IT201900014646A1 - Peptide neurotrofico resistente alle proteasi per il trattamento terapeutico di patologie neurodegenerative e/o cutanee - Google Patents

Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo: “Peptide neurotrofico resistente alle proteasi per il trattamento terapeutico di patologie neurodegenerative e/o cutanee”

DESCRIZIONE

La presente invenzione rientra nel campo dei trattamenti terapeutici delle patologie neurodegenerative, acute o croniche, dei traumi del sistema nervoso e delle patologie epiteliali/cutanee.

Le patologie neurodegenerative sono malattie di estrema rilevanza clinica ed epidemiologica, con un notevole impatto socio-economico, ma caratterizzate allo stesso tempo dalla mancanza di trattamenti terapeutici efficaci.

La malattia di Alzheimer, il morbo di Parkinson e la Corea di Huntington sono tra gli esempi più rappresentativi di forme neurodegenerative croniche che tendono ad instaurarsi ed aggravarsi con il progredire dell’età. Poiché sono associate ad una progressiva alterazione strutturale e funzionale del sistema nervoso centrale (SNC), tali patologie comportano un graduale e progressivamente invalidante deterioramento delle facoltà mentali e cognitive del paziente nonché delle sue funzioni motorie.

Processi neurodegenerativi si instaurano anche in seguito ad un danno cerebrale acuto che può essere di origine vascolare o traumatica. Tra questi, l’ictus ischemico rappresenta una delle principali cause di disabilità e morte nel mondo, e anche per questa patologia l’incidenza aumenta con l’aumentare dell’età. Nella maggioranza dei casi l’ictus è provocato da una trombosi delle arterie cerebrali principali. L’evento ischemico condivide diversi meccanismi fisiopatologici con il danno cerebrale da trauma (TBI, traumatic brain injury) che le statistiche indicano quale principale causa di morte tra gli individui di età inferiore ai 44 anni, ed entrambi questi fenomeni patologici scatenati da episodi acuti conducono a gravi deficit debilitanti di tipo sia motorio sia cognitivo.

Negli ultimi anni, un numero sempre crescente di evidenze sperimentali ha dimostrato che le patologie neurodegenerative acute e croniche, pur differendo sulla base dei sintomi, delle cause iniziali scatenanti e delle aree cerebrali interessate dal danno, presentano meccanismi patogenetici comuni i quali concorrono congiuntamente a determinare l’elevato grado di morte neuronale che caratterizza primariamente l’insorgenza e la progressione di queste patologie.

La proteina Nerve Growth Factor (NGF) rappresenta la prima neurotrofina ad essere stata identificata negli anni ‘50 e i suoi effetti biologici sulla proliferazione e sopravvivenza neuronale e sulla crescita delle fibre nervose sono ben noti. Il fattore NGF, al pari di altre proteine secrete, è sintetizzato a partire da un precursore proteico, il pro-nerve growth factor (proNGF), che può essere processato in neurotrofina matura all’interno della cellula da enzimi proteolitici, come ad esempio la furina, denominati pro-proteina convertasi o pro-convertasi o, alternativamente, può essere secreto e soggetto ad eventi proteolitici ad opera di proteasi extracellulari. La molecola proNGF è dotata di attività biologica propria e studi diversi hanno evidenziato un dualismo tra l’azione di questo precursore e quella della neutrofina matura (Fahnestock, M., et al. ProNGF: a neurotrophic or an apoptotic molecule? Prog Brain Res, 2004. 146: p. 101-10). Il proNGF può infatti esercitare un effetto neurotossico, legato all’attivazione del complesso recettoriale p75-sortilina, e pro-apoptotico, quest’ultimo responsabile di morte cellulare sia in condizioni fisiologiche, ad esempio durante lo sviluppo, che nel contesto di patologie neurodegenerative. Per contro, al NGF viene attribuito anche un ruolo neurotrofico, responsabile del differenziamento e del mantenimento delle caratteristiche fenotipiche di neuroni colinergici nel sistema nervoso centrale e catecolamminergici nel sistema nervoso periferico. Sinora nell’uomo sono state identificate due principali varianti del precursore proNGF: una variante cosiddetta “lunga”, composta di 296 amminoacidi, denominata proNGF-A, e una variante cosiddetta “corta” di lunghezza pari a 221 amminoacidi, denominata proNGF-B. La variante proNGF-B è stata la prima ad essere identificata mediante clonaggio del corrispondente gene codificante (Ullrich A et al.; Human beta-nerve growth factor gene sequence highly homologous to that of mouse Nature. (1983) 303(5920):821-5). Dalla porzione carbossi-terminale di questa proteina origina, per taglio proteolitico il fattore NGF maturo. Successivamente, le ricerche descritte in Soligo M. et al, 2019. Different responses of PC12 cells to different pro-nerve growth factor protein variants, Neurochem. Int., hanno rivelato la presenza della variante proNGF-A la cui sequenza codificante è accessibile sul database NCBI al seguente link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH358394.

Nella presente descrizione, detta sequenza codificante è designata come SEQ ID NO. 2.

Negli ultimi anni l’impiego del peptide NGF è stato posto al vaglio quale opportunità terapeutica per la cura delle malattie neurodegenerative, sulla base appunto del potenziale neurotrofico e neurotropico esercitato da questo peptide. Attualmente sono in corso studi clinici per verificare la potenziale applicazione terapeutica del peptide NGF nel campo oftalmologico, la cui efficacia terapeutica è stata già approvata per il trattamento delle cheratiti neurotrofiche. Recentemente il peptide NGF è stato anche impiegato nel trattamento di un grave caso clinico di trauma cerebrale, mediante somministrazione intranasale (Chiaretti, A., et al., 2017. Intranasal Nerve Growth Factor administration improves cerebral functions in a child with severe traumatic brain injury: A case report. Brain Inj 31, 1538-1547). L’impiego terapeutico di questa neurotrofina soffre però di alcune importanti limitazioni, che derivano dall’effetto iperalgesico del peptide NGF nonché dalla sua suscettibilità alla degradazione da parte delle proteasi di matrice extracellulare.

Nella domanda di brevetto IT102018000003279 è descritto l’impiego della variante proNGF-A per il trattamento terapeutico di patologie neurodegenerative, di natura acuta o cronica, e di patologie infiammatorie, reso possibile dalla significativa attività neuroprotettiva di cui detta variante è dotata nonché dai superiori profili di sicurezza farmacologici rispetto a NGF.

Nonostante, sulla base di quanto descritto in Soligo M. et al, 2019. Different responses of PC12 cells to different pro-nerve growth factor protein variants, Neurochem. Int., la variante proNGF-A mostri un’elevata resistenza all’azione delle proteasi di matrice extracellulare rispetto ai peptidi NGF e proNGF-B, caratteristica che ne consente la produzione ed isolamento in purezza, la sua produzione su larga scala mediante sistemi di espressione eterologhi, sia procariotici che eucariotici, risulta tuttavia particolarmente difficoltosa a causa della sensibilità del peptide proNGF-A all’azione delle proteasi endocellulari, chiamate pro-convertasi. Studi condotti dai presenti inventori hanno infatti rivelato che nella cellula produttrice, il peptide proNGF-A viene sottoposto ad una digestione proteolitica che determina la perdita di un frammento N-terminale di circa 60 aminoacidi di lunghezza, causandone la pericolosa conversione nella variante neurotossica proNGF-B (Figura 1, pannello di sinistra). Inoltre, nella cellula produttrice sia proNGF-A che proNGF-B vengono ulteriormente metabolizzati dalla proteasi furina con conseguente loro conversione, almeno parziale, nel peptide NGF (Bruno, M.A. et al., 2006. Activity-dependent release of precursor nerve growth factor, conversion to mature nerve growth factor, and its degradation by a protease cascade. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 6735-6740), unica variante proteica rilasciata ed identificabile nel mezzo di coltura (Figura 1, pannello di destra).

In tale contesto si pone pertanto la drammatica necessità dello sviluppo di strategie idonee a consentire un’efficiente produzione del peptide proNGF-A, più particolarmente una produzione su larga scala, preferibilmente su scala industriale, permettendo in tal modo l’impiego di detto peptide nel campo clinico-terapeutico e di sortire i benefici effetti della sua somministrazione.

Tale necessità è stata soddisfatta dai presenti inventori, i quali hanno isolato per la prima volta un nuovo mutante del peptide umano proNGF-A e trovato sorprendentemente che detto peptide mutante è dotato di particolare resistenza all’attacco da parte degli enzimi endocellulari pro-convertasi, impedendo in tal modo il suo processamento proteolitico nella variante proNGF-B neurotossica all’interno della cellula produttrice, pur mantenendo al contempo inalterate le proprietà e le funzioni biologiche del peptide nativo, in particolare la marcata attività neurotrofica e neuroprotettiva.

Forma quindi oggetto della presente invenzione un peptide isolato, da ora denominato human proNGF isoforma A A73Y/KG-RG (hproNGF-A A73Y/KG-RG), che consiste della sequenza amminoacidica SEQ ID NO. 3.

Il peptide hproNGF-A A73Y/KG-RG secondo l’invenzione è caratterizzato da un peso molecolare di 32-34 kDa, una elevata resistenza alla degradazione da parte delle proteasi extracellulari plasmina e metallo-proteasi di matrice (MMP) nonché alla degradazione da parte degli enzimi della famiglia delle pro-convertasi intracellulari denominate “proprotein convertases subtilisin/kexin-like(PCSK)1-9”, di cui fanno parte ad esempio gli enzimi furina, PC1/3, PC2, PC4 e PACE4. Il peptide oggetto dell’invenzione ha una lunghezza di 296 aminoacidi e un punto isoelettrico teorico di circa 9.5.

In confronto alla variante hproNGF-A nativa umana già nota, la cui sequenza aminoacidica è qui designata come SEQ ID NO. 1, il peptide secondo l’invenzione contiene tre sostituzioni amminoacidiche nella sua struttura primaria (Figura 2). Più specificamente, la sequenza amminoacidica del peptide mutato secondo l’invenzione, qui designata come SEQ ID NO. 3, comprende la sostituzione di un residuo di alanina con un residuo di tirosina in posizione 73 (A73Y), la sostituzione di un residuo di lisina con un residuo di glicina in posizione 175 (K175G), e la sostituzione di un residuo di arginina con un residuo di glicina in posizione 176 (R176G).

Come sarà descritto in dettaglio nella parte sperimentale che segue, i presenti inventori sono arrivati ad isolare il peptide hproNGF-A mutato dell’invenzione seguendo un approccio di mutagenesi sito specifica sequenziale basato sulla metodica della PCR, impiegando come templato per la reazione di amplificazione la sequenza nucleotidica codificante il peptide hproNGF-A nativo. Con tale approccio sono state generate una serie di sequenze codificanti recanti differenti mutazioni in posizioni diverse, la cui espressione in idonei sistemi cellulari ha condotto alla produzione dei corrispondenti peptidi hproNGF-A mutati. Sorprendentemente, l’analisi di questi mutanti ha rivelato un solo peptide proNGF-A strutturalmente stabile all’azione delle proteasi intracellulari. La successiva analisi della sequenza nucleotidica codificante detto peptide proNGF-A mutato ha mostrato per la prima volta la presenza di una combinazione unica di tre mutazioni puntiformi localizzate nelle regioni putativamente responsabili della trasformazione del peptide proNGF-A nel peptide proNGF-B, e della ulteriore trasformazione nel peptide NGF.

Rispetto alla sequenza nucleotidica nativa SEQ ID NO. 2, la sequenza di acido nucleico identificata per la prima volta dai presenti inventori è caratterizzata dal comprendere le seguenti mutazioni delle basi azotate: sostituzione di una guanina con una timina (transversione G>T) in posizione 217, sostituzione di una citosina con un’adenina (transversione C>A) in posizione 218, e sostituzione di una guanina con una timina (transversione G>T) in posizione 219, dette mutazioni corrispondendo, rispettivamente, alle sostituzioni aminoacidiche A73Y, K175G e R176G nel peptide hproNGF-A mutato come sopra definite (Figura 2).

Pertanto, formano ulteriore oggetto dell’invenzione una sequenza di acido nucleico isolata (cDNA) comprendente o consistente della SEQ ID NO. 4 e un peptide che è codificato dalla sequenza di acido nucleico SEQ ID NO:4.

Nell’ambito della presente invenzione rientra altresì un anticorpo monoclonale o policlonale isolato che lega specificamente il peptide mutato dell’invenzione. Le tecniche per l’ottenimento di anticorpi policlonali e monoclonali sono consolidate e l’esperto del settore è in grado di applicarle, senza dover ricorrere ad alcuna attività inventiva, in modo tale da ottenere l’anticorpo dell’invenzione.

Formano altresì oggetto della presente invenzione un vettore di espressione comprendente la sequenza di acido nucleico come sopra definita, ossia SEQ ID NO. 4, e opzionalmente comprendente altresì una sequenza promotore e una sequenza segnale di poliadenilazione, nonché una cellula ospite comprendente il suddetto vettore di espressione.

Vettori di espressione ricombinanti per l’impiego nella produzione di peptidi o proteine sono noti e descritti nello stato della tecnica, per cui la loro scelta e il loro impiego rientrano nelle capacità del tecnico medio del settore. Tali vettori possono essere procariotici od eucariotici. A titolo di esempio non limitativo si citano i vettori eucariotici per espressione in cellule di insetto quali pBacPAK8, pBacPAK9, pAcG2T, pAcHLT A, pAcHLT B, pAcHLT C, pAcGHLT A, pAcGHLT B, pAcGHLT C, pAcSG2, pBAC-1, pFastBac1, pFastBacHT, pFastBac-Dual, pAcP(+)IE1, pAcP(-)IE1, pAcUW31, pBAC-1, pBAC-2cp, pBAC-3, pBAC4x-1, pBAC-7, pBAC-8, pBAC-9, pBAC-10, pBacPAK8, pBacPAK9, pBACsurf-1, pBlueBac4.5, pBlueBacHis2, pMbac, pMelBac, pPbac, pTriEx-1, pVL1392, pVL1393. Alternativamente, il vettore secondo l’invenzione può essere idoneo per l’espressione nelle cellule di mammifero, ad esempio pcDNA3, pcDNA3.1(-),pcDNA3.1(-)_myc-His A, pcDNA3.1(-)_myc-His B, pcDNA3.1(-)_myc-His C, pcDNA3.1(+), pcDNA3.1(+)_myc-His A, pcDNA3.1(+)_myc-His B, pcDNA3.1(+)_myc-His C, pcDNA3.1/Hygro(-), pcDNA3.1/Hygro(+), pcDNA3.1/V5-His A, pcDNA3.1/Zeo (-), pcDNA3.1/Zeo (+), pcDNA3.1+C-6His, pcDNA3.1+C-DYK, pcDNA3.1+C-DYK-P2A, pcDNA3.1+C-HA, pcDNA3.1+C-Myc, pcDNA3.1+N-6His, pcDNA3.1+N-DYK-P2A, pcDNA3.1+N-GST, pcDNA3.1+N-HA, pcDNA3.1+N-Myc, pcDNA3.1-C-eGFP, pcDNA3.1-N-eGFP, pcDNA3.1-P2A, pcDNA3.1-P2A-eGFP, pcDNA5/FRT, pcDNA5-TOpcDNA6/V5-His A, pCI-Neo, pCMV-3Tag-1°, pCMV-3Tag-1a-P2A, pCMV-3Tag-2°, pCMV-3Tag-3°, pCMV-3Tag-3a-P2ApCMV-3Tag-4°, pEGFP-N1, pGen2.1, pGL3-Basic, pGL4.10[luc2], pGL4.14[luc2/Hygro], pGL4.17, pHLSec, pBABE, pBABE-puro, ). In alternativa, il vettore per l’impiego secondo l’invenzione può essere idoneo per l’espressione nelle cellule di lievito, ad esempio pETCON, pYES2, pAO815, pGAPZ, pGAPZa, pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K, pPIC9K, pPICZ, pPICZa, o per l’espressione nelle cellule batteriche, ad esempio pBluescript II KS(-), pBluescript II KS(+), pBluescript II SK(-), pBluescript II SK(+), pBluescript SK(+), pCDFDuet-1, pCOLADuet-1, pColdII, pET-11°, pET-11b, pET-11c, pET-11d, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b, pET-19bpET-20b(+), pET-21a(+), pET-21b(+), pET-21d(+), pET-22b(+)pET-23a(+), pET-24a(+), pET-24b(+), pET-24c, pET-24c(+), pET-24d , pET-24d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a(+), pET-28b(+), pET-28c(+), pET-29a(+), pET-29b(+), pET-29c(+), PET-30a(+), PET-30b(+), PET-30c(+), PET-31b(+), pET-32a(+), pET-32b(+), pET-3°, pET-3b, pET-3c, pET-3d, pET-41a(+), pET-41b(+), pET-41c(+), pET-42a(+), pET-42b(+), pET-42c(+), pET-43.1a(+), pET-43.1b(+), pET-45b(+), pET-50b(+), pET-51b(+), pET-52b(+), pET-9°, pETDuet-1, pGEX-2TK, pGEX-4T-1, pGEX-4T-1-H(RBS), pGEX-4T-1-M(RBS), pGEX-4T-2pGEX-4T-3, pGEX-5X-1, pGEX-5X-1-H(RBS), pGEX-5X-1-M(RBS), pGEX-5X-2, pGEX-5X-3, pGEX-6P-1, pGEX-6P-1-H(RBS), pGEX-6P-1-M(RBS), pGEX-6P-2, pGEX-6P-3, pGS-21°, pMAL-c4x, pMAL-c4x-1-H(RBS), pMAL-c4x-1-M(RBS), pMAL-c5E, pMAL-c5x, pMAL-p5E, pMAl-p5g, pMAl-p5x, pQE-1, PQE30, pQE32, pQE-60, pRSFDuet-1, pUC18, pUC19.

Allo scopo di operare il clonaggio della sequenza nucleotidica codificante il peptide mutato secondo l’invenzione in un vettore idoneo come sopra descritto, possono essere impiegate reazioni di restrizione, sia con tecnologie blunt-end, ad esempio il Topo-cloning, sia attraverso metodologie quali il TA cloning, GATEWAY Cloning Technology, In-Fusion, Ligation independent cloning (LIC), Di- o multi-cistronic cloning, GenEZ™ cloning. In aggiunta, possono essere impiegate sequenze tags all’estremità N- e/o C-terminale nonché specifiche sequenze promotore e specifiche sequenze segnale di poliadenilazione.

Preferibilmente, il sistema cellulare impiegato per l’espressione del vettore di espressione dell’invenzione è scelto tra sistemi eucariotici, ad esempio cellule di insetto quali SF-9, SF-21, High Five, Mimic, Drosophila S2, cellule di lievito, ad esempio S. cerevisiae e Pichia pastoris, cellule di mammifero, ad esempio cellule CHO, BHK, HeLa, Hek293, cellule di protozoi parassiti, come Leishmania tarentolae. Alternativamente, il sistema cellulare di espressione può essere un sistema procariotico, ad esempio cellule batteriche di E. coli.

Forma oggetto della presente invenzione anche un procedimento per la preparazione del peptide mutato dell’invenzione, secondo il quale la cellula ospite trasformata viene coltivata in condizioni idonee e per un tempo sufficiente per l’espressione del peptide dell’invenzione. Tipicamente le condizioni ed i tempi di coltura idonei dipendono dal sistema cellulare impiegato e possono riguardare, ad esempio, la composizione del mezzo di coltura, il pH, l’umidità relativa, la componente gassosa di O2 e CO2, nonché la temperatura. La selezione delle condizioni e dei tempi di coltura più idonei ad essere impiegati nel procedimento dell’invenzione rientra ampiamente nelle conoscenze e capacità del tecnico medio del settore.

In una forma di realizzazione preferita, il procedimento secondo l’invenzione prevede in aggiunta il passaggio di recuperare dalla coltura cellulare il peptide prodotto. Il passaggio di recupero può essere condotto impiegando metodiche di purificazione proteica che fanno parte della tecnica nota, ad esempio attraverso la denaturazione, solubilizzazione e/o rinaturazione della proteina, oppure mediante uno o più passaggi cromatografici e/o di desalting oppure mediante ultrafiltrazione, dialisi e/o liofilizzazione.

Come verrà illustrato più in dettaglio nella parte sperimentale che segue, i presenti inventori, mediante studi condotti in vitro, hanno dimostrato che il peptide mutato secondo l’invenzione ha la capacità di resistere all’azione delle proteasi intracellulari e di mantenere intatta la sua struttura primaria nel corso degli eventi metabolici che portano alla sua sintesi, preservando al contempo la minore sensibilità alle proteasi della matrice extracellulare caratteristica della variante nativa.

Il peptide dell’invenzione risulta pertanto particolarmente idoneo ad essere prodotto secondo metodologie impiegate nelle officine farmaceutiche e ad essere impiegato nel trattamento terapeutico di una patologia neurodegenerativa e/o neurotraumatica e/o epiteliale/cutanea.

Nell’ambito degli eventi patologici scatenati da un insulto cerebrale acuto che può essere di natura traumatica o vascolare, si citano ad esempio, ma non esclusivamente: ictus cerebrale (ischemico ed emorragico), lesioni cerebrali da trauma cranico, ipertensione intracranica, edema intracranico, ipossia/ischemia (perinatale, pediatrica o nell’adulto), ipossia/ischemia da arresto cardiocircolatorio, da annegamento o da ipotermia.

Con riferimento ai quadri patologici neurodegenerativi di natura cronica, si citano ad esempio, anche se non esclusivamente: la malattia di Alzheimer, il morbo di Parkinson e la Corea di Huntington, la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), la paralisi sopranucleare progressiva, la demenza frontotemporale, la demenza da corpi di Lewy, la Malattia di Creutzfeldt-Jakob (MCJ), la Malattia di Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS).

Tra le patologie degli epiteli e della cute si annoverano, ma non a titolo limitativo, ulcere cutanee secondarie a diabete, a polineuropatie periferiche, a quadri di scompenso neurologico secondari a sviluppo anomalo del sistema nervoso (spina bifida), ulcere della cute dovute a malattie infettive (lebbra, AIDS), ulcere dell’epitelio corneale secondarie a traumi o su base neurotrofica (cheratiti neurotrofiche), ulcere cutanee secondarie a vasculiti e a malattie infiammatorie croniche cutanee.

In una forma di realizzazione preferita, il peptide per l’impiego secondo l’invenzione è particolarmente idoneo per il trattamento terapeutico di una patologia scelta dal gruppo che consiste di ictus cerebrale (ischemico ed emorragico), lesioni cerebrali da trauma cranico, ipertensione intracranica, edema intracranico, ipossia/ischemia (perinatale, pediatrica o nell’adulto), ipossia/ischemia da arresto cardiocircolatorio, da annegamento o da ipotermia, la Corea di Huntington, la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), la paralisi sopranucleare progressiva, la demenza frontotemporale, la Malattia di Creutzfeldt-Jakob (MCJ), la Malattia di Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS), le vasculiti, le malattie infiammatorie croniche cutanee.

Nell’ambito dell’invenzione rientra inoltre una composizione farmaceutica comprendente il peptide come definito nelle annesse rivendicazioni 1 o 2, in combinazione con veicoli, eccipienti e/o diluenti farmaceuticamente accettabili.

La composizione farmaceutica per l’impiego secondo l’invenzione può essere formulata in qualsivoglia forma idonea ad esempio per la somministrazione per via enterale (orale o gastroenterica, rettale, sublinguale), via parenterale (percutanea, inalatoria, oculare, intravenosa, intra-arteriosa, intramuscolare, intradermica, intranasale, sottocutanea, intraperitoneale), via topica (contatto diretto del farmaco con il sito d’azione e/o con la cute e/o con le mucose e/o con la superficie oculare). Naturalmente la scelta dei veicoli, eccipienti e/o diluenti idonei è effettuata in dipendenza della forma di somministrazione desiderata e tale scelta rientra nelle capacità del tecnico medio del settore.

La parte sperimentale che segue è fornita a scopo puramente illustrativo e non limitativo della portata dell’invenzione come definita dalle annesse rivendicazioni. Nella parte sperimentale viene fatto riferimento ai disegni annessi, in cui:

La Figura 1 mostra i lisati cellulari (pannello di sinistra) ed i mezzi condizionati (pannello di destra) di cellule produttrici, in cui è stato fatto esprimere rispettivamente il vettore vuoto (linea 2), il vettore contenente la sequenza nucleotidica codificante il proNgf-A nativo (“proNgf-A wt”, linea 3) oppure il vettore contenente la sequenza nucleotidica codificante proNgf-B nativo (“proNgf-B wt”, linea 4), confrontati con i lisati da cellule non trasfettate (linea 1).

La Figura 2 riporta un disegno schematico della struttura della proteina pre-proNGF-A evidenziando la porzione comune al peptide proNGF-B. Sono, inoltre, indicate le posizioni dove occorrono le mutazioni aminoacidiche A73Y, K175G e R176G, localizzate nelle regioni all’interfaccia tra proNGF-A e proNGF-B e tra proNGF-A e NGF maturo, e le corrispondenti mutazioni nucleotidiche, secondo quanto riassunto nella tabella in basso della stessa figura.

La Figura 3A mostra microfotografie di cellule produttrici trasfettate rispettivamente con il vettore vuoto (prima immagine da sinistra), il vettore contenente la sequenza nucleotidica codificante il proNgf-A nativo (seconda immagine da sinistra) e quello contenente la sequenza nucleotidica codificante il proNgf-A A73Y/KG-RG (terza immagine da sinistra). La figura 3B mostra i lisati cellulari di cellule produttrici trasfettate con il plasmide che esprime il proNgf-A nativo, il plasmide che esprime il proNgf-A contenente soltanto le mutazioni KG-RG ed il plasmide che esprime il proNgf-A contenente le mutazioni A73Y/KG-RG.

La Figura 4 mostra i risultati dei sequenziamenti Sanger che hanno condotto all’identificazione nella sequenza nucleotidica codificante il peptide proNGF-A delle mutazioni corrispondenti a A73Y (in basso a sinistra) e KG-RG (a destra), evidenziando le sostituzioni nucleotidiche.

La Figura 5, pannello superiore, mostra la sequenza nucleotidica mutata del proNgf-A A73Y/KG-RG nella fase del processo che prevede il suo inserimento nel bacmide (SEQ ID NO. 11). Nel pannello inferiore è invece mostrato il risultato del sequenziamento Sanger, necessario per appurare il corretto inserimento e orientamento del proNgf-A A73Y/KG-RG nel bacmide rispetto alla sequenza di riconoscimento e taglio per l’enzima TEV e a quella della sequenza 6xHis, necessaria durante la fase di purificazione. La Figura 6A, a sinistra, mostra i prodotti ottenuti dopo cromatografia Ni-Sephasore dei peptidi proNGF-A nativo (“proNGF-A wt”) (A) e proNGF-A A73Y/KG-RG (B). Nel pannello A, a destra, sono inoltre riportati i risultati delle analisi densitometriche relative ai due prodotti ottenuti. La figura 6B mostra il prodotto finale ottenuto dopo la seconda cromatografia SP-Sepharose (A = proNGF-A nativo; B = proNGF-A A73Y/KG-RG).

La Figura 7 mostra la cinetica di permanenza nel mezzo di coltura del peptide NGF (pannello a sinistra) e del peptide proNGF-A A73Y/KG-RG (pannello a destra) utilizzati per trattare cellule PC12.

La Figura 8A mostra una serie di microfotografie indicative del differenziamento di cellule PC12 dopo esposizione a terreno senza siero (prima foto da sinistra), a NGF (seconda foto da sinistra) o a proNGF-A A73Y/KG-RG (terza foto da sinistra). L’istogramma in figura 8B riporta la percentuale di sopravvivenza di cellule PC12 mantenute in terreno senza siero e non trattate (prima barra da sinistra, trattate con il peptide NGF (seconda barra da sinistra) oppure trattate con il peptide proNGF-A A73Y/KG-RG (terza barra da sinistra).

ESEMPIO 1: produzione di hproNGF-A A73Y/KG-RG da parte di sistema eterologo

I presenti inventori hanno condotto un approccio di mutagenesi sito specifica sequenziale allo scopo di generare nella sequenza nucleotidica codificante hproNGF-A (SEQ ID NO. 2) mutazioni capaci di modificare l’interazione di questa proteina con gli enzimi proteolitici endocellulari (pro-convertasi) responsabili della conversione di hproNGF-A nella variante neurotossica hproNGF-B all’interno della cellula produttrice. Sono state ottenute sequenze nucleotidiche codificanti contenenti diverse combinazioni delle singole mutazioni puntiformi.

Dette sequenze mutate sono state clonate in un vettore di espressione idoneo, ed i vettori ricombinanti così ottenuti sono stati poi testati, mediante trasfezione, in cellule contenitore (ad esempio cellule HeLa o Hek 293, come descritto nel successivo Esempio 2), per la loro capacità di produrre una proteina in forma integra e che venga rilasciata in tale forma nel mezzo di coltura.

L’analisi condotta dai presenti inventori ha rivelato sorprendentemente che soltanto il costrutto ricombinante che esprime un peptide contenente la mutazione inserita nella posizione 73 della sequenza nativa di hproNGF-A (SEQ ID NO. 1) - attraverso conversione dell’amminoacido alanina in tirosina (A73Y) -, in associazione con la doppia mutazione K175G/R176G – in cui la lisina 175 è sostituita con una glicina e l’arginina 176 è sostituita con una glicina - ha preservato la capacità di essere espresso e sintetizzato all’interno della cellula, così come nel caso del hproNGF-A nativo, non mutato (“hproNGF-A wt”) (Figura 3, pannello A).

Tale costrutto è risultato inoltre essere capace di far produrre alle cellule contenitore un peptide corrispondente a hproNGF-A in termini di peso molecolare (Western blot, Figura 3, pannello B).

ESEMPIO 2: mutazione della sequenza codificante il peptide hproNGF-A

Allo scopo di introdurre una o più mutazioni nella sequenza codificante il peptide hproNGF-A, è stata allestita una reazione PCR secondo quanto previsto nelle istruzioni di uso del kit QuikChange II site-directed Mutagenesis prodotto da Agilent Technologies (#200523). Sono state impiegate coppie di primers diretto (“forward”) e inverso (“reverse”) complementari alla regione in cui introdurre la mutazione, per l’amplificazione dell’intero vettore d’espressione contenente la sequenza codificante hproNGF-A. Per l’inserimento di tre mutazioni sono state, quindi, condotte due PCR sequenziali utilizzando di volta in volta coppie di primers aventi le sequenze di seguito riportate:

Primer A73Y diretto (A73Y Forward):(SEQ ID NO. 5) 5’-GCTTTTCTGATCGGCATACAGTATGAACCACACTCAGAGAGCAAT-3’

Primer A73Y inverso (A73Y Reverse): (SEQ ID NO. 6) 5’-ATTGCTCTCTGAGTGTGGTTCATACTGTATGCCGATCAGAAAAGC-

3’

Primer K175G/R176G diretto (K175G/R176G Forward): (SEQ ID NO. 7)

5’-CAGGACTCACAGGAGCGGGGGGTCATCATCCCATCC -3’ Primer K175G/R176G inverso (K175G/R176G Reverse): (SEQ ID NO. 8)

5’-GGATGGGATGATGACCCCCCGCTCCTGTGAGTCCTG-3’.

Dopo aver effettuato i processi di mutagenesi sequenziale, i risultanti vettori di espressione contenenti gli hproNGF-A mutati sono stati utilizzati per trasformare attraverso il metodo “heat-shock”, cellule batteriche XL1-Blue altamente competenti nel ricevere ed amplificare il DNA plasmidico di interesse. I batteri trasformati sono stati poi seminati su piastre Petri contenenti terreno di coltura solido a base di agarosio ed addizionato con l’antibiotico ampicillina, necessario per la selezione dei batteri ricombinanti, che hanno incorporato attraverso il plasmide anche il gene della resistenza a questo antibiotico. Un’incubazione per una notte a 37°C è stata sufficiente a permettere la crescita di colonie batteriche resistenti all’ampicillina contenuta nel terreno solido di coltura. Le colonie sono state, quindi, prelevate ed utilizzate per l’isolamento del DNA plasmidico utilizzando il kit PureLink<® >HiPure Mini Plasmid Purification Kit (Numero di catalogo: K210002 Thermo Scientific) e seguendo le istruzioni fornite con il kit. È stato, quindi, possibile purificare tali prodotti e verificare le mutazioni inserite mediante analisi di sequenziamento Sanger, come mostrato in Figura 4, effettuata presso una compagnia di servizi altamente specializzata (Sequencing Core Facilities of Eurofins Genomics - Ebersberg, Germany).

ESEMPIO 3: Costruzione di un sistema di espressione Baculovirus per la produzione del peptide hproNGF-A A73Y/KG-RG

Il plasmide contenente la sequenza di DNA mutata codificante per il peptide hproNGF-A A73Y/KG-RG è stato sottoposto ad amplificazione mediante PCR impiegando una coppia di primer specifici (primer di clonaggio) disegnati come segue:

Primer diretto (Forward): 5’ ATGGCCTCATCTAATGGACA 3’ (SEQ ID NO. 9)

Primer inverso (Reverse): 5’ GGCTCTTCTCACAGCCTT 3’ (SEQ ID NO. 10)

Il prodotto di amplificazione è stato poi inserito in un plasmide vettore specifico, pFastBac ™ /CT-TOPO<®>, linearizzato e contenente Vaccinia virus DNA topoisomerasi I legata covalentemente all'estremità 3' di ciascun filamento di DNA (riferito come vettore "attivato TOPO<®>") utilizzando il Bac-to-Bac<® >C.HIS TOPO<® >Cloning Kit commercializzato da Thermo Scientific (Numero di catalogo: A11098) seguendo le istruzioni fornite con il prodotto. L’inserimento del frammento codificante nel plasmide è stato ottenuto in provetta tramite ricombinazione blunt-end catalizzata dall’enzima topoisomerasi. Attraverso la reazione sopradescritta, è stato ottenuto un plasmide codificante il peptide secondo l’invenzione, a cui è stata aggiunta una “coda” (tag) di sei residui dell’amminoacido istidina (6xHis), necessari nelle fasi di purificazione della proteina ricombinante.

Il prodotto della reazione è stato poi utilizzato per trasformare con il metodo “heatshock” batteri One Shot<® >Mach1™ T1R E. coli chimicamente competenti, utilizzati per la moltiplicazione del plasmide vettore, seguendo le istruzioni contenute nel Bac-to-Bac<® >C-HIS TOPO<® >Cloning Kit (numero di catalogo: A11098, Thermo Scientific). I batteri trasformati sono stati poi seminati su piastre Petri contenenti terreno solido a base di agarosio addizionato di ampicillina, necessaria per la selezione dei batteri ricombinanti, che hanno incorporato attraverso il plasmide anche il gene della resistenza a questo antibiotico. Dopo il tempo necessario per la crescita batterica (una notte a 37°C), sono state selezionate le colonie resistenti all’ampicillina, che sono state prelevate ed utilizzate per l’isolamento del DNA plasmidico utilizzando il kit PureLink<® >HiPure Mini Plasmid Purification Kit (Numero di catalogo: K210002 Thermo Scientific), seguendo le istruzioni contenute nel kit. L’analisi della correttezza della direzionalità di inserzione è stata effettuata mediante sequenziamento dei cloni di espressione con i primer forniti nel kit di clonaggio presso la “Sequencing Core Facilities of Eurofins Genomics” (Ebersberg, Germany) (Figura 5). Il plasmide purificato è stato utilizzato per trasformare, mediante “heat shock”, cellule batteriche competenti MAX Efficiency<® >DH10Bac™, fornite con il kit Bac-to-Bac<® >TOPO<® >Expression System (Numero di catalogo: A11100, Thermo Fisher). Queste cellule, attraverso le proteine codificate da un plasmide helper in esse contenuto, effettuano una ricombinazione incorporando il plasmide pFastBac ™ /CT-TOPO<® >in un plasmide più grande, denominato bacmide, che viene successivamente incorporato per trasfezione in cellule di insetto (SF-9), rendendole abili a produrre un baculovirus ricombinante contenente la sequenza che codifica hproNGF-A. Dopo la reazione di ricombinazione le cellule batteriche sono state coltivate in terreno liquido LB-AGAR secondo le istruzioni fornite con il kit e successivamente il bacmide da queste prodotto è stato purificato utilizzando il PureLink™ HiPure Plasmid Maxiprep Kit (Numero di catalogo: K210007, Thermo Scientific) seguendo le istruzioni ivi incluse. La presenza e il corretto orientamento della sequenza di DNA codificante per il peptide secondo l’invenzione è stata verificata mediante PCR con i primer di sequenziamento specifici presenti nel kit Bac-to-Bac<® >TOPO<® >Expression System (Numero di catalogo: A11100 Thermo Fisher).

ESEMPIO 4: Produzione del peptide hproNGF-A A73Y/KG-RG nelle cellule SF-9

Il bacmide ottenuto come descritto nell’Esempio 3 è stato usato per trasfettare, mediante il reagente Cellfectin<® >II (Numero di catalogo: 10362100, Thermo Scientific), cellule di insetto SF-9 coltivate in medium serum-free SF-900 II SFM (Numero di catalogo: 10902088, Thermo Scientific).

Allo scopo è stata seguita la metodologia indicata nel protocollo di utilizzo del reagente Cellfectin<® >II (Numero di catalogo: 10362100, Thermo Scientific) e nel Bac-to-Bac<® >TOPO<® >Expression System (Numero di catalogo: A11100, Thermo Fisher).

Dopo un tempo di circa 72 ore successivo alla trasfezione, il terreno di coltura delle cellule, contenente il baculovirus ricombinante generato dalle cellule stesse, è stato chiarificato per centrifugazione e sottoposto a plaque assay, secondo quanto descritto nelle istruzioni del kit Bac-to-Bac® TOPO® Expression System (Numero di catalogo: A11100, Thermo Fisher), per verificare il titolo infettivo del virus prodotto. Dopo aver verificato che il virus avesse un titolo minimo di 107 CFU, questo primo stock virale (P1) è stato utilizzato per infettare una quantità più grande di cellule SF-9 che hanno prodotto con modalità analoghe a quelle sopra descritte un secondo stock virale (P2) e contestualmente hanno espresso il peptide hproNGF-A A73Y/KG-RG ricombinante che è stato rilasciato nel mezzo di coltura e purificato come descritto di seguito.

ESEMPIO 5: Purificazione del peptide hproNGF-A A73Y/KG-RG

Per la purificazione del peptide secondo l’invenzione, il terreno di coltura, proveniente da cellule SF9, è stato centrifugato a 10000g per 45 minuti e filtrato con filtri 0,2 micron a bassa ritenzione di proteine (Millex GP, Millipore), per rimuovere le particelle virali e/o i frammenti cellulari, ed è stato messo a contatto con una resina Ni-Sepharose (GE-Healthcare), che lega selettivamente i frammenti di 6xHis presenti all’estremità C-terminale della proteina ricombinante. La resina, equilibrata con tampone fosfato 20 mM 0,5M NaCl 30 mM Imidazolo (tampone di legame), e il medium di coltura sono stati miscelati in rapporto 1:5 v/v e lasciati in agitazione orbitale a 200 rpm per una notte a 4°C, per permettere ai residui 6xHIS di legarsi ai gruppi attivati presenti sulla resina. Dopo il legame, la resina è stata impaccata in una colonna cromatografica (XK 16/20, GE Healthcare) ed è stato effettuato un lavaggio con 5 volumi di colonna mediante il tampone di legame. La proteina è stata quindi eluita applicando alla colonna un gradiente da 30 mM a 500 mM di imidazolo in 20 volumi di colonna. La proteina eluita è stata dializzata contro acqua ultrapura per 24 ore, quindi il materiale dializzato è stato congelato e sottoposto a liofilizzazione.

Dopo la liofilizzazione, la proteina è stata risospesa alla concentrazione di 1 mg/ml in apposito buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5 150 mM NaCl 0,5 mM EDTA 1 mM DTT) e successivamente la proteasi Tobacco Etch Virus (TEV) protease (Catalog Number T4455, Sigma Aldrich) è stata aggiunta in rapporto 100U di proteasi per ogni milligrammo di proteina. La reazione mediata dalla proteasi TEV serve a rimuovere la coda (tag) di 6xHIS, legata all’estremità C-terminale della proteina attraverso un piccolo ponte di aminoacidi contenete il sito riconosciuto dalla proteasi TEV. Per la reazione di taglio enzimatico, la miscela di reazione è stata incubata a 30°C per due ore, e successivamente è stata dializzata contro tampone fosfato 20 mM 0,5 M NaCl 30 mM Imidazolo (tampone di legame) per una notte. Il dializzato è stato quindi caricato su una resina Ni-Sepharose (GE-Healthcare), che lega selettivamente i frammenti di 6xHis presenti all’estremità N-terminale della proteina TEV ricombinante. La resina, equilibrata con tampone fosfato 20 mM 0,5M NaCl 30 mM Imidazolo (tampone di legame), e il dializzato sono stati miscelati nel rapporto 1:5 v/v e lasciati in agitazione orbitale a 200 rpm per 4 ore a 4°C, per permettere ai residui 6xHis della TEV di legarsi ai gruppi attivati presenti sulla resina. Dopo il legame, la resina è stata impaccata in una colonna cromatografica (PD10, GE Healthcare) ed è stato effettuato un lavaggio con 5 volumi di colonna mediante il tampone di legame. In questo lavaggio è presente il peptide hproNGF-A A73Y/KG-RG umano ricombinante a cui sono stati eliminati i frammenti C-terminali 6xHis. La proteina eluita è stata dializzata contro acqua ultrapura per 24 ore, quindi il materiale dializzato è stato congelato e sottoposto a liofilizzazione.

Il liofilizzato è stato risospeso in Sodio Acetato 25 mM pH 5,0 NaCl 0,2 M per una notte. Il dializzato è stato quindi caricato su una colonna SP-Sepharose FF 16/10 (GE Healthcare) per purificare ulteriormente il peptide hproNGF-A A73Y/KG-RG mediante cromatografia a scambio cationico. Dopo il carico in colonna ed un lavaggio con 10 volumi di colonna con buffer sodio Acetato 25 mM pH 5,0 NaCl 0,2 M, il peptide hproNGF-A A73Y/KG-RG è stato eluito con un gradiente 0,2-1 M di NaCl in 20 volumi di colonna. Il picco cromatografico corrispondente al peptide hproNGF-A A73Y/KG-RG è stato raccolto, dializzato per 24 ore contro 20 litri di acqua ultrapura e successivamente congelato e liofilizzato.

L’analisi della purezza e specificità della proteina purificata è stata effettuata attraverso SDS-PAGE, e Western blot.

In breve, un totale di 1 μg di proteina purificata è stato trattato con tampone di caricamento 4X (62,5 mM Tris HCl pH 6,8, 20% (v/v) glicerolo, 8% (p/v) SDS, 0,025% (w/v) blu di bromofenolo e ditiotreitolo 100 mM) e scaldato a 90°C per 5 minuti. I campioni sono stati risolti con SDS-PAGE in un gel di poliacrilammide a gradiente 8-12% mediante elettroforesi a 25-30 mA nel tampone di corsa (25 mM Tris HCl, 190 mM Glicina regolato a pH 8,3 e 0,1% (v/v) SDS). Dopo l’elettroforesi, il gel è stato trasferito su una membrana di nitrocellulosa per una notte a 30 V in tampone di trasferimento (Tris HCl 25 mM, glicina 190 mM regolata a pH 8,3 e 20% (v/v) metanolo) per effettuare il Western blot. Le membrane su cui sono state trasferite le proteine dal gel di poliacrilammide sono state sciacquate in PBS 1% Tween 20 (T-PBS), bloccate in T-PBS contenente 5% di latte liofilizzato non grasso per 1 ora a temperatura ambiente e quindi incubate con anticorpi primari appropriati, per una notte a 4°C. Le membrane sono state quindi lavate estesamente in T-PBS a temperatura ambiente ed incubate con anticorpo secondario coniugato a perossidasi di rafano (HRP). Dopo l’incubazione, il legame dell’anticorpo secondario al primario è stato rilevato con il sistema di chemiluminescenza potenziato (cod WBKLS0500, Millipore)(Figura 6).

Come illustrato nella Figura 6A, la produzione condotta in parallelo del peptide hproNGF-A nativo mediante le procedure sperimentali come sopra descritte ha conseguito rese estremamente basse, di circa 10 volte inferiori a quelle ottenute con il peptide mutato dell’invenzione. Infatti, a parità di materiale di partenza (stessa quantità di mezzo di coltura di cellule SF-9 infettate con baculovirus ricombinante), la resa viene fortemente condizionata dalla degradazione a cui è sottoposto il peptide hproNGF-A nativo prima di essere rilasciato. Quindi, nonostante al termine del processo di purificazione sopradescritto sia possibile ottenere entrambi i peptidi, nativo e mutato, isolati con soddisfacente purezza (Figura 6B), la quantità di hproNGF-A A73Y/KG-RG risulta essere di un ordine di grandezza 10 volte superiore a quella del hproNGF-A nativo.

Nella Figura 6A viene infatti riportata l’analisi densitometrica su Western blot di purificati hproNGF-A wt e hproNGF-A A73Y/KG-RG, dalla quale si evince che quasi il 90% della proteina hproNGF-A A73Y/KG-RG rimane integra a seguito della cromatografia su colonna Ni-Sepharose, mentre solo il 9% di hproNGF-A nativo rimane nella sua forma a 34 kDa, poiché nella cellula produttrice si generano diversi frammenti di peso molecolare, di circa 17, 13 e 6 kDa, che rappresentano la prevalenza del materiale NGF-immunoreattivo identificabile dopo cromatografia su colonna Ni-Sepharose.

ESEMPIO 6: Analisi comparativa tra il peptide hproNGF-A A73Y/KG-RG ed il fattore NGF maturo Allo scopo di valutare la resistenza dei peptidi hproNGF-A A73Y/KG-RG e NGF maturo all’azione delle proteasi extracellulari, cellule di feocromocitoma di ratto (PC12) sono state stimolate con l’uno o l’altro peptide. Campioni prelevati dai mezzi condizionati delle colture cellulari in tempi successivi (tempo zero; dopo 4, 8 e 24 ore dalla stimolazione) sono stati sottoposti ad analisi Western blot allo scopo di verificare la permanenza dei peptidi hproNGF-A A73Y/KG-RG e NGF nel mezzo di coltura.

L’analisi ha rivelato che il fattore NGF ha una permanenza non superiore alle 8 ore dallo stimolo, (Figura 7, pannello di sinistra) mentre il peptide hproNGF-A A73Y/KG-RG è ancora presente nel mezzo di coltura dopo 24 ore dallo stimolo (Figura 7, pannello di destra). Questi risultati dimostrano chiaramente la significativa minore suscettibilità del peptide hproNGF-A A73Y/KG-RG all’azione delle proteasi extracellulari rispetto al peptide mNGF.

ESEMPIO 8: Valutazione dell’attività biologica del peptide proNGF-A A73Y/ KG-RG.

Allo scopo di condurre un’analisi comparativa tra l’attività biologica del peptide proNGF-A A73Y/ KG-RG secondo l’invenzione e l’attività del peptide NGF, è stato eseguito uno studio in vitro mediante l’uso di cellule PC12, che differenziano in fenotipo neuronale a contatto con fattori neurotrofici quali, ad esempio, il peptide NGF.

Le cellule PC12 sono state coltivate nel terreno di coltura RPMI 1640 integrato con siero di cavallo al 10% e siero di vitello al 5% in un'atmosfera umida del 5% di CO2 a 37 ° C. Le cellule sono poi state seminate su piastre a 6 pozzetti contenenti poli-L-lisina, per permettere l'adesione cellulare al fondo del pozzetto. Le cellule sono state lavate tre volte per eliminare qualsiasi traccia di siero, mantenute nel terreno di coltura senza siero per un’ora e poi esposte a terreno senza siero contenente 100 ng/ml di mNGF o 250 ng/ml di hproNGF-A A73Y/KG-RG. Gli stimoli sono stati somministrati alle colture cellulari tutti i giorni per 5 giorni nelle condizioni di coltura sopradescritte. Dopo i cinque giorni di trattamento sia le cellule esposte a NGF che quelle esposte a hproNGF A-A73Y/KG-RG hanno emesso i caratteristici prolungamenti (neuriti) che testimoniano l’avvenuto differenziamento neuronale (come illustrato nella Figura 8A).

Inoltre, il test di vitalità effettuato esponendo le cellule PC12 in sospensione alle condizioni di coltura descritte in precedenza ha evidenziato che, a 48 ore dallo stimolo, sia il peptide NGF che il peptide hproNGF-A A73Y/KG-RG secondo l’invenzione mantengono una quota rilevante di cellule vive dopo deprivazione da siero, testimoniando la loro azione neuroprotettiva (come illustrato nell’istogramma della Figura 8B).

Claims (13)

1. RIVENDICAZIONI 1. Peptide isolato che consiste della sequenza aminoacidica SEQ ID NO:3.
2. 2. Peptide isolato secondo la rivendicazione 1, che è codificato dalla sequenza di acido nucleico SEQ ID NO:4.
3. 3. Sequenza isolata di acido nucleico comprendente SEQ ID NO:4.
4. 4. Vettore di espressione comprendente una sequenza isolata di acido nucleico secondo la rivendicazione 3.
5. 5. Cellula ospite comprendente un vettore di espressione secondo la rivendicazione 4.
6. 6. Procedimento per la preparazione di un peptide secondo la rivendicazione 1 o 2, comprendente il passaggio di coltivare una cellula ospite secondo la rivendicazione 5 in condizioni idonee e per un tempo sufficiente per l’espressione del peptide e, opzionalmente, il passaggio di recuperare il peptide dalla coltura.
7. 7. Peptide isolato secondo la rivendicazione 1 o 2 per l’impiego nel trattamento terapeutico di una patologia neurodegenerativa e/o una patologia epiteliale/cutanea.
8. 8. Peptide isolato per l’impiego secondo la rivendicazione 7, in cui la patologia è una patologia neurodegenerativa acuta o cronica scelta dal gruppo che consiste di ictus cerebrale ischemico o emorragico, lesioni cerebrali da trauma cranico, ipertensione intracranica, edema intracranico, ipossia/ischemia perinatale, pediatrica o adulta, paralisi cerebrale, ipossia/ischemia da arresto cardiocircolatorio, da annegamento o da ipotermia, malattia di Alzheimer, morbo di Parkinson, Corea di Huntington, sclerosi laterale amiotrofica (SLA), paralisi sopranucleare progressiva, demenza frontotemporale, demenza da corpi di Lewy, Malattia di Creutzfeldt-Jakob (MCJ), Malattia di Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS).
9. 9. Peptide isolato per l’impiego secondo la rivendicazione 7, in cui la patologia è una patologia epiteliale/cutanea scelta dal gruppo che consiste di ulcere cutanee secondarie a diabete, ulcere cutanee secondarie a polineuropatie periferiche, ulcere cutanee secondarie a quadri di scompenso neurologico secondari a sviluppo anomalo del sistema nervoso (spina bifida), ulcere della cute dovute a malattie infettive (lebbra, AIDS), ulcere dell’epitelio corneale secondarie a traumi o su base neurotrofica (cheratiti neurotrofiche) e ulcere cutanee secondarie a vasculiti e a malattie infiammatorie croniche cutanee.
10. 10. Anticorpo che lega specificamente il peptide secondo la rivendicazione 1 o 2.
11. 11. Composizione farmaceutica comprendente un peptide isolato secondo la rivendicazione 1 o 2 oppure un anticorpo secondo la rivendicazione 10 ed almeno un veicolo, eccipiente e/o diluente farmaceuticamente accettabile.
12. 12. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11, per l’impiego nel trattamento terapeutico di una patologia neurodegenerativa e/o una patologia epiteliale/cutanea.
13. 13. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11 o 12, che è in una forma idonea alla somministrazione per via enterale, parenterale o topica.