ES2657344T3

ES2657344T3 - Nuevos mutantes de proNGF y usos de los mismos en la producción de beta-NGF

Info

Publication number: ES2657344T3
Application number: ES15157320.1T
Authority: ES
Inventors: Susan Lorey; Bernhard Janowski; Heiko PULTKE; Daniela KATHMANN; Antje PARTHIER; Andreas Anton
Original assignee: Wacker Chemie AG
Current assignee: Wacker Chemie AG
Priority date: 2011-12-19
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2018-03-02
Anticipated expiration: 2032-12-19
Also published as: KR20160120788A; SG10201605028VA; MX353074B; DK2907521T3; PT2672984E; EP2907521B1; CA2859262C; JP2019006781A; NO2907521T3; HRP20180307T1; CN104203264A; HUE027245T2; MX370861B; PT2907521T; US20200031893A1; HUE036265T2; ZA201403753B; EA031333B1; JP2019011330A; BR112014014913B1

Abstract

Un mutante de proNGF que tiene una secuencia que consiste en la secuencia de proNGF humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) en donde el sitio de escisión de la proteasa R1SK3R4 está sustituido al menos en las posiciones R1 y K3 que se corresponden con las posiciones 101 y 103 de la secuencia de proNGF humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) por cualquier aminoácido seleccionado a partir de un aminoácido no básico e histidina.

Description

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103 Ala, Val, Asp, Asn, Glu, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Met, His, Cys, Pro, Phe, Trp, Ile, Leu

104 Arg*, Lys

Los aminoácidos Cys, Pro, Phe, Trp, Ile y Leu son sustituciones menos preferidas en las posiciones 101, 102 y 103.

Tabla 2B. Aminoácidos más preferidos en las posiciones 101-104 de proNGF de tipo silvestre

101 Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, Gln, Tyr, Met, His

102 Ser*, Val, Ala, Gly, Thr, Asn, Asp, Glu, Gln, Tyr, Met, His

103 Ala, Val, Gly, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, Gln, Tyr, Met, His

104 Arg*, Lys

Es esencial que puede haber cualquier aminoácido pero no Arg o Lys en las posiciones 101, 102 y 103 de la muteína de proNGF y que hay un aminoácido básico (Arg o Lys) en la posición 104 de la muteína de proNGF. Se ha observado sorprendentemente que las sustituciones de específicamente dos aminoácidos en las posiciones 101 y 103, dan lugar a eficacias elevadas de la producción de beta-NGF.

En la secuencia del mutante de proNGF más preferido de la invención (SEQ ID NO: 5), el aminoácido sustituido preferido en la posición 101 de proNGF humano de tipo silvestre es valina, en la posición 103 de proNGF humano de tipo silvestre es alanina, en la posición 102 de proNGF humano de tipo silvestre es serina y en la posición 104 de proNGF humano de tipo silvestre es arginina. En una realización particularmente preferida de la invención, el mutante de proNGF de la invención presente tiene una secuencia correspondiente a la de SEQ ID NO: 5.

La presente invención también se dirige a ácidos nucleicos que codifican los mutantes de proNGF descritos en este documento.

Método de preparación de un beta-NGF humano a partir de un mutante de proNGF de la invención

En un segundo aspecto, la presente invención se dirige a un método para preparar un beta-NGF humano biológicamente activo a partir de un mutante de proNGF inactivo insoluble, sustituido en el sitio de escisión natural de la proteasa R1SK3R4 (SEQ ID NO: 9) en las posiciones 101 y 103 (R1 y K3) de la secuencia de proNGF humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), que comprende proporcionar un mutante de proNGF sustituido en el sitio de escisión natural de la proteasa R1SK3R4 en las posiciones 101 y 103 (R1 y K3) de la secuencia de proNGF humano de tipo silvestre, y escindir el mutante de proNGF con el fin de obtener beta-NGF humano activo.

Preferiblemente, el mutante de proNGF se obtiene mediante expresión recombinante en células procariotas. Cepas bacterianas adecuadas son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, E. coli, Bacillus sp. y Salmonella, y kits para tales sistemas de expresión están disponibles comercialmente. Las células hospedadoras preferidas para la expresión recombinante son E. coli, por ejemplo, E. coli BL21, JM 108/109 (K12), JM106, JM83 y TB1 o derivados de las mismas. Se podría emplear cualquier otra cepa de E. coli adecuada para la expresión de proteínas recombinantes.

Los polinucleótidos están ligados funcionalmente a secuencias de control de la expresión que permiten una expresión de las proteínas de fusión de la invención en células hospedadoras procariotas. Tales secuencias de control de la expresión incluyen, pero no se limitan a promotores, operadores, represores inducibles y no inducibles y otros elementos que son conocidos por los expertos en la técnica y que dirigen o regulan de otra manera la expresión génica. Tales elementos reguladores incluyen, por ejemplo, promotores T7, TAC, PBAD, LAC, represores LacI, LacIQ.

La secuencia del mutante de proNGF se introduce en la célula hospedadora procariota mediante un vector adecuado. Los vectores adecuados pueden ser, por ejemplo, pero no limitados a: pBR322, pMAL, pUC19 y todos los derivados. La célula hospedadora procariota incluye pero no se limita a células procariotas tales como bacterias (por ejemplo, E. coli o B. subtilis), que se pueden transformar, por ejemplo, con ADN plasmídico, ADN de bacteriófago recombinante o vectores de expresión de ADN de cósmido que contienen las moléculas de polinucleótido de la invención. En una realización de la invención, se emplean vectores plasmídicos. Por ejemplo, pero sin estar limitados de ninguna manera a los mismos, se pueden emplear vectores de plásmidos descritos en el documento EP1697523B1 (que se incorpora como referencia en este documento).

Con el fin de expresar las muteínas de proNGF, se emplea un vector de expresión que contiene

a.: un promotor fuerte para dirigir la transcripción (por ejemplo, un promotor tac o T7),

b.: una secuencia que codifica proNGF o una muteína de proNGF

c.: un terminador de la transcripción/traducción (por ejemplo, terminador t0 del bacteriófago lambda)

d.: un primer gen marcador seleccionable, por ejemplo, un gen que codifica resistencia a antibióticos (por ejemplo, resistencia a kanamicina, kan),

e.: un segundo gen marcador seleccionable, por ejemplo, un gen que codifica proB y/o proA.

f.: un gen represor (por ejemplo, un gen lacI)

5 g. un origen de replicación con número elevado de copias

En una realización de la invención, los vectores de expresión patentados (Scil Proteins GmbH, véase el documento EP1697523B1 para la estructura de un vector de expresión adecuado) o vectores comercialmente disponibles, se pueden usar para la clonación. Con respecto a la información general sobre los vectores que se podrían utilizar en el método de la presente invención, se hace referencia a los detalles mencionados anteriormente. Sin embargo, se

10 puede emplear cualquier vector adecuado, tal y como se conoce en la técnica.

La estructura del vector de expresión patentado pSCIL101 a modo de ejemplo para un vector adecuado para la transformación de células hospedadoras procariotas, se representa a continuación:

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El método de preparación de un mutante de proNGF comprende las siguientes etapas iniciales: 15 i. preparación de un ácido nucleico que codifica una muteína de proNGF

ii. introducir dicho ácido nucleico en un vector de expresión procariota;

iii. introducir dicho vector de expresión en una célula hospedadora;

iv.: cultivar la célula hospedadora;

v.: someter la célula hospedadora a condiciones de cultivo adecuadas.

20 Debido a su expresión en células hospedadoras procariotas, la muteína de proNGF está en forma de su forma inactiva, insoluble.

En una realización preferida, el método de producción de beta-NGF a partir de un mutante de proNGF de acuerdo con la presente invención, comprende las etapas de:

a. disolver el mutante de proNGF sustituido en el sitio de escisión natural de la proteasa R1SK3R4 en las posi

25 ciones R1 y K3 correspondientes a las posiciones 101 y 103 de la secuencia de proNGF de tipo silvestre humana (SEQ ID NO: 1) mediante solubilización de cuerpos de inclusión en una solución desnaturalizante;

b. transferir el mutante de proNGF a una solución de renaturalización, en donde el proNGF desnaturalizado asume una conformación biológicamente activa;

c. purificar el mutante de proNGF desde la solución de renaturalización; 30 d. escindir la pro-secuencia del mutante de proNGF para obtener el beta-NGF activo.

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A continuación, se describen las etapas preferidas de un método para producir beta-NGF a partir de un mutante de proNGF de acuerdo con la presente invención.

Etapa a: Solubilización de un mutante de proNGF

La etapa a) se corresponde con la disolución del mutante de proNGF sustituido en el sitio de escisión natural de la proteasa R1SK3R4 en las posiciones R1 y K3 correspondientes a las posiciones 101 y 103 de la secuencia de proNGF humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) mediante la solubilización de cuerpos de inclusión en una solución desnaturalizante. Se observa que el mutante de proNGF de la invención en la etapa a) por lo general se encuentra en la forma de su forma inactiva, insoluble debido a su expresión en células hospedadoras procariotas. El proNGF inactivo que muestra una solubilidad deficiente se forma durante la sobreexpresión de la proteína en el citosol de los procariotas. En ese caso, el proNGF preparado mediante recombinación permanece en el citoplasma en forma insoluble y agregada. Estos agregados proteicos, su aislamiento, así como su purificación, se describen, por ejemplo, en Marston, F. A., Biochem. J. 240 (1986).

Para aislar estos agregados proteicos inactivos (cuerpos de inclusión), las células procariotas se destruyen después de la fermentación. La destrucción celular puede llevarse a cabo por métodos convencionales, por ejemplo, por medio de una homogeneización a alta presión, tratamiento con ultrasonidos o lisozimas (Rudolph, R., et al. (1997); Folding proteins. En: Creighton, T. E. (compilador): Protein Function: A Practical Approach. Oxford University Press,

p. 57-99).

Además, los cuerpos de inclusión se solubilizan. Los cuerpos de inclusión (IB) son acumulaciones de proteínas por lo general defectuosas o plegadas de forma incompleta. Se forman dentro de las células, por ejemplo, células bacterianas, tales como E. coli, en el caso de una expresión excesiva de proteínas recombinantes. Los cuerpos de inclusión empleados según la invención comprenden preferiblemente la muteína de proNGF. Esto significa que contienen al menos 60, al menos 70, al menos 80 o al menos 90% en peso de pro-NGF (basado en la cantidad total de proteína).

La invención proporciona un método para la producción de muteína de proNGF, en donde los cuerpos de inclusión los cuales son una muteína de proNGF no plegada, inactiva, insoluble o un derivado de la misma, se solubilizan en un tampón de desnaturalización (solución).

La solución de desnaturalizante de la etapa a) comprende preferiblemente una solución que contiene (i) un agente caotrópico, (ii) un agente quelante, (iii) un tampón y (iv) un agente reductor.

El tampón de desnaturalización comprende al menos una sustancia caotrópica (agente). Las sustancias químicas que disuelven enlaces de puentes de hidrógeno ordenados en el agua se llaman caotrópicas. Puesto que los enlaces de puentes de hidrógeno se rompen, las sustancias caotrópicas interfieren con la estructura del agua y aseguran el desorden (aumento de la entropía). La razón de esto es que se evita la formación de estructuras de jaula de H2O necesarias para la solvatación. En el caso de aminoácidos, estos reducen los efectos hidrófobos y tienen una acción desnaturalizante sobre las proteínas, ya que una fuerza motora para el plegamiento de proteínas es ensamblar aminoácidos hidrófobos entre sí en el agua. En general, cualquier sustancia que ejerce el efecto hidrófobo en el tampón de solubilización y que, por lo tanto, tiene una acción desnaturalizante sobre las proteínas, se puede emplear como una sustancia caotrópica. Las sustancias caotrópicas son en general sales o compuestos de bajo peso molecular, tales como urea. Las sustancias caotrópicas se distinguen claramente de los detergentes, ya que no contienen ningún radical hidrófobo, tal como un radical alquilo, en la molécula. En general, la acción caotrópica está acompañada por una mejora de la solubilidad de la proteína, en este caso la pretrombina.

En una realización preferida de la invención, el compuesto caotrópico se selecciona a partir de sales de guanidinio, en particular clorhidrato de guanidinio y tiocianato de guanidinio, yoduros, sales de bario, tiocianatos, urea y percloratos.

Los compuestos caotrópicos se emplean en cantidades convencionales. Por ejemplo, se puede emplear clorhidrato de guanidinio 4 -8 M o urea 4 -9 M.

El tampón de desnaturalización comprende un compuesto de agente reductor, por ejemplo, un compuesto de disulfuro tal como glutatión (GSH). El compuesto de disulfuro es capaz de formar disulfuros mixtos con los grupos tiol (-SH) de cisteínas de los polipéptidos en los cuerpos de inclusión. El disulfuro se añade a la solución. El disulfuro no indica proteínas que comprenden los cuerpos de inclusión y que posiblemente comprenden puentes disulfuro. Preferiblemente, el disulfuro no es un péptido verdadero. Preferiblemente, el disulfuro es un compuesto de bajo peso molecular. El peso molecular es, por ejemplo, inferior a 2.000 g/mol o a 1.000 g/mol. El disulfuro se emplea, por ejemplo, en una concentración de 5 mM a 1 M, en particular de 10 mM a 0,5 M.

En una realización preferida de la invención, el compuesto de disulfuro es disulfuro de glutatión. El glutatión (GSH), también γ-L-glutamil-L-cisteinilglicina, es un seudo-tripéptido que se forma a partir de los tres aminoácidos ácido glutámico, cisteína y glicina. El GSH está presente en el citoplasma tanto de procariotas como de eucariotas, y está implicado en la formación de puentes disulfuro. Está en equilibrio con el dímero GSSG que contiene un puente disulfuro. El glutatión reacciona con cisteínas R-SH y R'-SH procedentes de dos polipéptidos o de un solo polipéptido en

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Tales compuestos son conocidos por una persona experta en la técnica. Pueden ayudar al plegamiento de varias maneras. Se supone que la arginina desestabiliza productos intermedios plegados incorrectamente, de modo que estos, al menos parcialmente, están de nuevo desnaturalizados (desde un extremo termodinámicamente inactivo) y por lo tanto pueden ser plegados de nuevo correctamente. Por otro lado, el glicerol estabiliza usualmente a las proteínas. Unos compuestos que aumentan el rendimiento absoluto de una muteína de proNGF plegada en el método de acuerdo con la invención, en más de un 5%, en particular en más de un 10% o más de un 20% (basado en la cantidad total de proNGF que se emplea para el plegamiento) en comparación con un método sin el uso del agente auxiliar del plegamiento, son apropiados en particular como agentes auxiliares del plegamiento.

La renaturalización se lleva a cabo preferiblemente a un pH de entre 8 y 11, en particular pH 9,5.

Para aumentar la concentración de proteína en el recipiente de la renaturalización, se llevó a cabo una renaturalización por impulsos. La concentración de guanidinio HCI es limitativa para el número de impulsos, la cual no debería superar el valor de 0.3 M. La concentración de proteína por cada impulso no debería superar el valor de 50 µg/ml en relación con el volumen de renaturalización final.

En una realización preferida de la invención, el material solubilizado se añade al lote de plegamiento en varias fracciones o continuamente, durante varios días. Preferiblemente, el material solubilizado se añade en una "renaturalización por impulsos" mediante una dilución rápida en el material solubilizado. En este contexto, por ejemplo pero sin quedar limitado de ninguna manera a ello, se podrían ejecutar por lo menos 6 impulsos en un intervalo de, por ejemplo, 24 horas. El número de impulsos se ajusta de una manera tal que, después de la adición del lote de solubilización, la concentración de proteína que todavía no ha sido plegada no es demasiado alta, puesto que en caso contrario se obtienen unos agregados. Por ejemplo, con cada impulso se transfieren de nuevas al lote de plegamiento de 0,05 g/l a 0,2 g/l, de manera preferible 0,1 g/l de proteína (basado en la concentración de proteína en el lote de plegamiento después de la adición del material solubilizado). Por ejemplo cada etapa de renaturalización dura por lo menos 1-2 h.

Después de la renaturalización, la reacción de renaturalización se tiene que clarificar antes de cargarla sobre una columna. Esto puede hacerse por cualesquiera métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por filtración.

En una realización preferida, el método para producir un mutante de proNGF correctamente plegado incluye las etapas siguientes: a) los cuerpos de inclusión que comprenden el mutante de proNGF insoluble se solubilizan en una solución desnaturalizante como se ha descrito anteriormente, y b) el pro-NGF solubilizado se renaturaliza a continuación en un tampón de solución de renaturalización como se ha descrito anteriormente.

En una realización preferida de la invención, la solución desnaturalizante y/o la solución de renaturalización, por consiguiente, no contienen detergentes. Se ha encontrado que el uso de detergentes no es necesario para la solubilización y/o el plegamiento de la muteína de pro-NGF. Esto es ventajoso, puesto que ciertos detergentes son unas sustancias químicas comparativamente agresivas, que los productos farmacéuticos no deberían comprender o las deberían comprender solamente en pequeñas cantidades, y por lo tanto se deben eliminar de una manera costosa. El método de acuerdo con la invención es por lo tanto ventajoso en comparación con el método de Soejima et al., 2001, en el que tales detergentes agresivos (Triton X-100 o Brij-58) se emplean para el plegamiento de la proteína. En otras palabras, no se emplean detergentes en todo el método de producción de acuerdo con la invención, y por lo tanto el método de producción está exento de detergentes

Etapa c: Purificación del mutante de proNGF mediante cromatografía

Llevando a cabo el método de acuerdo con la invención con la desnaturalización y la subsiguiente renaturalización, se obtiene una solución acuosa de una muteína de proNGF plegada. La muteína de proNGF plegada se puede purificar subsiguientemente de forma adicional mediante unos métodos conocidos.

En una realización preferida, el mutante de proNGF se purifica a partir de la solución de renaturalización (p. ej., mediante una desnaturalización ausente o débil) a través de una purificación por cromatografía, en particular por medio de una cromatografía de modalidad mixta (etapa c del método de producción de beta-NGF a partir de un mutante de proNGF de la invención). La columna más preferida para la cromatografía es una columna con un ligando por afinidad sintético, de manera preferible 4-mercapto-etil-piridina (MEP Hypercell; Pall). Las ventajas de este medio consisten en que la unión es independiente de la fuerza iónica, no es necesario un apilamiento de sales y son posibles unos caudales más altos para acelerar el proceso. Por lo demás, la elución se efectúa mediante un desplazamiento del pH.

Se conocen, y se podrían usar, otras columnas de materiales de modalidad mixta. Por ejemplo, pero sin limitarse a ellas, se citan las columnas con MEP (Pall; en donde el ligando de afinidad es 4-mercapto etil piridina), HEA (Pall; en donde el ligando de afinidad es hexilamino), PPA (Pall, en donde el ligando de afinidad: es fenilpropilamino), MBI (Pall; en donde el ligando de afinidad es 2-mercapto-5-bencimidazol en ácido sulfúrico), Capto MMC (GEHC), Capto adhere (GEHC; en donde el ligando de afinidad es N-bencil-N-metil etanolamina), CHT hidroxiapatito (BioRad) y CHT fluoroapatito). Las columnas con MEP, HEA, PPA y MBI tienen una unión hidrófoba, en donde el Capto MMC es un intercambiador de cationes con una funcionalidad de modalidad mixta y el Capto adhere es un intercambiador de aniones con una funcionalidad de modalidad mixta. Las columnas de BioRad son unas columnas de intercambio

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de iones con componentes hidrófobos. Cualquier otra columna con un material de modalidad mixta, que aquí no se haya enumerado, se podría usar también para purificar el mutante de proNGF.

Etapa d: Escisión de proNGF a beta-NGF

El proNGF es el precursor del beta-NGF. Por lo tanto en la etapa d) del método de producción de un beta-NGF a partir de un mutante de proNGF de la invención, la pro-secuencia del mutante de proNGF se escinde con el fin de obtener un beta-NGF activo.

Las proteasas que tienen un sustrato similar a la tripsina escinden con especificidad la proteína sin digerir la porción activa de la molécula de proteína. Las proteasas similares a tripsina escinden los enlaces peptídicos a continuación de un aminoácido cargado positivamente, tal como arginina o lisina. Igual que las proteasas similares a tripsina, varias proteasas de serina (endopeptidasas de serina) se toman en consideración para que el procesamiento del proNGF dé como resultado beta-NGF. De manera preferible, la proteasa de serina tripsina se emplea para la escisión de la pro-secuencia, pero se podrían usar otras proteasas en su lugar.

Se hace observar que la escisión no está restringida a la efectuada con tripsina propiamente dicha, sino que puede implicar otras proteasas que tienen sustratos que son similares a la tripsina. Generalmente, si la relación del proNGF a la tripsina (o a otra proteasa) se ajusta de una manera apropiada, el beta-NGF maduro, correctamente plegado, no se escindirá con esta proteasa. Por el contrario, unas proteínas desnaturalizadas así como unos compuestos intermedios de plegamiento dejan expuestas secuencias que son susceptibles a un ataque por la proteasa.

De manera preferible para la escisión de un mutante de proNGF para proporcionar un beta-NGF, la relación de tripsina (o de otra proteasa) al mutante de proNGF es de 1 : 200 -1 : 100.000, más preferiblemente de 1 : 5.000 -1 :

20.000 en peso, y es sumamente preferida una relación de 1 : 10.000 (p/p). En una realización sumamente preferida, la escisión se realiza durante 8-23 horas a temperatura ambiente, de modo sumamente preferido durante 18 horas. En las condiciones que se usan en esta invención, el mutante de proNGF se escinde completamente y casi no se forman productos secundarlos. No se observó ninguna agregación.

Tal como se describirá claramente en los Ejemplos, los presentes inventores han encontrado que las modificaciones de aminoácidos que se han introducido en el mutante de proNGF de la invención, no solamente evitan una escisión de la proteína en sitios de escisión no deseados, sino que también dan como resultado inesperadamente un aumento en la eficacia de la escisión con tripsina, en comparación con la del proNGF de tipo silvestre, lo que permite llevar a cabo la escisión en unas condiciones muy selectivas para obtener un producto muy puro.

Detalladamente, los datos experimentales muestran con claridad que ya en una relación muy baja de tripsina/proteína, tal como la de 1:100.000, el mutante de proNGF de la invención (SEQ ID NO: 5) da como resultado un beta-NGF humano recombinante de una pureza muy alta, con un alto rendimiento de escisión (aproximadamente del 85%). Por lo demás, el proNGF de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) con la misma relación de tripsina a proteína muestra un rendimiento bajo de la escisión (aproximadamente del 5%). Un rendimiento satisfactorio se obtiene solamente con unas relaciones entre tripsina/proteína mucho más altas (1/250), pero esto está acompañado por una selectividad baja y una degradación elevada de los productos debido a una digestión excesiva.

Etapa e: Purificación adicional de beta-NGF

El beta-NGF producido a partir de un mutante de proNGF de la invención se purifica adicionalmente, por ejemplo, por diversos métodos cromatográficos. Se requieren unas etapas adicionales de purificación para separar la tripsina y las impurezas relacionadas con el producto de la digestión con tripsina a partir del beta-NGF. Las etapas de purificación deberían reducir los HCPs, las endotoxinas y el ADN. Se pueden usar cualesquiera métodos conocidos en la técnica de purificación de proteínas. Son sumamente preferidas las purificaciones mediante cromatografía, por ejemplo, con columnas de Sefarosa (p. ej. SP Sefarosa HP, Q Sefarosa FF).

El producto final beta-NGF que se había producido a partir de un proNGF, se analizó en lo que se refería a su pureza mediante SDS-PAGE, rp-HPLC, SE-HPLC y IEX-HPLC. Unos análisis por HPLC revelaron una pureza del beta-NGF de al menos un 97%.

En una realización preferida de la invención, el método para la producción de una muteína de proNGF que es apropiada para obtener un beta-NGF, incluye las siguientes etapas:

a) expresión de un mutante de proNGF recombinante con un sitio de escisión de la proteasa sustituido en células procariotas

b) aislamiento de los cuerpos de inclusión que contienen muteína de proNGF,

c) mezclar los cuerpos de inclusión con un tampón de desnaturalización apropiado que comprende por lo menos (i) una sustancia caotrópica, (ii) un agente quelante, (iii) un tampón y (iv) un agente de reducción

d) renaturalizar en una solución de renaturalización que comprende por lo menos una chaperona, un agente quelante de metales y una solución de barajado redox,

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e) purificar el mutante de proNGF renaturalizado,

f) escindir en la forma activa del beta-NGF con unas proteasas tales como la tripsina,

g) aislar y purificar el beta-NGF.

Uso de proNGF para la producción de beta-NGF

En un tercer aspecto, la invención está dirigida a la utilización del mutante de proNGF de la presente invención para producir beta-NGF humano.

Composición farmacéutica de beta-NGF obtenido a partir de mutantes de proNGF de la invención

En un aspecto adicional, la invención está dirigida a una composición farmacéutica que comprende betaNGF obtenido a partir de un mutante de proNGF que está sustituido en el sitio de escisión natural de la proteasa R1SK3R4 en las posiciones 101 y 103 (K3 y R1) de la secuencia de tipo silvestre de proNGF humano (SEQ ID NO: 1), como se ha descrito anteriormente y a un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización de la invención, el beta-NGF farmacéuticamente activo se administra al paciente por métodos de terapia génica. En la terapia génica hay dos métodos básicos disponibles, adecuados para la introducción de un gen, en el presente caso un gen que codifica un beta-NGF, en el paciente.

En la aplicación ex vivo, el gen farmacéuticamente activo que codifica beta-NGF se introduce en una célula del cuerpo a través de un vector, en donde la célula del cuerpo es preferiblemente una célula glial, y la célula tratada de esta manera, a continuación, se vuelve a introducir en el paciente, por ejemplo, mediante micropartículas o nanopartículas. Se prefiere particularmente una integración específica del gen de beta-NGF en el genoma celular.

En la terapia génica in vivo, el gen de beta-NGF es transportado a las células diana en el cuerpo por los vectores, por ejemplo, por medio de virus, que por un lado puedan infectar la célula diana y, de este modo, ser capaces de introducir el gen de beta-NGF farmacéuticamente activo pero, por otro lado, no son capaces de reproducirse a sí mismos dentro de la célula diana. En este enfoque, las nanopartículas o micropartículas, por ejemplo liposomas, que se pueden fusionar con la membrana celular, también se pueden utilizar como vectores.

Como vector para el gen de beta-NGF, se puede emplear un virus o un anticuerpo a modo de ejemplo, que sea capaz de infectar específicamente la célula hospedadora o de inmunorreaccionar con un antígeno en la célula diana. Como vehículo vírico se pueden emplear retrovirus a modo de ejemplo. Además, es posible utilizar adenovirus o vectores basados en el virus Vaccinia, por ejemplo, virus vaccinia modificado de Ankara (MVA).

La persona experta será capaz de seleccionar una formulación adecuada sobre la base de consideraciones de rutina y elegirá una forma adecuada para la administración de la presente composición farmacéutica a un paciente. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede comprender uno o varios ingredientes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, vehículos o diluyentes. Entre estas clases de sustancias, se podrían nombrar cargas, sales, tampones, estabilizadores, potenciadores de la penetración y otros materiales bien conocidos. Las técnicas para la formulación de composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden encontrar en libros de texto estándar bien conocidos, tales como "Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.

La dosificación del betaNGF obtenido por el método de producción, tal y como se describe en la presente invención puede estar en un intervalo de 0,1 μg/kg a 500 μg/kg de peso corporal, si se administra mediante infusión, y de 2 μg/kg a 2 mg/kg de peso corporal si se administra mediante inyección.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de pro-NGF y de los mutantes de pro-NGF de la invención.

En negrita se muestra la secuencia de la proforma de beta-NGF humano. El sitio de escisión de la proteasa (tripsina) se muestra en negrita y subrayado (aminoácidos 101-104 de SEQ ID NO: 1; los sitios de escisión con tripsina están situados entre los aminoácidos 101-102 (R1), 103-104 (K3) y 104 -105 (R4)). X en la secuencia puede ser cualquier aminoácido.

La Figura 1a muestra una secuencia de proNGF humano (SEQ ID NO: 1) con un sitio de escisión de la proteasa RSKR (SEQ ID NO: 9).

La Figura 1b muestra una secuencia de un mutante de proNGF de la invención (SEQ ID NO: 2) con el sitio de escisión de la proteasa VSXR (SEQ ID NO: 10).

La Figura 1c muestra una secuencia de un mutante de proNGF de la invención (SEQ ID NO: 3) con el sitio de escisión de la proteasa mutado a XSXR (SEQ ID NO: 11).

La Figura 1d muestra una secuencia de un mutante de proNGF de la invención (SEQ ID NO: 4) con el sitio de esci

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Ejemplo 2. Expresión recombinante del mutante de proNGF SP174-101 (SEQ ID NO: 5) en células procariotas

El hospedador bacteriano E. coli JM108 utilizado para la expresión de rh-proNGF (DSMZ 5585; F-thi Δ (lac-proAB) end AI gyrA96 relA1 phx hsdR17 supE44 recA) es auxótrofo para prolina, el cual se neutralizó mediante el uso del plásmido con la designación pSCIL101. El plásmido pSCIL101 se basa en el plásmido pSCIL008 (véase el documento WO05061716). La cepa no puede sintetizar tiamina (Vieira y Messing, 1982 Gene. Oct; 19(3): 259-68). El mutante de pro-NGF que se muestra en SEQ ID NO: 5 se expresa bajo el control del promotor tac localizado sobre pSCIL101. El vector pSCIL101 usado en esta memoria es un plásmido con un número elevado de copias con resistencia a la kanamicina. La expresión se lleva a cabo en un medio de sales minerales definido y se induce por la adición de IPTG. El mutante de pro-NGF se deposita en el citosol en forma de cuerpos de inclusión (IBs).

Línea celular:

▪: cepa hospedadora, por ejemplo, E. coli HMS174 (K12) o JM108 (K12)

▪: mutante de proNGF SP174-101 (SEQ ID NO: 5)

▪: promotor tac (inducción con IPTG)

▪: replicón ColE1

▪: resistencia a la kanamicina

▪: selección con proBA

▪: sistema de vector patentado pSCIL 101 (por ejemplo, véase el documento WO05/061716)

Ejemplo 3. Fermentación

El objetivo de esta fermentación era obtener el producto y la biomasa para las etapas subsiguientes del proceso. Para controlar la sobreexpresión de la proteína diana durante el proceso de fermentación, las muestras se analizaron por medio de SDS-PAGE antes y después de la inducción.

▪: Medio de sales minerales sin antibióticos

▪: Fase discontinua μ ≈ 0,25 h-1 (DOfinal = 18)

▪: Fase I de alimentación discontinua con alimentación exponencial con μset = 0,18 h-1

▪: Fase II de alimentación discontinua II: tasa de alimentación constante

▪: Punto de inducción DOind = 60 ± 5

▪: IPTG 1,0 mM

▪: Tiempo de inducción 5 h

▪: DO final = 82 ± 4

▪: Tiempo del proceso de 28,5 h ± 1,25

▪: Estabilidad del plásmido 100%

▪: Rendimiento: 40 mg/g de proNGF; 1,2 g/L ± 0,2 g/L de proNGF

Ejemplo 4. Recuperación primaria de cuerpos de inclusión que contienen SP174-101

En las células bacterianas, la proteína recombinante está presente en forma de agregados. La expresión de la muteína de pro-NGF se llevó a cabo en forma de IBs. La ruptura celular y la preparación de los IBs se llevaron a cabo de conformidad con protocolos estándar y se pueden efectuar a escala de laboratorio hasta realizar un tratamiento de aproximadamente 200 g de la biomasa. La preparación de estos "cuerpos de inclusión" que contienen la muteína de proNGF se realizó según Rudolph, R., et al. (1987); Folding proteins. En: Creighton, T. E. (compilador): Protein Function: A Practical Approach. Oxford University Press, p. 57-99, y según el documento EP0994188B1. Para la ruptura celular, los sedimentos celulares se resuspendieron en un tampón adecuado y, posteriormente, se rompieron las células mediante homogeneización a presión elevada en fosfato de sodio 50 mM pH 7,0, EDTA 1 mM.

Ejemplo 5. Disolución del mutante de proNGF SP174-101 en una solución desnaturalizante (solubilización de cuerpos de inclusión)

Los cuerpos de inclusión se solubilizaron en una solución desnaturalizante que comprendía una solución de (i) un agente caotrópico, (ii) un agente quelante, (iii) un tampón y (iv) un agente reductor. Para la solubilización, se sometió

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a ensayo guanidinio HCl (GuaHCl) en un intervalo de concentración de 4,0-6,0 M. El tampón de solubilización se mezcló en diferentes proporciones con una suspensión de cuerpos de inclusión (suspensión de IB). Todos los experimentos tenían una concentración final de cisteína de 5 mM y se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Los resultados se analizaron mediante SDS-PAGE (datos no mostrados). Los experimentos revelaron que una concentración de GuaHCl 4 M era suficiente para una solubilización completa de los cuerpos de inclusión. La relación entre los cuerpos de inclusión-suspensión y el tampón es de 1 + 1,25 (v/v) (suspensión de IB: tampón). Las condiciones finales de la solución de desnaturalización para la solubilización de los cuerpos de inclusión eran:

i. Guanidinio HCl 4 M,

ii. Tris 0,1 M,

iii. EDTA 10 mM

iv.: Cisteína 5 mM

v.: pH 8,0

El material solubilizado se clarifica mediante filtración en profundidad de acuerdo con procedimientos convencionales.

La concentración de proteína se determinó después utilizando el método de Bradford (Bradford, M. M., Anal. Biochem. 72 (1976) 248). La concentración de proteína de la muteína de proNGF estaba entre 10-20 mg/ml.

Ejemplo 6. Transferencia del mutante de proNGF SP174-101 a un tampón de renaturalización en el que el proNGF desnaturalizado asume una conformación biológicamente activa

Después de la solubilización es necesario volver a plegar la proteína en su conformación natural y de este modo minimizar un plegamiento erróneo y la agregación. Para preparar muteína de proNGF biológicamente activa de acuerdo con la invención a partir de materiales solubilizados, éstos se diluyeron en una solución de renaturalización en la que proNGF asume una conformación biológicamente activa.

La solución final de renaturalización para el material solubilizado basado en una suspensión de IBs comprendía

i. Arginina 0,75 M

ii. EDTA 5 mM

iii. L-cistina 1 mM y L-cisteína 5 mM

iv. pH 9,5

La obtención de NGF en la conformación activa se confirmó por la presencia de los puentes disulfuro que aparecen en beta-NGF humano maduro.

Para aumentar la concentración de proteína en el proceso de renaturalización, se llevó a cabo una renaturalización por impulsos. Un impulso se emitió cada hora por 50 µg/ml de proteína de mutante de proNGF. La concentración de guanidinio-HCl en la solución no debía exceder 0,3 M. Con el fin de lograr esto, fueron necesarios 15 impulsos. La fracción renaturalizada clarificada se filtró antes de cargarla a otras columnas.

El rendimiento de la reacción de renaturalización se analizó después de cada impulso mediante rp-HPLC. El área del pico resultante fue sometida a una transferencia de manchas frente al número de impulsos. Para la rp-HPLC se empleó una columna de fase inversa (por ejemplo, 214MS54, 4,6 x 250 mm; 300 Å, 5 µm, Vydac) con columna de protección (por ejemplo, 214GK54; 300 Å; Vydac). Los tampones de migración eran H2O con 0,05% de ácido trifluoroacético (TFA) y acetonitrilo con 0,05% de TFA. El caudal era de 1 ml/min. Los resultados se muestran en la Figura

3. Se puede observar a partir de la Figura 3 que las eficacias de la renaturalización del proNGF de tipo silvestre y mutante son idénticas.

Ejemplo 7. Purificación del mutante de proNGF SP174-101 a partir de la solución de renaturalización a través de una columna de material de modalidad mixta

Se usó una columna con un ligando de afinidad sintético, 4-mercapto-etil-piridina (MEP). La elución se realizó desplazando el valor de pH. Además, la elución se llevó a cabo con una baja concentración de sal que era beneficiosa para un diseño eficaz del procedimiento.

La columna se equilibró con arginina 0,75 M, EDTA 5 mM, pH 9,5. La reacción de renaturalización clarificada se cargó sobre la columna con MEP HyperCel (Pall) con una capacidad de carga máxima de 5 g de mutante de proNGF por L de medio de columna. En la etapa de lavado, la mayoría de las impurezas y la proteína no unida se redujeron mediante el uso de tampón GuaHCl 2 M, Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0 y Tris-HCl 10 mM, pH 8,0. La elución se realizó en un gradiente lineal de 0-70% de acetato 50 mM, pH 4,0 (caudal de 120 cm/h). La Figura 4 muestra un

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datos experimentales muestran con claridad que la escisión con tripsina del mutante de proNGF, SEQ ID NO: 5, da como resultado solamente un producto (beta-NGF) con un alto rendimiento de escisión (aproximadamente 85%) usando una relación baja entre tripsina y proteína (1/10.000). Esto se puede comparar con la escisión del proNGF de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) que muestra un bajo rendimiento de escisión (de solo aproximadamente 5%) con una relación baja entre tripsina y proteína (1/10.000) y una degradación elevada del producto (excesivamente digerido) con una relación alta entre tripsina y proteína (1/250).

Tabla 4

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Ejemplo 11. Ensayo de la actividad biológica de proNGF través de la estimulación de la proliferación de células TF1

Células TF1 (ATCC, n° de catálogo CRL2003) se cultivaron de acuerdo con unos procedimientos clásicos. Un medio de ensayo (90% de medio RPMI 1640, 10% de suero de bovino fetal FBS, 50 U/ml de penicilina y 50 µg/mL de estreptomicina) se añadió a las células y se centrifugó. El sedimento se suspendió de nuevo con una densidad de 1,5·105 células/ml en medio de ensayo a 37°C. La suspensión celular se mezcló con diferentes concentraciones de proteína proNGF (10-10 M, 3·10-10 M, 10-9 M, 3·10-9 M, 10-8 M, 3·10-8 M, 10-7 M, 3·10-7 M, 10-6 M, 3·10-6 M, 10-5 M y 3·10-5 M) y se analizaron en placas de 96 pocillos. Después de una incubación durante 48 h a 37°C, se añadió el reactivo de proliferación celular (por ejemplo, WST-1, Roche Applied Science, nº de cat. 1644807), y las placas se incubaron de nuevo durante 4 h a 37°C. La absorción se midió a 450 nm y el valor de CE50 se determinó mediante el uso de programas adecuados (por ejemplo, Sigma-Plot 2000).

Esta solicitud incluye además los siguientes elementos:

1.: Un mutante de proNGF en el que el sitio de escisión de la proteasa R1SK3R4 está sustituido al menos en las posiciones R1 y K3 correspondientes a las posiciones 101 y 103 de la secuencia de proNGF humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) por cualquier aminoácido seleccionado a partir de un aminoácido no básico e histidina.

2.: El mutante de proNGF según el apartado 1, en el que el sitio de escisión de la proteasa está sustituido en las posiciones 101 y 103 por cualquier aminoácido pero no por arginina o lisina.

3.: El mutante de proNGF según el apartado 1, en el que el sitio de escisión de la proteasa está sustituido en las posiciones 101 y 103 por cualquier aminoácido seleccionado a partir de alanina, glicina, valina, serina, treonina, metionina, tirosina, histidina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutámico, fenilalanina, isoleucina, leucina, triptófano, cisteína y prolina.

4.: El mutante de proNGF según el apartado 1, en el que el sitio de escisión de la proteasa está sustituido en las posiciones 101 y 103 por cualquier aminoácido seleccionado a partir de alanina, valina, glicina, serina, treonina, metionina, tirosina, histidina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutámico.

5.: El mutante de proNGF según el apartado 1, en el que el sitio de escisión natural de la proteasa está sustituido en las posiciones 101 y 103 por cualquier aminoácido seleccionado a partir de alanina y valina.

6.: El mutante de proNGF según los apartados 1 a 3, en el que el sitio de escisión de la proteasa está sustituido en la posición 101 por valina.

7.: El mutante de proNGF según los apartados 1 a 6, en el que el sitio de escisión de la proteasa está sustituido en la posición 103 por alanina.

8.: El mutante de proNGF según los apartados 1 a 7, en el que el aminoácido en la posición R4 que se corresponde con la posición 104 de la secuencia de proNGF humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) se selecciona a partir de arginina o lisina.

9.: El mutante de proNGF según los apartados 1 a 8, en el que el aminoácido sustituido en la posición 102 de la se

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Claims

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