TR201802360T4 - Özgün prongf mutantları ve bunların beta-ngf üretimindeki kullanımları. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş bir proNGF mutantı ve bunun kullanımı ile, özellikle bir proNGF mutantının insan beta-NGF üretimi için kullanımı ile ilgilidir. Mevcut buluş inaktif çözünemez bir proNGF mutantından biyolojik olarak aktif bir insan beta-NGF mutantı hazırlamaya dair bir metodu açıklamaktadır. Buluşun bir proNGF mutantı Arg ya da Lys haricinde herhangi bir amino asit tarafından, en azından insan doğal fenotip proNGF sekansındaki 101 ve 103 pozisyonlarına denk gelen R1 ve K3 pozisyonlarındaki R1SK3R4 natif proteaz bölünme alanında ikame edilir.

Description

TARIFNAME ÖZGÜN PRONGF MUTANTLARI VE BUNLARIN BETA-NGF ÜRETIMINDEKI KULLANIMLARI BULUSUN ALANI Mevcut bulus, natif proteaz bölünme bölgesindeki ikame edilebilir özgün proNGF mutantlariyla ilgilidir. Mevcut bulus ayrica, aktif olmayan bir çözülmez proNGF mutantdan biyolojik olarak aktif bir insan beta-NGF üretme metodu ve bir proNGF mutantin insan beta-NGF üretmek için kullanimini da açiklamaktadir.

BULUSUN ARKA PLANI Sinir büyüme faktörü (beta-NGF) nöronlarin (duyusal ve sempatik) büyümesi ve sagkaliminda çok önemli bir rol oynayan nörotrofik bir faktördür (Levi-Montalcini, R., Science 237 845). Beta-NGF stabil dimerik protein yapisina sahip büyüme faktörlerinin bir sistein-dügümü üst familyasina aittir.

Ayrica, beta-NGF merkezi sinir sisteminin kolinerjik nöronlarinin büyümesini, farklilasmasini ve canliligini Rekombinan insan sinir büyüme faktörü için muhtemel tedavi edici indikatörler arasinda, örn. diyabetle ya da bir yan etki olarak AIDS tedavisi ile ilgili periferik duyusal nöropatiler bulunur. Beta-NGF için diger indikatörler merkezi nöropatilerdir, Örn. Alzheimer hastaligi. Bu durumda, hafiza kaybi kolinerjik nöronlarin kaybinin sonucudur. Beta-NGF'nin ayrica insan cildi ve korneal ülserlerin tedavisinde etkili oldugu da bulunmustur (Bernabei et al. Lancet 1999; Lambiase et al. NEJM 1998). Ayrica, beta-NGF'nin glokom hastasi deneysel bir hayvan modelinde retina hücrelerini dejenerasyon ve apopitozdan korudugu ve glokom hastasi bazi hastalarda görsel islevi iyilestirdigi görülmüstür (Lambiase A, et. Al. PNAS 2009).

Matür insan beta-NGF, 241 amino asitten olusan bir preproprotein olarak çevrilen bir l18 amino asit proteinidir. 18 amino asitlerin sinyal peptitinin (propeptit) endoplazmik retikulum (ER) içine translokasyonu yapilirken bölünür.

Ortaya çikan protein (proNGF) pro-sekansin proteaz bölünmesi yoluyla çikarilmasi suretiyle N-ucunda islenir. Matür insan NGF, kemirgen (fare ve siçan) beta-NGF ile yüksek seviyede (yaklasik %90) benzerlik gösterir. Klinik çalismalar ya da tedavi amaçli kullanimlar için, beta-NGF yüksek konsantrasyonlarda sunulmalidir. Farelerin alt çene salgi bezleri dogal bir beta-NGF kaynagidir. Ancak, bu beta-NGF preparasyonlari farkli dimerlerin heterojen karisimlaridir ve dolayisiyla tedavi amaçli kullanima uygun degildir. Ayrica, proteinin insan formunun hastalari verilmesi istenir. Ne yazik ki insan dokularinda, nörotropik faktörler sadece düsük konsantrasyonlarda mevcuttur.

Prosekans, matür proteinden farkli bir domaindir (bkz. prosekansin koyu renkte gösterildigi Sekil l'deki sekans verisi). Bu iki domain, insan proNGF sekansinin (SEQ ID No:1) 101 ila 104 pozisyonlarinda konumlanmis olan Arg-Ser-Lys-Arg türü bazik bir amino asit hedef sekansi ile açikta kalan bir proteaz bölünme alani tarafindan ayrilirlar. Bu motif serin endoproeaz Furin için dogal olarak bir bölünme alanidir. Ek olarak, bölünme alani diger uygun proteazlar ile, tercihen amino asit Arginin'i (Arg, R) sonrasi bölünmenin substrat özgullügune sahip proteazlar araciligiyla özellikle islenmis olabilirler. Örnegin, proteaz tripsin Lizin (Lys, K) ya da Arginin (Arg, R) gibi bazik amino asitlerden sonra bölünür.

Beta-NGF'nin inaktif proformundan biyolojik olarak aktif formuna hazirlanisi için metotlar alanda gayet iyi bilinmektedir. Örnegin, EP O 994 188 81, biyolojik olarak aktif beta-NGF'nin zayif bir çözünürlügü olan inaktif proformundan hazirlanisi ile ilgili bir metodu açiklamaktadir. Bu metoda göre, beta-NGF bir denatüre edici solüsyon içinde çözdürülen rekombinan çözünemez inaktif proNGF'den elde edilebilir. Sonrasinda, çözdürülen proNGF denatüre edici olmayan ya da denatüre etme gücü zayif bir solüsyon içine aktarilir. Denatüre edilmis proNGF, natif beta-NGF içinde bulunan disülfat baglari ile belirlendigi üzere biyolojik olarak aktif bir yapi gösterir. Bunun sonrasinda, proNGF'nin prosekansi bölünür ve aktif beta-NGF Insan proNGF natif bir proteaz (Furin) bölünme bölgesi olan Arg-Ser-Lys-Arg içerir, dolayisiyla su sekans motifine sahiptir: RÂSK3R4. “Iyi Üretim Uygulamalari” kalite seviyelerini gerektirenler gibi özel üretim süreçleri için, enzimler gibi materyaller yüksek kalitede tedarik edilmelidir. Proteaz Furin bugün GMP-seviyesinde proteaz olarak kullanilamamaktadir.

Dolayisiyla, proNGF'yi matür bir beta-NGF elde etmek için bölmek üzere alternatif bir proteaz olan Tripsin (EC 3.4.21.4) seçilmistir. Serin proteaz Tripsin peptiti Zincirlerini bazik amino asitler Arginin ya da Lizin'in. karboksil tarafinda böler. Insan proNGF'de, dogal olarak olusan bölünme alani bazik amino asitlerle üç pozisyon içerir (SEQ ID NO:1'in ve R4 olarak da anilmislardir). Dolayisiyla, proNGF'nin Tripsin tarafindan. bölünmesi bölünmenin tam. olarak nerede gerçeklestigine bagli olarak sayisiz farkli bölünmüs ürüne sebep olabilir. Tipik bölünme ürünleri SKHÜ-beta-NGF ve R4- beta-NGF ve matür beta-NGF'dir. Bu problem, beta-NGF proteininin dimerizasyonu asagidaki adimlarda aritilmak zorunda kalacak çok daha yüksek sayida (altiya kadar) homojen olmayan ürünlere sebep olacagindan daha da kötülesir (bkz.

Sekil Za).

MEVCUT BULUSUN TEMELINDEKI TEKNIK PROBLEMLER VE ÇÖZÜMLERI Beta-NGF üretmek için metotlar daha önceki çalismalarda açiklanmistir. Ancak, bugün kullanilabilir olan ürün süreçlerinin, homojen olmayan beta-NGF ürünleri ve düsük verimli beta-NGF gibi çesitli sorunlari vardir.

Dogal fenotip pro-NGF'nin beta-NGF üretmek üzere Tripsin ile bölünmesi, bölünmüs beta-NGF'den yeterli verimi elde edebilmek için enzimin çok yüksek miktarlarda kullanilmasini gerektiren düsük verimlilik göstermektedir. Bu sonraki aritma adimi üzerinde etkileri olan birçok sorunu beraberinde getirir. Öncelikle, bölünmenin seçimliligini daha da azaltir ki bu da birçok ürünün parçalanmasina sebep olur. Ikincil olarak, beta-NGF'nin enzimden arindirilmasi mecburdur zira nihai protein numunesinde enzim olmamalidir. Bu bolca kullanilan Tripsin'in aritilmasi için çok fazla aritma sürecini gerektirir. Dolayisiyla, Tripsin'in önceki çalismalarin prosedürlerinde bölme enzimi olarak kullanilmasi ya çok düsük beta-NGF verimliliklerine ya da proteinin aritilmasina dair problemlere sebep olmaktadir.

Dolayisiyla alanda beta-NGF'nin yukarida açiklananlar gibi sorunlar olmadan üretilmesine dair bir metoda ihtiyaç oldugunu söylemeye bile gerek yoktur. Bu dolayisiyla, yüksek kalitede, yüksek etkinlikte ve yüksek verimliliklerde beta- NGF üretmeye dair özgün bir metodun saglanmasi için mevcut bulusun temelini olusturan problemdir. Ayrica bu, yüksek verimlilikte beta-NGF sonucu veren, etkin, güçlü, ölçeklenebilir' ve tekrar üretilebilir bir beta-NGF üretme metodu saglamak için mevcut bulusun altinda yatan temel problemdir.

Bulusun bir avantaji bir beta-NGF'nin özgün bir proNGF mutantintan üretilmesidir. Özgün mutant iyi verimliligi olan homojen beta-NGF ürünleri sonucunu verir çünkü özgün proNGF mutanti proteaz sayesinde homojen olmayan parçalanmayi ve dolayisiyla homojen olmayan beta-NGF ürünlerini önler.

Bulusun problemi bulusun proNGF mutantini ve bulus tarafindan açiklandigi gibi proNGF mutantindan beta-NGF üretmeye dair Özgün mutant, dogal fenotipe kiyasla bulusun mutasyona ugramis proNGF'sindeki ilgili bölgede tripsinin bölünmesinin verimliliginde beklenmedi ve sasirtici artisa sebep olmustur.

Bu, dogal fenotipte kullanilana kiyasla proteaz tripsinin son derece az miktarlarda kullanilmasina olanak tanir ve sonuç olarak beta-NGF'nin enzimin kendisinden ve bölünmenin ürünlerinden artirilmasina dair daha az probleme sebep olur.

Yukarida açiklanan problemler bagimsiz istemlerin konularinca çözülmüs ve avantajlar saglanmistir. Bulusun tercih edilen uygulamalari bagimli istemlerde ve bunun yani sira asagidaki açiklama, örnek ve sekillerde dahil edilmistir.

Yukaridaki genel bakis bulus tarafindan çözülmüs tüm problemleri açiklamamakla birlikte baskaca problemler ve bunlarin nasil çözümlendigi alanda yetkin kisilerce mevcut basvurunun çalisilmasi üzerine anlasilabilecektir.

BULUSUN ÖZETI Bir ilk yönden, mevcut bulus bir proNGF mutantiyla ilgilidir, proteaz bölünme alani RlSK3R4 en azindan insan dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ ID No:1) 101 ve lO3'üncü pozisyonlarina denk gelen R1 ve K3 pozisyonlarinda, bazik olmayan amino asitlerden ve Histidin'den seçilmis bir amino asitle ikame edilmistir.

Ikinci bir yönden, mevcut bulus proteaz bölünme alani RlSK3R4 en azindan insan dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ ID No:1) 101 ve lO3'üncü pozisyonlarina denk gelen R1 ve K3 pozisyonlarinda, bazik olmayan amino asitlerden ve Histidin'den seçilmis bir amino asitle ikame edilmis inaktif, çözünemez bir proNGF mutantindan biyolojik olarak aktif bir insan beta-NGF hazirlamak için bir metotla ilgilidir ve metot (i) bu bulusa göre bir proNGF mutanti saglamak ve (ii) proNGF mutantini aktif insan beta-NGF elde etmek için bölmekten Özellikle, bulus asagidaki süreçle ilgilidir: an proNGF mutantini denatüre edici bir solüsyon içinde çözmek; b.proNGF mutantini, denatüre edilmis proNGF'nin biyolojik olarak aktif bir yapi gösterdigi bir dogallasim solüsyonu içine aktarmak; c.proNGF mutantini dogallasim solüsyonundan aritmak; d.aktif beta-NGF elde etmek için proNGF mutantinin prosekansini bölmek.

Bulusun üçüncü bir yönü proNGF mutantinin en azindan insan dogal fenotip proNGF (SEQ ID No:1) 101 ila 104 pozisyonlarinda natif proteaz bölünme alani R15K3R4'ün 101 pozisyonunda Arginin'in 103 pozisyonunda Lizin'in bazik olmayan asitler tarafindan insan beta-NGF hazirlanmasi için ikame edildigi kullanimi ile ilgilidir.

Mevcut bulusun bir baska yönü ise en azindan insan dogal fenotip proNGF (SEQ ID No:1) 101 ila 104 pozisyonlarinda natif proteaz bölünme alani R18K3R4'ün 101 pozisyonunda Arginin'in 103 pozisyonunda Lizin'in bazik olmayan asitler ve Histidin'den seçilen bir amino asit ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ya da seyreltici ile ikame edildigi proNGF'den üretilen beta-NGF'yi içeren farmasötik bilesimlerle ilgilidir.

Bulusun bu özeti mevcut bulusun tüm özelliklerini açiklamiyor olabilir. Diger uygulamalar asagidaki detayli tarifin incelenmesiyle anlasilacaktir.

BULUSUN DETAYLI TARIFI Tanimlar Mevcut bulus asagida detayli olarak açiklanmadan önce, sunun anlasilmasi gerekir ki bu bulus belli bir metodolojiyle sinirli degildir, burada açiklanan protokoller ve reaktifler degisebilir. Ayrica burada kullanilan terminolojinin sadece belli uygulamalari açiklamak amaci tasidigi ve bulusun sadece ekteki istemlerce sinirlanacak olan kapsamini sinirlandirmak amaci tasimadigi da bilinmelidir. Aksi tanimlanmadigi sürece, burada kullanilan tüm teknik ve bilimsel terimler, bulusun ait oldugu alanda yeterince yetkin kisilerce genel olarak anlasilacagi anlamlari tasimaktadirlar.

Bu tarifname ve takip eden istemler boyunca, içerik aksini gerektirmedikçe, “içermek” kelimesi ve “içerir” ve içeren” gibi varyasyonlari bahsedilen bir içerik ya da adim ya da içerikler ya da adimlar grubunun dahil edildigi herhangi baska bir içerik ya da adimin ya da içerikler ya da adimlar grubunun hariç tutulmadigini ifade edecek sekilde anlasilmalidir. Çesitli dokümanlardan (örnegin: Patentler, patent basvurulari, bilimsel yayinlar, talimatnameler, Vb.) bu bildirimin metni boyunca alintilar yapilmistir. Buradaki hiçbir sey bulusun, Önceki bulustan dolayi bu tarifnamenin Önce gelme hakkina sahip olmadiginin kabul edildigi sekilde yorumlanmamalidir.

Sekanslar: burada bahsedilen tüm sekanslar tüm içerigi ve bildirimiyle bu tarifnamenin bir parçasi olan sekanslar listesinde açiklanmistir.

Sayisal bir degerle iliskili olarak kullanildiginda bir alt limit ve belirtilen sayisal degerden %5 büyük olan bir üst limit arasindaki bir aralik içindeki sayisal degerleri içerdigi anlamina gelir. ifade eder. Tam insan beta-NGF sekansi SEQ ID NO:1'de (Sekil la) tanimlanmistir. Matür beta-NGF elde etmek için, propeptit proNGF proteaz ile bölünmelidir. Beta-NGF'nin prosekansi matür beta-NGF'den farkli bir domaindir. Bu iki domain arasinda, SEQ ID NO:1'in 101 ila 104 pozisyonlarinda bir natif proteaz bölünme alani olan Arg-Ser-Lys-Arg (burada R18K3R4, SEQ ID NO: 9 olarak anilmaktadir) bulunmaktadir. Bölünme alani özellikle Furin proteaz olmak üzere uygun proteazlarla islenebilir.

NGF'nin amino asit ikameleri ile modifikasyonlarini ifade eder. Mevcut bulusun proNGF muteini natif proteaz bölünme alani RlSK3R4'te en azindan insan dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ ID No:9) 101 ve 103 pozisyonlarina denk gelen K3 ve R1 pozisyonlarinin her ikisinde de bazik olmayan amino asitler ve Histidin'den olusan bir gruptan seçilen bir amino asit ile ikame edilmistir.

Bulusun tercih edilen bir uygulamasinda, (pozisyon lO3'e denk gelen) K3 Pozisyonundaki amino asit Lizin, Alanin (bkz. Sekil 1d, SEQ ID No:4, Sekil 1e, SEQ ID No:5, Sekil lg, SEQ ID No:8) ile ikame edilmistir.

Bulusun bir baska tercih edilen uygulamasinda, (pozisyon 101'e denk gelen) R1 Pozisyonundaki amino asit Arginin, Valin (bkz. Sekil lb, SEQ ID No:2, Sekil le, SEQ ID No:5, Sekil lg, SEQ ID No:8) ile ikame edilmistir.

Bulusun bir baska uygulamasinda, dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ ID NO:1) 104 pozisyonuna denk gelen amino asit arginin R4 de beta-NGF elde etmek için, proNGF'nin proteolitik bölünme ile islenmesine olanak taniyan herhangi bir amino asitle, tercihen Arginin ya da Lizin gibi bir bazik amino asitle ikame edilebilir. Örnegin, Alanin'in Pozisyon R4'teki varligi proNGF'nin beta-NGF'ye islenmesini engeller.

Dolayisiyla, bulusun mutanti 104 pozisyonunda Alanin içeremez.

Tablo 1. ProNGF ve proNGF muteinlerinin proteaz bölünme alanlari (X Arg ya da Lys olmayan herhangi bir amino asidi ifade eder) SEQ ID NO: Proteaz bölünme alani (SEQ ID NO: 1'in 101-104 poz.) RSKR (dogal fenotip) (SEQ ID NO: 9) VSXR (SEQ ID NO: 10) XSXR (SEQ ID NO: 11) XSAR (SEQ ID NO: 12) VSAR (SEQ ID NO: 13) XXXR (SEQ ID NO: 14) VXAR (SEQ ID NO: 15) ooumuiißwm asitleri ifade eder. Terim bazik bir amino asitten farkli bir amino asit kökünü ifade eder. Terim pozitif yan zincirlere sahip olan amino asitler Lizin ve Arginin hariç tutar. Bazik olmayan amino asitler negatif yüklü amino asitler Glütamik Asit ve Aspartik Asit, polar yüksüz yan zincirleri olan amino asitler (Serin, Treonin, Asparagin, Glütamin), hidrofobik yan zincirleri olan amino asitler (Alanin, Valin, Izolesin, Metiyonin, Fenilalanin, Tirosin, Triptofan) ve amino asitler yapiya sahip proNGF” terimi proNGF'nin biyolojik aktivitesini ifade eder. ProNGF'nin biyolojik olarak aktif bir yapisi dogal beta-NGF'de olusan disülfat köprülerinin varligi ile belirlenir. Aktivite, örnegin Chevaliar ve ark. 1994, Blood dahil edilmis olan bir deneyle belirlenebilir. Örnek 11 proNGF'nin TFl hücrelerinin çogalmasinin uyarilmasi yoluyla biyolojik aktivitesi için bir deneyi açiklamaktadir. büyüme faktörünü ifade eder. Matür beta-sinir büyüme faktörü için sekans Sekil 1'de (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8) pozisyon 105'ten baslayacak sekilde gösterilmistir. terimi beta-NGF'nin biyolojik aktivitesini ifade eder.

Biyolojik olarak aktif beta-NGF bir dimer formunda var olur.

Biyolojik olarak aktif bir yapiya sahip olmasi için beta- NGF'nin dimerik bir formda mevcut olmasi gerekir. Beta-NGF'nin biyolojik olarak aktif bir yapisinin ön kosulu disülfat köprülerinin bir sistin dügümüne dogru formasyonudur.

Aktivite, örnegin DRG deneyine göre (dorsal kök gangliyon deneyi) göre belirlenebilir, örnegin bkz. Levi-Montalcini, R. et al., Cancer Res. 14 (1954) 49, ve Varon, S. et al., Meth. in Neurochemistry 3 (1972) 203. Bu deneyde, civciv embriyolarinin dorsal kök gangliyonundan ayrilmis duyusal nöronlarin uyarilmasi ve sagkalimi nörit formasyonu araciligiyla gözlemlenmistir. amino asitlerin yer degistirilmesi yoluyla modifikasyonlarini ifade eder. Terim amino asitlerin, örn. orijinal amino aside kimyasal gruplar ya da kökler eklenmesi ya da bunlarin ikame edilmesi yoluyla modifikasyonunu içerir. Seçilen amino asitlerin modifikasyon adimi tercihen genetik seviyede mutajenez yoluyla yapilir. Tercihen, proNGF'nin modifikasyonu proNGF'ye ait bir DNA'nin degistirilmesi için genetik mühendisligin metotlari yardimiyla yapilir. Modifikasyonlar tek bir temel nükleotidin genetik malzemedeki bir baska nükleotid ile yer degistirmesine sebep olan mutasyonlardir.

Nokta mutasyonlar dogal fenotip sekansina kiyasla farkli amino asitlerin kodlanmasina sebep olur. Tercihen, modifiye edilmis proNGF proteininin ifadesi bundan sonra prokaryotik ya da ökaryotik organizmalarda, en çok tercih edilir sekilde prokaryotik organizmalarda yapilir. katlanan yapisinin degistirildigi bir prosesi anlatir. Terim proNGF ya da proNGF muteininin üçüncül yapisinin açilmasini ifade eder. Katlanan yapinin degistirilmesi belli kimyasal ya da fiziksel faktörlere maruz kalmaktan kaynaklidir. Bunun bir sonucu olarak, proteinin orijinal özelliklerinden bazilari, özellikle de biyolojik aktivite azaltilir ya da ortadan kaldirilir. Denatüre etme süreci sebebiyle, protein biyolojik olarak inaktif hale gelir. Ayrica, denatüre edilmis proteinler biyolojik islev kaybi, çözünebilir ve/veya toplasma kaybi gibi çok kapsamli özellikler gösterebilirler. terimleri protein yapisinin natif islev kati ya da yapisina döndügü süreci ifade eder. Renatürasyon ya da tekrar katlanma süreçleri sebebiyle, protein biyolojik olarak aktif hale bir konakta ifade edilmesi için DNA'nin vektörler içine klonlanmasi anlamina gelir. Konak tercihen bir prokaryot, en tercih edilir sekilde bir bakteridir. Bir “rekombinan ifadesi” burada kullanildigi sekliyle proNGE' ya da proNGE' muteinin prokaryotik konak hücrelerinde ifade edilmesi anlamina gelir, örnegin rekombinan proteinlerin ifadesi için uygun E. coli suslari kullanilabilir. bir proteini ifade eder. olmayan bir proteini ifade eder.

Bulusun tarifi Bulusun proNGF mutantlari Bulusun bir ilk uygulamasinda, proteaz bölünme alani RÄSKHw'ünen azindan insan dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ pozisyonlarinda bazik olmayan amino asitler ve Histidin arasindan seçilen bir amino asit ile ikame edildigi bir proNGF mutant saglar. Bir baska degisle, en azindan natif proteaz bölünme alani RÃSK%U'in lOl pozisyonundaki Arginin R1 ve 193 pozisyonundaki Lizin K3 insan dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ ID No:1) 101 ila 104 pozisyonlarinda Arginin ya da Lizin disinda herhangi bir amino asile bölünmüslerdir.

Insan dogal fenotip proNGF'de (SEQ ID No:1) natif proteaz bölünme alani amino asit pozisyonlari 101 ila 104'ü ifade eder (ArgSerLysArg, RSKR, SEQ ID No:9). Dogal fenotip proNGF'nin 103 pozisyonundaki amino asit Lizin K3 ve 101 pozisyonundaki amino asit Arginin Rl, özellikle beta-NGF üretmek için olmak üzere gelistirilmis özellikler gösterecek bir proNGF sonucunu vermesi için Arg ya da Lys olmayan herhangi bir amino asitle yer degistirilirler. Yukarida ifade edilen hedefi basarmak için, yani beta-NGF üretmek için gelistirilmis özelliklere sahip bir mutein yaratmak için, Arginin (Rl) ya da Lizin (K3) tripsin için bir bölünme alani olusturmadiklari sürece tüm dogal olarak olusan amino asitler ya da yapay amino asitler ile ikame edilebilirler.

Bulusa göre, 101-103 köklerine denk gelen bir ya da daha fazla pozisyonlarda yapilacak amino asit modifikasyonlari bazik amino asitleri bazik olmayan amino asitlerle degistirecek ikameler olabilir. Bu ikameler bulusa göre proNGF mutantlari, özellikle de beta-NGF üretmek üzere kullanilabilir. Mutantlar, en azindan ArglOl ve Lys103 pozisyonlarinda ikameler içerirler. Amino asit kökleri bazik olmayan bir amino asit ya da Histidin ile yer degistirilir. Özellikle, bulusun mutantlari ArglOlVal ve LyslO3A1a ikamelerine sahiptir. Örnegin, bahsi geçen dogal bazik olmayan asitler dogal olarak olusan amino asit kökleri Alanin, Asparagin, Aspartik Asit, Sistein, Glütamin, Glütamik Asit, Glisin, Izolesin, Lesin, Metiyonin, Fenilalanin, Prolin, Serin, Treonin, Triptofan, Tirosin ve Valinden olusan gruptan seçilebilir. 101 ve 103 pozisyonlarindaki ikameler için amino asitler bazik (pozitif yüklü) amino asitler Arginin (Arg) ve Lizin (Lys) içinden seçilmez. Yine daha az tercih edilen amino asitler Izolesin (lie), Lesin (Leu) ya da Fenilalanin (Phe), Sistein (Cys), Prolin (Pro) ya da Triptofan (Trp)'dir. Serin insan proNGF dogal fenotip sekansinin 102 pozisyonunda dogal olarak olusur. Pozisyon X tercihen insan proNGF sekansinin 102 pozisyonunda dogal olarak olusan Serin'den (Ser) seçilir, ancak herhangi diger bir amino asitten de seçilir, lakin bu amino asit bazik olmayan bir amino asit olmalidir (yani Arginin ya da Lizin olmamalidir). 102 pozisyonundaki amino asidin bazik olmayan bir amino asit olmasi (yani Arg ya da Lys olmamasi) önemlidir.

Insan dogal fenotip proNGF sekansinin 104 pozisyonundaki amino asit tercihen insan proNGF sekansinin 104 pozisyonunda dogal olarak olusan Arginin'dir (Arg), ancak herhangi baska bir amino asitle, tercihen bir bazik amino asitle, daha da tercih edilir sekilde proNGF'nin proteolitik bölünme ile beta-NGF elde etmek10 üzere islenmesine olanak taniyan Lizin'dir. Örnegin, Alanin'in dogal fenotip insan proNGF'nin 104 pozisyonunda bulunmasi proNGF'nin beta-NGF'ye islenmesini engeller. Dolayisiyla, 104 pozisyonunda Ala hariç birakilmistir.

Tablo 2 proNGF'nin proteaz bölünme alani için tercih edilen ikameleri özetlemektedir.

Tablo 2A. Dogal fenotip proNGF'nin 101-104 pozisyonlarinda tercih edilen amino asitler Yildiz (*) proteaz bölünme alaninda (dogal fenotip proNGF, SEQ lOl Val, Ala, Asn, Asp, Glu, Gin, Gly, Ser, Thr, Tyr, Met, His, Cys, Pro, Phe, Trp, He, Leu 102 Ser*, Gly, Asp, Tyr, Thr, Asn, Glu, Ala, Val, Gln, His, Met, Cys, Pro, Phe, Trp, Ile, Leu 103 Ala, Val, Asp, Asn, Glu, Gin, Gly, Ser, Thr, Tyr, Met, His, Cys, Pro, Phe, Trp, He, Leu 104 Arg*, Lys Amino asitler Cys, Pro, Phe, Trp, Ile ve Leu 101, 102 ve 103 pozisyonlarinda daha az Tablo 23. Dogal fenotip tercih edilen ikamelerdir. proNGF'nin 101-104 pozisyonlarinda en çok tercih edilen amino asitler lOl Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, Gin, Tyr, Met, His 102 Ser*, Val, Ala, Gly, Thr, Asn, Asp, Glu, Gin, Tyr, Met, 103 Ala, Val, Gly, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, Gin, Tyr, Met, His 104 Arg*, Lys ProNGF muteinin 101, disinda bir amino 102 ve 103 pozisyonlarinda Arg ya da Lys olmasi ve proNGF muteinin 104 pozisyonunda bir bazik asidin (Arg ya da Lys) olmasi sarttir.

Sasirtici bir sekilde 101 ve 103 pozisyonlarindaki iki amino asit yer degistirmesinin beta-NGF üretiminde yüksek verimlilik sonucu verdigi görülmüstür.

Bulusun en çok tercih edilen proNGF mutantinin sekansinda (SEQ tercih edilen ikam edilmis amino asit Valin, 103 pozisyonunda Alanin, 102 pozisyonunda Serin ve 104 pozisyonunda Arginin'dir. Bulusun özellikle tercih edilen bir uygulamasinda, bulusun proNGF mutanti SEQ ID NO:5'in sekansina denk gelen bir sekans göstermektedir.

Mevcut bulus ayrica burada tarif edilen proNGF mutantlari için kodlama yapan nükleik asitlere de yöneliktir.

Bulusun bir proNGF mutantindan bir insan beta-NGF hazirlama metodu Ikinci bir yönden, mevcut bulus insan dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ ID No:1) 101 ve 103 pozisyonlarindaki (R1 ve K3) natif proteaz bölünme alani R18K3R4 `te ikame edilmis inaktif bir çözünemez proNGF mutantindan biyolojik olarak aktif bir insan beta-NGF mutanti hazirlamanin bir metoduna da yöneliktir ve Hßtot, insan dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ ID No:1) 101 ve 103 pozisyonlarindaki (R1 ve K3) natif proteaz bölünme alani R18K%U `te ikame edilmis proNGF mutantindan saglamak ve proNGF mutantini aktif insan beta-NGF elde etmek için bölmekten olusur.

Tercihen, proNGF mutant prokaryotik hücrelerde rekombinan ifade ile elde edilir. Uygun bakteriyel diziler alanda gayet iyi bilinirler, örn. E. coli, Bacillus sp., ve Salmonella, ve bu iade sistemleri için kitler piyasada bulunmaktadir.

Rekombinan ifade için tercih edilen konak hücreleri E. coli, örnegin E. coli BLZl, JM , JM106, JM83 ve TBl ya da bunlarin türevleridir. Rekombinan proteinlerin ideasi için uygun olan diger tüm E. coli dizileri kullanilabilir.

Polinükleotidler bulusun füzyon proteinlerinin prokaryotik konak hücrelerinde ifadesine olanak taniyacak sekilde ekpresyon kontrol dizilerine islevsel olarak baglanmistir. Bu ekspresyon kontrol dizileri, bunlarla sinirli olmamak üzere, uyarilabilir ve uyarilamaz destekleyiciler, operatörler, islemciler ve alanda yetkin kisilerce bilinen ve gen ekpresyonunu tetikleyen ya da baska sekilde düzenleyen diger unsurlari içerir. Bu tarz düzenleyici unsurlar arasinda örnegin T7, TAC, PBAD, LAC destekleyicileri, Lacl, LaclQ baskilayicilari bulunur.

ProNGF mutantinin sekansi prokaryotik konak hücrelerine uygun bir vektör ile sokulurlar. Uygun Vektörler örnegin, ve bunlarla sinirli olmamak üzere, sunlar olabilir: pBR322, pMAL, pUCl9ve diger türevler. Prokaryotik konak hücreleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, örnegin plazmit DNA ile dönüstürülebilen (örnegin, E. coli ya da B. Subtilis) gibi bakteriler, rekombinan bakteriofaj DNA ya da bulusun polinükleotid moleküllerini içeren kozmit DNA ekspresyon vektörleri gibi prokaryotik hücreler bulunur. Bulusun bir uygulamasinda, plazmit vektörler kullanilir. Örnegin, ancak hiçbir sekilde bununla sinirli olmamak üzere, (burada referansla eklenmis olan) EPl697523B1'de tanimlanmis olan plazmit vektörler kullanilabilir.

ProNGF muteinlerini ifade etmek için, asagidakileri içeren bir a. transkripsiyonu yönetmek üzere güçlü bir destekleyici (örn. bir tac ya da T7 destekleyici), IL proNGF ya da proNGF muteini için bir kodlama sekansi, c.bir transkripsiyon, translasyon sonlandirici (örn. bakteriofaj lambdanin tO-sonlandiricisi), d.bir ilk seçilebilir isaretçi gen, örn. antibiyotik direnç için kodlanabilir' bir gen (örn. Kanamycin resistence, e.ikinci bir seçilebilir isaretçi, örn. proB ve/Veya proA kodlayan bir gen, f.bir baskilayici gen (örn. bir lacl gen), g.replikasyonun yüksek bir kopya sayisi orijini.

Bulusun bir uygulamasinda, tescilli ekspresyon vektörleri (Scil Proteins GmbH, uygun bir ekspresyon vektörünün yapisi için bkz. EP1697523B1) ya da piyasada bulunabilen vektörler klonlama için kullanilabilir. Mevcut bulusun metodunda kullanilabilecek vektörler üzerine genel bilgiyle ilgili olarak, yukarida bahsedilen detaylara bakilabilir. Ancak, alanda bilindigi sekilde herhangi bir uygun vektör kullanilabilir.

Prokaryotik konak hücrelerinin dönüstürülmesi için uygun bir vektörün örnegi olarak tescilli ekspresyon vektörü pSCILlOl'in tac promoter .; pSCILlOl Bir proNGF mutanti hazirlama metodu asagidaki baslangiç adimlarini içerir: i. bir proNGF mutein kodlayan bir nükleik asidin hazirlanmasi ii. bahsi geçen nükleik asidin bir prokaryotik ekspresyon vektörü içine sokulmasi iii. bahsi geçen ekspresyon vektörünün bir konak hücre içine sokulmasi iv. konak hücrenin islenmesi v. konak hücrenin uygun kültürleme sartlarina tabi tutulmasi Prokaryotik konak hücrelerdeki ekspresyon sebebiyle, proNGF mutein inaktif, çözünemez formundadir.

Tercih edilen bir uygulamada, mevcut bulusa göre bir proNGF mutantindan beta-NGF üretimi metodu su adimlardan olusur: a.insan dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ ID No:1) 101 ve 103 pozisyonlarina denk gelen R1 ve K3 pozisyonlarinda natif proteaz bölünme alaninda RlsKüü ikame edilmis proNGF mutantinin denatüre edici bir solüsyon içinde inklüzyon cisimciklerinin çözünmesi yoluyla çözülmesi; b.proNGF mutantinin denatüre edilmis proNGF'nin biyolojik olarak aktif bir yapi gösterecegi bir dogallasim solüsyonu içine aktarilmasi; c.proNGF mutantinin dogallasim.solüsyonundan arindirilmasi; d.proNGF prosekansinin aktif beta-NGF elde etmek için bölünmesi.

Asagida, mevcut bulusa göre bir proNGF mutantindan beta-NGF üretmek için bir metodun tercih edilen adimlari açiklanmistir.

Adim a: proNGF mutantinin çözünmesi Adim a, insan dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ ID NO:l) 101 ve 103 pozisyonlarina denk gelen R1 ve K3 pozisyonlarinda natif proteaz bölünme alaninda RHHÖR4 ikame edilmis proNGF mutantinin denatüre edici bir solüsyon içinde inklüzyon cisimciklerinin çözünmesi yoluyla Çözülmesine karsilik gelmektedir. Unutulmamalidir ki bulusun proNGF mutanti adim a)'da prokaryotik konak hücrelerindeki ekspresyonu sebebiyle genellikle inaktif, çözünemez durumdadir. Düsük çözünebilirlik gösteren inaktif proNGF prokaryotlarin hücre sivisindaki proteinin asiri ekspresyonu boyunca olusur. Bu durumda, rekombinasyon ile hazirlanan proNGF sitoplazma içinde çözünemez ve yigin bir halde kalir; Bu. protein. yiginlari, bunlarin izolasyonu ve aritilmasi örnegin Marston, F.A., Biochem. J. 240 (1986)'da açiklanmistir.

Bu inaktif protein yiginlarini, inklüzyon cisimciklerini izole etmek için, prokaryotik hücreler fermantasyon sonrasi parçalanirlar. Hücre parçalanmasi geleneksel metotlarla, örn. yüksek basinçta homojenlestirme, sonifikasyon ya da lizozim yoluyla yapilabilir (Rudolph, R., et al. (1997); Folding proteins. In: Creighton, T. E. (ed.): Protein Function: A Practical Approach. Oxford University Press, pp. 57-99).

Ayrica, inklüzyon cisimcikleri çözündürülürler. Inklüzyon cisimcikleri (IB) genellikle hasarli ya da tam olarak katlanmamis proteinlerin birikmis halleridir. Örnegin E. coli gibi bakteri hücreleri gibi rekombinan proteinlerin asiri expresyonlari durumunda iç hücreleri olustururlar. Bulusa göre uygulanan bu inklüzyon cisimcikleri tercihen proNGF mutein içerirler. Bu (proteinin toplam miktari baz alindiginda) en az 60, en az 70, en az 80 ya da en az 80%wt proNGF içerdikleri anlamina gelir.

Bulus bunlardan proNGF mutein üretimi için bir metot sunmaktadir, katlanmamis inklüzyon cisimcikleri, inaktif, çözünemez proNGF mutein ya da bunun bir türevi bir denatüre edici tampon (solüsyon) içinde çözülebilirler.

Adim a)'nin denatüre edici solüsyonu tercihen (i) bir kaotropik ajan, (ii) bir selatör, (iii) bir tampon) ve (iv) bir redüktör Denatürasyon tamponu en az bir kaotropik madde (ajan) içerir.

Düzenli hidrojen köprü baglarini su içinde çözen kimyasal maddelere kaotropik denir. Hidrojen köprü baglari kirilip açildigi için, kaotropik maddeler su yapisiyla etkilesirler ve düzensizligi saglarlar (daginimda artis). Bunun sebebi çözünme için mecburi olan HZO kafes yapilarinin formasyonunun engellenmesidir. Amino asitlerin var oldugu durumda, hidrofobik etkileri azaltirlar ve proteinler üzerinde denatüre edici bir aksiyon gösterirler, zira protein katlanmasinin itici güçlerinden birisi hidrofobik amino asitlerin suda bir araya gelip birlesmesidir. Genel olarak, çözünme tamponu içinde hidrofobik etki uygulayan ve dolayisiyla proteinler üzerinde denatüre edici bir etkiye sahip olan herhangi bir madde kaotropik bir Hadde olarak kullanilabilir. Kaotropik maddeler genellikle tuzlar ve düsük moleküler agirliga sahip bilesimlerdir, örnegin üre gibi. Kaotropik maddeler deterjanlardan belirgin sekilde farklidirlar zira molekül içinde örnegin bir alkil radikal gibi herhangi bir hidrofobik radikal içermezler. Genel olarak, kaotropik aksiyon proteinin çözünürlügünde, bu durumda pretrombinde bir iyilesmeyi beraberinde getirir.

Tercih edilen bir uygulamada, kaotropik bilesim guanidinyum tuzlarindan, özellikle guanidinyum hidroklorür ve guanidinyum tiosiyanat, iyodürler, baryum tuzlari, tiosayanatlar, üre ve perkloratlardan seçilir.

Kaotropik bilesimler geleneksel miktarlarda uygulanirlar. Örnegin, 4-8 M guanidinyum hidroklorür ya da 4-9 M üre kullanilabilir.

Denatürasyon tamponu bir redüktör bileseni, örnegin Glutasyon (GSH) gibi bir disülfat bilesen. içerir. Disülfat bileseni inklüzyon cisimciklerinin içindeki polipeptitlerin sisteinlerinin tiyol gruplariyla (-SH) karisik disülfatlar yapabilir. Disülfat solüsyona eklenir. Disülfat inklüzyon Cisimciklerinin içerdigi proteinleri ve muhtemelen disülfat köprülerini içeren proteinleri düzenlemez. Tercihen, disülfat gerçek bir peptit degildir. Tercihen, disülfat düsük moleküler agirliga sahip bir bilesimdir. Moleküler agirlik, örnegin 2000 g/mol'den ya da 1000 g/mol'den daha düsüktür. Disülfat örnegin SmM ila lM arasinda, bilhassa 10 nM ila 0.5M arasinda bir konsantrasyonda kullanilir.

Bulusun tercih edilen bir uygulamasinda, disülfat bilesimi glutasyon disülfatidir. Glutasyon (GSH), ayni zamanda y-L- glütamil-L-sisteinilglisin, glütamik asit, sistein ve glisin olmak üzere üç amino asitten olusturulan bir yalanci bir tripeptittir. GSH hem prokaryotlarin hem de ökaryotlarin sitoplazmasinda bulunur ve disülfat köprülerinin olusumuna katilir. Bir disülfat köprüsü içeren dimer GSSG ile dengededir.

Glutasyon bir disülfat degisim reaksiyonunda iki polipeptit ya da tek bir polipettitten sisteinler R-SH ve R'-SH ile reaksiyona girer: RSSG bir karisik disülfat olarak bilinir. Bir polipeptitin bir baska sisteini ile reaksiyona sokulur, böylece iki sistein arasinda bir disülfat köprüsü elde edilir: Glutasyon sitosol içinde enzimatik. olarak indirgenmis bir formda (GSH) saklanir. Dolayisiyla sitosol içinde indirgeme kosullarindan da bahsedilmistir. Kosullar çözünme tamponu içinde, tamponun içerdigi disülfat bileseninin disülfat köprülerinin olusumunu yukarida açiklanan reaksiyonlara uygun olarak katalize edecegi sekilde saglanir. GSSG örnegin 10 nM ila 0.5 M arasinda bir konsantrasyonda kullanilir.

Alternatif olarak, bir redüktör (indirgeyici) olarak Sistein kullanilabilir.

Bulusun tercih edilen bir uygulamasinda denatürasyon solüsyonu bir Tris tamponudur.

Denatürasyon solüsyonu ek geleneksel katki maddeleri, Örnegin EDTA ya da tuzlar içerebilir. Çözme tamponunun pH degeri örnegin 7 ila 10 arasinda, tercihen pH 8'dir. Çözme tamponu tercihen mekanik olarak, örnegin geleneksel homojenlestirme aparatlari ya da ultrason araciligiyla desteklenir. Çözme sonrasi, kalan katilar tercihen temizlenir. Üst faz çözünmüs proNGF içerir.

Bulusun bir uygulamasinda, denatüre edici solüsyon sunlari i. Guanidinyum-HCI, l-8 M, tercihen 4-6 M, en tercih edilir sekliyle 4 M, GSH ya da Sistein, 1-100 nM, tercihen 5 nM ii. Tris, 0.0l - 1 M, tercihen 0.1 M, iii. EDTA, l - 50 nM, tercihen lO nM, iv. pH 7.0 - 10.0, tercihen pH 8.0 4 M Guanidinyum-HCI konsantrasyonu birçok durumda proNGF muteinin tamamen denatürasyonu için yeterlidir.

Adim b: proNGF mutantinin dogallasimi ProNGF mutantinin inklüzyon cisimciklerinden çözünmesi sonrasi proteinin tekrar natif yapisina katlanmasi sarttir. Tekrar katlama süreci için artan reaksiyon yanlis katlanmasi ve birikimi minimize etmek önemlidir. Yigilmanin önlenmesi için tekrar katlama ve düsük protein konsantrasyonlarinda yapilir çünkü protein yigilmasi yüksek protein konsantrasyonlarinda baskindir. Adim b)'de, proNGF Hmtantini bir tekrar katlama tamponu içine aktarmak denatüre edilmis proNGF'nin biyolojik olarak aktif bir yapi gösterdigi yerde gerçeklesir. Biyolojik olarak aktif bir yapi dogal beta-NGF'de gerçeklesen disülfat köprülerinin varligiyla belirlenebilir.

Bulusun tercih edilen bir uygulamasinda, çözünebilir proNGF mutanti en az bir saperon, en az bir metal selatör ve bir redoks karistirma sistemini içeren bir tekrar katlama solüsyonu içinde tekrar natüre edilir.

Tercih edilen bir uygulamada, mevcut bulusa göre metot adim b)'de asagidakileri içeren bir tekrar katlama solüsyonu kullanir: i. bir saperon, tercihen Arginin, O.5-1.0 M, tercihen 0.75 ii. bir metal selatör, tercihen EDTA, l-lO nM, tercihen 5 nM, iii. redoks karistirma sistemi, 0.1-10 nM arasinda, tercihen l nM L-Sistin ve 5 nM L-Sistein ya da 1 nM GSSG (okside edilmis glutasyon) ve 5 nM GSH (indirgenmis glutasyon). iv. pH 8.0 - pH 11.0, tercihen pH 9.5.

Sistamin/Sisteamin gibi alternatif redoks karistirma sistemleri kullanilabilir.

Bulusun tercih. edilen bir uygulamasinda katlama yardimcisi Arginin'dir. Proteinlerin katlanmasini destekleyen bilesenler genellikle “katlama yardimcilari” olarak kullanilabilirler. Bu bilesenler alanda yetkin kisilerce bilinirler. Katlamayi çesitli yollarla destekleyebilirler. Arginin'in yanlis sekilde katlanmis aracilari destabilize ettigi, böylece bunlarin en azindan kismen tekrar katlandigi (termodinamik bir kör uçtan) ve dolayisiyla dogru sekilde tekrar katlanabilecekleri kabul edilir. Diger taraftan, gliserol genellikle proteinleri stabilize eder. Bulusa göre metotta katlanmis proNGF muteinin salt verimini 5%'den fazla artiran bilesenler, özellikle %'dan ya da 20%'den fazla artiranlar (katlama için uygulanan toplam proNGF miktari baz alindiginda) katlama yardimcilari olarak özellikle uygundurlar.

Katlama tercihen 8 ila 11 pH degeri arasinda, özellikle pH 9.5'te yapilir.

Katlama kabi içindeki protein konsantrasyonunu artirmak için, bir atim renaturasyonu yapilmistir. Atim sayisinin limiti 0.3 M'i geçmemesi gereken Guanidinyum-HCI konsantrasyonudur. Atim basina protein konsantrasyonu nihai katlama hacmine iliskin olarak 50 ug/ml'i geçmemelidir.

Bulusun tercih edilen bir uygulamasinda, çözücü katlama partisine birden fazla parçalar halinde ya da birkaç gün boyunca devamli olarak eklenir. Tercihen, çözücü çözücüye hizla seyreltme uygulanarak bir “atim renatürasyon” içinde eklenir”. Bu baglamda, örnek olarak, ancak bununla sinirli olmamak üzere, en az (5 atim örnegin 24 saatlik bir zaman araligi içinde uygulanabilir. Atimlarin sayisi çözme parçasinin eklenmesinden sonra henüz katlanmamis olan proteinin konsantrasyonu çok yüksek. olmayacak sekilde ayarlanir, zira aksi takdirde yiginlar elde edilir. Örnegin, her bir atim ile 0.05 g/I ila 0.2 g/I, tercihen 9.1 g/I protein katlama parçasinin içine yeni transfer edilmis olur (çözücünün katlama partisi içine dahil edilmesinden sonraki protein konsantrasyonu baz alindiginda). Örnegin, her bir katlama adimi en az 1-2 saat sürer.

Katlama sonrasi, katlama reaksiyonunun bir kolon içine doldurulmadan önce temizlenmesi gerekir. Bu alanda bilinen herhangi bir metotla, örnegin filtrasyon ile yapilabilir.

Tercih edilen bir uygulamada, dogru sekilde katlanmis pro-NG mutant üretme metodu asagidaki adimlari içerir: a) Çözünemez proNGE` mutant içeren inklüzyon cisimcikleri. yukarida. tarif edildigi gibi bir denatüre edici solüsyon içinde çözülür ve b) çözünmüs proNGF sonra yukarida tarif edildigi gibi bir katlama solüsyon tamponu içinde renatüre edilir.

Bulusun tercih edilen bir uygulamasinda, denatüre edici solüsyon ve/Veya katlama solüsyonu haliyle herhangi bir deterjan içermez. Deterjanlarin kullaniminin proNGF muteinin çözünmesi ve/veya katlanmasi için gerekli olmadigi bulunmustur. Bu avantajlidir zira deterjanlar farmasötik ürünlerin içermemesi ya da sadece çok küçük miktarlarda içermesi gereken ve dolayisiyla pahali yöntemlerle temizlenmesi gereken nispeten agresif kimyasal maddelerdir.

Bulusa göre metot dolayisiyla, bu tür agresif deterjanlarin (Triton X-lOO ya da Drij-58) proteinin katlanmasi için kullanildigi Soejima et al. 2001 ile kiyaslandiginda avantajlidir. Diger bir deyisle, bulusa göre üretim metodunun tümü içinde hiçbir deterjan kullanilmamistir ve üretim metodu dolayisiyla deterjansiz bir metottur.

Adim c: proNGF mutantin kromatografi yoluyla aritilmasi Bulusa göre denatürasyon ve sonrasinda katlama metodunu kullanarak katlanmis proNGF muteinin sulu bir solüsyonu elde edilir. Katlanmis proNGF mutein bunun sonrasinda bilinen metotlarla ayrica aritilabilir.

Tercih edilen bir uygulamada, proNGF mutanti katlama (örn. denatüre edici olmayan ya da bu özelligi zayif olan) solüsyonundan kromatografik aritma ile, özellikle bir karisik mod kromatografi (bulusun bir proNGF mutantindan beta-NGF üretme metodunun c adimi) ile aritilir. Kromatografi için en çok tercih edilen kolon bir sentetik afinite ligandi, tercihen 4-mercapto-etil-piridin (MEP Hypercell; Pall) içeren bir kolondur. Bu ortamin avantajlari baglanmanin iyonik güçten bagimsiz olmasi, tuz istifinin. gerekmemesi ve süreci hizlandirmak için yüksek akis hizlarinin mümkün olmasidir.

Ayrica, elüsyon bir pH-geçisi ile yapilir.

Diger karisik mod materyal kolonlari bilinmektedir ve kullanilabilirler. Örnegin, ancak bunlarla sinirli olmamak üzere, MEP (Pall; afinite ligandi 4-Mercapto etil piridin), HEA (Pall; afinite ligandi: Heksilamino), PPA (Pall, afinite ligandi: Fenilpro- pilamino), MBI, (Pall, afinite ligandi: 2- Mercapto-Sbenzamidazol sülfa asit), Capto MMC (GEHC), Capto yapistirici (GEHC; afinite ligandi: N-benzil-N-metil10 etanolamin), CHY hidroksiapatit (BioRad, CHT florapatit). MEP, HEA, PPA ve MBI kolonlarinin hidrofobik bir baglanmasi vardir ve Capto MMC karisik mod isleviyle katyon degistiricidir ve Capto yapistirici karisik mod isleviyle bir anyon degistiricidir. BioRad kolonlari iyon degistirme kolonlaridir ve hidrofobik bilesenlere sahiptir. Burada listelenmeyen diger tüm karisik mod materyal kolonlari da proNGF mutantini aritmak için kullanilabilir.

Adim d: proNGF'nin beta-NGF'ye bölünmesi ProNGF beta-NGF'nin öncülüdür. Dolayisiyla, bulusun bir proNGF mutantindan beta-NGF üretim metodunun d) adiminda proNGF mutantin prosekansi bir aktif beta-NGF elde etmek üzere bölünür.

Tripsin-türü substrat özgüllügüne sahip proteazlar proteini protein molekülünün aktif kismini sindirmeden bölerler.

Tripsin-türü proteazlar pozitif yüklü Arginin ya da Lizin gibi bir amino asidi izleyen peptit baglarini bölerler. Tripsin- türü proteazlar gibi, çesitli serin proteazlar da (serin endopeptidaz) beta-NGF elde etmek için proNGF'nin islenmesi için düsünülür. Tercihen, serin proteaz Tripsin prosekansin bölünmesi için kullanilir ancak bunun yerine diger proteazlar da kullanilabilir.

Bölünmenin Tripsinin kendisiyle sinirli olmadigi ancak tripsin-türü substratlari içeren diger proteazlari da içerebilecegi not edilmelidir. Genel olarak, proNGF'nin tripsine (ya da diger proteaza) orani uygun sekilde ayarlanmissa, düzgün sekilde katlanmis, matür beta-NGF bu proteaz ile bölünmeyecektir. Aksine, denatüre edilmis proteinlerle birlikte katlama aracilari proteaz tarafindan yapilacak bir ataga karsi duyarli sekanslar ortaya çikarirlar.

Tercihen, proNGE' mutantin beta-NGF'ye bölünmesi için, tripsinin (ya da diger proteinin) proNGF mutantina orani agirlik basina 1:200 - l:lO0.000, daha tercih edilir sekilde 1:10.000 (w/w) bir orandir. En çok tercih edilen bir uygulamada, bölünme 8-23 saat arasinda oda sicakliginda, en tercih edilir sekilde 18 saatte gerçeklesir. Bu bulusta kullanilan kosullar altinda, proNGF mutanti tamamen bölünür ve neredeyse hiç yan ürün olusmaz. Herhangi bir yigin gözlemlenmemistir. Örneklerde açik sekilde açiklandigi üzere, mevcut bulusun sahipleri bulusun proNGF mutantina yapilan amino asit modifikasyonlarinin sadece istenmeyen bölünme alanlarinda proteinin bölünmesini engellemedigini bulmakla kalmamislar, ayrica beklenmedik sekilde dogal fenotip proNGF'ninkine kiyasla Tripsin bölünmesinin verimliliginde büyük bir artis sonucu verdigini bulmuslardir, ki bu da çok saf bir ürün elde etmek üzere çok seçimli sartlar altinda bölünmenin yapilmasina olanak tanimaktadir.

Detayli olarak, deneysel veri açik bir sekilde halihazirda 1:100.000 gibi son derece düsük bir Tripsin/Protein oraninda bulusun proNGF mutantini (SEQ ID NP:5) (yaklasik 85%'lik) bir bölünme verimiyle son derece yüksek bir saflikta rekombinan insan beta-NGF sonucunu verdigini göstermektedir. Ayrica, ayni Tripsin/Protein oranindaki dogal fenotip proNGF (SEQ ID No:1) düsük bir bölünme verimliligi (yaklasik 5%) göstermektedir.

Tatmin edici bir verimlilik sadece çokr daha yüksek tripsin/protein oranlarinda (1/250) elde edilmistir ancak bu beraberinde düsük seçimlilik ve asiri parçalanma sebebiyle yüksek bir ürün yipranmasini getirmistir.

Adim e: Beta-NGF'nin daha da aritilmasi Bulusun bir proNGF mutantindan üretilmis beta-NGF, örnegin, çesitli kromatografik yöntemlerle daha da aritilabilir. Diger aritma adimlari Tripsin ve ürünle beta-NGF'den triptik parçalanmayla ilgili kirliliklerinden aritilmasi için gereklidir. Aritma adimlari HCP, Endotoksinleri ve DNA'yi azaltmalidir. Protein aritimi için alanda bilinen herhangi bir metot kullanilabilir. En çok tercih edilenler kromatografik aritmalar, örnegin Sefaroz kolonlaridir (örn. SP Sefaroz HP, Q Sefaroz FF).

Bir proNGF'den üretilen beta-NGF'nin nihai ürünü safligiyla ilgili olarak SOS-PAGE, rp-HLPC, SE-HLPC ve IEX-HLPC ile analiz edilmistir. HLPC analizleri beta-NGF'nin en az 97% saf oldugu sonucunu vermistir.

Bulusun tercih edilen bir uygulamasinda, beta-NGF elde etmeye uygun bir proNGF muteinin üretimi için metot asagidaki adimlari a) rekombinan proNGF mutantin prokaryotik hücrelerdeki ikame edilmis proteaz bölünmesi ile ekspresyonu b)proNGF içeren inklüzyon cisimciklerinin izolasyonu c) inklüzyon cisimciklerinin en az (i) kaotropik bir madde, (ii) bir selatör, (iii) bir tampon ve (iv) bir redüktör içeren bir denatüre edici tampon ile karistirilmasi d)en azindan bir saperon, bir metal selatör ve bir redoks karistirici sistemi içeren bir katlama solüsyonu içinde katlanmasi e)tekrar katlanmis proNGF mutantinin aritilmasi f) tripsin gibi proteazlarla beta-NGF'nin aktif formuna bölünmesi g)beta-NGF'nin izolasyonu ve aritilmasi.

ProNGF'nin beta-NGF üretimi için kullanilmasi Üçüncü bir yönden, bulus, mevcut bulusun proNGF mutantinin insan beta-NGF üretimi için kullanilmasina yöneliktir.

Bulusun proNGF' mutantindan elde edilmis beta-NGF'nin farmasötik bilesimleri Bir baska yönden, bulus yukarida tarif edildigi gibi insan dogal fenotip sekansinin (SEQ ID No:1) 101 ve 103 pozisyonlarinda (K3 \KE Rl) RÃSK3R4 natif› proteaz bölünme alaninda ikame edilen bir proNGF mutantindan elde edilen beta-NGF içeren farmasötik bir bilesimle ve farmakolojik olarak kabul edilebilir bir tasiyiciya yöneliktir.

Bulusun bir uygulamasinda, farmasötik olarak aktif beta- NGF gen tedavisi yöntemleriyle hastaya uygulanmistir. Gen tedavisinde kullanilan ve bir genin yerlestirilmesi, bu bulusla ilgili olarak bir beta-NGF için bir gen kodlamasinin hastaya aktarilmasi için uygun olan iki basit yöntem mevcuttur.

EX vivo uygulamada, farmasötik olarak aktif gen kodlayan beta-NGF bir vücut hücresine bir vektör araciligiyla sokulur, Vücut hücresi tercihen bir gliyal hücredir ve bu sekilde islenen hücre sonrasinda hastaya, örnegin mikro ya da nanoparçaciklarla aktarilir. Özellikle tercih edilen beta-NGF geninin hücresel genoma spesifik bir entegrasyonudur. hücrelere vektörlerle, örnegin Virüslerle aktarilir, bu bir taraftan hedef hücreyi enfekte edecek ve dolayisiyla farmasötik olarak aktif beta-NGF genini aktaracak, ancak diger taraftan hedef hücre içinde üreyemeyecektir. Bu yaklasimda, nano ya da Jnikroparçaciklar, örnegin hücre zarindan geçebilecek liposomlar, vektör olarak kullanilabilirler.

Beta-NGF geni için bir vektör olarak, spesifik olarak konak hücreyi enfekte edebilecek ya da hedef hücre içindeki bir antijenle immüno etkilesebilecek bir virüs ya da bir antikor bir örnek olarak kullanilabilir. Ayrica, adenovirüsleri ya da Vaccinia bazli vektörleri, örnegin modifiye edilmis vaksinia virüsü Ankara (MVA) kullanmak da mümkündür.

Alanda yetkin kisiler rutin yaklasimlara dayali uygun bir formülasyon seçebilecekler ve farmasötik bilesimin hastaya verilmesi için uygun bir form seçeceklerdir. Örnegin, farmasötik bilesim.bir ya da daha fazla farmakolojik olarak kabul edilebilir içerik, örnegin tasiyicilar ya da seyreltioiler içerebilir. Bu madde siniflari arasinda, dolgular, tuzlar, tamponlar, stabilizatörler, tesir artiricilar ve diger iyi bilinen materyaller sayilabilir.

Mevcut bulusun farmasötik bilesimlerinin formülasyonu için teknikler “Remington's Pharmaceutioal Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, son versiyon gibi iyi bilinen standart kitaplarda bulunabilir.

Mevcut bulusta tarif edildigi gibi üretim metoduyla elde edilen beta-NGF'nin dozu infüzyon ile verilirse 0.1 ug/kg ila 500 ug/kg vücut agirligi ve enjeksiyon ile verilirse 2 ug/kg ila 2 mg/kg Vücut agirligi araliginda olabilir. ÇIZIMLERIN KISA TASVIRLERI Sekil 1, proNGF ve bulusun proNGF mutantlarinin sekansini göstermektedir.

Koyu renk harflerle gösterilenler insan beta-NGF'nin proformunun sekansidir. Koyu renk ve alti çizili olanlar ise proteaz (tripsin) bölünme alanidir (SEQ ID NO:1'in amino asitleri. 101-104; tripsin bölünme alanlari amino asitler ve 104-105 (RM arasindadir). Sekanstaki X herhangi bir amino asit olabilir.

Sekil la, insan proNGF'nin sekansini (SEQ ID NO:1) proteaz bölünme alani RSKR (SEQ ID No:9) ile göstermektedir.

Sekil lb, bulusun bir proNGF mutantinin sekansini (SEQ ID10 No:2) proteaz bölünme alani VSXR (SEQ ID NO:10) ile göstermektedir.

Sekil lc, bulusun bir proNGF mutantinin sekansini (SEQ ID No:3) XSXR'ye dönüsmüs proteaz bölünme alani (SEQ ID NO:11) ile birlikte göstermektedir.

Sekil ld, bulusun bir proNGF mütantinin sekansini (SEQ ID No:4) XSAR'ye dönüsmüs proteaz bölünme alani (SEQ ID NO:12) ile birlikte göstermektedir.

Sekil le, bulusun bir proNGF mutantinin sekansini (SEQ ID No:5) VSAR'ye dönüsmüs proteaz bölünme alani (SEQ ID NO:13) ile birlikte göstermektedir.

Sekil lf, bulusun bir proNGF mütantinin sekansini (SEQ ID NO:7) XXXR'ye dönüsmüs proteaz bölünme alani (SEQ ID NO:13) ile birlikte göstermektedir.

Sekil lg, bulusun bir proNGF mutantinin sekansini (SEQ ID No:8) VSAR'ye dönüsmüs proteaz bölünme alani (SEQ ID NO:14) ile birlikte göstermektedir.

Sekil lh, proteaz bölünme alanlarinin sekanslarini göstermektedir (SEQ ID NOlari: 6, 9-15).

Sekil 2. ProNGF ya da proNGF mutantlarinin beta-NGF'ye dönüstürülmesi Sekil 2a, natif bir Furin bölünme alani RSKR'ye sahip dogal fenotip proNGF kullanilarak tripsin bölünmesi sonrasi alti beta-NGF bölünme ürünlerini göstermektedir. Çizim açik sekilde dogal fenotip proNGF'nin beta-NGF'ye bölünmesinin birçok10 farkli bölünme ürününün homojen olmayan bir karisimini ortaya koydugunu göstermektedir.

Sekil 2b, bir proNGF mutanti SP kullanilarak natif Furin bölünme alaninin silinmesi ile tripsin bölünmesi sonrasi natif beta-NGF bölünme ürünlerini göstermektedir. Proteaz bölünme alani RSKR (SEQ ID No:9) bir VSAR (SEQ ID NO:12) alani sonucu elde etmek için iki amino asit ile ikame edilmistir. Bu alan sadece amino asit Arginin 104 pozisyonunda olduktan sonra bir proteaz ile bölünebilir; Tripsin (üç yerine) sadece bir bölünme alaninda bölebilir. Çizim açik sekilde proNGF mutantinin beta-NGF'ye bir bölünmesinin SP sadece tek bir homojen bölünme ürünü (beta-NGF) ortaya koydugunu göstermektedir.

Sekil 3, dogal fenotip proNGF'ye kiyasla proNGF mutanti SPl74- lOl'in (SEQ ID No:5) katlanmasini göstermektedir. Sekil dogal fenotip proNGF'nin (devamli çizgi) katlanma verimliligi ile proteaz bölünme alani VSAR'ye dönüsmüs proNGF mutantinin (kesikli çizgi) katlanma 'verimliligini karsilastirmaktadir.

Sekilden açikça görülebilir ki dogal fenotip ve mutant proNGF'nin katlanma verimliligi tipatip aynidir.

Sekil 4, proteaz bölünme alani VSAR'ye dönüsmüs proNGF mutanti SP bir MEP HyperCel kolon ile aritilmasini göstermektedir. Sekil katlanmis ve filtrelenmis bir proNGF mutantinin bir MEP HyperCel aritiminin bir elüsyon profilini göstermektedir.

Sekil 5, proteaz bölünme alani VSAR'ye dönüsmüs proNGF mutanti SP Tripsin ile bölünmesini göstermektedir. Sekil triptik bölünmenin parçalarinin Coomassie ile boyanmis SOS-PAGE jelini göstermektedir. ProNGF10 mutantinin triptik bölünme ürünü 4-7 hatlarinda görülebilir.

Sekil açik bir sekilde aritilmis proNGF mutantinin sadece bir bölünme ürünü (beta-NGF) ortaya koydugunu göstermektedir.

Sekil 6, beta-NGF'nin aritilmasini göstermektedir. Sekil triptik bölünme sonrasi bir SP Sefaroz HP kolonunun bir profilini göstermektedir. Triptik parçalanma reaksiyonu bir SP Sefaroz HP kolonu üzerine yüklenmistir. Elüsyon. üç adimda yapilmistir (a. 25 %25 nM sodyum fosfat, 1 M NaCl, pH 6.5 (tampon B), b. 25-50%'den itibaren lineer bir gradyan ile tampon B ve c. 100% tampon B (akis hizi 60 cm/saat)). ÖRNEKLER Asagidaki örnekler alanda yetkin kisilere bulusun metot ve bilesimlerinin nasil yapilacagi ve kullanilacaginin tam bir açiklama ve tarifini sunmak için verilmistir ve bulus sahiplerinin bulusu olarak gördüklerinin kapsamini sinirlandirma amaçli degildir. Kullanilan rakamlarla ilgili kesinlik saglamak üzere çaba harcanmistir ancak bazi deneysel hatalar ve sapmalar olabilecegi dikkate alinmalidir. Aksi belirtilmedigi sürece, moleküler agirlik ortalama moleküler agirliktir, sicaklik Santigrat cinsinden sicakliktir ve basinç atmosfer basinci ya da buna yakindir. Örnek 1. 101 ila 104 pozisyonlarindaki proteaz bölünme alaninda (R18K3R4) dogal fenotip proNGF'nin ikamesi Insan proNGF'nin (SEQ ID No:1) 101 ve 103 pozisyonlarina denk gelen Arginin R1 ve Lizin K3'ün ikamesi sentezlenmis bir gen kullanilarak alanda yetkin kisilerce bilinen metotlarla DNA seviyesinde yapilmistir. 102 pozisyonundaki serin ya degismeden kalmis ya da insan proNGF'nin (SEQ ID No:1) 102 pozisyonunda da sentezlenmis bir gen kullanilarak alanda yetkin kisilerce bilinen metotlarla DNA seviyesinde ikamesi yapilmistir. Pozisyon 104'e denk gelen Lizin K4 ikame edilmemistir. Sekanslar Sekil 1'de gösterilmistir. Örnek 2. ProNGF mutanti SP prokaryotik hücreler içinde rekombinan ekspresyonu Rh-proNGF (DSMZ 5585; F thi L'l (laC-proAB) end Al gyr A96 re/A l phx hsdR17 supE44 recA) ekspresyonu için kullanilan Bakteriyel konak E. coli JMlO8 prolin-oksotropiktir, plazmit kullanilarak ile pSCILlOl düzenlemesi ile nötralize edilmistir. Plazmit pSCIL lOl plazmit PSCILOO8 temeline dayalidir (bkz. WOO506l7l6). Dizi tiyamini sentezleyemez NO:5'te gösterilen proNGF mutanti pSCIL 101 üzerine konumlandirilmis tac destekleyicisinin kontrolü altinda ifade edilmistir. Burada kullanilan pSCILlOl vektörü bir kanamisin dayanimina sahip bir yüksek kopya plazmittir. Ekspresyon tanimli bir mineral tuzu ortaminda yapilmis ve IPTG eklenerek uyarilmistir. ProNGF mutanti inklüzyon cisimcikleri formunda sitosol içine yerlestirilmistir.

Hücre hatti: o konak dizi, örn. E. coli HMSl74 (Kl2) or JMlO8 (K12) o proNGF mutant SP 0 Tac destegi (IPTG uyarimi) o ColEl replikon o Kanamisin dayanimi o proBA seçimi o Tescilli vektör sistemi pSCIL lOl (örn. bkz. Örnek 3. Fermantasyon Bu fermantasyonun amaci sonraki isleme adimlari için ürün ve biokütle elde etmekti. Fermantasyon sürecinde hedef proteinin asiri ekspresyonunu görüntülemek için numuneler SOS-AGB araciligiyla endüksiyondan önce ve sonra analiz edildi. 0 Antibiyotikler olmaksizin mineral tuzu ortami 0 Parti asamasi u ~ 0.25 h*›(0Dmm=l8) o Fed parti asamasi I pax = 0.18 h” ile üstel besleme 0 Fed parti asamasi Il: sabit besleme hizi 0 Endüksiyon noktasi Oan = 60 +/- 5 0 1.0 mM IPTG o Endüksiyon zamani Ssaat o Nihai OD : 82 +/-4 0 Plazmit Stabilitesi 100% o Verimlilik: 40 mg/g proNGF; 1,2 g/L +- 0.2 g/L proNGF Örnek 4. SP174-101 içeren inklüzyon cisimciklerinin Ilk Toparlanisi Bakteri hücrelerinde, rekombinan protein yiginlar halinde bulunur. ProNGF muteinin ekspresyonu IBS seklinde olmustur.

Hücre yikimi ve IBs hazirlanmasi standart protokollere göre yapilmistir ve laboratuvar ölçeginde yaklasik 200 g biokütleye kadar bir çalisma için uygulanabilir. ProNGF mutein içeren bu (l987); Folding proteins. In: Creighton, T. E. (ed.): Protein Function: A Practical Approach. Oxford University Press, pp.4O için, hücre peptitleri uygun bir tampon içinde tekrar süspanse edilmis ve ardindan hücreler 50 nM Natriumfosfat pH 7.0, 1 nM EDTA'da yüksek basinç homojenlestirme ile parçalanmistir. Örnek 5. ProNGF mutanti SP174-101'in bir denatürasyon solüsyonu içinde çözünmesi (inklüzyon cisimciklerini çözdürülmesi) Inklüzyon cisimcikleri (i) bir kaotropik ajan, (ii) bir selatör, (iii) bir tampon ve (iv) bir redüktör içeren bir solüsyondan olusan bir denatüre edici solüsyon içinde çözdürülmüstür. Çözdürme için, Guanidinyum-HCI (GuaHCI) 4-0- 6.0 M bir konsantrasyon araliginda test edilmistir. Çözdürme tamponu bir inklüzyon cisimcigi harci (IB harci) ile farkli oranlarda karistirilmistir. Tüm deneylerin 5 rwd nihai bir Sistein konsantrasyonu olmustur ve oda sicakliginda yapilmislardir. Sonuçlar SOS-PAGE (veri gösterilmemistir) araciligiyla analiz edilmistir. Deneyler 4 M GuaHCI'nin inklüzyon cisimciklerinin tamamen Çözülmesi için yeterli bir konsantrasyon oldugunu ortaya koymustur. Inklüzyon cisimcigi harcinin tampona orani 1 + 1.25 (v/v) (IB harci : tampon).

Inklüzyon cisimciklerinin çözülmesi için denatüre edici solüsyonun nihai kosullari söyle olmustur: i. 4 M Guanidinyum HCI iii. lO nM EDTA iv. 5 nM Sistein Çözücü derin filtrasyon ile standart prosedürlere göre temizlenmistir.

Protein konsantrasyonu bundan sonra Bradford Metodu (Bradford, M. M., Anal. Biochem. 72 (1976) 248) kullanilarak belirlenmistir. ProNGF muteinin protein konsantrasyonu 10- mg/ml arasinda olmustur. Örnek 6. ProNGF mutani SP174-101'in denatüre edilmis proNGF'nin biyolojik olarak aktif bir yapi gösterdigi bir katlama tamponu içine aktarilmasi Çözünme sonrasi, proteinin natif haline döndürülmesi ve böylece yanlis katlama. ve yigilmanin, önlenmesi sarttir. Çözülmüs malzemelerden bulusa göre biyolojik olarak aktif proNGF mutein hazirlamak için, bunlar proNGF'nin biyolojik olarak aktif bir yapi gösterdigi bir katlama solüsyonu içine katilmistir. içermistir ii. 5 nM EDTA iii. l nM L-Sistin ve 5 nM L-Sistein Aktif yapidaki NGF'ninr elde edilmesi matür insan beta- NGF'de olusan disülfat köprülerinin varligi ile dogrulanmistir.

Katlama sürecindeki protein konsantrasyonunu artirmak için, bir atim renaturasyonu yapilmistir. 50 ug/ml proNGF mutant proteini basina bir atim her saatte bir verilmistir.

Guanidinyum-HCI'nin solüsyon içindeki konsantrasyonu 0.3 M'yi geçmemelidir. Bunu basarmak için, 15 atim gerekmistir.

Temizlenen, tekrar katlanan fraksiyon baska kolonlara konulmadan önce filtrelenmistir.

Tekrar katlama reaksiyonunun performansi rp-HPLC ile her atim sonrasi analiz edilmistir. Ortaya çikan zirve alani atim sayisina karsi blotlanmistir. rp-HPLC için, tersine A, 5 um, Vydac) bir koruyucu kolonla birlikte (örn. 214GK54; 300 A; Vydac) kullanilmistir. Çalisma tamponlari 0.05% trifloroasetik asit (TFA) ile HzO ve 0.05 TFA ile Asetonitrildir. Akis hizi 1 ml/dakikadir. Sonuçlar sekil 3'te gösterilmistir. Sekil 3'ten görülebilir ki dogal fenotip ve mutant proNGF'nin katlama verimlilikleri birebir aynidir. Örnek 7. ProNGF mutanti SP174-101'in bir karisik mod materyal kolonu araciligiyla katlama solüsyonundan arindirilmasi Sentetik bir afinite ligandi olan 4-mercapto-etil-piridin (MEP) içeren bir kolon kullanilmistir. Elüsyon pH-degerinin degistirilmesiyle yapilmistir. Ayrica, elüsyon etkin proses tasarimi için faydali olacak sekilde düsük bir tuz konsantrasyonu ile yapilmistir.

Kolon 0.75 Arginin, 5 mM EDTA, pH9.5 ile dengelenmistir.

Temizlenmis katlama reaksiyonu içine kolon ortaminin Litresi basina maksimal 5 g proNGF mutanti yükleme kapasitesine sahip bir MEP HyperCel kolon (Pall) içine konulmustur. Yikama adiminda, birçok kirlilik ve baglanmamis protein 2 M GuaHCI, 0.l M Tris-HCI, pH 8.0 ve nM Tris-HCI, pH 8.0 kullanilarak temizlenmistir. Elüsyon 50 nM Asetat, pH 4.0 0-70% lineer bir gradyan ile yapilmistir (akis hizi 120 cm/saat). Sekil 4, proteaz bölünme alani VSAR'ye dönüsmüs (SEQ ID No:5) katlanmis ve filtrelenmis proNGF mutantinin MEP HyperCel aritiminin bir elüsyon profilini göstermektedir. GuaHCI yikama adiminda, birçok kirlilik temizlenmistir, “Havuzda” yaklasik 60-70% Örnek 8. ProNGF mutanti SP174-101'in aktif beta-NGF elde etmek üzere bölünmesi ProNGF mutantinin beta-NGF'ye triptik parçalanmasi için, proteazin aktivitesini engellemeyen bir fosfat tamponu kullanilmistir. Sodyum fosfat tamponu MEP-eluatina 25 nM nihai sodyum fosfat konsantrasyonu olacak sekilde eklenmistir. pH-degeri 6.5'e ayarlanmistir. Proteoliz için Tripsin (Roche, GMP derecesi) 1: (tripsinzproNGF) oraninda eklenmistir. Proteoliz oda sicakliginda 18 saatlik bir inkübasyon süresi kullanilarak gerçeklestirilmistir. Performans ve triptik parçalanmanin verimliligi SOS-PAGE, rp-HPLC ve UV/VISZ80nn1 ile analiz edilmistir. Sekil 5 triptik bölünmenin parçalarinin bir SOS-PAGE'ini göstermektedir. 4-12 % Bis/Tris-Gel, 1 mm, 1x MES (lnvitrogen) çalisma tamponu olarak kullanilmistir. 5- 7 hatlari triptik bölünme ürünlerini bölünmemis proNGF mutantina (rhproNGF*, bkz. hat 3) ve matür beta-NGF'ye (NGF; bkz. hat 8) kiyasla göstermektedir. Sekiller açik bir sekilde aritilmis proNGF mutantinin sadece bir bölünme ürünü (beta-NGF) sonucunu verdigini göstermektedir. ProNGF mutantinin beta-NGF'ye tam bir dönüsümü gözlemlenebilmistir. Örnek 9. Aktif beta-NGF'nin aritilmasi Triptik parçalanma sonrasi beta-NGF bir SP Sefaroz HP kolonuna Tripsin, bölünmenin yan ürünleri ve diger kirliliklerin temizlenmesi için konulmustur. SP Sefaroz HP aritmasi Sekil 6'da gösterilmistir.

Kolon 25 nM Na-fosfat tamponu (pH 6.5) ile dengelenmistir.

Triptik parçalanma reaksiyonu bir SP Sefaroz HP kolon (2 g beta-NGF/l ortam) üzerine konulmus ve baglanmamis protein dengeleme tamponu ile yikanmistir. Elüsyon üç adimda yapilmistir (3 cv 25 %25 mM Na-fosfat pH 6.5 I 1 M NaCl (tampon B), 10 cv 25-50 %'den itibaren lineer gradyan ile tampon B, ve 3 cv 100 % tampon B (akis hizi 60 cm/saat)).

Sekil 6 beta-NGF'nin aritilmasini göstermektedir. Sekil triptik bölünme sonrasi SP Sefaroz HP kolonunun bir profilini göstermektedir. Beta-NGF'nin verimliligi 85-95% arasinda olmustur (zirve “numune elüsyonu”). Örnek 10. Mutant SP174-101 ve dogal fenotip üzerinde Tripsinin bölme verimliligi Bu prosedür hem proNGF mutant SP hem de insan dogal fenotip proNGF (SEQ ID No:1; rhProNGF) için paralel olarak uygulanmistir. ml aritilmis rhProNGF 25 mM fosfat tampon pH 6.5'a karsi diyalize alinmistir. Diyaliz sonrasi, 0.08 mg/ml'lik bir protein konsantrasyonu HPIC-UV ile ölçülmüstür. Parçalanma numunesi basina, 80 ug proNGF uygulanmistir. Proteoliz sonrasi, tüm numuneler HPIC-UV ile analiz edilmistir.

Tripsin/rhProNGF' mutantinin kütle orani l/l0.000 olarak kullanilirken, tripsin rhProNGF dogal fenotip için farkli kütle oranlari kullanilmistir (bkz. Tablo 3). Tripsin solüsyonu için 1.0 ug/ml ve 10 ug/ml kullanilmistir. Bir gece (yaklasik 17 saat) oda sicakliginda inkübasyon sonrasinda tüm numuneler analiz edilmistir. Kontrol amaciyla proteaz eklenmemis rhProNGF mutanti da ayrica inkübe edilmistir.

Tripsin/rhProNGF TripsinHacmi TripsinAmount rhProNGF rhProNGF Hacmi rhProNGF Miktari orani (ul) (ug) Türü (iul) (ug) Kontrol Mutant 1000 80 Tüm triptik parçalanmalarin performans ve verimlilikleri HPIC-UV ile bir Vydao 214MS C4 kolon kullanilarak yapilmistir.

Tablo 4 triptik parçalanmasi sonrasi elde edilen bölünme verimliliklerini göstermektedir. Deneysel veriler açik bir sekilde proNGF mutanti SEQ ID NO:5'in Tripsin ile bölünmesinin yüksek verimlilikte (yaklasik 85%), çok düsük bir tripsin/protein orani (1/10.000) orani kullanarak sadece tek bir ürünü (beta-NGF) ortaya koydugunu göstermektedir. Bu dogal fenotip proNGF'nin (SEQ ID No:1) bölünmesiyle kiyaslanabilir ki o düsük bir tripsin/protein oraninda (1/l0.000) çok düsük bir bölünme (sadece yaklasik %) ve yüksek tripsin/protein oraninda (1/250) çok yüksek bir ürün bozulmasi (asiri parçalanma) göstermektedir.

Miktar Tripsin/Pro % % % betaNGF 1.1g orani ProNGF betaNGF Formlari ProNGF Standart 80 100 NGF Standart 42 100, 0 Örnek 11. TF1 hücrelerinin. proliferasyonunun, uyarilmasi yoluyla proNGF'nin biyolojik aktivitesinin test edilmesi TFI hücreleri (ATCC, katalog no. CRL 2003) standart prosedürlere göre islenmistir. Bir test ortami (90% RPM: 50 ug/ml Streptomisin) hücrelere eklenmis ve santrifüjlenmistir. Tanecik 1,5 -105 hücre/ml yogunlukta test ortaminda 37 0C'de tekrar süspanse edilmistir. Hücre süspansiyonu farkli konsantrasyonlarda proNGF proteini ile M) ve 96 kuyulu plakalarda analiz edilmistir. 37OC'de 48 saat inkübasyon sonrasi hücre proliferasyon belirteci (örn.

WST-l, Roche Applied Science, kat no. 1644807) eklenmis ve plakalar tekrar 37ÜC'de 4 saat boyunca inkübe edilmistir.

Emme 450 nm'de ölçülmüs ve uygun programlar kullanilarak (örn. Bsp. Sigma-Plot 2000) ECSO-degeri belirlenmistir.

Bu uygulama ayrica asagidaki maddeleri kapsar: l.Bir proNGF Hmtanti olup, özelligi; proteaz bölünme alani RlsKüU bazik olmayan bir asit ve Histidin arasindan seçilmis herhangi bir amino asit ile en azindan insan dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ ID No:1) 101 ve 103 pozisyonlarina denk gelen R1 ve K3 pozisyonlarinda ikame edilmesidir. 2.Madde l'e göre proNGF mutanti olup, özelligi; proteaz bölünme alaninin Arginin ya da Lizin haricinde bir amino asit ile 101 ve 103 pozisyonlarinda ikame edilmis olmasidir. 3.Madde l'e göre proNGF mutanti olup, özelligi; proteaz bölünme alaninin Alanin, Glisin, Valin, Serin, Treonin, Metiyonin, Tirosin, Histidin, Asparagin, Aspartik Asit, Glütamin, Glütamik Asit, Fenilalanin, Izolesin, Lesin, Triptofan, Sistein ve Pralin arasindan seçilen bir amino asit ile 101 ve 103 pozisyonlarinda ikame edilmis olmasidir. 4.Madde l'e göre proNGF mutanti olup, özelligi; proteaz bölünme alaninin Alanin, Valin, Glisin, Serin, Treonin, Metiyonin, Tirosin, Histidin, Asparagin, Aspartik. Asit, Glütamin ve Glütamik. Asit arasindan seçilen bir amino asit ile lOl ve 103 pozisyonlarinda ikame edilmis olmasidir.

.Madde l'e göre proNGF mutanti olup, Özelligi; natif10 proteaz bölünme alaninin Alanin, ve Valin arasindan seçilmis herhangi bir amino asit ile 101 ve 103 pozisyonlarinda ikame edilmis olmasidir.

.Maddeler 1 ila 3'e göre proNGF mutanti olup, özelligi; proteaz bölünme alaninin 101 pozisyonunda Valin ile ikame edilmis olmasidir.

.Maddeler 1 ila 6'ya göre proNGF mutanti olup, özelligi; proteaz bölünme alaninin 103 pozisyonunda Alanin ile ikame edilmis olmasidir.

.Maddeler 1 ila 7'ye göre proNGF mutanti olup, özelligi; insan dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ ID No:1) 104 pozisyonuna denk gelen R4 pozisyonundaki amino asidin Arginin ya da Lizin arasindan seçilmis olmasidir.

.Maddeler 1 ila 8'e göre proNGF mutanti olup, özelligi; insan dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ ID No:1) 104 pozisyonunda ikame edilmis olan amino asidin Serin, Glisin, Sistein, Asparagin, Tirosin, Treonin, Aspartik Asit, Glütamin, Alanin, Valin, Glütamik Asit, Histidin, Izolesin, Lesin, Fenilalanin, Pralin Triptofan ve Metiyonin arasindan seçilmesidir.

Maddeler 1 ila 9'a göre proNGF mutanti olup, özelligi; insan dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ pozisyonundakinin Serin, 103 pozisyonundakinin Alanin ve 104 pozisyonundakinin. Arginin, ile ikame edilmis olmasidir.

Maddeler` 1 ila 11'e göre proNGE' mutanti olup, özelligi; mutantin prokaryotik hücrelerde rekombinan ekspresyon ile elde edilmis olmasidir. 13. Madde 12'ye göre proNGF mutanti olup, özelligi; mutantin E. coli içinde rekombinan ekspresyon ile elde edilmis olmasidir. 14. Biyolojik olarak aktif bir insan beta-NGF üretmek için metot olup, özelligi; sunlari içermesidir: (i) istemler 1_ ila 13'ten herhangi birisine göre bir proNGF mutant sunmak, ve (ii) aktif insan beta-NGF elde etmek için proNGF mutanti bölmek.

. Madde 14'ün metodu olup, özelligi; su adimlardan olusmasidir: a. istemler 1-13'ten herhangi birisine göre proNGF mutantini bir denatüre edici solüsyon içinde inklüzyon cisimciklerinin çözünmesi yoluyla çözmek b. proNGF mutantini denatüre edilmis proNGF mutantinin biyolojik olarak aktif bir yapi gösterdigi bir katlama solüsyonu içine c. katlanmis proNGF mutantini aritmak aktif beta-NGF elde etmek için proNGF mutantinin prosekansini bölmek 16. Madde 15'in metodu olup, özelligi; denatüre edici solüsyonun (i) bir kaotropik madde, (ii) bir selatör, (iii) bir tampon ve (iv) bir redüktör içermesidir. 17. Madde 16'nin metodu olup, özelligi; denatüre edici solüsyonun sunlari içermesidir V. 1 - 8 M Guanidinyum-HCI, tercihen 4-6 M, vi. vi. 0.01 - 1 M Tris, vii. l - 50 mM EDTA, Viii. 1 - ya da Sistein'den seçilmis, 18. Madde 17'nin metodu olup, özelligi; denatüre edici solüsyonun sunlari içermesidir i. Guanidinyum-HCI iii. lO nM EDTA iv. 5 nM GSH ya da Sistein 19. Madde 15'e göre metot olup, özelligi; katlama solüsyonunun sunlardan olusmasidir i. 0.5 - 1.0 M saperon, ii. 1 - 10 nM metal selatör, iii. 0.1 - 10 nM redoks karistirma sistemi, . Madde 18'e göre metot olup, özelligi; katlama solüsyonunun sunlari içermesidir i. 0.75 M Arginin, ii. 5 nM EDTA iii. 1 mM L-Sistin ve 5 mM L-Sistein ya da 1 mM GSSG (okside edilmis glutasyon) ve 5 nM (GSH (indirgenmis glutasyon), 21. Maddeler 15 ve 17-20'ye göre metot olup, Özelligi;katlamanin bir atim renatürasyonu olarak yapilmasidir. 22. Madde 21'e göre metot olup, özelligi; atim renatürasyonu sirasindaki nihai katlama hacmiyle ilgili olarak, Guanidinyum HCI konsantrasyonunun 0.3 M'yi ve atim basina protein konsantrasyonunun 50 pg/ml'yi geçmemesidir. 23. Maddeler lS'ten herhangi birisine göre metot olup, özelligi; proNGF mutantin karisik mod kromatografi ile aritilmasidir. 24. Madde 23'e göre metot olup, özelligi; kromatografi kolonunun sentetik bir afinite ligandi olan karisik mod bir materyal kolonu olmasidir.

. Madde 24'e göre metot olup, özelligi; karisik mod materyal kolonunun bir 4-mercapto-etil-piridin (MEP), Heksilamino (HEA), Fenilpropilamino (PPA), 2-Mercapto- Sbenzamidazol sülfa asit (MBI), Capto MMC (GEHC), N- benzil-N-metil etanolamin (GEHC)), CHT hidroksiapatit ya da CHT florapatit içeren bir kolon olmasidir. 26. Madde 25'e göre metot olup, özelligi; karisik mod materyal kolonunun 4-mercapto-etil-piridin (MEP) içeren bir kolon olmasidir. 27. Maddeler 14 ila 26'ya göre metot olup, özelligi; proNGF mutantin proformunun bir proteaz ile bölünmesidir. 28. Madde 27'ye göre metot olup, özelligi; proNGF mutantin proformunun bir serin proteaz ile bölünmesidir. 29. Madde 28'den herhangi birisine göre metot olup, özelligi; proNGF mutantin proformunun tripsin ile bölünmesidir.

- Maddeler 27-29'un metodu olup, özelligi; tripsinin proNGF mutantina oraninin 1:200 - l:lO0.000 arasinda olmasidir. 31. Madde 30'un metodu olup, özelligi; tripsinin proNGF mutantina oraninin agirlik basina 1:500 - l:20.000 arasinda olmasidir. 32. Madde 31'in metodu olup, özelligi; tripsinin proNGF mutantina oraninin l:l0.000 (w/w) olmasidir. 33. Maddeler* 14 ila 32'nin metodu olup, özelligi; ayrica ek bir beta-NGF aritma adimini içermesidir. 34. Madde 33'ün metodu olup, özelligi; ayrica beta- NGF'nin kolon kromatografisi ile aritilmasina dair ek bir adimi içermesidir.

. Madde 34'ün metodu olup, özelligi; ayrica beta- NGF'nin SP Sefaroz HP kolonu ile aritilmasina dair ek bir adimi içermesidir. 36. Maddeler 1-14'ten herhangi birisine göre insan beta-NGF üretmek için proNGF mutantini kullanimidir.

SEKANS LISTESI Wacker Chemie AG10 <120> Özgün proNGF mutantlari ve hazirlanisinda kullanimlari <130> F-30038/EP/DIV <160> 7 <170> Patentln versiyon 3.5 <210> 1 <21l> 222 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 bunlarin beta-NGF <2lO> <211> <212> <213> <220> <223> proNGF mutant <220> <221> sair özellik <222> (102)..(102) <223> Xaa dogal olarak olusan herhangi bir asit olabilir <400> 2 Met G1u Pro His Ser Giu Ser Asn Vai Pro Ala Giy His Thr Ile Pro Gln Val His Tip Thr Lys Leu Gln His Sar Leu Asp Thr Ala Leu Arg 25 30 Arq Ala Arq Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arq 50 55 60 Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Giu Ala 65 70 75 80 Ala Asp Thr Gln Asp Lou Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe 85 90 95 Asn Axg Thr His Arg xoa Lys Arg Set Ser Ser His Pro Ile Phe His 100 105 110 Arg Giy Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Vai Ser Vai Trp Vai Gly Asp 115 120 125 Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lya Gly Lya Glu Vai Met Vai Leu Giy 130 135 140 Glu Val Asu Ile Asn Asn Sar Val Phe 145 150 Lys Cys Arq Asp Pro Asn Pro Vai Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gin Ala 195 200 Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 210 215 <210> 3 <211> 222 <212> PRT <213> yapay <220> <223> proNGF mutant <220> <221 > sair özellik <222> (101) .. (101) <223> Xaa dogal olarak olusan olabilir <220> <221 > sair özellik <222> (103) .. (103) <223> Xaa dogal olarak olusan olabilir <400> 3 herhangi herhangi amino asit amino asit <210> 4 <211> 222 <212> PRT <213> yapay <220> <223> proNGF mutant <220> <221 > sair Özellik <222> (101) .. (101) <223> Xaa dogal olarak olusan herhangi bir amino asit olabilir <400> 4 Hat Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Giy His Thr Ile Pro 1 5 10 15 Gln Val His Trp Thr Lys Lou Gln His Sar Lou Asp Thr Ala Leu Arg 25 30 Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly 40 45 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> proNGF mutant SP174-101 <210> <211> <212> PRT <213> yapay <220> <223> proteaz bölünme alani <220> <221 > sair özellik <222> (2) .. (2) <223> Xaa dogal olarak olusan olabilir <400> 6 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> yapar <220> <223> proteaz bölünme alani <400> 7 herhangi amino asit Sekil la. insan oroNGF sekansi lSEQID NO: 1) MEPHSESNVPAG HTIPQVHWTKLQHSLDTALRRARSA PMAIAARVAG QTRNITVDPR LFKKRRLRSPRVLFST QPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSS! I PIHIRGF l'SVCDSVSVWVGDKTI'ATDIKGKEVMVLGEVNN NSVF KQYFFFTKCRDPNPVDSGCRG!DSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDG KQAAWRFIRICTACVCVl SRKAVR Sekil lb. Bulusun bir proNGF mutantinin sekansi (SEQ ID No:2) MEPHSESNVPAG HTIPQVHWTKLQHSLDTALRRARSA PAAAIAARVAG QTRNIWDPR LFKKRRLRSPRVLFST QPPREAADIQDIDFEVGGAAPFNRTHI ZS'YIISSSIlPJFIlRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDI KGKEVMVLGEVNI NNSUF KQYFFFTKCRDPNPVDGGCRG[DSKHWNSYCTITHTFV KAl TMDGKQAAWRFIRGDTACVCVI SRKAVR Sekil 1:. Bulusun bir proNGF mutantinin sekansi (SEQID NO: 3) MEPHSESNVPAG HTIPQVHWTKLQHSIDTALRRARSA PAMIAARVAGQTRNITV DPR LFKKRRLRS PRVLFST QPPREAADIQDUJFEVGGAAPFNRTHXERSSSH Pl F HRGF FSVCDSVSVWVGDKWAT-DIKGKFVMVLGIVNEN NSVFKQYFFFTK(ROPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHWVKAI TMOG KOA ÄWRFlRlDTACVCVl SRKAVR Sekil 1d. Bulusun bir proNGF mutantinin sekansi (SEQ ID NO: 4) MEPHSESNVPAG HTIPQVHWTKlQHSLDTAlRRARSAPAAAIMRVAG QTRNIW DPR LFKKRR LRS PRVLFST QPPREAADTQDlDFEVGGAAPFNRTHÄERSSSHPIF HRG H SVCDSVSVWVG DKi iAl DIKGKEVMVLGEVNIN NSVFKQYFFFTKfRDPNPVDSGCRGl DSKHWNSY(TITHTFVKAI TMDGKOAAWRFlRIDTANCVtSR KAVR Sekil le. pronGF mutanti SP MEPHSESNVPAGHTIPQVHWTKLQHSLDTALRRARSAPMAIAARVAGGTRNIWDPRLFKKRRLRSPRVLFST QPPREMDTQDIOFEVGGMPFNRTHVSARSSSHPIFHRGFFSVCDSVSVWVGDKTTATDlKGKIVMVIGEVNIN NSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYC l HTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTAÜ/(VISRKAVR Sekil If. Bulusun bir proNGF mutantinin sekansi (SEQID NO: 7) MEPHSESNVPAGHTIPQVHWTKlQHSLDTALRRARSAPMAIAARVAGQIRNIWDPRLFKKRRLRSPRVLFST QPPREMDTQDlOFEVGGMPFNRTHXÄXRSSSHPIFHRGI'FSVCDSVSVWVGDKTI'ATDIKGKI'VMVI Gl'VNIN NSVFKOYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYL i HTFVKALTMDGKQAAWRFlRlDTAO/CVLSRK/NR Sekil lg. Bulusun bir proNGF mutantinin sekansi (SEQID No:8) MEPHSESNVPAG HTIPQVHWTKLQHSlDTALRRARS/l PMAIAARVAGQTRNITVDPR LFKKRH LRSPRVLFST QPPREAADTQDlOFEVGGAAPFNRTH VXARSSSHPIFHRGI'FSVL'DSVSVWVGD KTI'AT DIKGKFVMVI GFVNI NNSVF KQYF E F lKÜiDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCITTHTI VKAI TMDGKQAAWRHR IÜTACVCVISRKAVR Sekil lh. Baska proteaz bölünme alanlari RXKR (SEQ lD NO: 6); RSKR (SEQ ID NO: 9); VSXR (SEQ ID NO: 10); XSXR (SEQ ID NO: 11); XSAR (SEQ Sekil 1. proNGF ya da proNGF mutanlarinin beta-NGF'ye dönüstürülmesi Sekil za. Dogal fenotip proNGF'nin islenmesi PFNRTHÄSKhGSSHPF Sekil ib proNGF mutanti SP PFNRTHHSABGSSHPF ' nmis Fur1n bö me a ani proNGF mutanti SP174-101'in tekrar katlanmasi

Claims (1)

1. ISTEMLER 1.Bir proNGF mutanti olup, özelligi; proteaz bölünme alani RlsKHÜ bazik olmayan bir asit ve Histidin arasindan seçilmis herhangi bir amino asit ile en azindan insan dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ ID No:1) 101 ve 103 pozisyonlarina denk gelen R1 ve K3 pozisyonlarinda ikame edilmesidir. .Istem l'e göre proNGF mutanti olup, özelligi; proteaz bölünme alaninin Alanin, Glisin, Valin, Serin, Treonin, Metiyonin, Tirosin, Histidin, Asparagin, Aspartik Asit, Glütamin, Glütamik Asit, Fenilalanin, Izolesin, Lesin, Triptofan, Sistein ve Pralin arasindan, tercihen Alanin, Valin, Glisin, Serin, Treonin, Metiyonin, Tirosin, Histidin, Asparagin, Aspartik Asit, Glütamin, Glütamik Asit arasindan ve daha da tercih edilir sekilde Alanin ve Valin arasindan seçilen bir amino asit ile bahsi geçen 101 ve 103 pozisyonlarinda ikame edilmis olmasidir. .Istemler l ya da 2'ye göre proNGF mutanti olup, özelligi; insan dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ ID No:1) 104 pozisyonuna denk gelen RA pozisyonundaki amino asidin Arginin ya da Lizin arasindan seçilmis olmasidir. .Istemler 1 ila 3'e göre proNGF mutanti olup, özelligi; insan dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ ID No:1) bahsi geçen proteaz bölünme alaninin 102 pozisyonundaki amino asidin Serin, Glisin, Sistein, Asparagin, Tirosin, Treonin, Aspartik Asit, Glütamin, Alanin, Valin, Glütamik Asit, Histidin, Izolesin, Lesin, Fenilalanin, Pralin Triptofan ve Metiyonin amino asitleri arasindan seçilmesidir. 5.Istemler 1 ila 4'e göre proNGF mutanti olup, özelligi; insan dogal fenotip proNGF sekansinin (SEQ ID No:1) 101 pozisyonundaki amino asidin Valin, 102 pozisyonundakinin Serin, 103 pozisyonundakinin Alanin ve 104 pozisyonundakinin Arginin ile ikame edilmis olmasidir. .Istemler 1 ila 5'e göre proNGF mutanti olup, özelligi; mutantin E. coli içinde rekombinan ekspresyon ile elde edilmis olmasidir. .Biyolojik olarak aktif insan beta-NGF hazirlamaya dair bir metot olup, özelligi; sunlari kapsamasidir: (i) istemler 1 ila 6'dan herhangi birisine göre bir proNGF mutant sunmak, ve (ii) aktif insan beta-NGF elde etmek için proNGF mutanti bölmek. .Istem 7'nin metodu olup, özelligi; su adimlardan olusmasidir: a.istemler l-6'dan herhangi birisine göre proNGF mutantini bir denatüre edici solüsyon içinde inklüzyon cisimciklerinin çözünmesi yoluyla çözmek b.proNGF mutantini denatüre edilmis proNGF mutantinin biyolojik olarak aktif bir yapi gösterdigi bir katlama solüsyonu içine aktarmak c.katlanmis proNGF mutantini aritmak d.aktif beta-NGF elde etmek için proNGF mutantinin prosekansini bölmek 9.istem 8'in metodu olup, özelligi; denatüre edici solüsyonun (i) kaotropik bir madde, (ii) bir selatör, (iii) bir tampon ve (iv) bir redüktör içermesi ve denatüre edici solüsyonun a.1 - 8 M Guanidinyum-HCI, tercihen 4-6 M, b.vi. 0.01 - 1 M Tris, c.l - 50 mM EDTA, d.l - ya da Sistein'den seçilmis, ve tercihen a.Guanidinyum-HCI b.O.1 Tris, c.lO nM EDTA d.5 nM GSH ya da Sistein içermesi ve tercihen, katlama solüsyonunun a.O.5 - 1.0 M saperon, b.l - 10 nM metal selatör, c.O.l - 10 nM redoks karistirma sistemi, ve daha tercih edilir sekilde a.O.75 M Arginin, b.5 nM EDTA c.l mM L-Sistin ve 5 mM L-Sistein ya da 1 mM GSSG (okside edilmis glutasyon) ve 5 nM (GSH (indirgenmis glutasyon), içermesidir. 10. Istemler 8 ya da 9'a göre metot olup, özelligi; tekrar katlamanin bir atim renatürasyonu olarak yapilmasidir. 11. Istem 8'e göre metot olup, özelligi; proNGF mutantinin bir karisik mod kromatografi ile aritilmasidir. 12. Istemler 7 ila 11'e göre metot olup, özelligi; proNGF mutantinin proformunun bir proteaz, tercihen bir serin 5 proteaz, daha da tercih edilecek sekilde tripsin ile bölünmesidir. 13. Istemler 7 ila 12'e göre metot olup, özelligi; beta- NGF'nin, tercihen kolon kromatografisi ile olmak üzere 10 aritilmasina dair ek bir adimi içermesidir. 14. Istemler` 1 ila 6'ya göre bir proNGE' mutanti olup, özelligi; insan beta-NGF mutanti üretmek için kullanilmasidir.