KR20140103318A - 신규 prongf 돌연변이체 및 베타-ngf의 제조에서의 이의 용도 - Google Patents

신규 prongf 돌연변이체 및 베타-ngf의 제조에서의 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 proNGF 돌연변이체 및 이의 용도, 특히 인간 베타-NGF를 제조하기 위한 proNGF 돌연변이체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 불활성 불용성 proNGF 돌연변이체로부터 생물학적 활성 인간 베타-NGF를 제조하는 방법을 개시한다. 본 발명의 proNGF 돌연변이체는 천연 프로테아제 절단 부위 R1SK3R4가 적어도 인간 야생형 proNGF 서열의 위치 101 및 103에 상응한 위치 R1 및 K3에서 Arg 또는 Lys가 아닌 임의의 아미노산으로 치환된다.

Description

신규 PRONGF 돌연변이체 및 베타-NGF의 제조에서의 이의 용도{NOVEL PRONGF MUTANTS AND USES THEREOF IN THE PRODUCTION OF BETA-NGF}
본 발명은 천연 프로테아제 절단 부위가 치환되는 신규 proNGF 돌연변이체에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 불활성 불용성 proNGF 돌연변이체로부터 생물학적 활성 인간 베타-NGF를 제조하는 방법 및 인간 베타-NGF를 제조하기 위한 proNGF 돌연변이체의 용도가 개시된다.
신경 성장 인자(베타-NGF)는 뉴런(지각 및 교감)의 성장 및 생존에 결정적 역할을 하는 신경영양 인자이다(Levi-Montalcini, R., Science 237 (1987) 1154; Thoenen, H., et al., Physiol. Rev. 60 (1980) 1284; Yankner, B. A., et al., Annu. Rev. Biochem. 51 (1982) 845). 베타-NGF는 안정한 이량체 단백질 구조를 취하는 성장 인자의 시스테인-노트(knot) 수퍼패밀리에 속한다. 추가적으로, 베타-NGF는 중추신경계의 콜린발생 뉴런의 성장, 분화 및 생활력을 촉진한다(Hefti, F. J., J. Neurobiol. 25 (1994) 1418). 재조합 인간 신경 성장 인자의 가능한 치료적 증상은, 예를 들면 당뇨병과 연관되거나 또는 AIDS 치료에서 가능한 부작용으로서 말초 지각 신경병증을 포함한다. 베타-NGF의 다른 증상은 중추 신경병증, 예컨대 알츠하이머병이다. 이 경우, 기억상실이 콜린발생 뉴런의 손실의 결과이다. 베타-NGF는 또한 인간 피부 및 각막 궤양의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다(Bernabei et al. Lancet 1999; Lambiase et al. NEJM 1998). 게다가, 베타-NGF는 또한 녹내장 실험 동물 모델에서 변질 및 아폽토시스로부터 망막 세포를 보호하고 녹내장에 영향을 받은 약간의 환자들에서 시각 기능을 향상시키는 것으로 확인되었다(Lambiase A, et al. PNAS 2009).
성숙 인간 베타-NGF는 241개의 아미노산으로 이루어진 프레프로단백질로서 번역되는 118개의 아미노산 단백질이다. 18개의 아미노산의 신호 펩티드(프레펩티드)는 소포체(ER)로의 전좌 동안 절단된다. 생성된 프로단백질(proNGF)은 이의 N-말단에서 프로테아제 절단에 의해 프로-서열을 제거함으로써 가공된다. 성숙 인간 NGF는 설치류(쥐과동물 및 래트) 베타-NGF에 대해 고도의 동일성(약 90%)을 제시한다. 임상 연구 또는 치료적 용도의 경우, 베타-NGF는 고농도로 제공되어야 한다. 마우스의 악하선은 베타-NGF의 천연원이다. 하지만, 이러한 베타-NGF의 제제는 상이한 이량체의 불균일 혼합물이며 이에 따라 치료적 용도에 적합하지 않다. 추가적으로, 단백질의 인간 형태를 환자에게 투여하는 것이 바람직하다. 하지만, 인간 조직에서, 신경영양 인자는 저농도로만 존재한다.
프로-서열은 성숙 단백질과 분리된 도메인이다(도 1의 서열 데이타를 참조하고, 이때 프로-서열은 볼드체로 표시함). 이러한 2개의 도메인은 인간 proNGF 서열(서열 번호 1)의 위치 101 내지 104에 위치한 유형 Arg-Ser-Lys-Arg의 염기성 아미노산 표적 서열을 갖는 노출된 프로테아제 절단 부위에 의해 분리된다. 이러한 모티프는 세린 엔도프로테아제 퓨린의 천연 절단 부위이다. 추가적으로, 이 절단 부위는 다른 적당한 프로테아제에 의해, 바람직하게는 아미노산 아르기닌(Arg, R) 다음을 절단하는 기질 특이성을 갖는 프로테아제에 의해 특이적으로 가공될 수 있다. 예를 들면, 프로테아제 트립신은 염기성 아미노산, 예컨대 리신(Lys, K) 또는 아르기닌(Arg, R) 다음을 절단한다.
불활성 프로-형태(pro-form)로부터의 생물학적 활성 베타-NGF의 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, EP 0 994 188 B1에는 용해성이 좋지 않은 불활성 프로-형태로부터 생물학적 활성 베타-NGF를 제조하는 방법이 기술되어 있다. 이 방법에 따르면, 베타-NGF는 변성 용액에 용해된 재조합 불용성 불활성 proNGF로부터 수득가능하다. 이후에, 용해된 proNGF를 비변성 또는 약한 변성 용액으로 옮긴다. 변성된 proNGF는 천연 베타-NGF에 존재하는 디설피드 결합에 의해 확인되는 생물학적 활성 구조를 취한다. 이어서, proNGF의 프로-서열이 절단됨으로써 활성 베타-NGF가 수득된다.
인간 proNGF는 천연 프로테아제 (퓨린) 절단 부위 Arg-Ser-Lys-Arg를 함유함으로써, 하기 서열 모티프: R1SK3R4를 갖는다. "우수 의약품 제조관리기준 "(GMP) 품질 수준에서 요구하는 것과 같은 특정한 제조 공정의 경우, 효소와 같은 물질은 고품질로 제조되어야 한다. 프로테아제 퓨린은 현재 GMP-등급 프로테아제로서 입수가 불가능하다.
따라서, 대안적인 프로테아제, 트립신(EC 3.4.21.4)이 proNGF를 절단하여 성숙 베타-NGF 단백질을 유도하도록 선택되었다. 세린 프로테아제 트립신은 염기성 아미노산 아르기닌 또는 리신의 카르복실 측에서 펩티드 쇄를 절단한다. 인간 proNGF에서, 인간 proNGF의 천연 발생 절단 부위는 염기성 아미노산을 갖는 3개의 위치(서열 번호 1의 위치 101, 103, 및 104; 대안적으로 본원에서 R1, K3 및 R4로 지칭됨)를 함유한다. 따라서, 트립신에 의한 proNGF의 절단은 절단이 정확히 어디에서 일어나는지에 따라 수많은 상이한 절단 생성물을 유도할 수 있다. 전형적인 절단 생성물은 SK3R4-베타-NGF 및 R4-베타-NGF 및 성숙 베타-NGF이다. 베타-NGF 단백질의 이량체화가 다음 단계에서 반드시 정제되어야 할 심지어 더 많은 수(최대 6개)의 불균일 생성물을 초래하기 때문에 이 문제는 악화된다(도 2a 참조).
본 발명의 기저를 이루는 기술적 문제 및 이의 해법
베타-NGF의 제조 방법이 종래 기술에 기술된 바 있다. 하지만, 현재 이용가능한 제조 방법은 불균일 베타-NGF 생성물 및 저수율의 베타-NGF와 같은 몇가지 결점을 갖는다.
베타-NGF를 제조하는 트립신에 의한 야생형 proNGF의 절단은 충분한 수율의 절단된 베타-NGF를 수득하기 위해 부득이하게 매우 많은 양의 효소를 사용하게 되어 낮은 효율을 나타내었다. 이는 후속 정제 과정에 영향을 미치는 몇가지 단점을 갖는다. 우선, 몇몇의 분해 생성물을 유도하는 절단의 선택성을 더욱 감소시킨다. 둘째로, 최종 단백질 샘플 내에 효소가 부재하여야 하기 때문에 효소로부터 베타-NGF의 정제가 필요하다. 이는 과잉 트립신을 제거하는 데 수회의 정제 절차를 암시한다. 따라서, 종래 기술의 절차에서 절단 효소로서 트립신의 사용은 매우 낮은 수율의 베타-NGF 또는 단백질의 정제 문제를 야기한다.
당업계에 상기 기술된 결점이 없는 베타-NGF의 제조 방법에 대한 요구가 남아있는 것은 말할 나위도 없다. 따라서, 본 발명의 기저를 이루는 문제는 고품질, 고효율 및 고수율로 수득되는 베타-NGF의 신규 제조 방법을 제공하는 것이다. 추가로, 본 발명의 기저를 이루는 문제는 고수율의 베타-NGF를 유도하고, 효율적이고, 강력하며, 증감가능하고 재현가능한 베타-NGF의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 장점은 신규 proNGF 돌연변이체로부터 베타-NGF를 제조한다는 점이다. 신규 돌연변이체는 신규 proNGF 돌연변이체가 프로테아제에 의한 불균일 분해를 방지하여 불균일 베타-NGF 생성물을 방지하기 때문에 우수한 수율의 균일한 베타-NGF 생성물을 유도한다. 본 발명의 문제는 본 발명의 proNGF 돌연변이체 및 본 발명에 기술된 roNGF 돌연변이체로부터 베타-NGF를 제조하는 방법을 제공함으로써 해결된다.
신규 돌연변이체는 야생형과 비교하였을 때 본 발명의 돌연변이된 proNGF의 관련 부위에서 트립신의 절단 효율에 있어 예상외의 현저한 증가를 유도한다. 이는 야생형에서 사용한 양과 비교하였을 때 극저량의 프로테아제 트립신을 사용하도록 하고, 그 결과, 효소 자체 및 절단 부산물로부터의 베타-NGF의 정제 문제를 감소시킨다.
청구범위 독립항의 청구 대상에 의해 상기 기술된 문제가 해결되고 장점이 실현된다. 본 발명의 바람직한 구체예는 종속항 및 하기 설명, 실시예 및 도면에 포함된다.
상기 개관은 본 발명에 의해 해결되는 모든 문제를 기술한 것은 아니다. 본 출원을 연구한 후 당업자라면 추가의 문제 및 이의 해결 방법을 알 수 있을 것이다.
본 발명의 요약
제1 측면에서, 본 발명은 프로테아제 절단 부위 R1SK3R4가 적어도 인간 야생형 proNGF 서열(서열 번호 1)의 위치 101 및 103에 상응한 위치 R1 및 K3에서 비염기성 아미노산 및 히스티딘으로부터 선택된 아미노산으로 치환되는 proNGF 돌연변이체에 관한 것이다.
제2 측면에서, 본 발명은 천연 프로테아제 절단 부위 R1SK3R4가 적어도 인간 야생형 proNGF 서열(서열 번호 1)의 위치 101 및 103에 상응한 위치 R1 및 K3에서 치환되는 불활성 불용성 proNGF 돌연변이체로부터 생물학적 활성 인간 베타-NGF를 제조하는 방법으로서,
(i) 본 발명에 따른 proNGF 돌연변이체를 제공하는 단계, 및
(ii) 상기 proNGF 돌연변이체를 절단하여 활성 인간 베타-NGF를 수득하는 단계
를 포함하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로는, 본 발명은
a. 변성 용액에서 proNGF 돌연변이체를 용해하는 단계;
b. 변성된 proNGF가 생물학적 활성 구조를 취하는 리폴딩(refolding) 용액으로 proNGF 돌연변이체를 옮기는 단계;
c. 리폴딩 용액으로부터 proNGF 돌연변이체를 정제하는 단계;
d. proNGF 돌연변이체의 프로-서열을 절단하여 활성 베타-NGF를 수득하는 단계
를 포함하는 방법에 관한 것이다
본 발명의 제3 측면은 적어도 천연 프로테아제 절단 부위 R1SK3R4의 위치 101의 아르기닌 및 위치 103의 리신이 인간 야생형 proNGF(서열 번호 1)의 위치 101 내지 104에서 인간 베타-NGF의 제조를 위해 비염기성 아미노산으로 치환된 proNGF 돌연변이체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 적어도 천연 프로테아제 절단 부위 R1SK3R4의 위치 101의 아르기닌 및 위치 103의 리신이 인간 야생형 proNGF(서열 번호 1)의 위치 101 내지 104에서 비염기성 아미노산 및 히스티딘으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 proNGF 돌연변이체로부터 제조된 베타-NGF 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
이러한 본 발명의 요약은 본 발명의 모든 특징을 기술한 것은 아니다. 하기 상세한 설명의 검토로 다른 구체예도 알게될 것이다.
본 발명의 상세한 설명
정의
하기 본 발명을 상세하게 설명하기 전, 당업자라면 본 발명은 본원에 기술된 특정한 방법론, 프로토콜 및 시약에 한정되지 않으며 이들이 다양할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자라면 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술하는 목적이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당업계의 당업자에게 공통적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
문맥상 달리 요구되지 않는 한, 하기 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 용어 "포함한다", 및 변형예, 예컨대 "포함하는"은 다른 임의의 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 제외하는 것이 아니고 언급된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군의 포함을 의미한다는 것을 이해할 것이다.
여러가지 문헌들(예: 특허, 특허 출원, 과학 출판물, 안내물 등)은 본 명세서의 본문 전반에 걸쳐 인용된다. 본원에는 본 발명이 종래의 발명으로 인해 그러한 개시내용을 선행한다는 자격을 주는 것이 아닌 허용된 것으로서 이해되지 않는다.
서열: 본원에 나타낸 모든 서열들은 모든 내용 및 개시내용과 함께 본 명세서의 일부인 첨부된 서열 목록에 개시된다.
용어 "약"은 수치 값과 관련하여 사용되었을 경우 제시된 수치 값보다 5% 작은 하한 및 제시된 수치 값보다 5% 큰 상한을 갖는 범위 내의 수치 값을 포괄한다는 것을 의미한다.
용어 "proNGF" 또는 "pro-NGF"는 인간 베타-NGF의 프로-형태를 지칭한다. 완전 인간 proNGF 서열은 서열 번호 1(도 1a)에 규정된다. 성숙 베타-NGF를 수득하기 위해, pro펩티드 proNGF는 프로테아제에 의해 절단되어야 한다. 베타-NGF의 프로-서열은 성숙 베타-NGF와 분리된 도메인이다. 상기 두 도메인 사이에, 서열 번호 1의 위치 101 내지 104에서 천연 프로테아제 절단 부위 Arg-Ser-Lys-Arg(본원에는 R1SK3R4로 지칭됨, 서열 번호 9)가 존재한다. 절단 부위는 적당한 프로테아제, 구체적으로는 퓨린 프로테아제에 의해 특이적으로 가공될 수 있다.
용어 "proNGF 돌연변이체" 또는 "pro-NGF 돌연변이단백질"은 아미노산의 치환에 의해 인간 베타-NGF의 프로-형태의 변형을 지칭한다. 본 발명의 pro-NGF 돌연변이단백질은 천연 프로테아제 절단 부위 R1SK3R4(서열 번호 9)가 적어도 인간 야생형 proNGF 서열(서열 번호 1)의 위치 101 및 103에 상응한 위치 K3 및 R1에서 비염기성 아미노산 및 히스티딘으로부터 선택된 아미노산으로 치환된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 위치 K3(위치 103에 상응함)에서 아미노산 리신은 알라닌으로 치환된다(도 1d, 서열 번호 4, 도 1e, 서열 번호 5, 도 1g, 서열 번호 8 참조).
본 발명의 또다른 바람직한 구체예에서, 위치 R1(위치 101에 상응함)에서 아미노산 아르기닌은 발린으로 치환된다(도 1b, 서열 번호 2, 도 1e, 서열 번호 5, 도 1g, 서열 번호 8 참조).
본 발명의 또다른 구체예에서, 야생형 proNGF 서열(서열 번호 1)의 위치 104에 상응한 아미노산 아르기닌 R4는 단백질분해 절단에 의해 proNGF를 가공하여 베타-NGF를 수득할 수 있는 임의의 아미노산, 바람직하게는 염기성 아미노산, 예컨대 아르기닌 또는 리신으로 치환될 수도 있다. 예를 들면, 위치 R4에서 알라닌의 존재는 proNGF의 베타-NGF로의 가공을 방지한다. 따라서, 본 발명의 돌연변이체는 위치 104에서 알라닌을 함유할 수 없다.
Figure pct00001
용어 "비염기성 아미노산"은 양으로 하전되지 않은 임의의 아미노산을 지칭한다. 이 용어는 염기성 아미노산 이외의 아미노산 잔기를 지칭한다. 이 용어는 양의 측쇄를 지닌 아미노산인 아미노산 리신 또는 아르기닌을 제외한다. 비염기성 아미노산은 음으로 하전된 아미노산 글루탐산 및 아스파르트산, 극성 비하전된 측쇄를 지닌 아미노산(세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민), 소수성 측쇄를 지닌 아미노산(알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판) 및 아미노산 시스테인, 글리신 및 프롤린이다.
이와 같이 용어 "생물학적 활성 pro-NGF" 또는 "생물학적 활성 구조를 갖는 proNGF"는 pro-NGF의 생물학적 활성을 지칭한다. proNGF의 생물학적 활성 구조는 자연적으로 베타-NGF에 발생하는 디설피드 교상결합의 존재에 의해 확인된다. 그 활성은, 예를 들면 본원에 참고 인용된 문헌[Chevalier et al. 1994, Blood 83: 1479-1485, 1994]에 기술된 검정에 따라 확인될 수 있다. 실시예 11에는 TF1 세포의 증식 자극을 통한 proNGF의 생물학적 활성의 검정이 기술되어 있다.
용어 "베타-NGF"란 바람직하게는 인간 유래의 성숙 베타-신경 성장 인자를 지칭한다. 위치 105에서 출발하는 성숙 베타-신경 성장 인자의 서열이 도 1(서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5, 서열 번호 7, 및 서열 번호 8)에 도시된다.
이와 같이 용어 "베타-NGF의 활성" 또는 "생물학적 활성 베타-NGF"는 베타-NGF의 생물학적 활성을 의미한다. 생물학적 활성 베타-NGF는 이량체의 형태로 존재한다. 베타-NGF는 생물학적 활성 구조를 갖는 이량체 형태로 존재하여야 한다. 베타-NGF의 생물학적 활성 구조의 전제조건은 시스틴 노트에 대한 디설피드 교상결합의 올바른 형성이다. 그 활성은, 예를 들면 DRG 검정(배근 신경절 검정)에 따라 확인될 수 있으며, 예를 들어 문헌[Levi-Montalcini, R. et al., Cancer Res. 14 (1954) 49], 및 [Varon, S. et al., Meth. in Neurochemistry 3 (1972) 203]에서 참고한다. 이러한 검정에서, 닭 배아의 해리성 배근 신경절로부터 지각 뉴런의 자극 및 생존이 신경돌기 형성에 의해 모니터링된다.
용어 "치환"은 아미노산의 치환으로 인간 베타-NGF의 프로-형태의 변형을 지칭한다. 그 용어는 예를 들어 화학적 기 또는 잔기를 본래의 아미노산으로 치환 또는 본래의 아미노산에 첨가함으로써 아미노산의 화학적 변형을 포함한다. 선택된 아미노산의 변형 단계는 바람직하게는 유전적 수준에서 돌연변이유발에 의해 수행된다. 바람직하게는, proNGF의 변형은 proNGF에 속하는 DNA의 변화를 위한 유전 공학 방법에 의해 수행된다. 변형은 단일 염기 뉴클레오티드를 유전 물질의 또다른 뉴클레오티드로 치환을 유도하는 돌연변이이다. 지점 돌연변이는 야생형 서열과 비교하였을 때 상이한 아미노산을 코딩하도록 유도한다. 바람직하게는, 변형된 proNGF 단백질의 발현이 이후 원핵 또는 진핵 유기체, 가장 바람직하게는 원핵 유기체에서 수행된다.
용어 "변성하는" 또는 "변성"이란 단백질의 폴딩 구조가 변경되는 과정을 지칭한다. 이 용어는 proNGF 또는 pro-NGF 돌연변이단백질의 3차 구조를 언폴딩(unfolding)시키는 것을 나타낸다. 폴딩 구조의 변경은 특정한 화학적 또는 물리적 요인에 노출되는 것에 의한 것이다. 결과적으로, 단백질의 본래의 특성 중 일부, 특히 이의 생물학적 활성이 줄어들거나 또는 제거된다. 변성 과정으로 인해, 단백질은 생물학적으로 불활성이 된다. 추가로, 변성된 단백질은 생물학적 기능의 손실, 용해성의 손실 및/또는 응집을 비롯한 광범위한 범위의 특징을 나타낼 수 있다.
용어 "리폴딩" 또는 "복원하는" 또는 "복원"이란 단백질 구조가 이의 천연 기능적 폴딩 또는 구조를 취하는 과정을 지칭한다. 복원 또는 리폴딩 과정으로 인해, 단백질은 생물학적 활성이 된다.
용어 "재조합"이란 적당한 숙주에서 DNA에 의해 코딩된 단백질의 발현을 위한 벡터 내에서 DNA를 클로닝하는 것을 지칭한다. 숙주는 바람직하게는 원핵생물, 가장 바람직하게는 박테리아이다. 본원에 사용된 "재조합 발현" 원핵 숙주 세포에서 proNGF 또는 pro-NGF 돌연변이단백질의 발현을 지칭하며, 예컨대 재조합 단백질의 발현에 적당한 이. 콜라이(E. Coli) 균주가 사용될 수 있다.
용어 "가용성"은 일부 용매에 용해되기 쉬운 단백질을 나타낸다. 용어 "불용성"은 일부 용매에 용해되기 쉽지 않은 단백질을 나타낸다.
본 발명의 설명
본 발명의 ProNGF 돌연변이체
본 발명의 제1 구체예에서, 본 발명은 프로테아제 절단 부위 R1SK3R4가 적어도 인간 야생형 proNGF 서열(서열 번호 1)의 위치 101 및 103에 상응한 위치 R1 및 K3에서 비염기성 아미노산 및 히스티딘으로부터 선택된 아미노산으로 치환되는 proNGF 돌연변이체를 제공한다. 다시 말해, 적어도 천연 프로테아제 절단 부위 R1SK3R4의 위치 101의 아르기닌 R1 및 위치 103의 리신 K3은 인간 야생형 proNGF 서열(서열 번호 1)의 위치 101 내지 104에서 아르기닌 또는 리신이 아닌 임의의 아미노산으로 치환된다.
인간 야생형 proNGF(서열 번호 1)에서, 천연 프로테아제 절단 측은 아미노산 위치 101 내지 104(ArgSerLysArg, RSKR, 서열 번호 9)를 지칭한다. 야생형 proNGF 서열의 위치 103의 아미노산 리신 K3 및 위치 101의 아미노산 아르기닌 R1은 Arg 또는 Lys가 아닌 임의의 아미노산으로 치환되어 특히 베타-NGF를 생성하는 향상된 특성을 갖는 proNGF를 유도한다. 상기 확인된 목적을 실현하기 위해, 즉 베타-NGF를 제조하는 향상된 특성을 갖는 돌연변이단백질을 생성하기 위해, 아르기닌(R1) 또는 리신(K3)은 모든 천연 발생 아미노산, 또는 마찬지로 인공 아미노산으로 치환될 수 있으나, 단 이들은 트립신을 위한 절단 부위를 구성하지 못한다.
본 발명에 따르면, 잔기 101 내지 103에 상응한 하나 이상의 위치에 대한 아미노산 변형은 염기성 아미노산을 비염기성 아미노산으로 대체하는 치환일 수 있다. 이러한 치환은 특히 베타-NGF를 제조하기 위한 본 발명에 따른 proNGF 돌연변이체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 돌연변이체는 적어도 위치 Arg 101 및 Lys 103에서의 치환을 포함한다. 아미노산 잔기는 비염기성 아미노산 또는 히스티딘으로 대체된다. 특히, 본 발명의 돌연변이체는 치환 Arg101Val 및 Lys103Ala를 갖는다. 예를 들면 상기 천연 비염기성 아미노산은 천연 발생 아미노산 잔기 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
치환을 위한 아미노산은 염기성 (양으로 하전된) 아미노산 아르기닌(Arg) 및 리신(Lys)에서 선택되지 않는다. 또한, 아미노산 이소류신(He), 류신(Leu), 또는 페닐알라닌(Phe), 시스테인(Cys), 프롤린(Pro) 또는 트립토판(Trp)은 덜 바람직하다. 세린(Ser)은 인간 proNGF 야생형 서열의 위치 102에서 천연 발생한다. 위치 102(서열 번호 7 및 서열 번호 8)의 X는 바람직하게는 바람직하게는 인간 proNGF 서열의 위치 102에서 천연 발생하는 세린(Ser)에서 선택되지만, 또한 아미노산이 반드시 비염기성 아미노산(즉, 아르기닌 또는 리신이 아님)인 임의의 다른 아미노산에서 선택될 수 있다. 위치 102의 아미노산은 비염기성 아미노산(즉, Arg 또는 Lys이 아님)인 것이 중요하다.
야생형 인간 proNGF 서열의 위치 104에서 아미노산은 바람직하게는 인간 proNGF 서열의 위치 104에서 천연 발생하는 아르기닌(Arg)이지만, 또한 임의의 다른 아미노산, 바람직하게는 염기성 아미노산, 더욱 바람직하게는 리신으로 치환될 수 있고, 이는 단백질분해 절단에 의해 proNGF를 가공하여 베타-NGF를 수득할 수 있다.
예를 들면, 야생형 인간 proNGF의 위치 104에서 알라닌의 존재는 proNGF에서 베타-NGF로의 가공을 방지한다. 따라서, 위치 104의 Ala는 제외된다.
하기 표 2에는 proNGF의 프로테아제 절단 부위의 바람직한 치환이 요약된다.
Figure pct00002
Figure pct00003
proNGF-돌연변이단백질의 위치 101, 102, 및 103에서 Arg 또는 Lys가 아닌 임의의 아미노산이 존재하고 proNGF-돌연변이단백질의 위치 104에서 염기성 아미노산(Arg 또는 Lys)이 존재하는 것이 필수적이다. 놀랍게도 위치 101 및 103에서 특별히 2개의 아미노산 치환은 고효율의 베타-NGF 제조를 유도한다는 것이 확인되었다.
본 발명의 가장 바람직한 proNGF 돌연변이체의 서열(서열 번호 5)에서, 인간 야생형 proNGF의 위치 101의 바람직한 치환된 아미노산은 발린이고, 인간 야생형 proNGF의 위치 103은 알라닌이고, 인간 야생형 proNGF의 위치 102는 세린이고, 인간 야생형 proNGF의 위치 104는 아르기닌이다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 proNGF 돌연변이체는 서열 번호 5의 것과 상응하는 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 마찬가지로 본원에 기술된 proNGF 돌연변이체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 proNGF 돌연변이체로부터 인간 베타-NGF를 제조하는 방법
제2 측면에서, 본 발명은 천연 프로테아제 절단 부위 R1SK3R4(서열 번호 9)가 인간 야생형 proNGF 서열(서열 번호 1)의 위치 101 및 103(R1 및 K3)에서 치환된 불활성 불용성 proNGF 돌연변이체로부터 생물학적 활성 인간 베타-NGF를 제조하는 방법으로서, 천연 프로테아제 절단 부위 R1SK3R4가 인간 야생형 proNGF 서열의 위치 101 및 103(R1 및 K3)에서 치환된 proNGF 돌연변이체를 제공하는 단계, 및 상기 proNGF 돌연변이체를 절단하여 활성 인간 베타-NGF를 수득하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, proNGF 돌연변이체는 원핵 세포에서 재조합 발현에 의해 수득된다. 적당한 박테리아 균주, 예를 들어 이. 콜라이, 바실러스 종(Bacillus sp.), 및 살모넬라(Salmonella)는 당업계에 잘 공지되어 있고, 이러한 발현계를 위한 키트는 구입 가능하다. 재조합 발현에 바람직한 숙주 세포는 이. 콜라이, 예컨대 이. 콜라이 BL21, JM 108/109 (K12), JM106, JM83 및 TBI 또는 이의 유도체이다. 재조합 단백질의 발현에 적당한 임의의 다른 이. 콜라이 균주가 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 원핵 숙주 세포에서 본 발명의 융합 단백질의 발현을 허용하는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 이러한 발현 조절 서열은 비제한적 예로서 유도성 및 비유도성 프로모터, 작동유전자, 리프레서 및 당업자에게 공지되어 있고 유전자 발현을 구동시키거나 그렇지 않은 경우 조절하는 기타 요소를 포함한다. 그러한 조절 요소는, 예를 들면 T7, TAC, PBAD, LAC 프로모터, LacI, LacIQ 리프레서를 포함한다.
proNGF 돌연변이체의 서열은 적당한 벡터에 의해 원핵 숙주 세포 내에 도입된다. 적당한 벡터는, 비제한적 예로서 pBR322, pMAL, pUC19 및 모든 유도체일 수 있다. 원핵 숙주 세포는, 비제한적 예로서 예를 들면 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 플라스미드 DNA, 재조합 박테리오파지 DNA, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터에 의해 형질전환될 수 있는 원핵 세포, 예컨대 박테리아(예, 이. 콜라이 또는 비. 서브틸리스(B. subtilis))를 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 플라스미드 벡터가 사용된다. 비제한적 예로서, EP1697523B1에 기술된 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다(상기 문헌은 본원에 참고 인용됨).
pro-NGF 돌연변이단백질을 발현하기 위해,
a. 전사를 유도하는 강력한 프로모터(예, tac 또는 T7 프로모터),
b. proNGF 또는 pro-NGF 돌연변이단백질의 코딩 서열
c. 전사/번역 종결부위(예, 박테리오파지 람다의 tO-종결부위)
d. 제1 선택성 마커 유전자, 예컨대 항생제 내성(예, 카나마이신 내성, kan)을 코딩하는 유전자,
e. 제2 선택성 마커 유전자, 예컨대 proB 및/또는 proA를 코딩하는 유전자,
f. 리프레서 유전자(예, lacI 유전자)
g. 높은 복제 갯수의 복제 기점
를 함유하는 발현 벡터가 사용된다.
본 발명의 일 구체예에서, 특허받은 발현 벡터(Scil Proteins GmbH, 적당한 발현 벡터의 구조로 EP1697523B1 참조) 또는 구입 가능한 벡터를 클로닝에 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 벡터의 일반적인 정보와 관련하여, 상기 언급된 상세한 사항에서 언급되어 진다. 하지만, 임의의 적당한 벡터는 당업계에 공지된 것으로 사용될 수 있다.
원핵 숙주 세포의 형질전환을 위한 적당한 벡터의 일례로서 특허받은 발현 벡터 pSCIL1O1의 구조가 하기 도시된다:
Figure pct00004
proNGF 돌연변이체의 제조 방법은 하기 초기 단계를 포함한다:
i. pro-NGF 돌연변이단백질을 코딩하는 핵산을 제조하는 단계,
ii. 상기 핵산을 원핵 세포 발현 벡터 내에 도입하는 단계;
iii. 상기 발현 벡터를 숙주 세포 내에 도입하는 단계;
iv. 숙주 세포를 배양하는 단계;
v. 숙주 세포를 적당한 배양 조건으로 처리하는 단계.
원핵 숙주 세포에서의 발현으로 인해, pro-NGF 돌연변이단백질은 불활성, 불용성 형태의 형태이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 proNGF 돌연변이체로부터의 베타-NGF의 제조 방법은
a. 변성 용액에서 봉입체의 가용화에 의해 천연 프로테아제 절단 부위 R1SK3R4가 인간 야생형 proNGF 서열(서열 번호 1)의 위치 101 및 103에 상응한 위치 R1 및 K3에서 치환된 proNGF 돌연변이체를 용해하는 단계;
b. 변성된 proNGF가 생물학적 활성 구조를 취하는 리폴딩 용액으로 상기 proNGF 돌연변이체를 옮기는 단계;
c. 리폴딩 용액으로부터 proNGF 돌연변이체를 정제하는 단계;
d. proNGF 돌연변이체의 프로-서열을 절단하여 활성 베타-NGF를 수득하는 단계
를 포함한다.
하기에서, 본 발명에 따른 proNGF 돌연변이체로부터 베타-NGF를 제조하는 방법의 바람직한 단계가 논의된다.
단계 a: proNGF 돌연변이체의 가용화
단계 a)는 변성 용액에서 봉입체의 가용화에 의해 천연 프로테아제 절단 부위 R1SK3R4가 인간 야생형 proNGF 서열(서열 번호 1)의 위치 101 및 103에 상응한 위치 R1 및 K3에서 치환된 proNGF 돌연변이체를 용해하는 단계에 따른 것이다. 단계 a)의 본 발명의 proNGF 돌연변이체는 통상 원핵 숙주 세포에서의 발현으로 인해 이의 불활성, 불용성 형태의 형태인 것을 유념한다. 불량한 용해성을 나타내는 불활성 proNGF는 원핵생물의 시토졸에서 단백질의 과발현 동안 형성된다. 이 경우, 재조합에 의해 제조된 proNGF는 불용성 및 응집된 형태로 세포질에 잔류한다. 이러한 단백질 응집체, 이의 단리물 및 이의 정제는, 예를 들어 문헌[Marston, F. A., Biochem. J. 240 (1986)]에 기술된다.
이러한 불활성 단백질 응집체(봉입체)를 단리하기 위해, 원핵 세포를 파괴한 후 발효시킨다. 세포 파괴는 통상의 방법, 예컨대 고압 균질화, 초음파처리 또는 리소자임에 의해 수행될 수 있다(Rudolph, R., et al. (1997); Folding proteins. In: Creighton, T. E. (ed.): Protein Function: A Practical Approach. Oxford University Press, pp. 57-99).
추가로, 봉입체를 가용화한다. 봉입체(IB)는 통상 결함이 있거나 불완전하게 폴딩된 단백질의 축적물이다. 이들은 재조합 단백질의 과도한 발현이 일어나는 경우 세포, 예를 들면 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이 내부에 형성된다. 본 발명에 따라 사용된 봉입체는 바람직하게는 pro-NGF 돌연변이단백질을 포함한다. 이는 이들이 (단백질의 총량을 기준으로) 60 중량% 이상, 70 중량% 이상, 80 중량% 이상 또는 90 중량% 이상의 proNGF를 함유한다는 것을 의미한다.
본 발명은 언폴딩된, 불활성, 불용성 pro-NGF 돌연변이단백질 또는 이의 유도체인 봉입체가 변성 버퍼(용액)에서 가용화되는 pro-NGF 돌연변이단백질의 제조 방법을 제공한다.
단계 a)의 변성 용액은 바람직하게는 (i) 카오트로픽 제제(chaotropic agent), (ii) 킬레이터, (iii) 버퍼, 및 (iv) 환원제를 함유하는 용액을 포함한다.
변성 버퍼는 하나 이상의 카오트로픽 물질(제제)을 포함한다. 수중에 정돈된 수소 교상 결합을 용해시킨 화학적 물질을 카오트로픽이라고 지칭한다. 수소 교상 결합이 파쇄 개방되기 때문에, 카오트로픽 물질은 물 구조를 방해하고 질병을 보장한다(엔트로피의 증가). 이의 이유는 용매화에 필요한 H20 케이지 구조의 형성이 방지되기 때문이다. 아미노산의 경우, 단백질 폴딩의 원동력은 수중에서 소수성 아미노산과 함께 모아지는 것 때문에, 소수성 효과가 감소되고 단백질 상 변성 작용을 갖는다. 일반적으로, 가용화 버퍼에서 소수성 효과가 발휘되고 이에 따라 단백질 상 변성 작용을 갖는 임의의 물질은 카오트로픽 물질로서 사용될 수 있다. 카오트로픽 물질은 일반적인 염 또는 저분자량 화합물, 예컨대 우레아이다. 카오트로픽 물질은 세제와 확실히 구별되는데, 그 이유는 이들이 분자 내 소수성 라디칼, 예컨대 알킬 라디칼을 함유하지 않기 때문이다. 일반적으로, 카오트로픽 작용은 프레트롬빈의 경우에, 단백질의 용해성의 향상을 동반한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 카오트로픽 화합물은 구아니디늄 염, 특히 구아니디늄 히드로클로라이드 및 구아니디늄 티오시아네이트, 요오다이드, 바륨 염, 티오시아네이트, 우레아 및 퍼클로레이트에서 선택된다.
카오트로픽 화합물은 통상적인 양으로 사용된다. 예를 들면, 4∼8 M 구아니디늄 히드로클로라이드 또는 4∼9 M 우레아가 사용될 수 있다.
변성 버퍼는 환원제 화합물, 예컨대 디설피드 화합물, 예를 들어 글루타티온(GSH)을 포함한다. 디설피드 화합물은 봉입체 내 폴리펩티드의 시스테인의 티올 기(-SH)와 디설피드를 혼합하여 형성시킬 수 있다. 디설피드를 용액에 첨가한다. 디설피드는 봉입체가 포함하고 가능하게는 디설피드 교상결합을 포함하는 단백질을 지정하지 못한다. 바람직하게는, 디설피드는 진정한 펩티드가 아니다. 바람직하게는, 디설피드는 저분자량 화합물이다. 분자량은, 예를 들어 2,000 g/몰 미만 또는 1,000 g/몰 미만이다. 디설피드는, 예를 들어 5 mM∼1 M, 특히 10 mM∼0.5 M의 농도로 사용된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 디설피드 화합물은 글루타티온 디설피드이다. 글루타티온(GSH), 또한 γ-L-글루타밀-L-시스테인일글리신은 3개의 아미노산 글루탐산, 시스테인 및 글리신으로부터 형성된 슈도-트리펩티드이다. GSH는 원핵생물 및 진핵생물 둘다의 세포질에 존재하며 디설피드 교상결합의 형성에 관련된다. 이것은 디설피드 교상 결합을 함유하는 이량체 GSSG와 평형 상태이다. 글루타티온은 디설피드 교환 반응에서 2개의 폴리펩티드 또는 단일 폴리펩티드로부터의 시스테인 R-SH 및 R'-SH와 반응한다:
R-SH + GSSG → R-S-S-G + GSH.
RSSG는 혼합 디설피드로 지칭된다. 이는 폴리펩티드의 추가의 시스테인과 반응하여, 그 결과 디설피드 교상 결합이 2개의 시스테인 사이에서 수득된다:
R-S-S-G + HS-R' → R-S-S-R' + GSH.
글루타티온은 시토졸에서 환원된 형태(GSH)로 효소로 유지된다. 이에 따라 시토졸의 "환원 조건"으로 나타낸다. 디설피드 화합물이 상기 기술된 반응에 따라 디설피드 교상결합의 형성을 촉진하는 것을 포함하는 조건이 가용화 버퍼에서 확립된다. GSSG는, 예를 들어 10 mM∼0.5 M의 농도에서 사용된다.
대안적으로, 환원제로서, 시스테인이 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 변성 용액은 트리스 버퍼이다.
변성 용액은 추가의 통상적 첨가제, 예를 들어 EDTA 또는 염을 포함할 수 있다. 가용화 버퍼의 pH는, 예를 들어 7∼10, 바람직하게는 pH 8이다. 가용화는, 예를 들면 통상적인 균질화 장치에 의해 또는 초음파에 의해 기계적으로 보조되는 것이 바람직하다. 가용화 후, 잔류하는 고체는 분리되는 것이 바람직하다. 상청액은 가용화된 pro-NGF를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 변성 용액은
i. 구아니디늄-HCl, 1∼8 M, 바람직하게는 4∼6 M, 가장 바람직하게는 4 M, GSH 또는 시스테인, 1∼100 mM, 바람직하게는 5 mM,
ii. 트리스, 0.01∼1 M, 바람직하게는 0.1 M,
iii. EDTA, 1∼50 mM, 바람직하게는 10 mM,
iv. pH 7.0∼10.0, 바람직하게는 pH 8.0
을 포함한다.
4 M 구아니디늄-HCl의 농도는 대부분의 경우 pro-NGF 돌연변이단백질의 완전 변성에 충분하다.
단계 b: proNGF 돌연변이체의 리폴딩
봉입체로부터 proNGF 돌연변이체의 가용화 후 이의 천연 구조로 단백질을 리폴딩할 필요가 있다. 리폴딩 과정의 경우 경쟁 반응 미스폴딩(misfolding) 및 응집을 최소화하는 것이 중요하다. 응집을 막기 위해 리폴딩은 매우 낮은 단백질 농도에서 수행되는데 그 이유는 단백질의 응집이 높은 단백질 농도에서 두드러지기 때문이다. 단계 b)에서, proNGF 돌연변이체의 리폴딩 버퍼로의 이동은 변성된 proNGF가 생물학적 활성 구조를 취하도록 한다. 생물학적 활성 구조는 천연 베타-NGF에서 발생하는 디설피드 교상결합의 존재에 의해 확인될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 가용화된 pro-NGF 돌연변이체는 하나 이상의 샤프론(chaperone), 하나 이상의 금속 킬레이터, 및 산화환원 셔플링(shuffling) 시스템을 함유하는 리폴딩 용액에서 복원된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 방법은
i. 샤프론, 바람직하게는 아르기닌, 0.5∼1.0 M, 바람직하게는 0.75 M,
ii. 금속 킬레이터, 바람직하게는 EDTA, 1∼10 mM, 바람직하게는 5 mM,
iii. 산화환원 셔플링 시스템, 0.1∼10 mM, 바람직하게는 1 mM L-시스틴 및 5 mM L-시스테인, 또는 1 mM GSSG(산화된 글루타티온) 및 5 mM GSH(환원된 글루타티온),
iv. pH 8.0∼pH 11.0, 바람직하게는 pH 9.5
를 포함하는 리폴딩 용액을 사용한다.
대안적인 산화환원 셔플링 시스템, 예컨대 시스타민/시스테아민이 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 폴딩 보조제는 아르기닌이다. 단백질의 폴딩을 촉진하는 화합물은 일반적으로 "폴딩 보조제"로서 사용될 수 있다. 이러한 화합물은 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 다양한 방식으로 폴딩을 보조할 수 있다. 아르기닌은 부정확하게 폴딩된 중간체를 불안정하게 하여, 이를 (열역학적 데드-엔드(dead-end)로부터) 적어도 부분적으로 다시 언폴딩되도록 하여 다시 정확하게 폴딩될 수 있도록 하는 것으로 추정된다. 다른 한편, 글리세롤은 통상 단백질을 안정화시킨다. 본 발명에 따른 방법에서 폴딩된 pro-NGF 돌연변이단백질의 완전한 수율이 폴딩 보조제를 사용하지 않는 방법과 비교하였을 때, (폴딩에 사용된 proNGF의 총량을 기준으로) 5% 초과, 특히 10% 초과 또는 20% 초과하여 증가하는 화합물은 특히 폴딩 보조제로서 적당하다.
리폴딩은 바람직하게는 pH 8∼11, 특히 pH 9.5에서 수행된다.
리폴딩 용기에서 단백질 농도를 증가시키기 위해, 펄스 복원(pulse renaturation)이 수행되었다. 펄스 수의 제한은 0.3 M을 초과하지 않아야 하는 구아니디늄-HCl 농도이다. 펄스 당 단백질 농도는 최종 리폴딩 부피에 대하여 50 ㎍/㎖를 초과하지 말아야 한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 피가용화물을 몇몇 분획으로 또는 수일에 걸쳐 연속적으로 폴딩 뱃치에 첨가한다. 바람직하게는, 피가용화물에 대한 신속한 희석에 의해 "펄스 복원"으로 피가용화물을 첨가한다. 이러한 문맥에서, 비제한적 예로서, 예를 들어 24시간의 시간 간격으로 6 이상의 펄스가 수행될 수 있다. 펄스 수는 가용화 뱃치의 첨가 후 아직 폴딩이 안된 단백질의 농도가 너무 높지 않도록 설정되며, 그 이유는 그렇지 않은 경우 응집체가 수득되기 때문이다. 예를 들면, (피가용화물의 첨가 후 폴딩 뱃치 내 단백질 농도를 기준으로) 각 펄스에 따라 0,05 g/ℓ 내지 0,2 g/ℓ, 바람직하게는 0.1 g/ℓ의 단백질이 새롭게 폴딩 뱃치로 이동한다. 예를 들면, 각 리폴딩 단계는 적어도 1∼2시간이 걸린다.
리폴딩 후, 리폴딩 반응물은 컬럼에 로딩하기 전에 정화될 필요가 있다. 이것은 당업자에게 공지된 임의 방법, 예컨대 여과에 의해 실시될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 정확하게 폴딩된 proNGF 돌연변이체의 제조 방법은 a) 불용성 proNGF 돌연변이체를 포함하는 봉입체를 상기 기술된 변성 용액에 가용화하는 단계, 및 b) 이후 가용화된 pro-NGF를 상기 기술된 리폴딩 용액 버퍼에서 복원하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 변성 용액 및/또는 리폴딩 용액은 결과적으로 세제를 함유하지 않는다. 세제의 사용은 pro-NGF 돌연변이단백질의 가용화 및/또는 폴딩에 필요하지 않다는 것을 발견하였다. 이것은 특정한 세제가, 약학 생성물이 포함하지 않거나 또는 극소량으로만 포함하며 이에 따라 고가의 방식으로 제거되어야 하는 화학적 물질에 대해 비교적 공격적이기 때문에 유리하다. 그러므로, 본 발명에 따른 방법은 단백질 폴딩에 그러한 공격적인 세제(트리톤 X-100 또는 Brij-58)가 사용되는 Soejima 등(2001)의 방법과 비교하였을 때 유리하다. 다시 말해, 본 발명에 따른 전체 제조 방법에서 세제가 사용되지 않으며, 이로 인해 이 제조 방법은 세제-불포함이다.
단계 c: 크로마토그래피에 의한 proNGF 돌연변이체의 정제
변성 및 후속 리폴딩에 의해 본 발명에 따른 방법을 수행함으로써, 폴딩된 pro-NGF 돌연변이단백질의 수용액을 수득한다. 이어서 공지된 방법에 의해 폴딩된 pro-NGF 돌연변이단백질을 추가로 정제할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 크로마토그래피 정제를 통해, 특히 혼합 방식 크로마토그래피(본 발명의 proNGF 돌연변이체로부터의 베타-NGF의 제조 방법의 단계 c)에 의해 proNGF 돌연변이체를 리폴딩(예, 비변성 또는 약 변성) 용액으로부터 정제한다. 크로마토그래피에 가장 바람직한 컬럼은 합성 친화력 리간드, 바람직하게는 4-머캅토-에틸-피리딘(MEP Hypercell; Pall)을 갖는 컬럼이다. 이 매질의 장점은 결합이 이온 강도와 무관하고, 염 스태킹(stacking)이 불필요하며 과정이 빨라지도록 더 높은 유속이 가능하다는 점이다. 추가로, 용출은 pH-이동에 의해 실시된다.
다른 혼합 방식 물질 컬럼도 공지되어 있으며 사용될 수 있다. 비제한적 예로서, MEP(Pall; 친화력 리간드는 4-머캅토 에틸 피리딘임), HEA(Pall; 친화력 리간드: 헥실아미노), PPA(Pall, 친화력 리간드: 페닐프로필아미노), MBI(Pall; 친화력 리간드: 2-머캅토-5벤즈아미다졸 설폰산), Capto MMC(GEHC), Capto adhere(GEHC; 친화력 리간드: N-벤질-N-메틸 에탄올아민), CHT 히드록시아파타이트(BioRad), CHT 플루오로아파티드). MEP, HEA, PPA, 및 MBI 컬럼은 소수성 결합을 갖고, Capto MMC는 혼합 방식 작용성을 갖는 양이온 교환기이고 Capto adhere는 혼합 방식 작용성을 갖는 음이온 교환기이다. BioRad 컬럼은 소수성 성분을 갖는 이온 교환 컬럼이다. 본원에 나열되지 않은 기타 임의의 혼합 방식 물질 컬럼도 또한 proNGF 돌연변이체를 정제하는 데 사용될 수 있다.
단계 d: proNGF의 베타-NGF로의 절단
proNGF는 베타-NGF의 전구체이다. 따라서, 본 발명의 proNGF 돌연변이체로부터의 베타-NGF의 제조 방법의 단계 d)에서, proNGF 돌연변이체의 프로-서열을 절단하여 활성 베타-NGF를 수득한다.
트립신-유사 기질 특이성을 갖는 프로테아제는 단백질 분자의 활성 부분을 분해하는 일 없이 단백질을 절단한다. 트립신-유사 프로테아제는 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 아르기닌 또는 리신 다음의 펩티드 결합을 절단한다. 트립신-유사 프로테아제로서, 몇몇 세린 프로테아제(세린 엔도펩티다제)가 베타-NGF를 유도하는 proNGF의 가공에 고려된다. 바람직하게는, 세린 프로테아제 트립신이 프로-서열의 절단에 사용되지만 다른 프로테아제가 대신 사용될 수도 있다.
절단은 트립신 그 자체에만 한정되지 않고, 마찬가지로 트립신-유사 기질을 갖는 다른 프로테아제를 수반할 수 있다는 것을 유념한다. 일반적으로, proNGF 대 트립신 (또는 다른 프로테아제)의 비율이 적절하게 조정되는 경우, 정확하게 폴딩된, 성숙 베타-NGF는 상기 프로테아제에 의해 절단되지 않는다. 대조적으로, 폴딩 중간체와 마찬가지로 변성된 단백질은 프로테아제에 의한 공격에 민감한 서열을 노출한다.
바람직하게는, proNGF 돌연변이체의 베타-NGF로의 절단의 경우, 트립신 (또는 다른 프로테아제) 대 proNGF 돌연변이체의 비율은 중량 기준으로 1:200 내지 1:100,000, 더욱 바람직하게는 1:5,000 내지 1:20,000이고, 가장 바람직한 것은 1:10,000(w/w)의 비율이다. 가장 바람직한 구체예에서, 절단은 실온에서 8∼23시간 동안, 가장 바람직하게는 18시간 동안 일어난다. 본 발명에 사용된 조건 하에서, proNGF 돌연변이체는 완전하게 절단되며 부산물이 거의 형성되지 않는다. 응집도 관찰되지 않았다.
실시예에서 명확하게 기술되는 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 proNGF 돌연변이체에 도입된 아미노산 변형이 불필요한 절단 부위에서의 단백질의 절단을 막을뿐 아니라 또한 예상외로 야생형 proNGF의 것과 비교하였을 때 트립신의 절단의 효율에 상당한 증가를 유도하며, 이는 매우 선택적 조건 하에서 절단을 수행하도록 하여 매우 순수한 생성물을 수득하도록 한다는 것을 밝혀내었다.
상세하게는, 실험 데이타에는 이미 매우 낮은 트립신/단백질 비율, 예컨대 1:100,000에서, 본 발명의 proNGF 돌연변이체(서열 번호 5)가 높은 절단 수율(약 85%)을 갖는 매우 높은 순도의 재조합 인간 베타-NGF를 유도한다는 것이 명확하게 제시된다. 추가적으로, 동일한 트립신/단백질 비율에서 야생형 proNGF(서열 번호 1)는 낮은 절단 수율(약 5%)을 나타낸다. 만족스러운 수율은 오직 훨씬 더 높은 트립신/단백질 비율(1/250)에서만 수득되고, 이것은 과분해로 인해 낮은 선택성 및 높은 생성물 열화를 동반한다.
단계 e: 베타-NGF의 추가 정제
예를 들어 몇몇의 크로마토그래피 방법에 의해 본 발명의 proNGF 돌연변이체로부터 생성된 베타-NGF를 추가 정제한다. 추가 정제 단계는 베타-NGF로부터 트립신 및 트립신에 의한 분해 불순물과 관련된 생성물을 분리시키는 것이 필요하다. 정제 단계는 HCP, 내독소, 및 DNA를 감소해야 한다. 단백질 정제로 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 가장 바람직한 것은 예를 들어 세파로스 컬럼(예, SP 세파로스 HP, Q 세파로스 FF)에 의한 크로마토그래피 정제이다.
proNGF로부터 생성된 최종 생성물 베타-NGF는 SDS-PAGE, rp-HPLC, SE-HPLC, 및 IEX-HPLC에 의해 이의 순도와 관련하여 분석되었다. HPLC 분석은 97% 이상의 베타-NGF 순도를 밝혀내었다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 베타-NGF를 수득하기에 적당한 pro-NGF 돌연변이단백질의 제조 방법은
a) 원핵 세포에서 치환된 프로테아제 절단 부위를 갖는 재조합 proNGF 돌연변이체를 발현하는 단계
b) pro-NGF 돌연변이단백질-함유 봉입체를 단리하는 단계,
c) 봉입체와, 적어도 (i) 카오트로픽 물질, (ii) 킬레이터, (iii) 버퍼, 및 (iv) 환원제를 포함하는 적당한 변성 버퍼를 혼합하는 단계,
d) 적어도 샤프론, 금속 킬레이터, 및 산화환원 셔플링 시스템을 포함하는 리폴딩 용액에서 리폴딩하는 단계,
e) 리폴딩된 proNGF 돌연변이체를 정제하는 단계,
f) 프로테아제, 예컨대 트립신에 의해 베타-NGF의 활성 형태로 절단하는 단계
g) 베타-NGF를 단리 및 정제하는 단계
를 포함한다.
베타-NGF의 제조에서의 proNGF의 용도
제3 측면에서, 본 발명은 인간 베타-NGF의 제조에서의 본 발명의 proNGF 돌연변이체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 proNGF 돌연변이체로부터 수득한 베타-NGF의 약학 조성물
추가 측면에서, 본 발명은 천연 프로테아제 절단 부위 R1SK3R4가 상기 기술된 인간 야생형 proNGF 서열(서열 번호 1)의 위치 101 및 103(K3 및 R1)에서 치환된 proNGF-돌연변이체로부터 수득한 베타-NGF 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 약학적 활성 베타-NGF는 유전자 치료 방법에 의해 환자에게 투여된다. 유전자 치료에는, 환자 내 유전자, 이 경우 베타-NGF를 코딩하는 유전자 도입에 적당한, 이용가능한 2가지 기본 방법이 있다.
생체외 응용예에서, 베타-NGF를 코딩하는 약학적 활성 유전자는 벡터에 의해 생체 세포에 도입되고, 이때 생체 세포는 바람직하게는 교질 세포이고, 이러한 방식으로 처리된 세포는 이후 예를 들어 마이크로입자 또는 나노입자에 의해 환자 내에 재도입된다. 특히 바람직한 것은 세포 게놈 내 베타-NGF 유전자의 특이적 통합이다.
생체내 유전자 치료에서, 베타-NGF 유전자는, 벡터에 의해, 예를 들어 한편으로는 표적 세포를 감염시킬 수 있고, 이에 따라, 약학적 활성 베타-NGF 유전자를 도입시킬 수 있지만, 다른 한편으로는, 표적 세포 내에서 그 자체를 복제할 수는 없는 바이러스에 의해 체내 표적 세포로 수송된다. 이러한 접근법으로, 세포막과 융합될 수 있는 나노입자 또는 마이크로입자, 예컨대 리포솜은 마찬가지로 벡터로 사용될 수 있다.
베타-NGF 유전자를 위한 벡터로서, 바이러스 또는 항체는 예를 들어 숙주 세포를 특이적으로 감염시킬 수 있거나 또는 표적 세포에서 항원과 면역반응하는 것으로서 사용될 수 있다. 바이러스 비히클로서, 레트로바이러스가 예로서 사용될 수 있다. 추가적으로, 아데노바이러스 또는 박시니아(Vaccinia) 기반 벡터, 예컨대 변형된 박시니아 바이러스 앙카라(Ankara)(MVA)를 사용하는 것도 가능하다.
당업자는 일상적인 고려사항을 바탕으로 적당한 제형을 선택할 수 있고 본 발명의 약학 조성물을 환자에게 투여하는 적당한 형태를 선택한다. 예를 들면, 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 성분, 예컨대 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 이러한 부류의 물질 중, 하나는 충전제, 염, 버퍼, 안정화제, 경피흡수 촉진제 및 기타 잘 공지된 물질로 명명될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형을 위한 기법은 잘 공지된 표준 교과서, 예컨대 ["Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co.(미국 펜실베니아주 이스턴 소재), 최종 에디션]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명에 기술된 제조 방법에 의해 수득된 베타-NGF의 투여량은 주입에 의한 투여의 경우 체중 1 kg 당 0.1 ㎍∼500 ㎍, 및 주사에 의한 투여의 경우 체중 1 kg 당 2 ㎍∼2 mg의 범위 내에 있을 수 있다.
도 1에는 본 발명의 proNGF 및 proNGF 돌연변이체의 서열이 도시된다.
인간 베타-NGF의 형태의 서열은 볼드체로 도시하였다. 프로테아제 (트립신) 절단 부위는 볼드체 및 밑줄로서 도시하였다(서열 번호 1의 아미노산 101-104; 트립신 절단 부위는 아미노산 101-102(R1), 103-104(K3) 및 104-105(R4)의 사이에 있음). 서열 내 X는 임의의 아미노산일 수 있다.
도 1a에는 프로테아제 절단 부위 RSKR(서열 번호 9)을 갖는 인간 proNGF의 서열(서열 번호 1)이 도시된다.
도 1b에는 프로테아제 절단 부위 VSXR(서열 번호 10)을 갖는 본 발명의 proNGF 돌연변이체의 서열(서열 번호 2)이 도시된다.
도 1c에는 XSXR(서열 번호 11)로 돌연변이된 프로테아제 절단 부위를 갖는 본 발명의 proNGF 돌연변이체의 서열(서열 번호 3)이 도시된다.
도 1d에는 XSAR(서열 번호 12)로 돌연변이된 프로테아제 절단 부위를 갖는 본 발명의 proNGF 돌연변이체의 서열(서열 번호 4)이 도시된다.
도 1e에는 VSAR(서열 번호 13)로 돌연변이된 프로테아제 절단 부위를 갖는 본 발명의 proNGF 돌연변이체의 서열(서열 번호 5)이 도시된다.
도 1f에는 XXXR(서열 번호 14)로 돌연변이된 프로테아제 절단 부위를 갖는 본 발명의 proNGF 돌연변이체의 서열(서열 번호 7)이 도시된다.
도 1g에는 VXAR(서열 번호 15)로 돌연변이된 프로테아제 절단 부위를 갖는 본 발명의 proNGF 돌연변이체의 서열(서열 번호 8)이 도시된다.
도 1h에는 프로테아제 절단 부위의 서열(서열 번호 6, 9-15)이 도시된다.
도 2. proNGF 또는 proNGF 돌연변이체의 베타-NGF로의 가공
도 2a에는 천연 퓨린 절단 부위 RSKR을 갖는 야생형 proNGF를 사용하여 트립신 절단 후 6개의 베타-NGF 절단 생성물이 도시된다. 도면에는 야생형 proNGF의 베타-NGF로의 절단이 수많은 상이한 절단 생성물의 불균일 혼합물을 유도한다는 것이 명확하게 도시된다.
도 2b에는 천연 퓨린 절단 부위가 결실된 proNGF 돌연변이체 SP174-101(서열 번호 5)을 사용하여 트립신 절단 후 천연 베타-NGF 절단 생성물이 도시된다. 프로테아제 절단 부위 RSKR(서열 번호 9)은 부위 VSAR(서열 번호 12)을 유도하는 2개의 아미노산으로 치환되었다. 이러한 부위는 위치 104의 아미노산 아르기닌 다음에서 프로테아제에 의해서만 절단될 수 있으며; 트립신은 (3개 대신에) 1개의 절단 부위에서만 절단할 수 있다. 도면에는 돌연변이체 proNGF SP174-101(서열 번호 5)의 베타-NGF로의 절단이 단 1개의 균일한 절단 생성물(베타-NGF)을 유도한다는 것이 명확하게 도시된다.
도 3에는 야생형 proNGF와 비교하였을 때 proNGF 돌연변이체 SP174-101(서열 번호 5)의 리폴딩이 도시된다. 도면에는 야생형 proNGF (실선) 및 VSAR로 돌연변이된 프로테아제 절단 부위를 갖는 proNGF 돌연변이체(파선)의 리폴딩 수율을 비교하였다. 도면으로부터 야생형 및 돌연변이체 proNGF의 리폴딩 효율이 동일하다는 것을 명확하게 확인할 수 있다.
도 4에는 MEP HyperCel 컬럼에 의한 VSAR(서열 번호 5)로 돌연변이된 프로테아제 절단 부위를 갖는 proNGF 돌연변이체 SP174-101의 정제가 도시된다. 도면에는 리폴딩되고 여과된 proNGF 돌연변이체의 MEP HyperCel 정제의 용출 프로파일이 도시된다.
도 5에는 트립신에 의한 VSAR(서열 번호 5)로 돌연변이된 프로테아제 절단 부위를 갖는 proNGF 돌연변이체 SP174-101의 절단이 도시된다. 도면에는 트립신 절단의 분획의 쿠마씨 착색 SDS-PAGE 겔이 도시된다. proNGF 돌연변이체의 트립신 절단 생성물은 래인 4∼7에서 확인할 수 있다. 도면에는 정제된 proNGF 돌연변이체가 단 1개의 절단 생성물(베타-NGF)만을 유도한다는 것이 명확하게 도시된다.
도 6에는 베타-NGF의 정제가 도시된다. 도면에는 트립신 절단 후 SP 세파로스 HP 컬럼의 프로파일이 도시된다. 트립신 분해 반응물이 SP 세파로스 HP 컬럼 상에서 로딩되었다. 용출은 3개의 단계로 실시되었다(a. 25% 25 mM 인산나트륨, 1 M NaCl, pH 6.5(버퍼 B), b. 25∼50% 버퍼 B의 선형 구배, 및 c. 100% 버퍼 B(유속 60 cm/h)).
하기 실시예는 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물의 제조 및 사용 방법에 대한 완전한 개시내용 및 설명을 제공하기 위해 제시되며, 본 발명자가 본 발명으로 간주하는 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 사용된 횟수와 관련하여 정확도를 보장하고자 하는 노력을 취하였지만 일부 실험 오차 및 편차도 유발될 수 있다. 달리 제시하지 않는 한, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이며, 압력은 대기압이거나 또는 대략 대기압이다.
실시예 1. 위치 101 내지 104(R 1 SK 3 R 4 )의 프로테아제 절단 부위에서 야생형 proNGF의 치환
당업자에게 공지된 방법으로 합성된 유전자를 사용하여 DNA 수준에서 인간 proNGF(서열 번호 1)의 위치 101 및 103에 상응한 아르기닌 R1 및 리신 K3의 치환을 구현하였다. 또한, 당업자에게 공지된 방법으로 합성된 유전자를 사용하여 DNA 수준에서 인간 proNGF(서열 번호 1)에서 불변한 위치 102의 세린 또는 위치 102의 치환을 구현하였다. 위치 104에 상응한 리신 K4는 치환되지 않았다. 서열을 도 1에 도시하였다.
실시예 2. 원핵 세포에서의 proNGF 돌연변이체 SP174-101(서열 번호 5)의 재조합 발현
rh-proNGF의 발현에 사용되는 박테리아 숙주 이. 콜라이 JM108(DSMZ 5585; F- thi Δ (lac-proAB) end AI gyrA96 relAl phx hsdR17 supE44 recA)은 명칭 pSCIL101을 갖는 플라스미드를 사용하여 중화된 프롤린-영양요구성이다. 플라스미드 pSCIL101은 플라스미드 pSCIL008을 기초로 한다(WO05061716 참조). 균주는 티아민을 합성할 수 없다(Vieira & Messing, 1982 Gene. Oct;19(3):259-68). 서열 번호 5에서 확인된 proNGF 돌연변이체는 pSCIL101에 위치한 tac 프로모터의 제어 하에 발현된다. 여기서 사용된 벡터 pSCIL101은 카나마이신 내성을 갖는 높은 복제 플라스미드이다. 발현이 규정된 무기 염 배지에서 수행되고 IPTG의 첨가에 의해 유도된다. proNGF 돌연변이체가 봉입체(IB)의 형태로 시토졸에서 침착된다.
세포주:
- 숙주 균주, 예를 들어 이. 콜라이 HMS174(K12) 또는 JM108(K12)
- proNGF 돌연변이체 SP174-101(서열 번호 5)
- Tac 프로모터(IPTG 유도)
- ColE1 레플리콘
- 카나마이신 내성
- proBA 선택
- 특허받은 벡터 시스템 pSCIL 101(예, WO05/061716 참조)
실시예 3. 발효
이 발효의 목적은 후속 과정 단계의 생성물 및 바이오매스를 얻기 위한 것이었다. 발효 과정 동안 표적 단백질의 과발현을 모니터링하기 위해, 유도 전 및 후에 SDS-PAGE에 의해 샘플을 분석하였다.
- 항생제 불포함 무기 염 배지
- 뱃치 상 μ
Figure pct00005
0.25 h-1 (ODend=18)
- μset = 0.18 h-1 공급된 페드 뱃치 상 I 지수
- 페드 뱃치 상 II: 일정한 공급 속도
- 유도점 ODind = 60 ± 5
- 1.0 mM IPTG
- 유도 시간 5시간
- 최종 OD = 82 ± 4
- 공정 시간 28.5시간 ± 1.25
- 플라스미드 안정성 100%
- 수율: 40 mg/g proNGF; 1,2 g/L ± 0.2 g/L proNGF
실시예 4. SP174-101을 함유하는 봉입체의 1차 회수
박테리아 세포에서, 재조합 단백질은 응집체의 형태로 존재한다. pro-NGF 돌연변이단백질의 발현은 IB의 형태로 일어난다. 세포 파괴 및 IB 제조는 표준 프로토콜에 따라 수행되었으며 대략 200 g의 바이오매스의 워크업까지 실험 규모 하에서 실시될 수 있다. pro-NGF 돌연변이단백질을 함유하는 이러한 "봉입체"의 제조는 문헌[Rudolph, R., et al. (1987); Folding proteins. In: Creighton, T. E. (ed.): Protein Function: A Practical Approach. Oxford University Press, pp. 57-99]에 따라, 그리고 EP0994188B1에 따라 수행되었다. 세포 파괴의 경우에는, 세포 펠렛을 적당한 버퍼 중에 현탁시킨 후 50 mM Natriumphosphat pH 7.0, 1 mM EDTA에서 고압 균질화를 사용하여 세포를 파괴하였다.
실시예 5. 변성 용액 중 proNGF 돌연변이체 SP174-101의 용해(봉입체의 가용화)
용액 (i) 카오트로픽 제제, (ii) 킬레이터, (iii) 버퍼, 및 (iv) 환원제을 포함하는 변성 용액 중에 봉입체를 가용화시켰다. 가용화의 경우, 구아니디늄 HCl(GuaHCl)을 4.0∼6.0 M의 농도 범위에서 테스트 하였다. 가용화 버퍼를 상이한 비율로 봉입체 슬러리(IB 슬러리)와 혼합하였다. 모든 실험은 5 mM의 최종 시스테인 농도를 가졌으며 실온에서 수행되었다. SDS-PAGE로 결과를 분석하였다(데이타는 제시되지 않음). 실험은 4 M GuaHCL 농도가 봉입체의 완전한 가용화에 충분하다는 것을 밝혀냈다. 봉입체 슬러리 대 버퍼의 비율은 1 + 1.25 (v/v)(IB 슬러리 : 버퍼)이다. 봉입체의 가용화를 위한 변성 용액의 최종 조건은 다음과 같았다:
i. 4 M 구아니디늄-HCl,
ii. 0.1 M 트리스,
iii. 10 mM EDTA
iv. 5 mM 시스테인
v. pH 8.0
표준 절차에 따라 심층 여과로 피가용화물을 정화하였다. 그리고나서 브래드포드 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다(Bradford, M. M., Anal. Biochem. 72 (1976) 248). pro-NGF 돌연변이단백질의 단백질 농도는 10∼20 mg/㎖이었다.
실시예 6. 변성된 proNGF가 생물학적 활성 구조를 취하는 리폴딩 버퍼로의 proNGF 돌연변이체 SP174-101의 전달
가용화 후, 단백질의 천연 구조로 단백질을 리폴딩하고 이에 의해 미스폴딩 및 응집을 최소화하는 것이 필요하다. 가용화된 물질로부터 본 발명에 따른 생물학적 활성 pro-NGF 돌연변이단백질을 제조하기 위해, proNGF가 생물학적 활성 구조를 취하는 리폴딩 용액에서 이들을 희석하였다.
IB-슬러리를 기초로 하는 피가용화물의 최종 리폴딩 용액은 다음을 포함하였다:
i. 0.75 M 아르기닌
ii. 5 mM EDTA
iii. 1 mM L-시스틴 및 5 mM L-시스테인
iv. pH 9.5
활성 구조의 NGF의 수득은 성숙 인간 베타-NGF에서 일어나는 디설피드 교상결합의 존재에 의해 확인되었다.
리폴딩 과정에서 단백질 농도를 증가시키기 위해, 펄스 복원을 수행하였다. 펄스는 50 ㎍/㎖의 proNGF 돌연변이체 단백질 당 매시간 제공되었다. 용액 중 구아니디늄-HCl의 농도는 0.3 M을 초과하지 말아야 한다. 이를 실현하기 위해, 15 펄스가 필요하였다. 정화된 리폴딩된 분획을 여과한 후 추가 컬럼에 로딩하였다.
rp-HPLC에 의해 매 펄스 후 리폴딩 반응의 성능을 분석하였다. 생성된 피크 면적은 펄스 수에 대하여 플로팅되었다. rp-HPLC의 경우, 가드 컬럼(예, 214GK54; 300 Å; Vydac)을 갖는 역상 컬럼(예, 214MS54, 4.6 x 250 mm; 300 Å, 5 ㎛, Vydac)이 사용되었다. 러닝 버퍼는 0.05% 트리플루오로아세트산(TFA)를 갖는 H20 및 0.05% TFA를 갖는 아세토니트릴이었다. 유속은 1 ㎖/분이었다. 결과를 도 3에 도시하였다. 야생형 및 돌연변이체 proNGF의 리폴딩 효율이 동일하다는 것을 도 3에서 확인할 수 있다.
실시예 7. 혼합 방식 물질 컬럼을 통한 리폴딩 용액으로부터의 proNGF 돌연변이체 SP174-101의 정제
합성 친화력 리간드, 4-머캅토-에틸-피리딘(MEP)을 갖는 컬럼을 사용하였다. pH값을 이동시킴으로써 용출을 실시하였다. 추가로, 효율적인 과정 고안에 유리한 저 염 농도로 용출을 수행하였다.
컬럼은 0.75 M 아르기닌, 5 mM EDTA, pH 9.5로 평형을 이루었다. 정화된 리폴딩 반응물을 L 컬럼 배지 당 최대 로딩 용량이 5 g의 proNGF 돌연변이체인 MEP HyperCel 컬럼(Pall) 상에 로딩하였다. 세척 단계에서, 버퍼 2 M GuaHCl, 0.1 M 트리스-HCl, pH 8.0 및 10 mM 트리스-HCl, pH 8.0을 사용하여 대부분의 불순물 및 비결합된 단백질을 격감시켰다. 0∼70%의 선형 구배로 50 mM 아세테이트, pH 4.0(유속 120 cm/h)으로부터 용출을 실시하였다. 도 4에는 본 발명의 VSAR(서열 번호 5)로 돌연변이된 프로테아제 절단 부위를 갖는 리폴딩되고 여과된 proNGF 돌연변이체의 MEP HyperCel 정제의 용출 프로파일이 도시된다. GuaHCL 세척 단계에서 수많은 불순물이 제거되었다. "풀"에서, 약 60∼70%의 proNGF 돌연변이체를 회수하였다.
실시예 8. 활성 베타-NGF의 수득을 위한 proNGF 돌연변이체 SP174-101의 절단
proNGF 돌연변이체를 베타-NGF로 만들기 위한 트립신 분해를 위해, 프로테아제 활성을 억제하지 않는 인산염 버퍼를 사용하였다. 인산나트륨 버퍼를 MEP-용출액에 첨가하여 최종 농도가 25 mM 인산나트륨이 되었다. pH-값을 pH 6.5로 조정하였다. 단백질 가수분해를 위해, 트립신(Roche, GMP 등급)을 1:10,000 (w/w)(트립신:proNGF)의 비율로 첨가하였다. 단백질 가수분해를 실온에서 18시간의 배양 시간을 사용하여 수행하였다. 트립신 분해의 성능 및 수율을 SDS-PAGE, rp-HPLC 및 UV/VIS280nm에 의해 분석하였다. 도 5에는 트립신 절단의 분획의 SDS-PAGE가 도시되었다. 4∼12% 비스/트리스-겔, 1 mm, 1x MES를 러닝 버퍼(Invitrogen)로서 사용하였다. 래인 5∼7에는 미절단된 proNGF 돌연변이체(rhproNGF*, 래인 3 참조) 및 성숙 베타-NGF(NGF; 래인 8 참조)와 비교된 트립신 절단 생성물이 도시된다. 도면에는 정제된 proNGF 돌연변이체가 단 1개의 절단 생성물(베타-NGF)을 생성한다는 것이 명확하게 도시된다. proNGF 돌연변이체에서 베타-NGF로의 완전한 분해를 관찰할 수 있었다.
실시예 9. 활성 베타-NGF의 정제
트립신 분해 후, 트립신, 절단 부산물 및 추가의 불순물을 고갈시키기 위해 SP 세파로스 HP 컬럼 상에 베타-NGF를 로딩하였다. SP 세파로스 HP 정제가 도 6에 도시되었다.
컬럼은 25 mM Na-인산염 버퍼(pH 6.5)로 평형을 이루었다. 트립신 분해 반응물을 SP 세파로스 HP 컬럼(2 g 베타-NGF/L 배지) 상에 로딩하고 비결합 단백질을 평형 버퍼로 세척하였다. 용출을 3 단계로 실시하였다(3 cv 25%의 25 mM Na-인산염 pH 6.5/1 M NaCl(버퍼 B), 25∼50% 버퍼 B의 선형 구배로 10 cv, 및 3 cv 100% 버퍼 B(유속 60 cm/h)).
도 6에는 베타-NGF의 정제가 도시된다. 도면에는 트립신 절단 후 SP 세파로스 HP 컬럼의 프로파일이 도시된다. 베타-NGF의 수율은 85∼95%였다(피크 "샘플 용출").
실시예 10. 돌연변이체 SP174-101 및 야생형 proNGF 상 트립신의 절단 효율
이 절차는 proNGF-돌연변이체 SP174-101(서열 번호 5) 및 인간 야생형 proNGF(서열 번호 1; rhProNGF) 모두에게 동시 적용되었다.
5 ㎖의 정제된 rhProNGF를 25 mM 인산염 버퍼 pH 6.5에 대해 투석하였다. 투석 후, HPLC-UV에 의해 0.08 mg/㎖의 단백질 농도를 측정하였다. 분해 샘플 당, 80 ㎍의 proNGF가 사용되었다. 단백질 가수분해 후, 모든 샘플은 HPLC-UV에 의해 분석되었다.
질량 비율 1/10,000 w/w의 트립신/rhProNGF 돌연변이체가 사용되고, 상이한 질량 비율의 트립신/rhProNGF 야생형이 사용되었다(표 3 참조). 트립신 용액에 따라 1.0 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖가 사용되었다. 밤새 실온에서 배양(약 17시간)한 후, 모든 샘플을 분석하였다. 또한 대조군을 위해 첨가된 프로테아제 없이 돌고래(porpoises) rhProNGF 돌연변이체를 배양하였다.
Figure pct00006
모든 트립신 분해의 성능 및 수율을 Vydac 214MS C4 컬럼을 사용하여 HPLC-UV에 의해 분석하였다.
표 4에는 트립신 분해 후 얻은 절단 수율이 제시된다. 실험 데이타에는 트립신에 의한 proNGF 돌연변이체(서열 번호 5)의 절단이 매우 낮은 트립신/단백질 비율(1/10,000)을 사용하여 높은 절단 수율(약 85%)에서 단 1개의 생성물(베타-NGF)을 유도한다는 것이 명확하게 제시된다. 이것은 낮은 트립신/단백질 비율(1/10,000)에서 낮은 절단 수율(단지 약 5%) 및 높은 트립신/단백질 비율(1/250)에서 높은 생성물 분해(과분해됨)를 제시하는 야생형 proNGF(서열 번호 1)의 절단과 비교될 수 있다.
Figure pct00007
실시예 11. TF1 세포의 증식 자극을 통한 proNGF의 생물학적 활성 테스트
TF1 세포(ATCC, 카달로그 번호 CRL2003)를 표준 절차에 따라 배양하였다. 테스트 배지(90% 배지 RPMI 1640, 10% 소 태아 혈청 FBS, 50 U/㎖ 페니실린 및 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신)를 세포에 첨가하고 원심분리하였다. 37℃의 테스트 배지 내 1.5·105개의 세포/㎖의 밀도에서 펠렛을 재현탁하였다. 세포 현탁액을 상이한 농도의 proNGF 단백질(10-10 M, 3·10 M, 10-9 M, 3·10-9 M, 10-8 M, 3·10-8 M, 10-7 M, 3·10-7 M, 10-6 M, 3·10-6 M, 10-5 M 및 3·10-5 M)과 혼합하고 96웰 플레이트에서 분석하였다. 37℃에서 48시간 동안 배양 후, 세포 증식 시약(예, WST-1, Roche Applied Science, 카테고리 번호 1644807)을 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 다시 플레이트를 배양하였다. 흡수율을 450 nm에서 측정하고 적당한 프로그램(z. Bsp. Sigma-Plot 2000)을 사용하여 ECso-값을 확인하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Scil Proteins GmbH <120> Novel proNGF mutants and uses thereof in the preparation of beta-NGF <130> P32092-EP <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 222 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro 1 5 10 15 Gln Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg 20 25 30 Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly 35 40 45 Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg 50 55 60 Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala 65 70 75 80 Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe 85 90 95 Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His 100 105 110 Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp 115 120 125 Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly 130 135 140 Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr 145 150 155 160 Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp 165 170 175 Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys 180 185 190 Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile 195 200 205 Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg 210 215 220 <210> 2 <211> 222 <212> PRT <213> artificial <220> <223> proNGF mutant <220> <221> misc_feature <222> (102)..(102) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 Met Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro 1 5 10 15 Gln Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg 20 25 30 Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly 35 40 45 Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg 50 55 60 Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala 65 70 75 80 Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe 85 90 95 Asn Arg Thr His Arg Xaa Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His 100 105 110 Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp 115 120 125 Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly 130 135 140 Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr 145 150 155 160 Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp 165 170 175 Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys 180 185 190 Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile 195 200 205 Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg 210 215 220 <210> 3 <211> 222 <212> PRT <213> artificial <220> <223> proNGF mutant <220> <221> misc_feature <222> (101)..(101) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (103)..(103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 3 Met Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro 1 5 10 15 Gln Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg 20 25 30 Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly 35 40 45 Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg 50 55 60 Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala 65 70 75 80 Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe 85 90 95 Asn Arg Thr His Xaa Ser Xaa Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His 100 105 110 Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp 115 120 125 Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly 130 135 140 Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr 145 150 155 160 Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp 165 170 175 Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys 180 185 190 Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile 195 200 205 Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg 210 215 220 <210> 4 <211> 222 <212> PRT <213> artificial <220> <223> proNGF mutant <220> <221> misc_feature <222> (101)..(101) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 4 Met Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro 1 5 10 15 Gln Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg 20 25 30 Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly 35 40 45 Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg 50 55 60 Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala 65 70 75 80 Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe 85 90 95 Asn Arg Thr His Xaa Ser Ala Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His 100 105 110 Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp 115 120 125 Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly 130 135 140 Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr 145 150 155 160 Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp 165 170 175 Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys 180 185 190 Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile 195 200 205 Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg 210 215 220 <210> 5 <211> 222 <212> PRT <213> artificial <220> <223> proNGF mutant SP174-101 <400> 5 Met Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro 1 5 10 15 Gln Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg 20 25 30 Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly 35 40 45 Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg 50 55 60 Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala 65 70 75 80 Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe 85 90 95 Asn Arg Thr His Val Ser Ala Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His 100 105 110 Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp 115 120 125 Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly 130 135 140 Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr 145 150 155 160 Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp 165 170 175 Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys 180 185 190 Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile 195 200 205 Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg 210 215 220 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> artificial <220> <223> protease cleavage site <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 6 Arg Xaa Lys Arg 1 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> artificial <220> <223> protease cleavage site <400> 7 Arg Ser Lys Arg 1

Claims (36)

  1. proNGF 돌연변이체로서, 프로테아제 절단 부위 R1SK3R4가 적어도 인간 야생형 proNGF 서열(서열 번호 1)의 위치 101 및 103에 상응한 위치 R1 및 K3에서 비염기성 아미노산 및 히스티딘으로부터 선택된 임의의 아미노산으로 치환되는 proNGF 돌연변이체.
  2. 제1항에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 위치 101 및 103에서 아르기닌 또는 리신이 아닌 임의의 아미노산으로 치환되는 것인 proNGF 돌연변이체.
  3. 제1항에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 위치 101 및 103에서 알라닌, 글리신, 발린, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 티로신, 히스티딘, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 페닐알라닌, 이소류신, 류신, 트립토판, 시스테인, 및 프롤린으로부터 선택된 임의의 아미노산으로 치환되는 것인 proNGF 돌연변이체.
  4. 제1항에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 위치 101 및 103에서 알라닌, 발린, 글리신, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 티로신, 히스티딘, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산으로부터 선택된 임의의 아미노산으로 치환되는 것인 proNGF 돌연변이체.
  5. 제1항에 있어서, 천연 프로테아제 절단 부위는 위치 101 및 103에서 알라닌 및 발린으로부터 선택된 임의의 아미노산으로 치환되는 것인 proNGF 돌연변이체.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 위치 101에서 발린으로 치환되는 것인 proNGF 돌연변이체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 위치 103에서 알라닌으로 치환되는 것인 proNGF 돌연변이체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인간 야생형 proNGF 서열(서열 번호 1)의 위치 104에 상응한 위치 R4의 아미노산은 아르기닌 또는 리신으로부터 선택되는 것인 proNGF 돌연변이체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인간 야생형 proNGF 서열(서열 번호 1)의 위치 102에서 치환되는 아미노산은 아미노산 세린, 글리신, 시스테인, 아스파라긴, 티로신, 트레오닌, 아스파르트산, 글루타민, 알라닌, 발린, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 메티오닌으로부터 선택되는 것인 proNGF 돌연변이체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인간 야생형 proNGF 서열(서열 번호 1)의 위치 101의 아미노산은 발린으로, 위치 102의 아미노산은 세린으로, 위치 103의 아미노산은 알라닌으로 치환되고, 위치 104의 아미노산은 아르기닌인 proNGF 돌연변이체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열 번호 5를 갖는 proNGF 돌연변이체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 돌연변이체는 원핵 세포에서 재조합 발현에 의해 수득되는 것인 proNGF 돌연변이체.
  13. 제12항에 있어서, 돌연변이체는 이. 콜라이(E. Coli)에서 재조합 발현에 의해 수득되는 것인 proNGF 돌연변이체.
  14. (i) 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 따른 proNGF 돌연변이체를 제공하는 단계, 및
    (ii) 상기 proNGF 돌연변이체를 절단하여 활성 인간 베타-NGF를 수득하는 단계
    를 포함하는, 생물학적 활성 인간 베타-NGF의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    a. 변성 용액에서 봉입체의 가용화에 의해 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 따른 proNGF 돌연변이체를 용해하는 단계,
    b. 변성된 proNGF가 생물학적 활성 구조를 취하는 리폴딩(refolding) 용액으로 상기 proNGF 돌연변이체를 옮기는 단계,
    c. 리폴딩된 proNGF 돌연변이체를 정제하는 단계,
    d. proNGF 돌연변이체의 프로-서열(pro-sequence)을 절단하여 활성 베타-NGF를 수득하는 단계
    를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 변성 용액은 (i) 카오트로픽 물질(chaotropic substance), (ii) 킬레이터, (iii) 버퍼, 및 (iv) 환원제를 함유하는 용액을 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 변성 용액은
    i. 1∼8 M 구아니디늄-HCl, 바람직하게는 4∼6 M,
    ii. 0.01∼1 M 트리스,
    iii. 1∼50 mM EDTA,
    iv. 글루티온(GSH) 또는 시스테인으로부터 선택된 1∼100 mM,
    v. pH 7.0∼10.0
    을 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 변성 용액은
    i. 4 M 구아니디늄-HCl,
    ii. O.1 M 트리스,
    iii. 10 mM EDTA,
    iv. 5 mM GSH 또는 시스테인,
    v. pH 8.0
    을 포함하는 것인 방법.
  19. 제15항에 있어서, 리폴딩 용액은
    i. 0.5∼1.0 M의 샤프론,
    ii. 1∼10 mM의 금속 킬레이터,
    iii. 0.1∼10 mM의 산화환원 셔플링 시스템,
    iv. pH 8.0∼pH 11.0
    을 포함하는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 리폴딩 용액은
    i. 0.75 M 아르기닌,
    ii. 5 mM EDTA,
    iii. 1 mM L-시스틴 및 5 mM L-시스테인, 또는 1 mM GSSG(산화된 글루타티온) 및 5 mM GSH(환원된 글루타티온),
    iv. pH 9.5
    를 포함하는 것인 방법.
  21. 제15항, 제17항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리폴딩은 펄스 복원(pulse renaturation)으로서 수행되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 펄스 복원 동안 최종 리폴딩 부피와 관련하여, 구아니디늄 HCl의 농도는 0.3 M을 초과하지 않으며 펄스 당 단백질 농도는 50 ㎍/㎖를 초과하지 않아야 하는 것인 방법.
  23. 제15항에 있어서, proNGF 돌연변이체는 혼합 방식 크로마토그래피를 통해 정제되는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 크로마토그래피 컬럼이 합성 친화력 리간드를 갖는 혼합 방식 물질 컬럼인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 혼합 방식 물질 컬럼은 4-머캅토-에틸-피리딘(MEP), 헥실아미노(HEA), 페닐프로필아미노(PPA), 2-머캅토-5벤즈아미다졸 설폰산(MBI), Capto MMC(GEHC), N-벤질-N-메틸 에탄올아민(GEHC), CHT 히드록시아파티드 또는 CHT 플루오로아파티드를 갖는 컬럼인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 혼합 방식 물질 컬럼은 4-머캅토-에틸-피리딘(MEP)을 갖는 컬럼인 방법.
  27. 제14항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, proNGF 돌연변이체의 프로-형태(pro-form)가 프로테아제에 의해 절단되는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, proNGF 돌연변이체의 프로-형태는 세린 프로테아제에 의해 절단되는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, proNGF 돌연변이체의 프로-형태는 트립신에 의해 절단되는 것인 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트립신 대 proNGF 돌연변이체의 비율은 1:200 내지 1:100,000인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 트립신 대 proNGF 돌연변이체의 비율은 중량 기준으로 1:5,000 내지 1:20,000인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 트립신 대 proNGF 돌연변이체의 비율은 1:10,000(w/w)의 비율인 방법.
  33. 제14항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 베타-NGF를 정제하는 추가 단계를 추가로 포함하는 방법
  34. 제33항에 있어서, 컬럼 크로마토그래피에 의해 베타-NGF를 정제하는 추가 단계를 추가로 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, SP 세파로스 HP 컬럼에 의해 베타-NGF를 정제하는 추가 단계를 추가로 포함하는 방법.
  36. 인간 베타-NGF를 제조하기 위한 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 따른 proNGF 돌연변이체의 용도.
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