JPH06181778A

JPH06181778A - ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白質をコードするＤＮＡおよびその用途

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Publication number: JPH06181778A
Application number: JP4335935A
Authority: JP
Inventors: Haruo Onda; 治夫音田; Masaki Hosoya; 昌樹細谷; Tadao Ono; 忠夫大野
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1992-12-16
Filing date: 1992-12-16
Publication date: 1994-07-05
Anticipated expiration: 2018-01-14
Also published as: JP3366358B2

Abstract

(57)【要約】【目的】ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白
質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡの単離および該
ＤＮＡを用いるタンパク質の生産。【構成】ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白
質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡをヒトｃＤＮＡ
ライブラリーから単離し、その塩基配列を決定した。【効果】ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白
質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡおよび該ＤＮＡ
を発現させて得られる該蛋白質は、（１）神経生理・生
化学、免疫学の研究や該蛋白質の抗体提供に有用であ
り、該抗体は神経系腫瘍等の診断薬として用いることが
でき、また（２）活性調節・機能阻害等の神経系・免疫
系に作用する医薬の開発に有用であり、特に該蛋白質の
欠損、機能不全に起因する疾病、例えば免疫不全に対す
る遺伝子治療剤として有効に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒトカルシニューリンＡ
αアイソフォーム蛋白質をコードするＤＮＡを含有する
ＤＮＡ、ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白
質および該蛋白質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】カルシニューリン（Klee, C. B. et al.
プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エイ（Proc. Nat
l. Acad. Sci. ＵＳＡ）７９：６２７０−６２７３；１
９７９）は蛋白質の脱リン酸化反応を触媒するプロテイ
ンホスファターゼの１種である（Stewart, A. A. et a
l. フェブス・レターズ（ＦＥＢＳ Lett.）１３７：８
０−８４；１９８２）。カルシニューリンなどのプロテ
インホスファターゼが関与する蛋白質のリン酸化・脱リ
ン酸化反応は、細胞外から各種受容体蛋白質が受け取っ
た特定の刺激を増幅・伝達する経路として細胞の機能調
節においてきわめて重要である。蛋白質はプロテインキ
ナーゼによってリン酸化され、プロテインホスファター
ゼによって脱リン酸化される。プロテインホスファター
ゼはセリンまたはスレオニン残基に付加されたリン酸基
をはずすもの（セリン／スレオニンホスファターゼ）と
リン酸化チロシンに作用するもの（チロシンホスファタ
ーゼ）の２つに大別され、カルシニューリンはその前者
に属する。

【０００３】カルシニューリンはおよその分子量が６１
ｋＤのＡサブユニットと１９ｋＤのＢサブユニットから
なるヘテロダイマーの蛋白質である（Klee, C. B. et a
l.アドバンシズ・イン・エンザイモロジー（Adv. Enzym
ol.）６１：１４９−２００；１９８７）。Ａサブユニ
ット（カルシニューリンＡ）はプロテインホスファター
ゼとしての触媒活性部位を含み、さらにカルシウム結合
蛋白質として細胞の機能調節に重要であるカルモジュリ
ンとの結合部位をもつ。ＡサブユニットにはＡα、Ａβ
のタイプ、さらにＡβにはＡ１、Ａ２のサブタイプの合
計３種のアイソフォームが存在することが知られてい
る。Ｂサブユニット（カルシニューリンＢ）はＥＦハン
ド型カルシウム結合部位を有し、その分子種は精巣特異
的なものを除くと１種類のみである。カルシニューリン
は中枢神経系に多量に存在しており、また、その他の末
梢組織にも存在する。特に、ラットにおける知見から、
カルシニューリンＡアイソフォームの分布には差があ
り、それぞれのアイソフォームにおける異なった生理的
役割の存在が示唆されている。脳内のあらゆる領域にお
いて、ＡαはＡβよりも２〜４倍多く存在している（Ku
no, T. et al. ジャーナル・オブ・ニューロケミストリ
ー（J. Neurochem.）５８：in press；久野高義ほか、
実験医学１０：１２３８−１２４２；１９９２）。カル
シニューリンが神経系に多量に存在することから、この
蛋白質が神経系の機能調節に重要な役割を果たしている
ことが考えられ、その生理的役割や神経特異的な発現機
構の解明、カルシニューリン特異的阻害薬の開発等が進
められている。

【０００４】また近年、臓器移植の際の拒絶反応を抑え
たり、自己免疫疾患の治療などに用いられている強力な
免疫抑制剤であるサイクロスポリンＡやＦＫ５０６の作
用機序の研究から、カルシニューリンがこれらの免疫抑
制剤の共通の標的であることが明らかにされた（Liu,
J. et al. セル（Cell）６６：８０７−８１５(１９９
１)）。各々の免疫抑制剤はイムノフィリンと呼ばれる
免疫抑制剤結合蛋白質と結合し、その複合体がカルシニ
ューリンと結合することによってカルシニューリンのホ
スファターゼ活性を阻害する。その結果として、リン酸
化によって機能調節されている蛋白質の脱リン酸化が阻
害され、その中でも特に、ＮＦ−ＡＴと呼ばれる転写因
子等の脱リン酸化阻害によって、この因子に依存したリ
ンホカイン遺伝子の転写が抑制される（Mattilla, P.
S. et al. エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ J.）９：４
４２５−４４３３；１９９０；Emmel, E. A. サイエン
ス（Science）２４６：１６１７−１６２０；１９８
９）。カルシニューリンに関するこのような知見は従来
より多くの努力が積み重ねられて来た免疫抑制剤の作用
機序の解明に対し、その端緒を拓くものである。

【０００５】カルシニューリンの構造の解明については
遺伝子組み換え技術の適用により、特にホスファターゼ
活性を担うＡサブユニットについて、ヒト、ウシ、ラッ
ト、マウス等の構造決定がなされてきた。特にラットに
ついてはＡα、Ａβ（Ａ１、Ａ２）の３種のタイプにつ
いて全て構造決定がなされた（Ito, A. et al. バイオ
ケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケー
ションズ（Biochem, Biophys. Res. Commun.）１６３：
１４９２−１４９７；１９８９；Kuno, T. etal. バイ
オケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ
ーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.）１６
５：１３５２−１３５８；１９８９）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ヒトではカルシニュー
リンＡβについてはＡ１、Ａ２ともにその構造が完全に
明らかにされているが（Guerini, D. and Klee, C. B,
プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス・ユー・エス・エイ（Proc.Natl. A
cad. Sci. ＵＳＡ）８６：９１８３−９１８７；１９８
９）、Ａαアイソフォームについては部分的に構造が決
定されているのみである（Kincaid, R.L, et al. ザ・
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol. Chem.）２６５：１１３１２−１１３１９；１９
９０）。

【０００７】カルシニューリンＡの活性調節をその主要
な作用機作とする医薬品の研究、開発を進めることを考
えた場合、それぞれのアイソフォームにおいて異なる生
理作用が予想されることから、ヒトの全てのカルシニュ
ーリンＡアイソフォームの構造、性質を明らかにする必
要があった。また、特に神経系において主要に存在する
Ａαアイソフォームの完全な構造の決定は、神経系に作
用する医薬の開発にとって重要な課題であった。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らはヒトからも
完全なカルシニューリンＡαアイソフォームを採取し、
しかもそれを遺伝子組み換え技術によって製造すること
ができれば、今後の研究、医薬品開発に多大な効果を奏
することができると考え、研究を重ねた結果、ヒト神経
芽細胞腫のｃＤＮＡライブラリーより、はじめて完全長
の翻訳領域をもつカルシニューリンＡαアイソフォーム
をコードするｃＤＮＡのクローニングおよびその翻訳領
域の完全塩基配列を解明することに成功した。さらに、
このｃＤＮＡからヒトカルシニューリンＡαアイソフォ
ームのアミノ酸配列を明らかにし、これを遺伝子組み換
え技術によって大量に生産する道を拓くことに成功した
ものである。

【０００９】本発明は（１）ヒトカルシニューリンＡα
アイソフォーム蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤ
ＮＡ、（２）ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム
蛋白質、（３）ヒトカルシニューリンＡαアイソフォー
ム蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを保持す
る形質転換体、および（４）該形質転換体の培養、培養
物中への蛋白質の生産蓄積、採取を包含するヒトカルシ
ニューリンＡαアイソフォーム蛋白質の製造方法に関す
るものである。

【００１０】本発明者はヒトカルシニューリンＡαアイ
ソフォーム蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ
として図１に示す１種類のものをクローニングし、その
翻訳領域の完全な蛋白質の一次構造を推定した（図２お
よび図３）。この配列における第１番目のメチオニンが
開始コドンと考えられる。Ｎ末端の配列解析により、こ
のカルシニューリンＡαアイソフォームにはＡβアイソ
フォームに存在するようなプロリン残基のクラスターが
全く存在しない。Ａβアイソフォームにおいてはこのプ
ロリン残基のクラスターがカルモジュリンとの相互作用
において重要であることが推定されており、Ａαアイソ
フォームがこのような構造を持たないことはＡα、Ａβ
の２種のアイソフォームの間に何らかの機能的差異が存
在することを示唆するものである。１５番目のアスパラ
ギン酸より４４６番目のセリンまでの部分は、特に一致
するアミノ酸残基を枠で囲って示したようにカルシニュ
ーリンＡのアイソフォームＡα、Ａβ（Ａ１、Ａ２）の
間できわめて構造が類似している（図４および図５）。
この部分は酵素活性を担う部分およびカルモジュリン結
合部位を包含しており（Hubbard, M. J. and Klee, C.
B. バイオケミストリー（Biochemistry）２８：１９６
８−１８７４；１９８９）、カルシニューリンＡ蛋白質
を特徴づける重要な部分である。Ａβアイソフォームの
サブタイプＡ１、Ａ２は図４および図５に示す一部の挿
入部およびＣ末端のアミノ酸配列が異なるのみで、ｃＤ
ＮＡの解析から共通の遺伝子から転写後のスプライシン
グによってＡ１、Ａ２の差異が生じることが示されてい
る。Ａαアイソフォームはこれらと遺伝子を異にするこ
とがラットにおいてすでに示されているが（Kuno, T. e
t al. バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・
コミュニケーションズ（Biochem, Biophys. Res. Commu
n.）１６５：１３５２−１３５８；１９８９）、今回そ
の構造を明らかにしたヒトのＡαアイソフォームも、ラ
ットと同様にＡβアイソフォームとは異なる遺伝子に由
来することによってＡβとの差異が生じるものと考えら
れる。

【００１１】ラットにおいて示されているようなＡαア
イソフォームは脳内においてカルシニューリンＡの大半
を占めることから、ヒトのＡαの完全な構造を解明する
ことは、ヒトにおける本蛋白質の機能解明に多大な貢献
をするものと考えられる。特に、カルシニューリンの機
能調節を主な作用機作とする神経系の医薬の開発を進め
るためには、ヒトカルシニューリンＡαを単離し、その
特徴を知ることが必要である。

【００１２】本発明のヒトカルシニューリンＡαアイソ
フォーム蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡと
しては、ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白
質をコードする塩基配列を含有するものであればいかな
るものであってもよい。すなわち、本発明のヒトカルシ
ニューリンＡαアイソフォーム蛋白質をコードするＤＮ
Ａを含有するＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの何れ
であってもよく、該ＤＮＡのスクリーニングは一般の遺
伝子工学的手法あるいはそれに準じる方法を用いて行う
ことができる。

【００１３】ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム
蛋白質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のヒト
カルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白質をコードす
るＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの
下流に連結することにより製造することができる。この
時、先に述べたように効率的に分泌生産させるために、
ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白質をコー
ドするＤＮＡの上流側に適当なシグナル配列をコードす
るＤＮＡを付加する。

【００１４】クローン化されたヒトカルシニューリンＡ
αアイソフォームをコードするＤＮＡは目的によりその
まま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカ
ーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡは
その５′末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有
し、また３′末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡ
Ａ，ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの
翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡ
アダプターを用いて付加することもできる。さらに該Ｄ
ＮＡを発現させるにはその上流にプロモーターを接続す
る。

【００１５】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３），枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４），酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５），あるいはλファージ
などのバクテリオファージおよびレトロウイルス、ワク
シニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルス
などが用いられる。本発明で用いられるプロモーターと
しては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプ
ロモーターであればいかなるものでもよい。形質転換す
る際の宿主がエシェリヒア属菌である場合は、trp プロ
モーター，lac プロモーター，recＡプロモーター，λ
ＰＬプロモーター，lpp プロモーターなどが、宿主がバ
チルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター，ＳＰ
Ｏ２プロモーター，penＰプロモーターなど、宿主が酵
母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター，ＰＧＫプロモ
ーター，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロモーターなど
が好ましい。

【００１６】宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０
由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、
メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモ
ーターなどがそれぞれ利用できる。なお、発現にエンハ
ンサーの利用も効果的である。また、必要に応じて分泌
発現を行なわせるためには、宿主に合ったシグナル配列
を、カルシニューリンＡαアイソフォームのＮ端末側に
付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、アル
カリフォスファターゼ・シグナル配列、ＯmpＡ・シグナ
ル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−
アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配
列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファ
クターα・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配
列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシ
ュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナ
ル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用で
きる。

【００１７】このようにして構築されたヒトカルシニュ
ーリンＡαアイソフォーム蛋白質をコードするＤＮＡを
含有するベクターを用いて、形質転換体を製造する。宿
主としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属
菌、酵母、昆虫、動物細胞などが用いられる。上記エシ
ェリヒア属菌、バチルス属菌の具体例としては、エシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プ
ロシージンクス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad.
Sci.ＵＳＡ），６０，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３
〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acid
s Research），９，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Jo
urnal of Molecular Biology）〕，１２０，５１７(１
９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー４１，４５９(１９６９)〕，Ｃ６０
０〔ジェネティックス（Genetics），３９，４４０(１
９５４)〕などが用いられる。上記バチルス属菌として
は、たとえばバチルス・サチルス（Bacillus subtill
s）ＭＩ１１４〔ジーン，２４，２５５(１９８３)〕，
２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（Journal of Biochemistry）９５，８７(１９８４)〕
などが用いられる。上記酵母としては、たとえばサッカ
ロマイセスセレビシエ（Saccaromyces cerevisiae)Ａ
Ｈ２２，ＡＨ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５
Ｄ，２０Ｂ−１２などが用いられる。昆虫としては、例
えばカイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャ
ー（Nature），３１５，５９２(１９８５)〕。動物細胞
としては、たとえばサル細胞ＣＯＳ−７，Ｖero，チャ
イニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細胞，ヒトＦ
Ｌ細胞などが用いられる。

【００１８】上記エシェリヒア属菌を形質転換するに
は、たとえばプロシージンク・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sc
i. ＵＳＡ），６９，２１１０(１９７２)やジーン，１
７，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なわ
れる。バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレ
キュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mo
lecular ＆ General Genetics），１６８，１１１(１９
７９)などに記載の方法に従って行われる。酵母を形質
転換するには、たとえばプロシージング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Nat
l. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５，１９２９(１９７８)に
記載の方法に従って行なわれる。動物細胞を形質転換す
るには、たとえばヴィロロジー（Virology）５２，４５
６(１９７３)に記載の方法に従って行なわれる。

【００１９】このようにして、ヒトカルシニューリンＡ
αアイソフォーム蛋白質をコードするＤＮＡを含有する
発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。

【００２０】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナト
リウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵
母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。

【００２１】培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェ
リヒア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコ
ース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），
ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュ
ラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in
Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring
Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。
ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため
に、たとえば３β−インドリルアクリル酸のような薬
剤を加えることができる。

【００２２】宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通
常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、
通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌
の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行
ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿
主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培地
〔Bostian, K. L. ら、「プロシージング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Na
tl. Acad. Sci.ＵＳＡ）７７，４５０５(１９８０)〕や
０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A.
ら、「プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.
ＵＳＡ）８１，５３３０(１９８４)〕が挙げられる。培
地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通
常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応
じて通気や撹拌を加える。

【００２３】宿主が動物細胞である形質転換体を培養す
る際、培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血
清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Seience）１２２，
５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Vi
rology），８，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ１６４
０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカ
ル・アソシエーション（The Jounal of the American M
edical Association）１９９，５１９(１９６７)〕，１
９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・
フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding
of the Society for the Biological Medicine）７
３，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８
であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約
１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。

【００２４】上記培養物からヒトカルシニューリンＡα
アイソフォーム蛋白質を分離精製するには、例えば下記
の方法により行なうことができる。ヒトカルシニューリ
ンＡαアイソフォーム蛋白質を培養菌体あるいは細胞か
ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白質の粗抽
出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素
や塩酸グアニジンなどのたんぱく変性剤や、トリトンＸ
−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。

【００２５】培養液中にヒトカルシニューリンＡαアイ
ソフォーム蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、
それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離
し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、
あるいは抽出液中に含まれるヒトカルシニューリンＡα
アイソフォーム蛋白質の精製は、自体公知の分離・精製
法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの
溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過
法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換
クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、ア
フィニティークロマトグラフィーなどの特異的新和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの
疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等
電点の差を利用する方法などが用いられる。

【００２６】なお、組換え体が産生するヒトカルシニュ
ーリンＡαアイソフォーム蛋白質を、精製前または精製
後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意
に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去するこ
ともできる。蛋白修飾酵素としては、トリプシン、キモ
トリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテイ
ンキナーゼなどが用いられる。かくして生成するヒトカ
ルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白質の活性は特異
抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定
することができる。また生成物に脱リン酸化活性がある
場合は、該活性を指標にして測定することもできる。

【００２７】以上、ヒトカルシニューリンＡαアイソフ
ォーム蛋白質の発現ベクターの作製と、それらによる形
質転換体の製造、該形質転換体を用いたヒトカルシニュ
ーリンＡαアイソフォーム蛋白質の製造及びその有用性
等について詳細に述べた。本発明明細書および図面にお
いて、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵ
ＰＡＣ−ＩＵＢ Commision on Biochemical Nomenclat
ure による略号あるいは当該分野における慣用略号に基
づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関
し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ
−体を示すものとする。

【００２８】ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウムＥＩＡ：エンザイムイムノアッセイＧly またはＧ：グリシンＡla またはＡ：アラニンＶal またはＶ：バリンＬeu またはＬ：ロイシンＩle またはＩ：イソロイシンＳer またはＳ：セリンＴhr またはＴ：スレオニンＣys またはＣ：システインＭet またはＭ：メチオニンＧlu またはＥ：グルタミン酸Ａsp またはＤ：アスパラギン酸Ｌys またはＫ：リジンＡrg またはＲ：アルギニンＨis またはＨ：ヒスチジンＰhe またはＦ：フェニールアラニンＴyr またはＹ：チロシンＴrp またはＷ：トリプトファンＰro またはＰ：プロリンＡsn またはＮ：アスパラギンＧln またはＱ：グルタミンなお、本発明のヒトカルシニューリンＡαアイソフォー
ム蛋白質においては、そのアミノ酸配列の一部が修飾
（付加、除去、その他のアミノ酸への置換など）されて
いてもよい。

【００２９】

【実施例】以下の実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
後述の実施例４で得られた形質転換体エシェリヒアコ
リ（Escherichia coli）ＭＶ１１８４／ｐＣＮＡ１０６
は、平成４年１２月１０日通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所(ＦＲＩ)に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４
１１１として寄託されている。

【００３０】〔実施例１〕ヒト神経芽細胞腫ＬＡ−Ｎ
−２由来ｃＤＮＡライブラリーの作成ヒト神経芽細胞腫ＬＡ−Ｎ−２より市販のｍＲＮＡ抽出
キット（インビトロゲン社）を用いてｍＲＮＡを抽出・
精製した。ｃＤＮＡ合成キット（アマシャム社）を用い
て精製ｍＲＮＡ約１０μg よりｃＤＮＡを合成した。こ
のｃＤＮＡの末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（アマシャ
ム社）で平滑にした後ＥcoＲＩアダプター（アマシャム
社）を付加した。このｃＤＮＡをλgt１１ベクター（ア
マシャム社）に結合し、インビトロパッケージングキッ
ト（アマシャム社）を使用してパッケージングを行なっ
た。このライブラリーは１.６×１０⁶個の独立した組み
換え体ファージを含有するものであった。

【００３１】〔実施例２〕プローブの精製以前にヒト精巣のｃＤＮＡライブラリー（クロンテック
社）よりヒトＰＡＣＡＰ前駆体のクローニングを行な
い、クローンｐＨＴ３８ｐ８を単離してあったので（特
願平２−３９８４１号）、これをＥcoＲＩ、ＰstＩ（タ
カラ社）で切断した後、このクローンの挿入断片の５′
側に相当する約３００塩基対のＤＮＡを調製した。これ
を〔α−³²Ｐ〕−ｄＣＴＰ（アマシャム社）とランダム
プライマー法による標識キット（アマシャム社）を用い
て標識し、プローブとして用いた。

【００３２】〔実施例３〕スクリーニング１.６×１０⁶ ｐｆｕ（プラークフォーミングユニ
ット）分のλgt１１ベクターｃＤＮＡライブラリーを硫
酸マグネシウムで処理したＹ１０９０と混ぜ、３７℃、
１５分間インキュベートした後、０．５％アガロース
（ファルマシア社）ＬＢを加え、１．５％寒天（和光純
薬社）ＬＢプレートに播いた。プラークのできたプレー
トにニトロセルロースフィルターを置き、フィルター上
にプラークを転写した。このフィルターをアルカリ処理
することによって変性させた後、８０℃３時間の加熱に
よってＤＮＡの固定を行なった。このフィルターを５０
％ホルムアミド（ベセスダリサーチラボラトリー社
（Bethesda Research Laboratories)）、５×デンハル
ト液（０．０２％ウシ血清アルブミン（シグマ社）、
０．０２％ポリビニルピロリドン（シグマ社）、０．０
２％フィコール（シグマ社）、５×ＳＳＰＥ（０．１５
モル塩化ナトリウム、０．０１モルリン酸１ナトリウ
ム、１ミリモルＥＤＴＡ）、０．１％ＳＤＳ、加熱変成
した１００μg／mlサケ精子ＤＮＡ（シグマ社）からな
るバッファー中で先に標識したプローブと一緒に一晩イ
ンキュベートし、ハイブリダイズさせた。洗浄は２×Ｓ
ＳＣ，０．１％ＳＤＳで５５℃１時間おこない、その
後、−８０℃でオートラジオグラフィをおこなってハイ
ブリダイズするクローンを検出した。

【００３３】〔実施例４〕ＤＮＡ配列解析一つのクローンが同定され、配列解析のためにｐＵＣ１
１８（タカラ社）にサブクローニングした。このプラス
ミドで大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換し、形質転換体エ
シェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＭＶ１１８４／
ｐＣＮＡ１０６を得た。このプラスミドをさらにエキソ
ヌクレアーゼ消化によって段階的に削って行き、または
適当な制限酵素によって切断後自己閉環あるいはサブク
ローニングし、配列解析のための鋳型ＤＮＡを調製し
た。配列決定には蛍光式ＤＮＡシーケンサー（アプライ
ドバイオシステムズ社）を用い、データー解析にはＤＮ
ＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング社）を使
用した。

【００３４】図２および図３にこのヒトカルシニューリ
ンＡαアイソフォーム蛋白質のＤＮＡの塩基配列、およ
びそれから推定されるアミノ酸配列をともに示す。

【００３５】〔実施例５〕ノザンブロッティングによ
る転写産物の検出ヒトカルシニューリンＡαアイソフォームｃＤＮＡの翻
訳領域の５'側に存在する２カ所のＥｃｏＲＶ切断部位
を用い、約４００ｂｐのＤＮＡ断片をプローブとして調
製した。これを先に述べた方法と同様にランダムプライ
ム法にて放射標識した。ＬＡ−Ｎ−２細胞より調製した
ｍＲＮＡ分画より５μgを用い、グリオキサールを含む
バッファー（１Ｍグルオキサール（和光純薬社）、５０
％ジメチルスルフォキシド（シグマ社）、０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウムｐＨ７．０）中で５０℃で１時間保温し
た。これを１．２％アガロースゲルを用いて電気泳動
し、ニトロセルロースフィルター上に転写した。ＲＮＡ
を転写したフィルターを８０℃で２時間処理した後、５
０％ホルムアミド、５×デンハルト液、１０×ＳＳＣ、
５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、加熱変成し
た１００μg／ｍｌサケ精子ＤＮＡからなるバッファー
中で先に標識したプローブと一緒に一晩インキュベート
し、ハイブリダイズさせた。洗浄は２×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳで５５℃で１時間行ない、その後−８０℃でオ
ートラジオグラフィを行なってハイブリダイズするバン
ドを検出した（第６図）。

【００３６】

【発明の効果】本発明のＤＮＡでＤＮＡ感染または形質
転換した菌体や細胞では、大量のヒトカルシニューリン
Ａαアイソフォーム蛋白質を産生せしめることができ、
ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白質の生産
を有利に導くことができる。本発明のヒトカルシニュー
リンＡαアイソフォーム蛋白質をコードするＤＮＡを含
有するＤＮＡおよび該ＤＮＡから製造されるヒトカルシ
ニューリンＡαアイソフォーム蛋白質は神経生理・生化
学、免疫学の研究、該蛋白質の抗体提供、該蛋白質の活
性調節・機能阻害を主な作用機作として神経系・免疫系
に作用する医薬の開発等につながるものである。

【００３７】近年、カルシニューリンが属するプロテイ
ンフォスファターゼは細胞癌化のプロモーションの過程
に関与している可能性が示唆されている（Suganuma, M.
etal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1768, 1988、
Haystesd, T.A.J. et al. Nature(London)337, 78, 198
9）。また、神経系腫瘍組織におけるカルシニューリン
の免疫化学的研究の結果、特定のタイプの腫瘍組織にカ
ルシニューリン陽性細胞が検出される傾向にある（Got
o, S. et al. Brain Res. 371, 237-243, 1986）。した
がって、本発明のヒトカルシニューリンＡαアイソフォ
ーム蛋白質を用いてより特異性の高い抗体の調整がで
き、それを特定の神経系腫瘍の診断薬として有効に用い
ることができる。また、ＰＣＲ法による遺伝子増幅のプ
ライマーとして本発明のＤＮＡ配列の一部を用いること
ができ、遺伝子診断用の診断薬としても用いることがで
きる。さらには、ヒトカルシニューリンＡαアイソフォ
ーム蛋白質の欠損、機能不全に起因する疾病、例えば免
疫不全に対する遺伝子治療剤として有効に用いることが
できる。

【００３８】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１６２０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源：生物名：ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：５５・・・１５８７特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：ｍａｔｕｒｅｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：５５・・・１５８７特徴を決定した方法：Ｓ配列：ＧＧＧＧＴＧＴＧＣＡＧＴＣＧＧＡＣＧＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＧＣＧＴ
ＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧＴＣＣ６０ＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＡＡＴＴＧＡＴＣＣＣＡＡＧＴＴＧＴＣＧＡＣ
ＧＡＣＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＣＴＧＴＴＣＣＡ１２０ＴＴＴＣＣＴＣＣＡＡＧＴＣＡＣＣＧＧＣＴＴＡＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡ
ＡＧＴＧＴＴＴＧＡＴＡＡＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＣＧＴ１８０ＧＴＧＧＡＴＡＴＣＴＴＡＡＡＧＧＣＧＣＡＴＣＴＴＡＴＧＡＡＧＧＡ
ＧＧＧＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＧＴＧＴＴＧＣＡＴＴＧ２４０ＡＧＡＡＴＡＡＴＡＡＣＡＧＡＧＧＧＴＧＣＡＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣＧ
ＡＣＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＴＡＴＴＧＡＴ３００ＧＣＧＣＣＡＧＴＣＡＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＧＧＡＣＡＴＴＣＡＴＧＧ
ＡＣＡＡＴＴＣＴＴＴＧＡＴＴＴＧＡＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＴ３６０ＧＡＡＧＴＣＧＧＧＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＣＡＡＣＡＣＴＣＧＣＴＡ
ＣＣＴＣＴＴＣＴＴＡＧＧＧＧＡＣＴＡＴＧＴＴＧＡＣＡＧＡ４２０ＧＧＧＴＡＣＴＴＣＡＧＴＡＴＴＧＡＡＴＧＴＧＴＧＣＴＧＴＡＴＴＴ
ＧＴＧＧＧＣＣＴＴＧＡＡＡＡＴＴＣＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＡ４８０ＡＣＡＣＴＧＴＴＴＴＴＡＣＴＴＣＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＴＧＡＡＴＧ
ＴＡＧＡＣＡＴＣＴＡＡＣＡＧＡＧＴＡＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴ５４０ＡＡＡＣＡＡＧＡＡＴＧＴＡＡＡＡＴＡＡＡＧＴＡＴＴＣＡＧＡＡＣＧ
ＣＧＴＡＴＡＴＧＡＴＧＣＣＴＧＴＡＴＧＧＡＴＧＣＣＴＴＴ６００ＧＡＣＴＧＣＣＴＴＣＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＣＣＡ
ＡＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＴＧＣＡＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧ６６０ＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＴＴＡＡＣＡＣＴＴＴＡＧＡＴＧＡＴＡＴＣＡＧ
ＡＡＡＡＴＴＡＧＡＣＣＧＡＴＴＣＡＡＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴ７２０ＧＣＡＴＡＴＧＧＡＣＣＴＡＴＧＴＧＴＧＡＴＡＴＣＣＴＧＴＧＧＴＣ
ＡＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＡＡＡＴＧＡＧ７８０ＡＡＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＣＡＴＴＴＣＡＣＴＣＡＣＡＡＣＡＣＡＧＴ
ＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＡＴＡＣＴＴＣＴＡＣＡＧＴＴＡＣ８４０ＣＣＧＧＣＴＧＴＡＴＧＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＡＡＴＡＡ
ＣＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＴＡＣＴＣＣＧＡＧＣＣＣＡＣＧＡＡ９００ＧＣＣＣＡＡＧＡＴＧＣＡＧＧＧＴＡＣＣＧＣＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＡ
ＡＡＧＣＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＧＣＴＴＣＣＣＴＴＣＴＣＴＡ９６０ＡＴＴＡＣＡＡＴＴＴＴＴＴＣＡＧＣＡＣＣＡＡＡＴＴＡＣＴＴＡＧＡ
ＴＧＴＡＴＡＣＡＡＴＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＡＴＴＧ１０２０ＡＡＧＴＡＴＧＡＧＡＡＣＡＡＴＧＴＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＡＧＧＣＡ
ＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＴＣＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＴＡＣＴＧＧ１０８０ＣＴＴＣＣＡＡＡＴＴＴＣＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＴＴＡＣＴＴＧＧＴＣ
ＣＣＴＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＴＧＡＣＴ１１４０ＧＡＧＡＴＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＴＧＣＴＣ
ＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣＴＡＧＧＧＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴ１２００ＧＧＡＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＣＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＡＡ
ＡＧＡＧＧＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＣＡＡＧＡＴＣＣＧＡＧＣＡ１２６０ＡＴＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧＡＧＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＧＣＴ
ＣＡＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＴＧＡＧＡＧＴＧＴＣＣＴＧＡＣＧ１３２０ＣＴＧＡＡＡＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＣＡＴＧＣＴＣＣＣ
ＣＡＧＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＴＣＴＧＧＡＧＧＧＡＡＧＣＡＡ１３８０ＡＣＣＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＣＴＡＴＣＡＡＡＧＧＡＴＴＴＴＣＡＣＣ
ＡＣＡＡＣＡＴＡＡＧＡＴＣＡＣＴＡＧＣＴＴＣＧＡＧＧＡＡ１４４０ＧＣＣＡＡＧＧＧＣＴＴＡＧＡＣＣＧＡＡＴＴＡＡＴＧＡＧＡＧＧＡＴ
ＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＣＴ１５００ＧＡＣＧＣＣＡＡＣＣＴＴＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＴＣＴ
ＣＡＣＣＴＣＡＧＡＧＡＣＴＡＡＣＧＧＣＡＣＧＧＡＣＡＧＣ１５６０ＡＡＴＧＧＣＡＧＴＡＡＴＡＧＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＣＡＧＴＧＡＣＣ
ＡＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ１６２０配列番号：２配列の長さ：５１２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク配列： M S E P K A I D P K L S T T D R V V K A 20 V P F P P S H R L T A K E V F D N D G K 40 P R V D I L K A H L M K E G R L E E S V 60 A L R I I T E G A S I L R Q E K N L L D 80 I D A P V T V C G D I H G Q F F D L M K 100 L F E V G G S P A N T R Y L F L G D Y V 120 D R G Y F S I E C V L Y L W A L K I L Y 140 P K T L F L L R G N H E C R H L T E Y F 160 T F K Q E C K I K Y S E R V Y D A C M D 180 A F D C L P L A A L M N Q Q F L C V H G 200 G L S P E I N T L D D I R K L D R F K E 220 P P A Y G P M C D I L W S D P L E D F G 240 N E K T Q E H F T H N T V R G C S Y F Y 260 S Y P A V C E F L Q H N N L L S I L R A 280 H E A Q D A G Y R M Y R K S Q T T G F P 300 S L I T I F S A P N Y L D V Y N N K A A 320 V L K Y E N N V M N I R Q F N C S P H P 340 Y W L P N F M D V F T W S L P F V G E K 360 V T E M L V N V L N I C S D D E L G S E 380 E D G F D G A T A A A R K E V I R N K I 400 R A I G K M A R V F S V L R E E S E S V 420 L T L K G L T P T G M L P S G V L S G G 440 K Q T L Q S A I K G F S P Q H K I T S F 460 E E A K G L D R I N E R M P P R R D A M 480 P S D A N L N S I N K G L T S E T N G T 500 D S N G S N S S N I Q * 512

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白
質をコードするｃＤＮＡクローンの制限酵素切断地図お
よび翻訳領域の位置を示した図である。枠で囲んだ部分
が翻訳領域である。SaはSacIを示す。AはAccIを示す。E
はEcoRIを示す。KはKpnIを示す。PはPstIを示す。SpはS
phIを示す。XはXbaIを示す。

【図２】ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白
質のＤＮＡの塩基配列を、それから推定されるアミノ酸
配列とともに示した図である。

【図３】ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白
質のＤＮＡの塩基配列を、それから推定されるアミノ酸
配列とともに示した図である。

【図４】ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白
質と他のヒトカルシニューリンＡβアイソフォーム蛋白
質のアミノ酸配列とを比較して示した図である。本発明
の蛋白質（カルシニューリンＡα）はＣＮＡＡで表示
し、他のヒトのアイソフォーム（カルシニューリンＡβ
１，Ａβ２）はＣＮＢＡ１、ＣＮＢＡ２で表示する。ア
ミノ酸の番号はＣＮＡＡの最初のメチオニンを基準と
し、最大の類似度を示すように併置してある。またＣＮ
ＢＡ１の一部は挿入部として示してある。

【図５】ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白
質と他のヒトカルシニューリンＡβアイソフォーム蛋白
質のアミノ酸配列とを比較して示した図である。本発明
の蛋白質（カルシニューリンＡα）はＣＮＡＡで表示
し、他のヒトのアイソフォーム（カルシニューリンＡβ
１，Ａβ２）はＣＮＢＡ１、ＣＮＢＡ２で表示する。ア
ミノ酸の番号はＣＮＡＡの最初のメチオニンを基準と
し、最大の類似度を示すように併置してある。またＣＮ
ＢＡ１の一部は挿入部として示してある。

【図６】ＬＡ−Ｎ−２細胞におけるヒトカルシニューリ
ンＡαアイソフォームのｍＲＮＡの大きさを示した図で
ある。図の右には一緒に泳動した分子量マーカーの位置
を示し、左には検出されたＲＮＡの大きさを示した。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム
蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項２】配列番号１の塩基配列を有するものである
請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】配列番号２の５１２個のアミノ酸から成る
ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白質をコー
ドする請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項４】ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム
蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
【請求項５】配列番号１の塩基配列を有するものである
請求項４記載のｃＤＮＡ。
【請求項６】ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム
蛋白質。
【請求項７】配列番号２で示される５１２個のアミノ酸
残基を含有するアミノ酸配列を有する請求項６記載のヒ
トカルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白質。
【請求項８】ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム
蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを保持する
形質転換体。
【請求項９】ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム
蛋白質をコードするｃＤＮＡを保持する形質転換体。
【請求項１０】宿主がエシェリヒア属菌である請求項８
または請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】請求項８または９記載の形質転換体を培
養し、培養物中に成熟ヒトカルシニューリンＡαアイソ
フォーム蛋白質を生成蓄積せしめ、これを採取すること
を特徴とする成熟ヒトカルシニューリンＡαアイソフォ
ーム蛋白質の製造方法。