

4045

Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg

5560

- 26 031333

Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala

70 7580

Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe

9095

Asn Arg Thr His Val Ser Ala Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His

100 105110

Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp

115 120125

Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly

130 135140

Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr

145 150 155160

Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp

165 170175

Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys

180 185190

- 27 031333

Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile

195 200 205

Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg

210 215 220 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> protease cleavage site <220>

<221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 6

Arg Xaa Lys Arg <210> 7 <211> 4

- 28 031333 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> protease cleavage site <400> 7

Arg Ser Lys Arg

Claims (32)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Мутантный про-НРФ, характеризующийся тем, что участок расщепления протеазой R¹SK³R⁴ содержит замены, по меньшей мере, в позициях R¹ и K³, которые соответствуют позициям 101 и 103 последовательности SEQ ID NO: 1 человеческого немутантного про-НРФ, на любую аминокислоту, выбранную из неосновных аминокислот и гистидина.

2. Мутантный про-НРФ по п.1, характеризующийся тем, что участок расщепления протеазой замещен в позициях 101 и 103 любой аминокислотой, но не аргинином или лизином.

3. Мутантный про-НРФ по п.1, характеризующийся тем, что участок расщепления протеазой замещен в позициях 101 и 103 любой аминокислотой, выбранной из списка: аланин, глицин, валин, серин, треонин, метионин, тирозин, гистидин, аспаргин, аспаргиновая кислота, глутамин, глутаминовая кислота, фенилаланин, изолейцин, лейцин, триптофан, цистеин и пролин.

4. Мутантный про-НРФ по п.1, характеризующийся тем, что участок расщепления протеазой замещен в позициях 101 и 103 любой аминокислотой, выбранной из списка: аланин, валин, глицин, серин, треонин, метионин, тирозин, гистидин, аспаргин, аспаргиновая кислота, глутамин, глутаминовая кислота.

5. Мутантный про-НРФ по п.1, характеризующийся тем, что участок расщепления протеазой замещен в позициях 101 и 103 любой аминокислотой, выбранной из списка: аланин и валин.

6. Мутантный про-НРФ по любому из пп.1-3, характеризующийся тем, что участок расщепления протеазой замещен в позиции 101 валином.

7. Мутантный про-НРФ по любому из пп.1-3, характеризующийся тем, что участок расщепления протеазой замещен в позиции 101 аланином.

8. Мутантный про-НРФ по любому из пп.1-7, характеризующийся тем, что участок расщепления протеазой в позиции R⁴, которая соответствует позиции 104 последовательности SEQ ID NO: 1, замещен лизином.

9. Мутантный про-НРФ по любому из пп.1-8, характеризующийся тем, что участок расщепления протеазой в позиции S, которая соответствует позиции 102 последовательности SEQ ID NO: 1, замещен любой аминокислотой, выбранной из списка: глицин, цистеин, аспаргин, тирозин, треонин, аспаргиновая кислота, глутамин, аланин, валин, глутаминовая кислота, гистидин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, пролин, триптофан или метионин.

10. Мутантный про-НРФ по любому из пп.1-9, характеризующийся тем, что участок расщепления протеазой замещен в позиции 101 валином или аланином, в позиции 102 серином и в позиции 104 аргинином.

11. Мутантный про-НРФ по любому из пп.1-10, имеющий последовательность SEQ ID NO: 5.

12. Мутантный про-НРФ по любому из пп.1-11, образованный путем рекомбинантной экспрессии в прокариотических клетках.

13. Мутантный про-НРФ по п.12, образованный путем рекомбинантной экспрессии в Е. coli.

14. Способ получения биологически активного человеческого бета-НРФ, включающий в себя следующие этапы:

(i) получение мутантного про-НРФ по любому из пп.1-13 и (ii) расщепление мутантного про-НРФ с получением активного человеческого бета-НРФ.

15. Способ по п.14, характеризующийся тем, что этап (ii) включает следующие стадии:

a) растворение телец включения мутантного про-НРФ по любому из пп.1-13 в денатурирующем растворе;

b) помещение мутантного про-НРФ в ренатурирующий раствор, в котором денатурированный проНРФ принимает биологически активную форму;

16. Способ по п.15, характеризующийся тем, что денатурирующий раствор включает:

(i) хаотропное вещество;

(ii) хелатор;

(iii) буфер и (iv) агент восстановитель.

17. Способ по п.16, характеризующийся тем, что денатурирующий раствор имеет следующий со став:

i) 1-8 М гуанидиния-HCl, предпочтительно 4-6 М;

ii) 0.01-1 M Tris;

iii) 1-50 мМ EDTA;

iv) 1-100 мМ глутиона (GSH) или цистеина;

v) pH 7.0-10.0.

18. Способ по п.17, характеризующийся тем, что денатурирующий раствор имеет следующий состав:

i) 4 М гуанидиния-HCl;

ii) 0.1 M Tris;

iii) 10 мМ EDTA;

iv) 5 мМ GSH или цистеина;

v) pH 8.0.

19. Способ по п.15, характеризующийся тем, что ренатурирующий раствор имеет следующий состав:

i) 0.5-1.0 М шаперона;

ii) 1-10 мМ хелатора металлов;

iii) 0.1-10 мМ редокс перетасовочной системы;

iv) pH 8.0-11.0.

20. Способ по п.19, характеризующийся тем, что ренатурирующий раствор имеет следующий со став:

i) 0.75 М аргинина;

ii) 5 мМ EDTA;

iii) 1 мМ L-цистина и 5 мМ L-цистеина или 1 мМ GSSG (окисленного глутатиона) и 5 мМ GSH (редуцированного глутатиона);

iv) pH 9.5.

21. Способ по любому из пп.15 и 17-20, характеризующийся тем, что ренатурацию осуществляют путем пульсовой ренатурации.

22. Способ по п.21, характеризующийся тем, что концентрация гуанидиния-HCl не превышает 0.3 М, а концентрация белка на каждую пульсацию не превышает 50 мг/мл относительно конечного объема пересворачивания во время пульсационной ренатурации.

23. Способ по п.15, характеризующийся тем, что мутантный про-НРФ очищают с помощью хроматографии смешанного типа.

24. Способ по п.23, характеризующийся тем, что в хроматографии используют хроматографическую колонку, содержащую смешанный материал с синтетическим аффинным лигандом.

25. Способ по п.24, характеризующийся тем, что хроматографическая колонка содержит 4меркапто-этилпиридин (МЕР), гексиламино (НЕА), фенилпропиламино (РРА), 2-меркапто-5бензамидазолсульфокислоту (MBI), Capto MMC (GEHC), Ы-бензил-Ы-метилэтаноламин (GEHC), СНТ гидроксиапатид или СНТ фтор-апатид.

26. Способ по п.25, характеризующийся тем, что хроматографическая колонка содержит 4меркапто-этилпиридин (МЕР).

27. Способ по любому из пп.14-26, характеризующийся тем, что мутантный про-НРФ расщепляют протеазой.

28. Способ по п.27, характеризующийся тем, что мутантный про-НРФ расщепляют серинпротеазой.

29. Способ по п.28, характеризующийся тем, что мутантный про-НРФ расщепляют трипсином.

- 29 031333

c) очистка ренатурированного мутантного про-НРФ;

d) расщепление мутантного про-НРФ с получением активного бета-НРФ.

30. Способ по п.29, характеризующийся тем, что соотношение трипсина к мутантному про-НРФ находится в диапазоне 1:200-1:100.000 (по весу).

- 31 031333

Фигура 2а. Обработка немутантного про-НРФ

Участок Трипсинового расщепления

PF N RTHVSArIsSHPIF

О й-НРФ]

Й-НРФ

Уничтоженный фуриновый участок расщепления

Фигура 2Ь. Обработка мутантного про-НРФ SP174-101 (SEQ ID N0:5)

Фиг. 3

Фиг. 5

Дорожка Проба 1 Пустая 2 PageRuler ™ предокрашенный 3 Rh-προ-ΗΡΦ* 1 мг 4 Пул МЕР 5 Триптическое расщепление 6 Триптическое расщепление 7 Триптическое расщепление 8 НРФ 1 мг

31. Способ по п.30, характеризующийся тем, что соотношение трипсина к мутантному про-НРФ находится в диапазоне 1:5.000-1:20.000 (по весу).

32. Способ по п.31, характеризующийся тем, что соотношение трипсина к мутантному про-НРФ составляет 1:10.000 (по весу).

33. Способ по любому из пп.14-32, характеризующийся тем, что он включает дополнительный этап очистки бета-НРФ.

34. Способ по п.33, характеризующийся тем, что он включает дополнительный этап очистки бета- 30 031333

НРФ с помощью хроматографической колонки.

35. Способ по п.34, характеризующийся тем, что он включает дополнительный этап очистки бетаНРФ с помощью колонки, содержащей SP-сефарозу.

36. Применение мутантного про-НРФ по любому из пп.1-13 для получения человеческого бетаНРФ.

Фигура 1а. Последовательность человеческого про-НРФ (SEQ ID N0:1)

MEPHSES1WPAGHTIPQVHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFST QPPREA ADTQDLDFE VGG AAPFN RTHK5KKSSSH PIF H RG E FSVC DSVS V W VG DKTTATDI KG KEV MV LG EV NIN NSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR

Фигура lb. Последовательность мутантного про-НРФ, описанного в изобретении (SEQ ID N0:2)

MEPHSESNVPAGHTIPQVHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDRRLFKKRRLRSPRVLFST QPPRE A ADTQDLDFE VGG AAPFN RTH I^MtSSS HPIF Н RGEFS VCDS VS VWVGD KTTATDI KG KE VMVLGEVNI N NSVFKQYF FETKCRD P N P VD SG CRGI DS К H W N SYCTTTHTFVKA LTMDG КОДА W R Fl RIDTACVCVLSRK A VR

Фигура lc. Последовательность мутантного про-НРФ, описанного в изобретении, (SEQ ID N0:3)

MEPHSESNVPAGHTIPQVHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFST QPPRE A ADTQDLDFE VGG AAPFN RTHXSXKSSSH PIF H RG E FSVC DSVSV W VG DKTTATD I KG KEV MV LG E V NIN NSVFKQ.YFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTHHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR

Фигура Id. Последовательность мутантного про-НРФ, описанного в изобретении, (SEQ ID N0:4)

MEPHSESIWPAG HTIPQVH WTKLQHSLDTALRRARS АР AAAI AARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPR VLF$T QPPREA ADTQDLDFE VGGAAPFNRTHTO4RSSSHPIFHRGEFSV CDS VS VW VGDKTTATDIК GKEVMVLGEVNIN N S VF KQY FF ETK CR DPN PV DSG CRG I DS К H W N SYCTTTHTFV KA LTMDG KQA AWRFIR,IDTACVCVLS R К AVR

Фигура le. Последовательность мутантный про-НРФ SP174-101 (SEQ ID N0:5)

MEPHSESNVP AG HTIPQVH WTKLQHSLDTALRRARSAP AAAI AARVAGQTRN ITVDPRLFKKRRLRSPR VLF$T QPPRE A ADTQDLDFE VGG AAPFN RTH WSARSSS H PIF H RG E F 5 VCDS VS VW VG D KTTATDI KG К E VM VLG EV NIN N S VF KQY FF ETK CR DPN P V DSG CRG I DS К H W N S YCTTTHTFV KA LTMDG KQA AWRFIRIDTACVCVLS R К AVR

Фигура If. Последовательность мутантного про-НРФ, описанного в изобретении, (SEQ ID N0:7)

MEPHSESNVP AG HTIPQVH WTKLQHSLDTALRRARS АР AAAI AARVAGQTRN ITVDPRLFKKRRLRSPR VLFST QPPRE A ADTQDLDFE VGG AAPFN RTHXXXflSSS H PI F H RG EFS VCDS VS VWVGD KTT ATDl KG KE VM V LG E V NIN NSVFKQYFFETK CRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFV KA LTMDGKQMWRFIRI DTACVCVLS RKAVR

Фигура lg. Последовательность мутантного про-НРФ, описанного в изобретении, (SEQ ID N0:8)

MEPHSESiWPAG HTIPQVH WTKLQHSLDTALRRARS АР AAAI AARVAGQTRN ITVDPRLFKKRRLRSPR VLFST QPPRE AADTQDLDFE VGG AAPFN RTH VXAftSSS H PIF H RGE F S VCDS VS VWVG D KTTATDI KG К E VM VLGE VNl N NSVFKQVF FETKCRD P N P VD SG CRG IDSK H WNSY CTTTHTF VK ALTM DG KQA AW R FI Rl DTACVCVLS R KA VR

Фигура lh. Участок расщепления протеаз

Фиг. 1

RXKR (SEQ ID N0:6); RSKR (SEQ ID N0:9);

VSXR (SEQ ID N0:10); XSXR (SEQ ID N0:11);

XS AR (SEQ ID N0:12); VS AR (SEQ ID N0:13);

XXXR (SEQ ID N0:14); VXAR (SEQ ID N0:15)

Фиг. 2

- 32 031333