JP2001342198A - 組み換え型タンパク質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】活性なタンパク質の製造方法の提供。 【解決手段】遺伝子工学的に原核細胞宿主中で発現させ
たタンパク質を、還元電位が−３３１ｍＶより大きい還
元剤を約０．１ｍM〜約５０ｍＭの濃度で含有する溶液
を用いて抽出し、メルカプト基を有さないアミノ酸また
はその塩を含有する溶液中でリフォールディングするこ
とを特徴とする活性型タンパク質またはその塩の製造方
法など。 【効果】本発明の製造方法を用いることにより、原核細
胞中に発現した組み換え型タンパク質の不活性体を効率
よく活性化でき、上記のような作用を有する生物学的、
薬理学的に活性な組み換え型タンパク質を大量に調製で
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子組み換え技
術を用いて原核細胞中で発現させたタンパク質に対し
て、低濃度（約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭ、好ましくは約
０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ）の弱い還元剤（還元電位が−
３３１ｍＶより大きい還元剤）の存在下での変性可溶
化、およびリフォールデイング操作を施すことにより、
生物学的に活性な組み換え型タンパク質を効率的に製造
する方法などに関する。

【０００２】

【従来の技術】多細胞生物は、その恒常性を保つために
細胞の増殖と死を巧妙にコントロールしている。個体発
生の過程では、多くの細胞が細胞死によって除去され、
また、成体においても臓器、組織を構成する細胞は常に
増殖と死のバランスを保ちながら、その機能を維持して
いる。こうした際の細胞死は、予め予定された死、"Pro
grammed Cell Death"であるとされており、物理的・化
学的要因で不慮に起こる細胞死であるネクローシス（Ne
crosis、壊死）とは形態学的に明確に区別されたアポト
ーシス（Apoptosis）の過程を経て起こることが知られ
ている。これまでにアポトーシスが関与する多くの生理
的、病理的現象が明らかにされてきており、細胞のアポ
トーシスを誘導あるいは抑制することにより、各種疾患
の診断、予防および治療を図る試みも盛んに行われてい
る（サイエンス（SCIENCE）267, 1456-1462, 1995）。
アポトーシスは当業界で特に注目されている生命現象の
一つである。

【０００３】アポトーシスは種々の生理的条件下で誘導
されるが、中でもＦａｓ抗原（ＣＤ９５，ＡＰＯ−１）
は免疫系の細胞に死を誘導する分子として近年注目を集
めている（サイエンス（SCIENCE）267, 1449-1456, 199
5）。Ｆａｓ抗原は分子量４５ｋＤａのＴＮＦ（腫瘍細
胞壊死因子，tumor necrosis factor）レセプターファ
ミリーに属するＩ型膜タンパク質であり、Ｆａｓリガン
ドと結合することにより、細胞死を誘導する。Ｆａｓ抗
原の発現が各種血球系細胞や、肝臓、心臓、小腸など多
くの組織や細胞で見られるのに対して、分子量４０ｋＤ
ａのII型膜タンパク質であるＦａｓリガンドの発現は活
性化Ｔリンパ球やナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マク
ロファージ、精巣、角膜などに限られる。最近、マウス
における遺伝子の解析から、Ｆａｓ抗原遺伝子は、ｌｐ
ｒ（lymphoproliferation）マウスと呼ばれる自己免疫
疾患発症マウスにおいて変異が起きているｌｐｒ構造遺
伝子そのものであること、またｌｐｒマウスと同様の症
状を呈するｇｌｄ（generalized-lymphoproliferative
disease）マウスではＦａｓリガンドに変異が起きてい
ることが明らかにされた。ヒトにおいてもＦａｓ抗原遺
伝子に変異を有する自己免疫疾患患者が報告されてお
り、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の機能不全が自己免疫疾
患を惹起することが強く示唆されている（サイエンス
（SCIENCE）268,1347-1349, 1995）。

【０００４】また、ヒトＦａｓリガンドの大部分がマト
リックスメタロプロテイナーゼ（matrix metalloprotei
nase）により切断され、可溶型Ｆａｓリガンドとして遊
離されることが判明し、Ｆａｓリガンドが細胞間の接触
による相互作用だけでなく、より広範に免疫応答を調節
している可能性も示唆されている（ジャーナル・オブ・
エクスペリメンタル・メディシン（JOURNAL OF EXPERIM
ENTAL MEDICINE）182,1777-1783, 1995）。Ｆａｓリガ
ンド以外にも、多彩な生物活性を有するＴＮＦファミリ
ーに属するタンパク質の中で、ＴＮＦ−α、リンホトキ
シン−α（Lymphotoxin−α、ＬＴ−α）およびリンホ
トキシン−β（Lymphotoxin−β、ＬＴ−β）にアポト
ーシスを誘導する活性があることが報告されている（ザ
・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシ
ン（THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE）334, 1717
-1725, 1996）。またごく最近、Ｆａｓリガンド様タン
パク質として、ＴＬ４がHuman Genome Science社から報
告された（Immunity 8 21-30, 1998）。ＴＬ４は配列表
(配列番号：１)に示すように、アミノ酸２４０残基から
構成されるタンパク質で、Ｎ末端に３７残基のcytoplas
mic tail、２２残基のtransmembrane領域を含んでい
る。Ｃ末端側のreceptor binding領域(150残基)は、 Ｆ
ａｓＬ、ＴＮＦ−α、ＬＴ、 ＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ
などと各々、２５−３５％のホモロジーがあり、やはり
可溶型リガンドとして遊離し薬理作用を示すと考えられ
る。また、ＴＬ４に対するレセプターは、ＴＮＦＲファ
ミリーのＨＶＥＭ(herpes virus entry mediator)およ
びＬＴβＲであり、soluble decoy receptorとしてTR6/
DcR3が存在する。ＴＬ４の生理作用として最近、 ＨＶ
ＥＭおよびＬＴβＲを発現している癌細胞に対してアポ
トーシスをもたらすことが分かり、抗ガン剤としての可
能性が注目されている（J. Clin. Invest. 102 1142-11
51, 1998; WO 98/03648号）。また、ＴＬ４は活性化Ｐ
ＢＬ細胞に対して、ＩＦＮγの発現分泌を促進すること
から免疫調節剤としての機能も有すると考えられる。さ
らにごく最近、ＴＬ４の正常ヒト肝実質細胞に対するDN
A合成促進作用が見いだされたことから、肝臓機能調節
剤としても有用である（特願2000-014044号）。

【０００５】一般に生体内に微量にしか存在しない生理
活性タンパク質の薬理薬効作用について検討を行う場
合、組み換え型として多量発現させ純化するのが常套手
段となっている。Ｆａｓリガンド様タンパク質であるＴ
Ｌ４の場合においても、ＣＨＯ細胞などを用いた動物細
胞発現系やSf-9細胞などを用いた昆虫細胞発現系を利用
して、活性型ＴＬ４の分泌発現が認められた。ただ、こ
れらの真核細胞の培養は効率的でなく、しかも組み換え
型タンパク質の発現量もそう高くはなく、生理活性タン
パク質の工業的規模での製造法として問題も数多い。一
方、大腸菌などの原核細胞を宿主として用いた場合、か
なりの確率で組み換え型タンパク質の高発現が期待でき
る。この場合、多量に生産された組み換え型タンパク質
は大腸菌内で封入体とよばれる不溶性の顆粒を形成し、
変性した還元型として存在する。従って、封入体から組
み換え型タンパク質を取得するためには、塩酸グアニジ
ンなどのタンパク変性剤で変性抽出を行った後、リフォ
ールディングとよばれる操作でポリペプチド鎖を巻き戻
し、活性型のコンフォメーションを賦与する必要があ
る。事実、このような手法を駆使して、成長ホルモンや
インターロイキン-２などが大腸菌から生産され、医薬
品として製造販売されている。ただ、このリフォールデ
ィング操作は、個々のタンパク質の性質によって、難易
度に幅がある。特に、システイン残基を多数含有する
(従って、多数のジスルフィド結合を形成する)タンパク
質の場合は、そう簡単ではないことはよく知られてい
る。実際、特開平４−２１８３８７号や特開平９−１２
１８８６号においては、目的蛋白抽出時に強還元剤であ
るＤＴＴを用いているが、リファールディング操作前に
透析、ゲルろ過等により、還元剤を除去する必要があ
る。また、Journal ofEndocrinology(1997) 153, 139-1
50では、目的蛋白抽出時にシステインを添加している
が、該方法が生理活性タンパク質の工業的規模での製造
法として適するか否かは不明である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】Ｆａｓリガンド様タン
パク質であるＴＬ４の場合、システインは２残基で一対
のジスルフィド結合を形成するだけであるが、大腸菌で
組み換え型として発現させた場合、これら通常のリフォ
ールディング条件では、活性型のコンフォメーションを
有するＴＬ４を効率よく取得することは不可能であっ
た。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
欠点を解決すべく、原核細胞の高生産性を利用すると共
に、効率的な活性化方法（再生方法）を提供すべく鋭意
研究を重ねた。その結果、遺伝子組み換え型タンパク質
を原核細胞において発現後、活性化する方法において、
抽出時の低濃度での還元剤添加とリフォールディング時
のアミノ酸添加を組み合わせることにより、予想外にも
飛躍的に組み換え型タンパク質の収量が上昇することを
Ｆａｓリガンド様タンパク質であるＴＬ４を具体例とし
て見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明
は、遺伝子工学的に原核細胞宿主中で発現させたタンパ
ク質に対して、抽出時の低濃度での還元剤添加およびリ
フォールデイング時のアミノ酸添加、を施すことを特徴
とする組み換え型タンパク質またはその塩の効率的な製
造方法に関するものである。具体的には、本発明は、
（１）遺伝子工学的に原核細胞宿主中で発現させたタン
パク質を、還元電位が−３３１ｍＶより大きい還元剤を
約０．１ｍM〜約５０ｍＭの濃度で含有する溶液を用い
て抽出し、メルカプト基を有さないアミノ酸またはその
塩を含有する溶液中でリフォールディングすることを特
徴とする活性型タンパク質またはその塩の製造方法、
（２）メルカプト基を有さないアミノ酸またはその塩
および還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオ
ン、システインおよびシスチン、またはシステアミンお
よびシスタミンを含有する溶液中でリフォールディング
することを特徴とする上記（１）記載の製造方法、
（３）タンパク質がＦａｓリガンド様タンパク質である
上記（１）記載の製造方法、（４）Ｆａｓリガンド様タ
ンパク質がＴＬ４である上記（３）記載の製造方法、
（５）還元剤がメルカプト基を有する化合物である上記
（１）記載の製造方法、（６）メルカプト基を有する化
合物が２−メルカプトエタノールまたはシステアミンで
ある上記（５）記載の製造方法、（７）メルカプト基を
有さないアミノ酸がアルギニンである上記（１）記載の
製造方法、および（８）タンパク質を遺伝子工学的に原
核細胞宿主中で発現させ、還元電位が−３３１ｍＶより
大きい還元剤を約０．１ｍM〜約５０ｍＭの濃度で含有
し、かつタンパク変性剤を含む溶液を用いて該タンパク
質を該細胞から抽出・可溶化し、ついでメルカプト基を
有さないアミノ酸またはその塩を含有するリフォールデ
イング溶液で変性剤を不作用濃度まで希釈することを特
徴とする上記（１）記載の製造方法などを提供するもの
である。

【０００８】本発明の実施例で用いられるＦａｓリガン
ド様タンパク質は、公知のＦａｓリガンドやＴＮＦαな
どと同様の作用を有するものであって、哺乳動物由来の
Ｆａｓリガンド様タンパク質や、そのＮ末端にＭｅｔが
付加されたタンパク質等があげられ、中でも配列番号：
１または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有す
るタンパク質またはその部分ペプチド、特に配列番号：
１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第８４（Ｉｌ
ｅ）〜第２４０（Ｖａｌ）番目の部分アミノ酸配列また
は配列番号：４で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第
８１（Ｌｅｕ）〜第２３９（Ｖａｌ）番目の部分アミノ
酸配列を含有する可溶型ヒトＴＬ４または可溶型マウス
ＴＬ４およびそれらのＮ末端にＭｅｔが付加されたタン
パク質が好ましい。さらには、配列番号：１で表される
アミノ酸配列のＮ末端から第８４（Ｉｌｅ）〜第２４０
（Ｖａｌ）番目の部分アミノ酸配列または配列番号：４
で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第８１（Ｌｅｕ）
〜第２３９（Ｖａｌ）番目の部分アミノ酸配列を含有す
る可溶型ヒトＴＬ４または可溶型マウスＴＬ４と同様の
作用を有する限り、そのＮ末端もしくはＣ末端の欠損型
ムテインや逆にＮ末端もしくはＣ末端が伸展したムテイ
ン、配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から
第８４（Ｉｌｅ）〜第２４０（Ｖａｌ）番目の部分アミ
ノ酸配列または配列番号：４で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端から第８１（Ｌｅｕ）〜第２３９（Ｖａｌ）番目
の部分アミノ酸配列中の特定のアミノ酸残基を置換した
ムテイン等があげられる。また、本明細書において、Ｆ
ａｓリガンド様タンパク質とは、WO98/03648号、WO97/3
4911号、US Patent No. 5,874,240号などに記載のタン
パク質をも包含する意味で用いられる。本明細書におい
てタンパク質の塩としては、塩酸、臭化水素、硝酸、硫
酸、リン酸等の無機酸との塩、酢酸、フタル酸、フマー
ル酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタ
ンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との
塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カ
ルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等
の薬学的に許容されうる塩や水和物等があげられる。

【０００９】本発明で用いられる原核細胞としては、Es
cherichia coli（大腸菌）等のエシェリヒア属菌、Baci
llus subtilis（枯草菌）等のバチルス属菌、Serratia
marcescens（セラチア）等のセラチア属菌等があげら
れ、中でもEscherichia coli等が好ましい。これらの原
核細胞の形質転換、培養等は次に示す方法のほか、常法
（例えば、特開平3-204897号公報に記載の方法等）に準
じて行うこともできる。例えば、本発明の実施例で用い
られるＦａｓリガンド様タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａを含有する発現型ベクターは、例えば、（ｉ）Ｆａｓ
リガンド様タンパク質産生細胞からメッセンジャーＲＮ
Ａ（ｍＲＮＡ）を分離し、（ii）該ｍＲＮＡから単鎖の
ｃＤＮＡを、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、（iii）該
相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込み、
（iv）得られた組み換えファージまたはプラスミドで宿
主を形質転換し、（v）得られた形質転換体を培養後、
形質転換体から適当な方法、例えばＦａｓリガンド様タ
ンパク質の一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブ
リダイゼーションにより、あるいは抗体を用いたイムノ
アッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージ
あるいはプラスミドを単離し、（vi）その組み換えＤＮ
Ａから目的とするクローン化ＤＮＡを切り出し、（vi
i）該クローン化ＤＮＡまたはその一部を発現ベクター
中のプロモーターの下流に連結する、ことにより製造す
ることができる。

【００１０】ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、
たとえば大腸菌由来のｐＢＲ３２２〔ジ−ン（Gene）、
２巻、９５頁（１９７７年）〕、ｐＢＲ３２５〔ジー
ン、４巻、１２１頁（１９７８年）〕、ｐＵＣ１２〔ジ
ーン、１９巻、２５９頁（１９８２年）〕、ｐＵＣ１３
〔ジーン、１９巻、２５９頁（１９８２年）〕、枯草菌
由来のｐＵＢ１１０〔バイオケミカル・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical an
d Biophysical Research Communications）、１１２
巻、６７８頁（１９８３年）〕などがあげられるが、そ
の他のものであっても、宿主内で複製増殖されるもので
あれば、いずれを用いることもできる。またｃＤＮＡを
組み込むファージベクターとしては、たとえばλｇｔ１
１〔ヤング及びデーヴィス（Young, R. and Davis,
R.）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユー・エス・
エー（Proc. Natl. Acad. Sci.,U.S.A.）、８０巻、１
１９４頁（１９８３年）〕などがあげられるが、その他
のものであっても宿主内で増殖できるものであれば用い
ることができる。プラスミドに組み込む方法としては、
たとえば、ティー・マニアティス（T. Maniatis）ら、モ
レキュラー・クローニング（Molecular Cloning） コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spr
ing Harbor Laboratory）、２３９頁（１９８２年）に
記載の方法などがあげられる。またファージベクターに
ｃＤＮＡを組み込む方法としては、たとえばヒューン
（Hyunh,T.V.）らの方法〔ディー・エヌ・エー・クローニ
ング、ア・プラクティカル・アプローチ（DNA Cloning,
A Practical Approach）１巻、４９頁（１９８５
年）〕などがあげられる。

【００１１】このようにして得られたプラスミドは、適
当な宿主たとえばエシェリヒア（Escherichia）属菌，
バチルス（Bacillus）属菌などに導入する。上記エシェ
リヒア属菌の例としては、エシェリヒア・コリ（Escher
ichia coli）Ｋ１２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A.）６０巻、１６０頁（１９６
８年）〕、ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ（Nucleic Acids Research）、９巻、３０９頁（１９
８１年）〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕、１２０巻、５１７頁（１９７８年）〕、ＨＢ１
０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー、４１巻、４５９頁（１９６９年）〕、Ｃ６００〔ジ
ェネティックス（Genetics）、３９巻、４４０頁（１９
５４年）〕、ＭＭ２９４〔ネイチャー（Nature）、２１
７巻、１１１０頁（１９６８年）〕などがあげられる。
上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチリ
ス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン、２４
巻、２５５頁（１９８３年）〕、２０７−２１〔ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochem
istry）９５巻、８７頁（１９８４年）〕などがあげら
れる。プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、
たとえばティー・マニアティス（T．Maniatis）ら，モレ
キュラー・クローニング（Molecular Cloning）、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spr
ing Harbor Laboratory）、２４９頁（１９８２年）に
記載のカルシウムクロライド法あるいはカルシウムクロ
ライド／ルビジウムクロライド法などがあげられる。ま
たファージ・ベクターを用いる場合には、たとえば増殖
させた大腸菌にインビトロパッケージング法を用いて導
入することができる。

【００１２】このようにしてクローン化されたＦａｓリ
ガンド様タンパク質をコードするｃＤＮＡは必要があれ
ばプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１２、ｐＵ
Ｃ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵ
Ｃ１１９などにサブクローニングすることができる。こ
のようにして得られたｃＤＮＡの塩基配列を、たとえば
マキサム・ギルバート（Maxam-Gilbert）法〔Maxam, A.
M. and Gilbert, W.、プロシーディングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・
ザ・ユー・エス・エー（Proc. Natl. Acad. Sci.,U.S.
A.）、７４巻、５６０頁（１９７７年）〕あるいはジデ
オキシ法〔Messing, J.ら、ヌクレイック・アシッズ・
リサーチ（Nucleic Acids Research）９巻、３０９頁
（１９８１年）〕によって決定し、既知のアミノ酸配列
との比較からＦａｓリガンド様タンパク質のｃＤＮＡの
存在を確認できる。上記のようにして、本発明の実施例
で用いられるＦａｓリガンド様タンパク質をコードする
ｃＤＮＡが得られる。上記のようにしてクローン化され
たＦａｓリガンド様タンパク質をコードするｃＤＮＡは
目的によりそのまま、または所望により制限酵素やエキ
ソヌクレアーゼで消化して使用することが出来る。

【００１３】次に、クローン化されたｃＤＮＡから発現
させたい領域を切り出し、発現に適したビークル（ベク
ター）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベクタ
ーを得ることができる。該ｃＤＮＡはその５’末端に翻
訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端には
翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを
有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止
コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加す
ることもできる。さらに該ＤＮＡを発現させるにはその
上流にプロモーターを接続する。ベクターとしては、上
記の大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢ
Ｒ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３），枯草菌由来プラ
スミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）な
どがあげられる。

【００１４】本発明で用いられるプロモーターとして
は、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモ
ーターであればいかなるものでもよい。形質転換する際
の宿主がエシェリキア属菌である場合は、Ｔ７プロモー
ター，ｔｒｐプロモーター，ｌａｃプロモーター，ｒｅ
ｃＡプロモーター，λＰＬプロモーター，ｌｐｐプロモ
ーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ
Ｏ１プロモーター，ＳＰＯ２プロモーター，ｐｅｎＰプ
ロモーターなどが好ましい。とりわけ宿主がエシェリキ
ア属菌でプロモーターがＴ７プロモーター，ｔｒｐプロ
モーターまたはλＰＬプロモーターであることが好まし
い。なお、発現にエンハンサーの利用も効果的である。
このようにして構築されたＦａｓリガンド様タンパク質
をコードするｃＤＮＡを含有するベクターを用いて、原
核細胞の形質転換体を製造する。

【００１５】上記エシェリキア属菌を形質転換するに
は、たとえばプロシージング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA）、６９巻、２１１０頁（１９７２年）やジーン（Ge
ne）、１７巻、１０７頁（１９８２年）などに記載の方
法に従って行なわれる。バチルス属菌を形質転換するに
は、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェ
ネティックス（Molecular & General Genetics）、１６
８巻、１１１頁（１９７９年）などに記載の方法に従っ
て行われる。このようにして、 Ｆａｓリガンド様タン
パク質をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターで
形質転換された原核細胞の形質転換体が得られる。宿主
としてエシェリヒア属菌を、プロモーターとしてＴ７プ
ロモーターを用いる場合、Ｔ７プロモーターの発現効率
の向上を目的として、 Ｆａｓリガンド様タンパク質を
コードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターに加え、Ｔ
７リゾチーム発現プラスミドを共存させてもよい。

【００１６】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナト
リウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵
母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加しても
よい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリヒア
属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコース、
カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller）、ジャー
ナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェ
ネティックス（Journal of Experiments in Molecular
Genetics）、４３１−４３３頁、Cold Spring Harbor L
aboratory, New York 1972〕、ＬＢ培地等が好ましい。
ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため
に、たとえばイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（ＩＰＴＧ）、３β−インドリルアクリル酸のよ
うな薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属
菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間
行い、必要により、通気や攪拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃
で約６〜２４時間行ない、必要により通気や攪拌を加え
ることもできる。

【００１７】組み換え型タンパク質が宿主原核細胞中で
封入体を形成する場合には、培養後、遠心分離等の方法
により集菌した後、細胞を破砕し、封入体を変性剤を用
いて可溶化することによって、組み換え型タンパク質を
抽出することができる。細胞の破砕は、常法で、たとえ
ば超音波処理により実施できる。懸濁媒体として中性付
近のｐＨ値（ｐＨ６．５〜７．５）に調整した好適な緩
衝液（例えばリン酸緩衝液等）を用いることが好まし
い。この際、細胞の破砕を促進させるためＥＤＴＡを添
加してもよい。このようにして細胞を破砕した後に、不
溶成分（封入体）を任意の方法で、遠心分離するか、濾
過することにより分取する。原核細胞由来の蛋白質をで
きる限り除去するため、たとえば水、リン酸緩衝液を用
いて洗浄することが好ましいが、場合により４Ｍ程度の
尿素で洗浄してもよい。得られた沈殿（ペレット）を変
性剤を用いて可溶化する際の変性剤としては、公知の変
性剤、特にグアニジンまたは尿素等を使用することがで
きる。変性剤は通常水溶液として用いられ、水溶液中の
変性剤の濃度は、グアニジンでは１〜８モル／リット
ル、好ましくは約３〜６モル／リットル、尿素では５〜
９モル／リットル、好ましくは約８モル／リットルであ
る。グアニジンは通常グアニジン塩酸塩等のグアニジン
の酸付加塩として用いられる。

【００１８】組み換え型タンパク質が宿主原核細胞中で
封入体を形成しない場合には、培養後、遠心分離等の方
法により集菌した後、細胞を変性剤を用いて可溶化する
か、あるいは細胞を破砕後変性剤で可溶化することによ
って組み換え型タンパク質を抽出することができる。集
菌した細胞の可溶化に用いられる変性剤としては、例え
ばグアニジンなどがあげられる。変性剤は通常水溶液と
して用いられ、水溶液中の変性剤の濃度は、グアニジン
では通常１〜８モル／リットル、好ましくは約３〜６モ
ル／リットルである。グアニジンは通常グアニジン塩酸
塩等のグアニジンの酸付加塩として用いられる。細胞の
破砕は、常法で、たとえば超音波処理、フレンチ・プレ
スにより実施できる。破砕された細胞の可溶化に用いら
れる変性剤としては、公知の変性剤、特にグアニジンま
たは尿素を使用することができる。変性剤は通常水溶液
として用いられ、水溶液中の変性剤の濃度は、グアニジ
ンでは１〜８モル／リットル、好ましくは約３〜６モル
／リットル、尿素では５〜９モル／リットル、好ましく
は約８モル／リットルである。グアニジンは通常グアニ
ジン塩酸塩等のグアニジンの酸付加塩として用いられ
る。また、菌体内で発現させた組み換え型タンパク質が
システイン残基を含有する場合、封入体を形成するしな
いに拘わらず、変性剤を用いた抽出操作のさいに還元剤
を添加することは、一般的によく行われている（Biotec
hnology and Bioengineering 41 3-13, 1993）。
これは、菌体内もしくは抽出操作以前に形成された組み
換え型タンパク質のＳ−Ｓ結合（多くは天然型には存在
しない間違った分子間や分子内Ｓ−Ｓ架橋様式）を切断
する目的で、DTTなどの還元力の強い試薬を高濃度(少な
くとも10mM以上)添加するのが通常である。従って、抽
出後のＳ−Ｓ結合形成を伴うリフォールディング操作を
行う場合には、それに先だって透析やゲル濾過により還
元剤を除去する必要がある。

【００１９】これに対して、本発明の製造方法は、変性
剤を用いた抽出操作中のＳ−Ｓ結合形成を妨げる目的
で、低濃度(約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭ、好ましくは約
１ｍＭ〜約１０ｍＭ))の弱い（還元電位が−３３１ｍＶ
より大きい）還元剤（たとえば、２−メルカプトエタノ
ールまたはシステアミン等）を抽出操作時の酸化防止剤
として使用する。本発明の製造方法では、低濃度の弱い
還元剤を用いているので、従来技術のようにリフォール
ディング前の還元剤除去操作を必要としない。組み換え
型タンパク質抽出に際して、変性剤を含む抽出溶液に添
加される還元剤としては、本発明の目的が達成される限
り、いずれの還元剤でもよく、２−メルカプトエタノー
ルの他にグルタチオン、システイン、システアミンなど
があげられる。組み換え型タンパク質の収率の点で好ま
しい還元剤の添加濃度は０．１〜５０ミリモル／リット
ル、特に好ましくは１〜１０ミリモル／リットルであ
る。

【００２０】上記のようにして封入体の可溶化を行う
か、あるいは菌体を変性剤で直接可溶化するか、あるい
は細胞を破砕後変性剤で可溶化した後、遠心分離等で不
純物を除去し、得られた上澄液に対して、組み換え型タ
ンパク質のリフォールディング（活性化、再生化）を行
うことができる。リフォールディングは、組み換え型タ
ンパク質を含有する上澄液を緩衝液で約１０〜２５倍に
希釈することにより行われる。この場合、変性剤の濃度
を活性化に適した中性ｐＨにおいて不作用濃度まで希釈
することが望ましく、たとえば変性剤がグアジニンであ
る場合には希釈液中のグアニジンの濃度を０〜２．０モ
ル／リットル、好ましくは約１モル／リットル以下ま
で、変性剤が尿素である場合には希釈液中の尿素の濃度
を０〜４．０モル／リットル、好ましくは約２モル／リ
ットル以下まで希釈することが望ましい。

【００２１】本発明の製造方法において、リフォールデ
ィング時に用いる希釈緩衝液には、チオール基（メルカ
プト基）を有さないアミノ酸(たとえば、アルギニン等)
を含有させる。後述の実施例５からも明らかなとおり、
チオール基を有さないアミノ酸(たとえば、アルギニン
等)の添加は前述の抽出時の低濃度での還元剤添加と組
み合わせると、予想外にも組換え型タンパク質またはそ
の塩の飛躍的な収量上昇をもたらす。さらに、リフォー
ルディング時の希釈緩衝液には、レドックスバッファー
（酸化型グルタチオン(ＧＳＳＧ)および還元型グルタチ
オン(ＧＳＨ)、システインおよびシスチン、またはシス
テアミンおよびシスタミンなど）を加えてもよい。レド
ックスバッファー中の酸化剤および還元剤の濃度は一般
にそれぞれ０．０１〜１００ミリモル／リットル、特に
好ましくは０．１〜１０ミリモル／リットルである。リ
フォールディングに際して希釈緩衝液に添加されるチオ
ール基を有さないアミノ酸としては、本発明の目的が達
成される限り、チオール基を有さないアミノ酸であれば
いずれのアミノ酸でもよいが、アルギニンの他にアスパ
ラギン酸、バリン、リジン、アラニン、シトルリン等が
あげられる。組み換え型タンパク質のリフォールディン
グにおける収率の点で好ましいアミノ酸添加濃度は、
０．１〜２．０モル／リットル、特に好ましくは０．１
〜１．０モル／リットルである。

【００２２】なお、可溶化後かつリフォールディングの
前に、例えば抽出、塩析、透析、分配、結晶化、再結
晶、ゲルろ過、クロマトグラフィー等の公知で常用の精
製工程を導入することができ、好ましくは、たとえば
０．１モル／リットル リン酸緩衝液中セファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５（ファルマシア バイオ
テク（株））にかけることにより精製することができ
る。変性剤の分離は場合により０．１モル／リットル
リン酸緩衝液に対して透析することによっても可能であ
る。精製工程はリフォールディングに続いて行うことも
できる。一般にそのような精製としては例えば抽出、塩
析、透析、分配、結晶化、再結晶、ゲルろ過、クロマト
グラフィー等があげられ、好ましい例として透析や、た
とえばＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア
バイオテク（株））、ＣＭ−５ＰＷ（トーソー
（株））あるいは、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（トーソー
（株））を介したイオン交換クロマトグラフィー、たと
えばＯＤＰ−５０（昭和電工（株））を用いた逆相クロ
マトグラフィー等による精製法があげられる。

【００２３】本発明で得られる組み換え型タンパク質
は、公知の天然型タンパク質と同様の作用を有してお
り、公知の天然型タンパク質の使用方法と同様にして用
いることができる。

【００２４】

【発明の実施の形態】本発明明細書および図面におい
て、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-
IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。また、アミノ酸に関し光学異性
体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すも
のとする。 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：伝令リボ核酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ２−ＭＥ ：２−メルカプトエタノール ＤＴＴ ：ジチオスレイトール Ｇｌｙ（Ｇ）：グリシン Ａｌａ（Ａ）：アラニン Ｖａｌ（Ｖ）：バリン Ｌｅｕ（Ｌ）：ロイシン Ｉｌｅ（Ｉ）：イソロイシン Ｓｅｒ（Ｓ）：セリン Ｔｈｒ（Ｔ）：スレオニン Ｃｙｓ（Ｃ）：システイン Ｍｅｔ（Ｍ）：メチオニン Ｇｌｕ（Ｅ）：グルタミン酸 Ａｓｐ（Ｄ）：アスパラギン酸 Ｌｙｓ（Ｋ）：リジン Ａｒｇ（Ｒ）：アルギニン Ｈｉｓ（Ｈ）：ヒスチジン Ｐｈｅ（Ｆ）：フェニルアラニン Ｔｙｒ（Ｙ）：チロシン Ｔｒｐ（Ｗ）：トリプトファン Ｐｒｏ（Ｐ）：プロリン Ａｓｎ（Ｎ）：アスパラギン Ｇｌｎ（Ｑ）：グルタミン Ａｓｘ ：Ａｓｐ＋Ａｓｎ Ｇｌｘ ：Ｇｌｕ＋Ｇｌｎ 本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。 〔配列番号：１〕ヒトＴＬ４をコードするアミノ酸配列
を示す。 〔配列番号：２〕後述の参考例１で用いられたプライマ
−の塩基配列を示す。 〔配列番号：３〕後述の参考例１で用いられたプライマ
−の塩基配列を示す。 〔配列番号：４〕マウスＴＬ４をコードするアミノ酸配
列を示す。 〔配列番号：５〕後述の参考例３で用いられたプライマ
−の塩基配列を示す。 〔配列番号：６〕後述の参考例３で用いられたプライマ
−の塩基配列を示す。 以下の参考例および実施例によって本発明をより具体的
に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではな
い。

【００２５】

【参考例】参考例１ 大腸菌での可溶型ヒトＴＬ４発現
用プラスミドの構築 ヒトＴＬ４（配列番号：１）の細胞外領域に対応する第
８４アミノ酸残基（Ｉｌｅ）から第２４０アミノ酸残基
（Ｖａｌ）までをコードするＤＮＡ断片を得るため、鋳
型として特開平１１−１４１１０６号公報の参考例１に
記載のプラスミドｐＴＢ１９３９、プライマーとして２
個のオリゴヌクレオチド（配列番号：２５’−ＴＡＴＡ
ＣＡＴＡＴＧＡＴＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＡＧＧＴＣ−
３’、配列番号：３ ５’−ＡＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡ
ＣＣＴＣＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡ−３’）を用いてＰＣ
Ｒ（polymerase chain reaction）を行った。得られた
ＰＣＲ産物の塩基配列をＴＡクローニングし、塩基配列
を確認した後、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、
２．０％アガロースゲル電気泳動で分画して、目的とす
るＤＮＡ断片を単離した。このＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断
片を、同じくＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＴ
ＣIIのＴ７プロモーターの下流にＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結しプラスミドｐＴＣII-ｓｈＴＬ４（図２）
を得た。

【００２６】参考例２ 大腸菌での可溶型ヒトＴＬ４の
発現 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子(lacプロモーター制御
下)を有する大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)に、上記参考例
１で得られたプラスミドｐＴＣII-ｓｈＴＬ４を導入
し、大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)/ｐＴＣII-ｓｈＴＬ４を
得た。この形質転換細胞を、１０μｇ／ｍｌのテトラサ
イクリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母
エキス、０．５％塩化ナトリウム）１リットルを仕込ん
だ２リットル容フラスコ中で３７℃、８時間振とう培養
した。得られた培養液を５μｇ／ｍｌのテトラサイクリ
ンを含む主発酵培地（１．６８％リン酸一水素ナトリウ
ム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．１％塩化アン
モニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸
マグネシウム、０．０２％消泡剤、０．０００２５％硫
酸第一鉄、０．０００５％塩酸チアミン、１．５％ブド
ウ糖、１．５％カザミノ酸）１９リットルを仕込んだ５
０リットル容発酵槽へ移植して、３７℃で通気撹拌培養
を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位にな
った時点で、７５μＭ分のイソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに２時
間培養を続けた(1480クレットユニット)。最終的にこの
培養液の遠心分離を行うことにより、約２１０ｇの湿菌
体が得られ、−８０℃に凍結保存された。なお本菌体に
おける可溶型ヒトＴＬ４の発現量は、菌体抽出液をSDS-
PAGEに供し、可溶型ヒトＴＬ４が示す１７Ｋｄのバンド
の染色度から、約４ｍｇ/ｇ湿菌体(５０ｍｇ/Ｌ)と推測
された。

【００２７】この形質転換大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)/
ｐＴＣII-ｓｈＴＬ４は、２０００年２月２日から茨城
県つくば市東１−１−３、通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−７０１９として、また受託番号ＩＦＯ １６３５６
として２０００年１月２０日付で大阪府大阪市淀川区十
三本町２−１７−８５、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）
に寄託されている。また、配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列を有するヒトＴＬ４をコードするＤＮＡは、形
質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli)ＤＨ
１０Ｂ／ｐＴＢ１９３９およびエシェリヒア コリ（Es
cherichia coli)ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４０として、
それぞれ１９９６年７月１７日から茨城県つくば市東１
−１−３、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５５９５お
よびＦＥＲＭ ＢＰ−５５９６として、また１９９６年
７月１１日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−
８５、財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦ
Ｏ １５９９７およびＩＦＯ １５９９８として寄託さ
れている。

【００２８】参考例３ 大腸菌での可溶型マウスＴＬ４
発現用プラスミドの構築 マウスＴＬ４をコードするアミノ酸配列（配列番号：
４）の細胞外領域に対応する８１アミノ酸残基（Ｌｅ
ｕ）から２３９アミノ酸残基（Ｖａｌ）（図７）までを
コードするＤＮＡ断片を得るため、鋳型としてWO 98/03
648号の参考例２に記載のプラスミドpTB1958、プライマ
ーとして２個のオリゴヌクレオチド（配列番号：５；
５’−ＧＧＣＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＡＣＡＡＧＡＴＣＡ
ＡＣＧＡＴＣＴＣ−３’、配列番号：６；５’−ＣＧＧ
ＡＴＣＣＴＣＡ ＧＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣＴＣＣＧＡ
ＡＡＴ−３’）を用いてＰＣＲ（polymerase chain rea
ction）を行った。得られたＰＣＲ産物の塩基配列をＴ
Ａクローニングし、塩基配列を確認した後、ＮｄｅＩお
よびＢａｍＨＩで消化し、２．０％アガロースゲル電気
泳動で分画して、目的とするＤＮＡ断片を単離した。こ
のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を、同じくＮｄｅＩおよび
ＢａｍＨＩで消化したｐＴＣIIのＴ７プロモーターの下
流にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結しプラスミドｐＴ
ＣII ｍＴＬ４（図８）を得た。

【００２９】参考例４ 大腸菌での可溶型マウスＴＬ４
の発現 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子(lacプロモーター制御
下)を有する大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)に、上記参考例
３で得られたプラスミドｐＴＣII ｍＴＬ４を導入し、
大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)/ｐＴＣII ｍＴＬ４を得た。
この形質転換細胞を、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリ
ンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキ
ス、０．５％塩化ナトリウム）１リットルを仕込んだ２
リットル容フラスコ中で３７℃、８時間振とう培養し
た。得られた培養液を５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン
を含む主発酵培地（１．６８％リン酸一水素ナトリウ
ム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．１％塩化アン
モニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸
マグネシウム、０．０２％消泡剤、０．０００２５％硫
酸第一鉄、０．０００５％塩酸チアミン、１．５％ブド
ウ糖、１．５％カザミノ酸）１９リットルを仕込んだ５
０リットル容発酵槽へ移植して、３７℃で通気撹拌培養
を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位にな
った時点で、７５μＭ分のイソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに４時
間培養を続けた(1905クレット)。最終的にこの培養液の
遠心分離を行うことにより、約２１０ｇの湿菌体が得ら
れ、−８０℃に凍結保存された。なお本菌体における可
溶型マウスＴＬ４の発現量は、菌体抽出液をSDS-PAGEに
供し、可溶型マウスＴＬ４が示す１７Ｋｄのバンドの染
色度から、約５０ｍｇ/ｇ湿菌体(５５０ｍｇ/Ｌ)と推測
された。この形質転換大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)/ｐＴ
ＣIIｍＴＬ４は、２００１年３月５日から茨城県つくば
市東１−１−３、経済産業省産業技術総合研究所生命工
学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−７４８１として、また受託番号ＩＦＯ １６５５０
として２００１年２月１日付で大阪府大阪市淀川区十三
本町２−１７−８５、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に
寄託されている。

【００３０】

【実施例】実施例１ 可溶型ヒトＴＬ４の大腸菌からの
抽出 参考例２で得られた菌体２５ｇに、５０ｍＭトリス／Ｈ
Ｃｌ、５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１２５ｍＬを加え
て超音波破砕機（ソニファー ４５０）(ブランソン
（株））を用いて４℃、５分間の菌体破砕を繰り返した
後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０分間）を行い、
沈殿画分（封入体画分）を得た。本沈殿画分を５０ｍＭ
トリス／ＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）５００
ｍｌ、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ７．
５）５０ｍｌ、にて洗浄を行った後、沈殿画分に５０ｍ
Ｍトリス／ＨＣｌ、４Ｍグアニジン塩酸塩（ｐＨ７．
５）、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール ７５ｍｌを
加えて４℃で一晩撹拌溶解した後、遠心分離（１５００
０ｒｐｍ、３０分間）を行い上澄液を得た。

【００３１】実施例２ 可溶型ヒトＴＬ４のリフォール
ディング 実施例１で得られた上澄液に０．８Ｍアルギニン、５０
ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１．５リットルを加
えて、４℃で一晩活性化を行った。

【００３２】実施例３ 可溶型ヒトＴＬ４の精製 実施例２で得られた活性化の終了した再生液をｐＨ６に
調整し、限外濾過膜（再生セルロース膜 分画分子量３
Ｋ（k dalton）、膜面積０．１ｍ² Ｘ ２枚）（ミリポ
ア（株））で濃縮した後、蒸留水で４倍に希釈し、遠心
分離（８０００ｒｐｍ、１５分間）を行ない上澄液を得
た。本上澄液を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１５
０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ ＦＦ（１．１ｃｍＩＤ Ｘ ５ｃｍＬ、５ｍＬ）（フ
ァルマシア バイオテク（株））に吸着させた後、０〜
６０％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、
１．５Ｍ ＮａＣｌ）の段階勾配で４０分間、４ｍｌ／
分の流速で溶出し、ＴＬ４を含むフラクションをプール
した。続いて、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１
５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＣＭ−５ＰＷ（２１．
５ｍｍＩＤ Ｘ １５０ｍｍＬ、１３μｍ）（東ソー
（株））に吸着させた後、０〜４０％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１．５Ｍ ＮａＣｌ）の段
階勾配で３０分間、５ｍｌ／分の流速で溶出した。ＴＬ
４のフラクションをプールし、ＴＬ４の沈殿防止の為、
蒸留水で２倍に希釈した。本希釈液を限外濾過膜（アミ
コン ８０５０ＹＭ−１０）（ミリポア(株)）で濃縮し
た後５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１５０ｍＭ
ＮａＣｌに置換し、可溶型ヒトＴＬ４約１．５ｍｇを得
た。

【００３３】このようにして得られた可溶型ヒトＴＬ４
標品の純度を測定する目的で、ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行った。本標品を１００ｍＭ ＤＴＴ
を添加したＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ［Laemmli, Nat
ure, 227, 680 (1979)］に懸濁し、９５℃で１分間加熱
した後、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品）で電気
泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシー・ブリリアン
ト・ブルー（Coomassie brilliant blue）で染色した結
果、約１７Ｋｄに単一バンドの蛋白が認められた。この
ことから可溶型ヒトＴＬ４の本標品は単一であり、きわ
めて高純度の標品であることが分かった（図３）。

【００３４】実施例４ ＨＰＬＣを用いた可溶型ヒトＴ
Ｌ４の分析 実施例３で得られた可溶型ヒトＴＬ４の純度を測定する
目的でギルソンＨＰＬＣシステム（ギルソン（株））を
用いイオン交換、逆相ＨＰＬＣにより分析を行った。イ
オン交換ＨＰＬＣにおいては５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＣＭ−５
ＰＷ（７．５ｍｍＩＤ Ｘ ７５ｍｍＬ、１０μｍ）（東
ソー（株））に可溶型ヒトＴＬ４ ５μｇを注入し、０
〜３０％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．８）、
１．５Ｍ ＮａＣｌ）の段階勾配で３０分間、０．８ｍ
ｌ／分の流速で溶出した。逆相ＨＰＬＣにおいては３０
％Ｂ（Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｂ＝
８０％ アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）で平衡化し
たＣ４Ｐ−５０（４．６ｍｍＩＤ Ｘ ２５０ｍｍＬ、５
μｍ）（昭和電工（株））に可溶型ヒトＴＬ４ ２μｇ
を注入し、３０〜６０％Ｂの段階勾配で４０分間、０．
５ｍｌ／分の流速で溶出した。検出は２８０ナノメート
ルの波長で行い、得られたデータはクロマトコーダー２
１（システムインスツルメンツ（株））で波形処理を行
い純度を計算した。その結果、可溶型ＴＬ４は単一ピー
クを示し、このことから可溶型ヒトＴＬ４の本標品は単
一であり、きわめて高純度の標品であることが分かった
（図４）。

【００３５】実施例５ 可溶型ヒトＴＬ４収量に及ぼす
効果： 抽出時の還元剤添加効果およびリフォールディ
ング時のアミノ酸添加効果 参考例２で得られた菌体１０ｇに、５０ｍＭトリス／Ｈ
Ｃｌ （ｐＨ７．５）５０ｍｌを加えて超音波破砕機
（ソニファー４５０）（ブランソン（株））にて４℃、
５分間の菌体破砕を４回繰り返した後、遠心分離（１５
０００ｒｐｍ、３０分間）を行い、沈殿画分（封入体画
分）を得た。本沈殿画分を５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、５
ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１０ｍｌ、５０ｍＭトリ
ス／ＨＣｌ、３Ｍ尿素（ｐＨ７．５）１０ｍｌ、にて洗
浄を行った後、菌体５ｇより得られる沈殿画分に５０ｍ
Ｍトリス／ＨＣｌ、４Ｍグアニジン塩酸塩（ｐＨ７．
５）、０もしくは５ｍＭ ２−メルカプトエタノール１
５ｍｌを加えて４℃で一晩撹拌溶解した後、遠心分離
（１５０００ｒｐｍ、３０分間）を行い上澄液を得た。
本上澄液１ｍｌに５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、０、０．
２、０．４、０．６もしくは０．８Ｍアルギニン（ｐＨ
８．０）のリフォールディング液２０ｍｌを加えて、４
℃で一晩活性化を行なった後、酢酸でｐＨ６に調整し、
蒸留水にて４倍に希釈して遠心分離（３０００ｒｐｍ、
１５分間）を行い上澄液を得た。本上澄液を５０ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ６．０）１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化
したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（８ｍｍＩＤ Ｘ
５０ｍｍＬ）（ファルマシア バイオテク（株））に吸
着させた後、０〜１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ６．０）、１．５Ｍ ＮａＣｌ）の段階勾配で２
０分間、１ｍｌ／分の流速で溶出した。得られたＴＬ４
フラクションをプールした後、実施例４で示したＣ４Ｐ
−５０（４．６ｍｍＩＤ Ｘ ２５０ｍｍＬ、５μｍ）
（昭和電工（株））を用いて可溶性ヒトＴＬ４量を定量
した。

【００３６】その結果、可溶型ヒトＴＬ４収量はリフォ
ールディング時のアルギニン添加により、著しく上昇す
ることが分かった（図５）。さらに、このアルギニン添
加と抽出時の２−メルカプトエタノール添加を組み合わ
せることにより、両者が相乗的に作用して可溶型ヒトＴ
Ｌ４収量の飛躍的な増大をもたらすことも分かった（図
５）。なお、可溶型ヒトＴＬ４収量に対する抽出時の２
−メルカプトエタノール至適濃度は５ｍＭ、リフォール
ディング時のアルギニン至適濃度は０．８Ｍであった。

【００３７】実施例６ 可溶型ヒトＴＬ４の蛋白化学的
分析 （ａ）アミノ酸組成分析 実施例３で得られた可溶型ヒトＴＬ４について、そのア
ミノ酸組成値をアミノ酸分析計（ベックマンシステム６
３００Ｅ）を用いて決定した。その結果、本標品の測定
値は、Ｎ末端にＭｅｔが付加された可溶型ヒトＴＬ４の
アミノ酸組成の理論値と一致した（表１）。 〔表１〕 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １モル当たりの 可溶型ヒトＴＬ４の塩基配列 アミノ酸 残基数 から予測される値 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ａｓｘ ５．９ ６ Ｔｈｒ¹⁾ ８．７ ９ Ｓｅｒ¹⁾ １３．８ １５ Ｇｌｘ １４．１ １４ Ｐｒｏ ６．５ ６ Ｇｌｙ １８．６ １９ Ａｌａ ９．７ １０ Ｃｙｓ²⁾ Ｎ．Ｄ． ２ Ｖａｌ １２．７ １５ Ｍｅｔ １．９ １ Ｉｌｅ ２．７ ３ Ｌｅｕ ２１ ２１ Ｔｙｒ ７．９ ８ Ｐｈｅ ３．８ ４ Ｈｉｓ ５．０ ５ Ｌｙｓ １２．０ １２ Ａｒｇ ７．１ ７ Ｔｒｐ ２．６ ３ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 酸加水分解（６Ｎ ＨＣｌ−４％チオグリコール酸、１１０℃、２４及び４８時 間加水分解の平均値） １）０時間に外挿した値 ２）未検出 約１０μｇを用いて分析を行った。

【００３８】（ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステムモデル４９２）を用いて決定し
た。その結果、得られた可溶型ヒトＴＬ４のＮ末端には
Ｍｅｔが付加されていることの他は塩基配列から推定さ
れた可溶型ヒトＴＬ４のＮ末端アミノ酸配列と一致した
（表２）。 〔表２〕 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 検出された 可溶型ヒトＴＬ４の塩基配列 残基Ｎｏ． ＰＴＨ¹⁾−アミノ酸 から予測される （ｐｍｏｌ） アミノ酸 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １ Ｍｅｔ（１４） ２ Ｉｌｅ（１８） Ｉｌｅ ３ Ｇｌｎ（９．８） Ｇｌｎ ４ Ｇｌｕ（８．３） Ｇｌｕ ５ Ａｒｇ（７．１） Ａｒｇ ６ Ａｒｇ（９．９） Ａｒｇ ７ Ｓｅｒ（３．６） Ｓｅｒ ８ Ｈｉｓ（３．６） Ｈｉｓ ９ Ｇｌｕ（３．６） Ｇｌｕ １０ Ｖａｌ（３．８） Ｖａｌ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １）フェニールチオヒダントイン ５０ｐｍｏｌを用いて分析を行った。

【００３９】（ｃ）Ｃ末端アミノ酸分析 Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマンシステム
６３００Ｅ）を用いて決定した。得られた可溶型ヒトＴ
Ｌ４は塩基配列から推定されたＣ末端アミノ酸と一致し
た（表３）。 〔表３〕 −−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｃ末端アミノ酸 回収率（％） −−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｖａｌ ３３．６ −−−−−−−−−−−−−−−−−−− 気相ヒドラジン分解法（１００℃，３．５時間） ４ｎｍｏｌを用いて分析を行った。

【００４０】実施例７ 可溶型ヒトＴＬ４の活性測定 実施例３で得られた精製可溶型ヒトＴＬ４の有する癌細
胞株に対する細胞障害活性を調べた。細胞障害活性は下
記のようにして測定した。すなわち、９６穴プレートに
ヒト大腸癌細胞株ＷｉＤｒを５０００個/wellで播種
し、大腸菌由来可溶型ヒトＴＬ４または特開平１１−１
４１１０６号公報の実施例１に記載の昆虫細胞由来可溶
型ヒトＴＬ４を種々の濃度で、インターフェロンγ（Ge
nzyme社）を最終濃度２００U/ml存在下、および非存在
下で作用させた。３日間培養後、ブロモデオキシウリジ
ンの取り込みをCell proliferation ELISA（ベーリン
ガー社）で測定した。その結果、インターフェロンγ存
在下において、大腸菌由来可溶型ヒトＴＬ４は良好な細
胞障害活性を示し、その効果は昆虫細胞由来可溶型ヒト
ＴＬ４と同等であった（図６）。

【００４１】実施例８ 可溶型マウスＴＬ４の大腸菌か
らの抽出 参考例４で得られた菌体３０ｇに、５０ｍＭトリス／Ｈ
Ｃｌ、５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１５０ｍＬを加え
て超音波破砕機（ソニファー ４５０）(ブランソン
（株）)を用いて４℃、５分間の菌体破砕を繰り返した
後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０分間）を行い、
沈殿画分（封入体画分）を得た。本沈殿画分を５０ｍＭ
トリス／ＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）９０ｍ
ｌ、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ７．５）
９０ｍｌ、にて洗浄を行った後、沈殿画分に１００ｍＭ
トリス／ＨＣｌ、４Ｍグアニジン塩酸塩（ｐＨ７．
５）、５ｍＭ システアミン ９００ｍｌを加えて４℃
で一晩撹拌溶解した後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、３
０分間）を行い上澄液を得た。

【００４２】実施例９ 可溶型マウスＴＬ４のリフォー
ルディング 実施例８で得られた上澄液に０．８Ｍアルギニン、５０
ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２２．５リットルを
加えて、４℃で一晩活性化を行った。

【００４３】実施例１０ 可溶型マウスＴＬ４の精製 実施例９で得られた活性化の終了した再生液を限外濾過
膜（再生セルロース膜分画分子量１０Ｋ、膜面積０．１
ｍ² Ｘ ２枚）（ザルトリウス（株））で濃縮した後、
ｐＨ６に調整し、蒸留水で４倍に希釈し、遠心分離（８
０００ｒｐｍ、１５分間）を行ない上澄液を得た。本上
澄液を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した
ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（５ｃｍＩＤ Ｘ ５ｃ
ｍＬ、１００ｍＬ）（ファルマシア バイオテク
（株））に吸着させた後、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
６．０）、０．７５Ｍ ＮａＣｌにてＴＬ４を溶出し
た。次に、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化
したＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ（１．６ｃｍＩＤ
Ｘ １５ｃｍＬ、２５μ）（ファルマシア バイオテク
（株））に吸着させた後、０〜７０％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１．５Ｍ ＮａＣｌ）の段
階勾配で３０分間、４ｍｌ／分の流速で溶出した。続い
て、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１５０ｍＭ
ＮａＣｌで平衡化したＣＭ−５ＰＷ（２１．５ｍｍＩＤ
Ｘ １５０ｍｍＬ、１３μ）（東ソー（株））に吸着さ
せた後、０〜６０％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
６．０）、１．５ＭＮａＣｌ）の段階勾配で４０分間、
５ｍｌ／分の流速で溶出した。ＴＬ４のフラクションを
プールし、ＴＬ４の沈殿防止の為、蒸留水で２倍に希釈
した。本希釈液を限外濾過膜（ビバスピン２０ 分画分
子量１０Ｋ）（ザルトリウス(株)）で濃縮した後５０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌに
置換し、可溶型マウスＴＬ４約１．２ｍｇを得た。この
ようにして得られた可溶型マウスＴＬ４標品の純度を測
定する目的で、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行った。本標品を１００ｍＭ ＤＴＴを添加したＳａ
ｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ［Laemmli, Nature, 227, 680
(1979)］に懸濁し、９５℃で１分間加熱した後、マルチ
ゲル１５／２５（第一化学薬品）で電気泳動を行った。
泳動後のゲルをクーマシー・ブリリアント・ブルー（Co
omassie brilliant blue）で染色した結果、約１７Ｋｄ
に単一バンドの蛋白が認められた。このことから可溶型
マウスＴＬ４の本標品は単一であり、きわめて高純度の
標品であることが分かった（図９）。

【００４４】実施例１１ ＨＰＬＣを用いた可溶型マウ
スＴＬ４の分析 実施例１０で得られた可溶型マウスＴＬ４の純度を測定
する目的でギルソンＨＰＬＣシステム（ギルソン
（株））を用いイオン交換、逆相ＨＰＬＣにより分析を
行った。イオン交換ＨＰＬＣにおいては５０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化し
たＣＭ−５ＰＷ（７．５ｍｍＩＤ Ｘ ７５ｍｍＬ、１０
μ）（東ソー（株））に可溶型マウスＴＬ４ １０μｇ
を注入し、２０〜７０％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．８）、１．５Ｍ ＮａＣｌ）の段階勾配で３
０分間、０．８ｍｌ／分の流速で溶出した。逆相ＨＰＬ
Ｃにおいては３０％Ｂ（Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）、Ｂ＝８０％ アセトニトリル／０．１％Ｔ
ＦＡ）で平衡化したＣ４Ｐ−５０（４．６ｍｍＩＤ Ｘ
２５０ｍｍＬ、５μ）（昭和電工（株））に可溶型マウ
スＴＬ４ ２．５μｇを注入し、３０〜６０％Ｂの段階
勾配で４０分間、０．５ｍｌ／分の流速で溶出した。検
出は２８０ナノメートルの波長で行い、得られたデータ
はクロマトコーダー２１（システム インスツルメンツ
（株））で波形処理を行い純度を計算した。その結果、
可溶型ＴＬ４は単一ピークを示し、このことから可溶型
マウスＴＬ４の本標品は単一であり、きわめて高純度の
標品であることが分かった（図１０）。

【００４５】実施例１２ 可溶型マウスＴＬ４収量に及
ぼす効果---抽出時の還元剤添加効果およびリフォール
ディング時のアミノ酸添加効果 参考例４で得られた菌体１０ｇに、５０ｍＭトリス／Ｈ
Ｃｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）５０ｍｌを加え
て超音波破砕機（ソニファー４５０）（ブランソン
（株））にて４℃、５分間の菌体破砕を４回繰り返した
後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０分間）を行い、
沈殿画分（封入体画分）を得た。本沈殿画分を５０ｍＭ
トリス／ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１０
ｍｌ、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ７．
５）１０ｍｌ、にて洗浄を行った後、菌体１ｇより得ら
れる沈殿画分に５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４Ｍグアニジ
ン塩酸塩（ｐＨ７．５）、０もしくは５ｍＭ システア
ミン３０ｍｌを加えて４℃で一晩撹拌溶解した後、遠心
分離（１５０００ｒｐｍ、３０分間）を行い上澄液を得
た。本上澄液に０．８ｍｌに５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、
０、０．２、０．４、０．６もしくは０．８Ｍアルギニ
ン、（ｐＨ８．０）のリフォールディング液２０ｍｌを
加えて、４℃で２日間活性化を行なった後、酢酸でｐＨ
６に調整し、蒸留水にて４倍に希釈して遠心分離（３０
００ｒｐｍ、１５分間）を行い上澄液を得た。本上澄液
を実施例１１で示したＣ４Ｐ−５０（４．６ｍｍＩＤ
Ｘ ２５０ｍｍＬ、５μ）（昭和電工（株））を用いて
可溶性マウスＴＬ４量を定量した。その結果、可溶型マ
ウスＴＬ４収量はリフォールディング時のアルギニン添
加により、著しく上昇することが分かった（図１１）。
さらに、このアルギニン添加と抽出時のシステアミン添
加を組み合わせることにより、両者が相乗的に作用して
可溶型マウスＴＬ４収量の飛躍的な増大をもたらすこと
も分かった（図１１）。なお、可溶型マウスＴＬ４収量
に対する抽出時のシステアミン至適濃度は５ｍＭ、リフ
ォールディング時のアルギニン至適濃度は０．８Ｍであ
った。

【００４６】実施例１３ 可溶型マウスＴＬ４の蛋白化
学的分析 （ａ）アミノ酸組成分析 実施例１０で得られた可溶型マウスＴＬ４について、そ
のアミノ酸組成値をアミノ酸分析計（ベックマンシステ
ム６３００Ｅ）を用いて決定した。その結果、本標品の
測定値は、Ｎ末端にＭｅｔが付加された可溶型マウスＴ
Ｌ４のアミノ酸組成の理論値と一致した（表４）。

【００４７】 〔表４〕 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １モル当たりの 可溶型マウスＴＬ４の塩基配列 アミノ酸 残基数 から予測される値 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ａｓｘ ９．４ ９ Ｔｈｒ¹⁾ ７．３ ７ Ｓｅｒ¹⁾ １０．８ １２ Ｇｌｘ １２．８ １２ Ｐｒｏ １１．０ ９ Ｇｌｙ １９．５ ２０ Ａｌａ １１．１ １１ Ｃｙｓ²⁾ Ｎ．Ｄ． ２ Ｖａｌ １３．２ １４ Ｍｅｔ ３．１ ２ Ｉｌｅ ３．９ ４ Ｌｅｕ ２０ ２０ Ｔｙｒ ７．８ ８ Ｐｈｅ ４．１ ４ Ｈｉｓ ４．９ ５ Ｌｙｓ ３．３ ３ Ａｒｇ １３．４ １４ Ｔｒｐ ２．４ ３ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 酸加水分解（６Ｎ ＨＣｌ−４％チオグリコール酸、１１０℃、２４及び４８時 間加水分解の平均値） １）０時間に外挿した値 ２）未検出 約１０μｇを用いて分析を行った。

【００４８】（ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステムモデル４９２）を用いて決定し
た。その結果、得られた可溶型マウスＴＬ４のＮ末端に
はＭｅｔが付加されていることの他は塩基配列から推定
された可溶型マウスＴＬ４のＮ末端アミノ酸配列と一致
した（表５）。

【００４９】 〔表５〕 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 検出された 可溶型マウスＴＬ４の塩基配列 残基Ｎｏ． ＰＴＨ¹⁾−アミノ酸 から予測される （ｐｍｏｌ） アミノ酸 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １ Ｍｅｔ（３４） ２ Ｌｅｕ（３１） Ｌｅｕ ３ Ｉｌｅ（３５） Ｉｌｅ ４ Ｇｌｎ（２４） Ｇｌｎ ５ Ｇｌｕ（２０） Ｇｌｕ ６ Ｇｌｎ（２０） Ｇｌｎ ７ Ａｒｇ（１５） Ａｒｇ ８ Ｓｅｒ（１１） Ｓｅｒ ９ Ｈｉｓ（６．４） Ｈｉｓ １０ Ｇｌｎ（９．５） Ｇｌｎ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １）フェニールチオヒダントイン １００ｐｍｏｌを用いて分析を行った。

【００５０】

【発明の効果】本発明では遺伝子工学を用いて原核細胞
中に発現した組み換え型タンパク質の不活性体を効率よ
く活性化でき、上記のような作用を有する生物学的、薬
理学的に活性な組み換え型タンパク質を大量に調製でき
る。このようにして得られる活性なタンパク質のなかで
も、例えば、Ｆａｓリガンド様タンパク質であるＴＬ４
は、抗ガン剤として癌（乳癌、前立腺癌、大腸癌、胃癌
など）、免疫調節剤として癌、ウイルス感染、腎炎、自
己免疫疾患、リウマチ関節炎など、肝臓機能調節剤とし
て肝炎などに対する治療薬として有用である。

【００５１】

【配列表】 [Sequence Listing] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Method for Producing of a Recombinant Protein <130> B01112 <150> JP 12-097891 <151> 2000-03-30 <160> 6 <210> 1 <211> 240 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Glu Glu Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Thr Asp Ile Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gln Ser 20 25 30 Cys Ser Val Ala Arg Val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Gly 35 40 45 Ala Gly Leu Ala Val Gln Gly Trp Phe Leu Leu Gln Leu His Trp Arg 50 55 60 Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp 65 70 75 80 Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala 85 90 95 His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu 100 105 110 Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr 115 120 125 His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr 130 135 140 Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser 145 150 155 160 Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu 165 170 175 Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser 180 185 190 Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His 195 200 205 Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu 210 215 220 Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val 225 230 235 240 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 2 tatacatatg atacaagagc gaaggtc 27 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 3 agccggatcc gacctcacac catgaaa 27 <210> 4 <211> 239 <212> PRT <213> Mouse <400> 4 Met Glu Ser Val Val Gln Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln Thr 1 5 10 15 Asp Ile Pro Phe Arg Arg Leu Glu Gln Asn His Arg Arg Arg Arg Cys 20 25 30 Gly Thr Val Gln Val Ser Leu Ala Leu Val Leu Leu Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Leu Ala Thr Gln Gly Trp Phe Leu Leu Arg Leu His Gln Arg Leu Gly 50 55 60 Asp Ile Val Ala His Leu Pro Asp Gly Gly Lys Gly Ser Trp Glu Lys 65 70 75 80 Leu Ile Gln Asp Gln Arg Ser His Gln Ala Asn Pro Ala Ala His Leu 85 90 95 Thr Gly Ala Asn Ala Ser Leu Ile Gly Ile Gly Gly Pro Leu Leu Trp 100 105 110 Glu Thr Arg Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Thr Tyr His Asp 115 120 125 Gly Ala Leu Val Thr Met Glu Pro Gly Tyr Tyr Tyr Val Tyr Ser Lys 130 135 140 Val Gln Leu Ser Gly Val Gly Cys Pro Gln Gly Leu Ala Asn Gly Leu 145 150 155 160 Pro Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Ser Arg Tyr Pro Lys Glu 165 170 175 Leu Glu Leu Leu Val Ser Arg Arg Ser Pro Cys Gly Arg Ala Asn Ser 180 185 190 Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu 195 200 205 Glu Ala Gly Glu Glu Val Val Val Arg Val Pro Gly Asn Arg Leu Val 210 215 220 Arg Pro Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val 225 230 235 239 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 5 ggcatatgct gatacaagat caacgatctc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 6 cggatcctca gaccatgaaa gctccgaaat 30

【００５２】

【図面の簡単な説明】

【図１】可溶型ヒトＴＬ４(Ile84-Val240)のアミノ酸配
列を示す。

【図２】プラスミドｐＴＣII-ｓｈＴＬ４の構築図を示
す。

【図３】可溶型ヒトＴＬ４の精製標品のＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動での挙動を示す。レーン１は分
子量マーカーを、レーン２は可溶型ヒトＴＬ４の精製標
品を示す。

【図４】可溶型ヒトＴＬ４の精製標品のイオン交換ＨＰ
ＬＣおよび逆相ＨＰＬＣでの溶出パターンを示す。

【図５】可溶型ヒトＴＬ４の収量に及ぼす抽出時の２−
メルカプトエタノール添加効果およびリフォールディン
グ時のアルギニン添加効果を示す。

【図６】可溶型ヒトＴＬ４の生物活性を示す。

【図７】図７は、可溶型マウスＴＬ４(Leu81-Val239)の
アミノ酸配列を示す。

【図８】図８は、プラスミドｐＴＣII ｍＴＬ４の構築
図を示す。

【図９】図９は、可溶型マウスＴＬ４の精製標品のＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動での挙動を示す。レ
ーン１は分子量マーカーを、レーン２は可溶型マウスＴ
Ｌ４の精製標品を示す。ゲルはマルチゲル １５／２５
（第一化学薬品（株））を用い、クーマシー・ブリリア
ント・ブルーで染色を行った。

【図１０】図１０は、可溶型マウスＴＬ４の精製標品の
イオン交換ＨＰＬＣおよび逆相ＨＰＬＣでの溶出パター
ンを示す。

【図１１】図１１は、可溶型マウスＴＬ４の収量に及ぼ
す抽出時のシステアミン添加効果およびリフォールディ
ング時のアルギニン添加効果を示す。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】遺伝子工学的に原核細胞宿主中で発現させ
   たタンパク質を、還元電位が−３３１ｍＶより大きい還
   元剤を約０．１ｍM〜約５０ｍＭの濃度で含有する溶液
   を用いて抽出し、メルカプト基を有さないアミノ酸また
   はその塩を含有する溶液中でリフォールディングするこ
   とを特徴とする活性型タンパク質またはその塩の製造方
   法。
2. 【請求項２】メルカプト基を有さないアミノ酸または
   その塩および還元型グルタチオンおよび酸化型グルタ
   チオン、システインおよびシスチン、またはシステアミ
   ンおよびシスタミンを含有する溶液中でリフォールディ
   ングすることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
3. 【請求項３】タンパク質がＦａｓリガンド様タンパク質
   である請求項１記載の製造方法。
4. 【請求項４】Ｆａｓリガンド様タンパク質がＴＬ４であ
   る請求項３記載の製造方法。
5. 【請求項５】還元剤がメルカプト基を有する化合物であ
   る請求項１記載の製造方法。
6. 【請求項６】メルカプト基を有する化合物が２−メルカ
   プトエタノールまたはシステアミンである請求項５記載
   の製造方法。
7. 【請求項７】メルカプト基を有さないアミノ酸がアルギ
   ニンである請求項１記載の製造方法。
8. 【請求項８】タンパク質を遺伝子工学的に原核細胞宿主
   中で発現させ、還元電位が−３３１ｍＶより大きい還元
   剤を約０．１ｍM〜約５０ｍＭの濃度で含有し、かつタ
   ンパク変性剤を含む溶液を用いて該タンパク質を該細胞
   から抽出・可溶化し、ついでメルカプト基を有さないア
   ミノ酸またはその塩を含有するリフォールデイング溶液
   で変性剤を不作用濃度まで希釈することを特徴とする請
   求項１記載の製造方法。