BR112014014913B1 - mutante prongf e método de preparação de uma beta-ngf humana biologicamente ativa - Google Patents

Abstract

MUTANTE PRONGF E MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA BETA-NGF HUMANA BIOLOGICAMENTE ATIVA. A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A UM MUTANTE PRONGF E A UTILIZAÇÃO DO MESMO, EM PARTICULAR, A UTILIZAÇÃO DE UM MUTANTE PRONGF HUMANO PARA A PRODUÇÃO DE BETA-NGF. A PRESENTE INVENÇÃO DESCREVE UM MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA BETA-NGF HUMANA ATIVA BIOLOGICAMENTE A PARTIR DE UM MUTANTE PRONGF INSOLÚVEL INATIVO. UM MUTANTE PRONGF DA INVENÇÃO É SUBSTITUÍDO POR QUALQUER AMINOÁCIDO, MAS NÃO ARG OU LYS NO LOCAL DE CLIVAGEM DA PROTEASE NATIVA R1SK3R4, PELO MENOS NAS POSIÇÕES R1 E K3. CORRESPONDENTES ÀS POSIÇÕES 101 E 103 DA SEQUÊNCIA DE PRONGF TIPO SELVAGEM HUMANA.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a novos mutantes proNGF com substituições no local de clivagem da protease nativa. A presente invenção descreve ainda um método de produção de uma beta-NGF humana ativa biologicamente a partir de um mutante proNGF insolúvel inativo e a utilização de um mutante proNGF humano para a produção de beta-NGF.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O fator de crescimento neural (beta-NGF) é um fator neurotrófico desempenhando um papel crucial no crescimento e sobrevivência de neurônios (sensorial e simpático) (Levi-Montalcini, R., Ciência 237 (1987) 1154; Thoenen, H., et al .., Physiol Rev. 60 (1980) 1284;. Yankner BA, et al, Annu Rev. Biochem 51 (1982) 845). Beta-NGF pertence a uma superfamilia de cisteína-nó de fatores de crescimento, assumindo a estrutura da proteína dimérica estável. Além disso, o beta-NGF promove o crescimento, diferenciação e da vitalidade dos neurônios colinérgicos do sistema nervoso central (Hefti, FJ, J. Neurobiol. 25 (1994) 1418). Indicações terapêuticas possíveis para fator de crescimento neural humano recombinante incluem neuropatias periféricas sensoriais, por exemplo, associadas com a diabetes ou como um possível efeito colateral na terapia da AIDS. Outras indicações para a beta-NGF são neuropatias centrais, doença de Alzheimer, por exemplo. Neste caso, a perda de memória é o resultado de uma perda de neurônios colinérgicos. Beta-NGF também foi encontrado para ser eficaz no tratamento de úlceras cutâneas e da córnea humana (BERNABEI et ai Lancet 1999; Lambiase et ai NEJM 1998). Além disso, o NGF-beta, também tem sido demonstrado para proteger as células da retina de degenerescência e a apoptose em um modelo animal experimental de glaucoma e para melhorar a função visual em alguns pacientes afectados por glaucoma (Lambiase A, et al. PNAS 2009). Beta-NGF madura humana é uma proteína de 118 aminoácidos que é traduzida como um pré-proproteína consistindo de 241 aminoácidos. O péptido de sinal (prepeptido) de 18 aminoácidos, é clivado durante a translocação para o retículo endoplasmático (ER). Apró-proteína resultante (proNGF) é transformada no seu N-terminal, removendo o pró-sequência por clivagem com protease. NGF humano maduro apresenta um elevado grau de identidade (90%) de roedor (murino e rato), beta-NGF. Para os estudos clínicos ou as utilizações terapêuticas, beta-NGF tem de ser fornecida em concentrações elevadas. Glândulas submaxilares de ratinhos são uma fonte natural de beta-NGF. No entanto, estas preparações beta-NGF são misturas heterogêneas de diferentes dímeros e, portanto, não é adequado para fins terapêuticos. Além disso, é desejável administrar a forma humana da proteína para os pacientes. Em tecidos humanos, no entanto, os factores neurotróficos estão presentes apenas em concentrações baixas.

[0003] A pró-sequência é um domínio separado a partir da proteína madura (ver os dados de sequência da Figura 1, em que a pró- sequência está indicada em negrito). Estes dois domínios estão separados por um local de clivagem de protease exposta com uma sequência alvo de ácido amino básico do tipo Arg-Ser-Lys-Arg localizados nas posições 101 a 104 da sequência de proNGF humana (SEQ ID NO: 1). Este motivo é naturalmente um local de clivagem para a endoprotease de serina furina. Além disso, o local de clivagem podem ser processados especificamente por outras proteases adequadas, de preferência, por proteases com especificidade para o substrato de clivagem após o aminoácido arginina (Arg, R). Por exemplo, as proteases tripsina cliva após aminoácidos básicos tais como a lisina (Lys, K) ou Arginina (Arg, R).

[0004] Os métodos para a preparação de beta- biologicamente ativa do NGF a partir da sua proforma inativa são bem conhecidos no campo da arte. Por exemplo, a EP 0 994 188 BI descreve um método para a preparação de beta-biologicamente ativa do NGF a partir da sua pró-forma inativa que tem uma solubilidade pobre. De acordo com este método, o beta-NGF pode ser obtida a partir de proNGF inativo insolúvel recombinante que solubilizado numa solução de desnaturação. Em seguida, o proNGF solubilizado é transferido para uma solução não ou fracamente desnaturante. O proNGF desnaturado assume uma conformação biologicamente ativa como determinado pelas pontes dissulfeto presentes na nativa beta- NGF. Subsequentemente, a pró-sequência de proNGF é clivada pela qual ativa beta-NGF é obtida.

[0005] ProNGF humano contém uma protease nativa (Furin) local de clivagem Arg-Ser-Lys-Arg, tendo, portanto, o seguinte motivo de sequência: R X SK 3 R 4 .Para processos de produção específicos, como aqueles que exigem "Manufacturing Practice Good"(BPF) os níveis de qualidade, materiais, tais como enzimas têm de ser fornecidos em alta qualidade. A protease Furin não está disponível atualmente como protease GMP-grade.

[0006] Portanto, uma alternativa de protease, tripsina (EC 3.4.21.4), foi escolhida para clivar proNGF para resultar numa proteína de beta- NGF maduro. As serina proteases tripsina cliva cadeias peptídicas no lado carboxilo de aminoácidos básicos, arginina ou lisina. Em proNGF humano, o local de clivagem de ocorrência natural em proNGF humano contém três posições com aminoácidos básicos (posições 101, 103, e 104 da SEQ ID NO: 1; alternativamente referidas como R 1 , K 3 e R 4 aqui). Assim, a clivagem de proNGF por tripsina pode levar a vários produtos clivados diferentes dependendo do local onde ocorre exactamente clivagem. Produtos de clivagem típicos são SK 3 R 4 - beta-NGF e R 4 -beta-NGF maduro e beta-NGF. Este problema é exacerbado uma vez que a dimerização da proteína beta-NGF irá conduzir a um número ainda mais elevado (até seis) de produtos heterogênea que têm de ser purificado em etapas seguintes (ver Figura 2a).

PROBLEMAS TÉCNICOS SUBJACENTES À PRESENTE INVENÇÃO E SUAS SOLUÇÕES

[0007] Os métodos para produzir betaNGF têm sido descritos na técnica anterior. No entanto, os processos de produção atualmente disponíveis têm vários inconvenientes, tais como produtos de beta- NGF heterogêneos e baixos rendimentos de beta-NGF.

[0008] A clivagem do tipo selvagem pro-NGF com tripsina para produzir beta-NGF mostrou baixa eficiência que obriga a utilização de quantidades muito elevadas de enzima de modo a obter um rendimento suficiente de clivada beta-NGF. Isto tem várias desvantagens que têm impacto sobre o processo posterior de purificação. Em primeiro lugar, diminui ainda mais a selectividade de clivagem que conduz a vários produtos de digestão. Em segundo lugar, a purificação de beta-NGF a partir da enzima é necessária uma vez que a enzima tem de estar ausente na amostra final da proteína. Isto implica vários procedimentos de purificação para remover a tripsina abundante. Assim, a utilização de tripsina como enzima de clivagem no procedimento da arte anterior conduz quer a rendimentos muito baixos de beta- NGF ou a problemas de purificação da proteína. Escusado será dizer que continua a haver uma necessidade na arte de um método de produção de beta- NGF, sem os inconvenientes descritos acima. É, portanto, um problema subjacente à presente invenção proporcionar um novo método de produção de beta-NGF a ser obtido com elevada qualidade, de alta eficiência e com rendimentos elevados. Além disso, é um problema subjacente à invenção proporcionar um processo de produção de beta-NGF que resulta em elevados rendimentos de beta-NGF, é eficiente e robusta, escalável e reprodutível.

[0009] Uma vantagem da invenção é a produção de uma beta-NGF a partir de um novo mutante proNGF. Os novos resultados mutantes em produtos beta-NGF homogêneos em bom rendimento, porque o mutante proNGF impede a digestão não homogênea por proteases e produtos de beta- NGF, assim, não homogêneo. O problema da invenção é resolvido proporcionando o mutante proNGF da invenção e o método de produção de beta-NGF a partir do mutante proNGF como descrita pela presente invenção.

[0010] Os novos mutantes resultam em um aumento inesperado e surpreendente no rendimento da clivagem de tripsina, no local correspondente no proNGF mutado do invento, comparada com o tipo selvagem. Isto permite a utilização de quantidades extremamente baixas de tripsina de protease, em comparação com a quantidade a ser usada com o tipo selvagem e, como consequência, resulta em problemas de redução de purificação de NGF a partir de beta-se a enzima a partir de e pelos produtos da clivagem.

[0011] Os problemas acima descritos são resolvidos e as vantagens são alcançadas pelo objeto das reivindicações independentes. Formas de realização preferidas da invenção são incluídas nas reivindicações dependentes, bem como na seguinte descrição, exemplos e Figuras.

[0012] A síntese acima não descreve necessariamente todos os problemas resolvidos pela presente invenção. Outros problemas e como não são resolvidos podem ser evidentes para o perito na arte, depois de ter estudado o presente pedido.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0013] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um mutante proNGF, em que o local de clivagem de protease de R1SK3R4 é substituído, pelo menos nas posições de R1 e K3 correspondentes às posições 101 e 103 do proNGF tipo selvagem sequência humana (SEQ ID NO: 1) por um aminoácido selecionado a partir de amino ácidos não-básicos e histidina.

[0014] Num segundo aspecto, a presente invenção refere- se a um método de preparação de uma beta-NGF humana ativa biologicamente a partir de um mutante proNGF insolúvel inativa substituído no local de clivagem da protease nativa R1SK3R4, pelo menos nas posições de R 1 e K 3correspondente a posições 101 e 103 do sequência de proNGF tipo selvagem humana (SEQ ID NO: 1), que compreende (i) proporcionar um mutante proNGF de acordo com esta invenção, e (ii) clivar o mutante proNGF, a fim de obter ativo humano beta-NGF.

[0015] Em particular, a invenção relaciona-se com o seguinte processo: a. dissolver o mutante proNGF numa solução desnaturante; b. transferir o mutante proNGF para uma solução de redobramento, onde a proNGF desnaturada assume uma conformação biologicamente ativa; c. purificação do mutante proNGF a partir da solução de redobramento; d. clivar apró-sequência do mutante proNGF obter o beta- NGF ativo.

[0016] Um terceiro aspecto da invenção relaciona-se com a utilização de um mutante proNGF em que pelo menos arginina na posição 101 e a lisina na posição 103 do local de clivagem da protease nativa R'S nas posições 101 a 104 do proNGF tipo selvagem humana (SEQ ID NO: 1 ) é substituído por aminoácidos não básicos, para a preparação de beta-NGF humano.

[0017] Um outro aspecto da presente invenção refere-se a composições farmacêuticas que compreendem beta-NGF produzido a partir do mutante proNGF em que pelo menos arginina na posição 101 e de lisina na posição 103 do local de clivagem da protease nativa R X SK 3 R 4 nas posições 101 a 104 do proNGF tipo selvagem humana (SEQ ID NO: 1) são substituídos por um aminoácido selecionado a partir de amino ácidos não-básicos e histidina, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[0018] Este resumo da invenção não descreve necessariamente todos os aspectos da presente invenção. Outras formas de realização serão evidentes a partir de uma revisão da descrição detalhada que se segue.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[0019] Antes da presente invenção ser descrita em detalhe abaixo, é para ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia particular, protocolos e reagentes descritos aqui uma vez que estes podem variar. É também para ser compreendido que a terminologia utilizada aqui é para o propósito de descrever apenas formas de realização particulares, e não se destina a limitar o âmbito da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm os mesmos significados que normalmente entendidos por um perito na arte à qual este invento pertence.

[0020] Ao longo desta especificação e das reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra "compreender", e variações tais como "compreende" e "compreendendo", será entendida como implicando a inclusão de um inteiro ou etapa ou grupo de inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro inteiro ou etapa ou grupo de inteiro ou etapa.

[0021] Vários documentos (por exemplo: patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, instruções etc) são citados ao longo do texto desta especificação. Nada aqui contido deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem o direito de antecipar a divulgação em virtude da invenção anterior.

[0022] Sequências: Todas as sequências aqui referidas são divulgadas na listagem da sequência anexa que, com todo o seu conteúdo e divulgação, é uma parte desta especificação.

[0023] O termo "cerca de", quando utilizado em ligação com um valor numérico é destinado a englobar os valores numéricos dentro de um intervalo com um limite inferior, que é 5% menor do que o valor numérico indicado e que tem um limite superior, que é 5% maior do que o numérico indicado valor.

[0024] O termo "proNGF" ou "pro-NGF"refere-se a proforma da beta-NGF humano. A sequência proNGF humano completo é definido pela SEQ ID NO: 1 (Figura 1a). A fim de obter madura beta-NGF, o proNGF propéptido tem de ser clivada por proteases. A pró-sequência da beta-NGF é um domínio separado a partir da beta-NGF maduro. Entre estes dois domínios, existe um local de clivagem da protease nativa Arg-Ser-Lys-Arg (aqui referido R1 SK3R4 SEQ ID NO: 9) nas posições 101 a 104 da SEQ ID NO: 1. A clivagem site pode ser processada especificamente por proteases adequadas, nomeadamente protease furin.

[0025] O termo "mutante proNGF" ou "muteína proNGF"refere-se a modificações da pro-forma de humano beta-NGF por substituições de aminoácidos. A muteína proNGF da presente invenção é substituído no local de clivagem da protease nativa R1SK3R4 (SEQ ID NO: 9), pelo menos em ambas as posições K3 e R1 que correspondem às posições 101 e 103 da sequência de proNGF tipo selvagem humana (SEQ ID NO: 1) por um aminoácido selecionado a partir de amino ácidos não-básicos e histidina.

[0026] Numa forma de realização preferida da invenção, o aminoácido lisina na posição K (correspondendo à posição 103) é substituído por alanina (ver Figura 1d, SEQ ID NO: 4, Figura 1e, a SEQ ID NO: 5, Figura 1g, SEQ : 8).

[0027] Numa outra forma de realização preferida da invenção, o aminoácido arginina na posição R 1 (correspondendo à posição 101) é substituído por valina (ver Figura 1b, SEQ ID NO: 2, a Figura 1e, a SEQ ID NO: 5, Figura 1g, SEQ ID NO: 8).

[0028] Numa outra forma de realização da invenção, o aminoácido arginina R4 correspondente à posição 104 da sequência de proNGF tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) também podem ser substituídos por qualquer aminoácido que permite o processamento do proNGF por clivagem proteolítica para se obter beta NGF, de preferência, um aminoácido básico tal como arginina ou lisina. Por exemplo, a presença de alanina na posição R 4 evita o processamento da proNGF para beta do NGF. Assim, o mutante de invenção não pode conter alanina na posição 104.

[0029] Tabela 1. Locais de clivagem de protease de proNGF e proNGF muteínas (X refere-se a qualquer aminoácido, mas não Arg ou Lys) SEQ ID NO: Local de clivagem de protease (pos. 101104da SEQ ID NO: 1) 1 RSKR (tipo selvagem) (SEQ ID NO: 9) 2 VSXR (SEQ ID NO: 10) 3 XSXR (SEQ ID NO: 11) 4 XSAR (SEQ ID NO: 12) 5 Vsar (SEQ ID NO: 13) 6 RXKR 7 XXXR (SEQ ID NO: 14) 8 VXAR (SEQ ID NO 15)

[0030] O termo "aminoácido não- básico" refere-se a qualquer aminoácido que não está carregado positivamente. O termo refere-se a um resíduo aminoácido diferente de um aminoácido básico. O termo não inclui os aminoácidos de lisina ou arginina que são amino ácidos com cadeias laterais positivos. Os aminoácidos não-básicos são aminoácidos carregados negativamente ácido glutâmico e ácido aspártico, ácidos aminados com cadeias laterais polares sem carga (serina, treonina, asparagina, glutamina), aminoácidos com cadeias laterais hidrofóbicas (alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptofano) e os aminoácidos cisteína, glicina e prolina.

[0031] O termo "pro-NGF biologicamente ativo" ou "proNGF com conformação biologicamente ativo" refere-se, como tal, a atividade biológica das pró-NGF. Uma conformação biologicamente ativa de proNGF é determinada pela presença de pontes de dissulfureto que ocorrem na beta natural-NGF. A atividade pode ser, por exemplo, determinada de acordo com um ensaio conforme descrito por Chevalier et al. 1994, Blood 83: 1479-1485, 1994, que é aqui incorporada por referência. Exemplo 11 descreve um ensaio para a atividade biológica de proNGF através da estimulação da proliferação de células TF1.

[0032] O termo "beta-NGF"refere-se a um fator de crescimento beta madura de nervos, de preferência a partir de humano. A sequência para o factor de crescimento maduro beta-nervo é mostrado na Figura 1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, e SEQ ID NO: 8), que começa na posição 105.

[0033] O termo "atividade de beta-NGF" ou " beta-NGF ativo biologicamente", como tal, entende-se a atividade biológica das beta- NGF. Biologicamente beta-NGF ativo existe sob a forma de um dímero. Beta- NGF tem de estar presente numa forma dimérica que têm uma conformação biologicamente ativa. O pré-requisito de uma conformação biologicamente ativa da beta-NGF é a formação correta das pontes dissulfeto a um nó de cistina. A atividade pode ser, por exemplo, determinada de acordo com o ensaio de DRG (ensaio do gânglio da raiz dorsal), ver por exemplo, Levi-Montalcini, R. et al., Câncer Res. 14 (1954) 49, e Varon, S. et al. Meth. em Neuroquímica 3 (1972) 203. Neste ensaio a estimulação ea sobrevivência dos neurônios sensoriais de dissociada gânglios da raiz dorsal de embriões de galinha é monitorado por meio de formação de neurite.

[0034] O termo "substituição" ou "substituições"refere-se a modificações da pro-forma da beta-NGF humano por substituição de aminoácidos. O termo inclui a modificação química de aminoácidos, por exemplo, por substituição ou adição de grupos químicos ou resíduos de aminoácido inicial. A etapa de modificação dos aminoácidos selecionados é realizada de preferência por mutagénese ao nível genético. Preferencialmente, a modificação de proNGF é realizada por meio de métodos de engenharia genética para a alteração de um DNA pertencente proNGF.As modificações são as mutações que causam a substituição de um único nucleótido de base com outro nucleótido do material genético. Mutações pontuais resultados em codificando diferentes aminoácidos em comparação com a sequência de tipo selvagem. Preferencialmente, a expressão da proteína proNGF modificada é então efectuada em organismos procariotas ou eucariotas, de preferência, em organismos procariotas.

[0035] O termo "desnaturante" ou "desnaturação"refere- se a um processo em que a estrutura dobrável de uma proteína é alterada. O termo refere-se a revelar a estrutura terciária de proNGF ou proNGF muteína. A alteração da estrutura dobrável é devida à exposição a certos factores químicos ou físicos. Como resultado, algumas das propriedades originais da proteína, especialmente a sua atividade biológica, são diminuídas ou eliminadas. Devido ao processo de desnaturação, as proteínas tornam-se biologicamente inativa. Além disso, as proteínas desnaturadas pode apresentar uma grande variedade de características, incluindo a perda de função biológica, a perda de solubilidade e / ou agregação.

[0036] O termo "redobramento" ou "renaturante" ou "renaturação"refere-se a um processo pelo qual a estrutura da proteína funcional assume a sua dobra nativa ou conformação. Devido aos processos de renaturação ou redobragem, a proteína se torna biologicamente ativo.

[0037] O termo "recombinante"refere-se à clonagem de DNA em vetores para a expressão da proteína codificada pelo ADN num hospedeiro adequado. O hospedeiro é de preferência, um procariota, mais preferivelmente uma bactéria. Uma "expressão recombinante" como aqui utilizado refere-se a expressão de proNGF ou o proNGF mutei no em células hospedeiras procariotas, por exemplo estirpes de E. coli adequada para a expressão de proteínas recombinantes que podem ser utilizados.

[0038] O termo "solúvel" refere-se a uma proteína que é susceptível de ser dissolvido em algum solvente. O termo "insolúvel" refere-se a uma proteína que não é susceptível de ser dissolvido em algum solvente.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO Os mutantes do invento proNGF

[0039] Numa primeira forma de realização da invenção, a presente invenção proporciona um mutante proNGF em que o local de clivagem de protease de R X SK 3 R 4 é substituído, pelo menos nas posições de R 1 e K 3 correspondentes às posições 101 e 103 do proNGF tipo selvagem sequência humana (SEQ ID NO: 1) por um aminoácido selecionado a partir de amino ácidos não-básicos e histidina. Em outras palavras, pelo menos arginina R1 na posição 101 e a Lisina K 3 na posição 103 do local de clivagem da protease nativa R X SK 3 R 4 nas posições 101 a 104 da sequência de proNGF tipo selvagem humana (SEQ ID NO: 1) estão substituídos por qualquer aminoácido, mas não arginina ou lisina.

[0040] No proNGF tipo selvagem humana (SEQ ID NO: 1), do lado de clivagem da protease nativa refere-se aos aminoácidos posições 101 a 104 (ArgSerLysArg, RSKR, SEQ ID NO: 9). Aminoácido Lisina K3 na posição 103 da sequência de proNGF do tipo selvagem e aminoácidos arginina R1 na posição 101 é substituído por qualquer aminoácido, mas não Arg ou Lys para resultar em um proNGF com propriedades melhoradas, em particular, para a produção de beta-NGF. A fim de alcançar o objectivo acima identificado, isto é, para gerar uma muteína com características melhoradas para a produção de beta-NGF, Arginina (R1) ou de lisina (K 3) pode ser substituído por todos os aminoácidos que ocorrem naturalmente ou aminoácidos artificiais, bem como, desde que não constituam um local de clivagem para a tripsina.

[0041] De acordo com o invento, as modificações de aminoácidos a uma ou mais posições correspondentes aos resíduos 101-103 podem ser substituições, que substituem os aminoácidos básicos com aminoácidos não básicos. Teses substituições podem ser utilizados para criar mutantes proNGF de acordo com a invenção, em particular, para a produção de beta-NGF. Os mutantes compreendem substituições, pelo menos, nas posições Arg 101 e Lys 103. Os resíduos de aminoácidos são substituídos por um aminoácido não básico ou Histidina. Particularmente, os mutantes do invento têm as substituições Arg101Val e Lys103Ala. Por exemplo, os referidos ácidos aminados naturais não-básicos podem ser selecionados a partir do grupo consistindo dos que ocorrem naturalmente, os resíduos de aminoácidos alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, Serina, Treonina, Triptofano, Tirosina, Valina.

[0042] Os aminoácidos para as substituições nas posições 101 e 103 não são selecionados a partir de (carregados positivamente) aminoácidos básicos arginina (Arg) e lisina (Lys). Também menos preferidos são os aminoácidos isoleucina (He), leucina (Leu), ou fenilalanina (Fen), cisteína (Cis), prolina (Pro) ou triptofano (Trp). Serina (Ser) é de ocorrência natural na posição 102 da proNGF humano do tipo selvagem de sequência. X na posição 102 (SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8) é de preferência selecionado a partir de Serina (Ser), que são de ocorrência natural na posição 102 da sequência de proNGF humano, mas também pode ser selecionado a partir de qualquer outro aminoácido em que o aminoácido deve ser um aminoácido não básico (isto é, não arginina ou lisina). É importante que o aminoácido na posição 102 é um ácido não-aminoácido básico (isto é, não Arg ou Lys).

[0043] O aminoácido na posição 104 da sequência de proNGF humana de tipo selvagem é de preferência Arginina (Arg), que ocorre naturalmente na posição 104 da sequência de proNGF humano, mas pode também ser substituído por qualquer outro aminoácido, preferencialmente um aminoácido básico, mais preferencialmente lisina, a qual permite o processamento do proNGF por clivagem proteolítica para se obter beta NGF.

[0044] Por exemplo, a presença de alanina na posição 104 do proNGF tipo selvagem humana evita o processamento da proNGF para beta do NGF. Assim, Ala na posição 104 é excluído.

[0045] A Tabela 2 resume as substituições preferidas para o local de clivagem de protease de proNGF.

[0046] Tabela 2A. Aminoácidos preferidos nas posições 101-104 de proNGF tipo selvagem. O asterisco (*) indica os aminoácidos que ocorre naturalmente no local de clivagem de protease (de proNGF tipo selvagem, SEQ ID NO: 1). 101 Vai, Ala, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Met, His, Cys, Pro, Phe, Trp, He, Leu 102 Ser *, Gly, Asp, Tyr, Thr, Asn, Glu, Ala, Val, Gin, His, Met, Cys, Pro, Phe, Trp, Ele, Leu 103 Ala, Val, Asp, Asn, Glu, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Met, His, Cys, Pro, Phe, Trp, He, Leu 104 Arg*, Lys

[0047] Aminoácidos Cys, Pro, Phe, Trp, Ile e Leu são substituições menos preferidas nas posições 101, 102, e 103.

[0048] Tabela 2B: Os aminoácidos mais preferidos nas posições 101-104 de proNGF tipo selvagem. 101 Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, Gln, Tyr, Met, His 102 Ser*, Val, Ala, Gly, Thr, Asn, Asp, Glu, Gln, Tyr, Met, His 103 Ala, Vai, Gly, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, Gln, Tyr, Met, His 104 Arg*, Lys

[0049] É essencial que haja qualquer aminoácido, mas não Arg ou Lys nas posições 101, 102, e 103 da proNGF-muteína e que não é um aminoácido básico (Arg ou Lys) na posição 104 da proNGF-muteína. Foi surpreendentemente mostrado que, especificamente, duas substituições de aminoácidos nas posições 101 e 103 resultam em altas eficiências de produção de beta-NGF.

[0050] Na sequência do mutante proNGF mais preferida do invento (SEQ ID NO: 5), o aminoácido substituído preferido na posição 101 de humano do proNGF tipo selvagem é Valina, na posição 103 de humano do proNGF tipo selvagem é Alanina, em posição 102 de humano do proNGF tipo selvagem serina, e na posição 104 de humano do proNGF tipo selvagem Arginina. Na forma de realização particularmente preferida da invenção, o mutante proNGF dos presentes invenção tem uma sequência correspondente ao da SEQ ID NO: 5.

[0051] A presente invenção também é dirigida a ácidos nucleicos que codificam para os mutantes proNGF aqui descritos como bem.

Método de preparação de um beta-NGF humano a partir de um mutante da invenção proNGF

[0052] Num segundo aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de preparação de uma beta-NGF humana ativa biologicamente a partir de um mutante proNGF insolúvel inativa substituído no local de clivagem da protease nativa R1SK3R4 (SEQ ID NO: 9) nas posições 101 e 103 (R 1 e K 3 ) da sequência de proNGF tipo selvagem humana (SEQ ID NO: 1), compreendendo o fornecimento de um mutante proNGF substituído no local de clivagem da protease nativa R1SK3R4 nas posições 101 e 103 (R1 e K3 ) da sequência de proNGF tipo selvagem humano, e clivagem do mutante proNGF, a fim de obter ativo humano beta-NGF.

[0053] De preferência, o mutante proNGF é obtido por expressão recombinante em células procarióticas. Estirpes bacterianas adequadas são bem conhecidas na arte, por exemplo, E. coli, Bacillus sp., E Salmonella, e kits para tais sistemas de expressão são disponíveis comercialmente. As células hospedeiras preferidas para a expressão recombinante de E. coli são, por exemplo, E. coli BL21, JM 108/109 (K12), JM106, JM83 TCE und ou seus derivados.Qualquer outra estirpe de E. coli adequada para a expressão de proteínas recombinantes que podem ser utilizados.

[0054] Os polinucleótidos estão ligados operativamente a sequências de controle da expressão que permitem a expressão das proteínas de fusão da presente invenção em células hospedeiras procarióticas. Tais sequências de controlo de expressão incluem, mas não estão limitados a promotores indutíveis e não indutíveis, operadores, repressores e outros elementos que são conhecidos pelos especialistas na matéria e que a unidade de outra forma ou regulam a expressão do gene. Tais elementos reguladores incluem como, por exemplo, T7, TAC, pBAD, promotores da ALC, lacL, LacIQ repressores.

[0055] A sequência do mutante proNGF é introduzida na célula hospedeira procariótica de um vetor adequado. Os vetores adequados podem ser, por exemplo, mas não se limitando a: pBR322, pMAL, pUC19, e todos os seus derivados. A célula hospedeira procariótica inclui, mas não está limitado a células procarióticas tais como bactérias (por exemplo, E. coli ou B. subtilis), que podem ser transformados com, por exemplo, o DNA de plasmídeo, DNA de bacteriófago recombinante, ou vetores de expressão de ADN de cosmídeos contendo as moléculas polinucleotídicas da invenção.Em uma forma de realização da invenção, os vetores são de uso plasm ídicos. Por exemplo, mas de nenhuma forma limitada, vetores plasmídeos descritos no EP1697523B1 pode ser utilizada (que é aqui incorporada por referência).

[0056] A fim de expressar as muteínas proNGF, um vetor de expressão é usado que contém: a. um forte promotor de transcrição direta (por exemplo, um tac ou promotor T7), b. uma seqüência de codificação para proNGF ou proNGF muteína c. um terminador de transcrição / tradução (por exemplo, a-terminador do bacteriófago lambda) d. um primeiro gene marcador selecionável, por exemplo, um gene que codifica para a resistência a antibióticos (por exemplo, Canamicina resistência, kan), e. um segundo gene marcador selecionável, por exemplo, um gene que codifica para proB e / ou proA. f. um gene repressor (por exemplo, um gene lacl), g. uma origem elevada de número de cópias de replicação.

[0057] Em uma forma de realização da invenção, os vetores de expressão de propriedade (Scil Proteínas GmbH, ver EP1697523B1 para a estrutura de um vetor de expressão adequado) ou vetores comercialmente disponíveis podem ser utilizados para a clonagem. No que diz respeito a informação geral sobre os vetores que podem ser utilizados no método da presente invenção, é a que se refere aos detalhes acima mencionados. No entanto, quaisquer vetores adequados podem ser utilizados como é conhecido na arte.

[0058] A estrutura do vetor de expressão propriedade pSCIL101 como um exemplo de um vetor adequado para a transformação de células hospedeiras procarióticas é descrito abaixo:

[0059] O método de preparação de um mutante é proNGF compreendendo os seguintes etapas iniciais: i. a preparação de um ácido nucleico que codifica uma muteína proNGF ii. introduzir o referido ácido nucleico num vetor de expressão procariótico; iii. introdução do referido vetor de expressão numa célula hospedeira; iv. cultivar a célula hospedeira; v. sujeitar a célula hospedeira a condições de cultura adequadas.

[0060] Devido à sua expressão em células hospedeiras procarióticas, o muteína proNGF está na forma da sua forma inativa, insolúvel. Numa forma de realização preferida, o método de produção de beta- NGF a partir de um mutante proNGF de acordo com a presente invenção compreende os etapas de: a. dissolver o mutante proNGF substituído no local de clivagem da protease nativa R X SK 3 R 4 R nas posições 1 e 3 K correspondente a positons 101 e 103 do proNGF tipo selvagem sequência humana (SEQ ID NO: 1) por solubilização dos corpos de inclusão numa solução desnaturante; b. transferir o mutante proNGF para uma solução de redobramento, onde a proNGF desnaturado assume uma conformação biologicamente ativa; c. purificação do mutante proNGF a partir da solução de redobramento; d. clivar a pró-sequência do mutante proNGF obter o beta- NGF ativo.

[0061] No que se segue, são discutidas as medidas preferidas de um método para a produção de beta-NGF a partir de um mutante proNGF de acordo com a presente invenção.

Etapa a: A solubilização de mutante proNGF

[0062] Etapa a) corresponde à dissolução do mutante proNGF substituído no local de clivagem da protease nativa R X SK 3R 4 R nas posições 1 e K 3 correspondente a positons 101 e 103 do proNGF tipo selvagem sequência humana (SEQ ID NO: 1) por solubilização de corpos de inclusão em uma solução de desnaturação. Note-se que o mutante proNGF da invenção na etapa a) é geralmente sob a forma de sua forma inativa, insolúvel, devido à sua expressão em células hospedeiras procarióticas. ProNGF inativa, mostrando uma solubilidade pobre é formada durante a sobre-expressão da proteína no citossol de procariotas. Neste caso, proNGF preparado por recombinação permanece no citoplasma numa forma insolúvel e agregados. Estes agregados de proteínas, o seu isolamento, bem como a sua purificação são descritos por exemplo em Marston, FA, Biochem. J. 240 (1986).

[0063] Para isolar esses agregados de proteínas inativas (corpos de inclusão), as células procariotas são interrompidas na seguinte fermentação. Rompimento celular pode ser realizado por métodos convencionais, por exemplo, por meio de homogeneização de alta pressão, ultra-sons ou a lisozima (Rudolph, R., et al (1997); dobramento de proteínas em:. Creighton, TE (ed.): Função da proteína: A. Abordagem Prática. Oxford University Press, pp 57-99). Além disso, os corpos de inclusão solubilizados. Corpos de inclusão (IB) são acúmulos de proteínas geralmente defeituosos ou incompleta dobradas. Eles formam no interior das células, por exemplo células de bactérias, tais como E. coli, no caso de a expressão excessiva de proteínas recombinantes. Os corpos de inclusão empregues de acordo com a invenção compreendem, de preferência a muteína proNGF. Isto significa que eles contêm pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80 ou pelo menos 90 wt.% De pro-NGF (com base na quantidade total de proteína).

[0064] A invenção proporciona um método para a produção de muteína proNGF destes, em que corpos de inclusão que não dobrada, inativo, muteína proNGF insolúvel, ou um seu derivado, são solubilizadas em tampão de desnaturação (solução).

[0065] A solução de desnaturação da etapa a) compreende, preferencialmente, uma solução contendo (i) um agente caotrópico, (ii) um agente quelante, (iii) um tampão, e (iv) um agente de redução.

[0066] O tampão de desnaturação compreende pelo menos uma substância caotrópico (agente). As substâncias químicas que dissolvem encomendados laços de ponte de hidrogênio em água são chamadas de caotrópica. Uma vez que os títulos de pontes de hidrogênio são arrombados, as substâncias caotrópicos interferir com a estrutura de água e garantir a desordem (aumento da entropia). A razão para isto é que a formação de H 2 0 necessárias estruturas de gaiola para a solvatação é impedida. No caso de aminoácidos, que reduzem os efeitos hidrofóbicos e têm uma acção de desnaturação das proteínas, uma vez que uma força motriz de dobramento de proteínas é a montagem em conjunto de aminoácidos hidrofóbicos na água. Em geral, qualquer substância que exerce o efeito hidrofóbico no tampão de solubilização e, portanto, tem uma acção desnaturante sobre as proteínas podem ser utilizadas como uma substância caotrópico. Substâncias caotrópicos são em geral os sais ou compostos de baixo peso molecular, tais como a ureia. Substâncias caotrópicos são claramente distinguidos de detergentes, uma vez que não contêm nenhum radical hidrofóbico, tal como um radical alquilo, na molécula. Geralmente, a acção caotrópico é acompanhado por uma melhoria na solubilidade da proteína, neste caso a pretrombina.

[0067] Numa forma de realização preferida da invenção, o composto caotrópico é escolhido a partir dos sais de guanidínio, em particular o cloridrato de guanidina e tiocianato de guanidina, iodetos, sais de bário, tiocianatos, ureia e percloratos. Os compostos trópico chao são utilizados em quantidades convencionais. Por exemplo, a 4 - 8 M de cloridrato de guanidina ou de 4-9 M de ureia pode ser empregue.

[0068] O tampão de desnaturação compreende um composto agente de redução, por exemplo, um composto dissulfureto, como a glutationa (GSH). O composto dissulfureto é capaz de formar dissulfuretos misturados com os grupos tiol (-SH) de cisteínas dos polipéptidos nos corpos de inclusão. O dissulfureto é adicionado à solução. O dissulfeto não designa proteínas que compõem os corpos de inclusão e que possivelmente compõem pontes dissulfeto. De preferência, o dissulfureto não é um verdadeiro péptido. De preferência, o dissulfureto é um composto de baixo peso molecular. O peso molecular é, por exemplo, inferior a 2000 g / mol ou de 1.000 g / mol. O dissulfureto é empregado, por exemplo, em uma concentração de 5 mM a 1 M, em particular de 10 mM a 0,5 M.

[0069] Numa forma de realização preferida da invenção, o composto é o dissulfureto de glutationa dissulfureto. A glutationa (GSH), também Y-L-glutamil-L-cisteinilglicina, é um pseudo-tripeptídeo que é formado a partir de três aminoácidos ácido glutâmico, cisteína e glicina. GSH está presente no citoplasma de ambos os procariotas e eucariotas e está envolvido na formação de pontes de dissulfureto. Ela está em equilíbrio com o dímero de GSSG, que contém uma ponte de dissulfureto. A glutationa reage com cisteínas R-SH e R '-SH a partir de dois polipéptidos ou a partir de um único polipeptídeo de uma reação de permuta de dissulfureto: R-SH + GSSG ^ R-S-S-G + GSH.

[0070] RSSG é chamado um dissulfureto misturado. Ele é feito reagir com uma cisteína adicional de um polipéptido, de modo que, como resultado de uma ponte de dissulfureto é obtido entre duas cisteínas: RSSG + HS-R'^ R-S-S-R' + GSH.

[0071] A glutationa é mantida enzimaticamente na forma reduzida (GSH) no citosol. "Redução" condições no citosol são, portanto, referidas. As condições são estabelecidas no tampão de solubilização para que o composto de dissulfureto que compreende catalisa a formação de pontes de dissulfureto de acordo com as reacções acima descritas. A GSSG é utilizada, por exemplo, em uma concentração compreendida entre 10 mM a 0,5 M. Alternativamente, como agente de redução (o redutor), cisteína pode ser usada.

[0072] Numa forma de realização preferida da invenção, a solução de desnaturação é um tampão de Tris.

[0073] A solução de desnaturação pode compreender outros aditivos convencionais, por exemplo, EDTA ou os seus sais. O pH do tampão de solubilização, por exemplo, entre 7 e 10, de preferência a pH 8. A solubilização é de preferência assistida mecanicamente, por exemplo, com aparelhos de homogeneização convencionais ou por meio de ultra-som. Após a solubilização, que permanecem sólidos são preferencialmente separada. O sobrenadante compreende o solubilizado pro-NGF.

[0074] Em uma forma de realização da invenção, a solução desnaturante compreende: i. Guanidina-HCl, 1-8 M, de preferência 4-6 M, mais preferido de 4 M, GSH ou Cisteína, 1 - 100 mM, de preferência 5 mM ii. Tris, 0,01-1 M, preferivelmente 0,1 M, iii. EDTA, 1 - 50 mM, de preferência 10 mM iv. pH 7,0-10,0, preferivelmente pH 8,0

[0075] Uma concentração de 4 M de guanidínio-HCl é na maioria dos casos suficiente para a desnaturação completa da proNGF muteína.

Etapa b: A redobragem do mutante proNGF

[0076] Após a solubilização do mutante proNGF a partir de corpos de inclusão que é necessário para redobrar a proteína na sua conformação nativa. Para o processo de redobramento é importante para minimizar as reacções concorrentes misfolding e agregação. Para prevenir a agregação do redobramento é realizado a concentrações muito baixas de proteína devido a agregação das proteínas é predominante em concentrações elevadas de proteínas. Na etapa b), transferindo o mutante proNGF em um tampão de redobragem ocorre onde a proNGF desnaturado assume uma conformação biologicamente ativa. Uma conformação biologicamente ativa pode ser determinada pela presença de pontes de dissulfureto que ocorrem na beta natural-NGF.

[0077] Numa forma de realização preferida da invenção, o mutante proNGF solubilizado é renaturada numa solução de redobramento que contém, pelo menos, uma chaperona, pelo menos, um quelante de metal, e um sistema redox de baralhar.

[0078] Numa forma de realização preferida, o método de acordo com a presente invenção utiliza uma solução de redobramento na etapa b), que compreende: i. um chaperone, de preferência arginina, 0,5-1,0 M, de preferência 0,75 M, ii. um quelante de metal, de preferência EDTA, 1-10 mM, de preferência 5 mM, iii. um sistema de baralhar redox, a 0,1-10 mM, de preferência de 1 mM de L-cistina e 5 mM de L-cisteína, ou GSSG 1 mM (glutationa oxidada) e GSH 5 mM (glutationo reduzido). iv. pH 8,0 - pH de 11,0, de preferência pH 9,5

[0079] Sistemas de baralhar redox alternativos tais como Cystamin / Cysteamin poderia ser utilizado.

[0080] Numa forma de realização preferida da invenção, o auxiliar dobrável é Arginina. Os compostos que promovem a dobragem de proteínas geralmente podem ser empregues como "auxiliares de dobragem". Tais compostos são conhecidos do perito na arte. Eles podem ajudar a dobragem de várias maneiras. Supõe-se que a arginina desestabiliza intermediários incorrectamente enroladas, de modo a que estes sejam pelo menos parcialmente desdobrada de novo (a partir de uma termodinâmico beco sem saída) e, por conseguinte, podem ser correctamente dobrado novamente. Por outro lado, o glicerol geralmente estabiliza proteínas. Os compostos que aumentam o rendimento absoluto de dobrado pro-NGF muteína no método de acordo com a invenção, em mais de 5, em particular, por mais de 10% ou mais de 20% (com base na quantidade total de pro-NGF utilizado para a dobragem), em comparação com um método sem usar o assistente de dobrar, são adequados, em particular, como dobrar assistentes.

[0081] O redobramento é de preferência efectuada a um pH entre 8 e 11, em particular de pH 9,5.

[0082] Para aumentar a concentração de proteína no vaso de redobragem, uma renaturação pulso foi realizada. Limitando o número de pulsos é a concentração de guanidínio-HCl que não deve exceder 0,3 M. A concentração de proteína por pulso não deve exceder 50 mg / ml em relação ao volume de redobramento final.

[0083] Numa forma de realização preferida da invenção, o solubilizado é adicionado ao lote de dobragem em várias fracções ou continuamente ao longo de vários dias. De preferência, o solubilizado é adicionado em uma "renaturação pulso" por rápida diluição para o solubilizado. Neste contexto, por exemplo, mas não se limita a, pelo menos, 6 pulsos pode ser realizada num intervalo de tempo de, por exemplo, 24 horas. O número de pulsos é definida de tal modo que após a adição do lote de solubilização a concentração de proteína que ainda não tenha sido dobrado não é muito elevada, uma vez que de outra forma agregados são obtidos. Por exemplo, com cada pulso de 0,05 g / 1 a 0,2 g / 1, de preferência de 0,1 g / 1 de proteína foi recentemente transferida para o lote de dobragem (baseado na concentração de proteína no lote de dobragem após a adição do solubilizado). Por exemplo, cada etapa de redobragem tem, pelo menos, 1-2 h.

[0084] Após a redobragem, a reação de redobramento precisa ser esclarecida antes do carregamento para uma coluna. Isto pode ser feito por quaisquer métodos conhecidos na arte, por exemplo, por filtração.

[0085] Numa forma de realização preferida, o método para a produção de um mutante de pro-NGF correctamente dobrado inclui as seguintes etapas: a) Os corpos de inclusão insolúveis que compreendem mutante proNGF são solubilizados numa solução de desnaturação como descrito acima, e b) o solubilizado pro-NGF é então renaturado num tampão de solução de redobragem tal como descrito acima.

[0086] Numa forma de realização preferida da invenção, a solução de desnaturação e / ou a solução de redobragem, por conseguinte, não contém qualquer detergente. Verificou-se, que a utilização de detergentes não é necessário para a solubilização e/ou dobragem das pro-NGF muteína. Isto é vantajoso, uma vez que certos detergentes são substâncias químicas relativamente agressivas que os produtos farmacêuticos não devem compõem ou deve incluir apenas em pequenas quantidades e, portanto, devem ser removidos de forma caro. O método de acordo com a invenção é, por conseguinte, vantajoso em comparação com o método de Soejima et al. De 2001, em que tais detergentes agressivos (Triton X-100 ou Brij-58) são utilizados para dobrar a proteína. Em outras palavras, não há detergentes são utilizados em todo o processo de produção de acordo com a invenção, e o método de produção é, por conseguinte, livre de detergente.

Etapa c: A purificação por cromatografia de mutante proNGF

[0087] Ao realizar o método de acordo com a invenção com a desnaturação e redobramento subsequente, uma solução aquosa de dobrado muteína pro-NGF é obtida. A muteína pro-NGF dobrado pode ser subsequentemente adicionalmente purificado por meio de métodos conhecidos. Numa forma de realização preferida, o mutante proNGF é purificado a partir da solução de redobramento (por exemplo, não-desnaturante ou fraco) por purificação cromatográfica, em particular por meio de uma cromatografia de modo misturado (etapa c do método de produção de beta- NGF a partir de um mutante de proNGF da invenção). A coluna mais preferido para a cromatografia em uma coluna de afinidade com um ligando sintético, de preferência, 4-mercapto-etil-piridina (MEP Hypercell; Pall). As vantagens deste meio é que a ligação é independente da força iónica, de empilhamento sal não é necessário, e as taxas de fluxo mais elevadas para acelerar o processo são possíveis. Além disso, a eluição é feita por uma alteração do pH.

[0088] Outras colunas de material de modo misturado são conhecidas e podem ser utilizadas. Por exemplo, mas não limitado a, MEP (Pall; ligando de afinidade é piridina acetato de 4-mercapto), HEA (Pall; afinidade de ligando: hexilamino), PPA (Pall, ligando de afinidade: fenilpropilamino), MBI (Pall; afinidade de ligando: 2 -mercapto-5benzamidazole ácido sulfo), Capto MMC (GEHC), Capto aderir (GEHC; afinidade de ligando: etanolamina de N-benzil-N-metil), CHT hidroxiapatita (BioRad), CHT fluoroapatide). Os MEP, HEA, PPA, e MBI colunas têm uma ligação hidrofóbica, onde Capto MMC é um trocador de cátions com a funcionalidade de modo misturado e Capto aderir é um permutador de aniões com a funcionalidade de modo misturado. As colunas BioRad são colunas de troca iônica com componentes hidrofóbicos.Qualquer outra coluna de material de modo misturado não está aqui também pode ser utilizado para purificar o mutante proNGF.

Etapa d: A clivagem de proNGF para beta-NGF

[0089] ProNGF é o precursor da beta-NGF. Assim, na etapa d) do método de produção de beta-NGF a partir de um mutante proNGF da invenção, a sequência pró-do mutante proNGF é clivado a fim de obter um beta-NGF ativo.

[0090] Proteases tendo substrato de tripsina especificidade clivar a proteína sem digerir a parte ativa da molécula de proteína. Proteases semelhantes a tripsina ligações peptídicas pelas seguintes um aminoácido carregado positivamente, tal como arginina ou lisina. Como proteases semelhantes a tripsina, várias serina-proteases (endopeptidases da serina) são considerados para o processamento do proNGF resultar beta- NGF. De preferência, a serina-protease de tripsina é utilizado para a clivagem da pró-sequência, mas outras proteases poderiam ser utilizadas em vez disso.Note-se que a clivagem não está limitada à própria tripsina, mas pode envolver outros substratos com proteases semelhantes a tripsina bem. Geralmente, se a proporção de proNGF a tripsina (ou outros inibidores da protease), é ajustado de forma apropriada, o enrolamento correcto, madura beta-NGF não será clivada por esta protease. Em contraste, as proteínas desnaturadas, bem como intermediários de dobramento expor sequências que são susceptíveis ao ataque por protease.

[0091] De preferência para a clivagem do mutante proNGF para beta-NGF, a proporção de tripsina (ou outros inibidores da protease) a mutante proNGF é de 1: 200 - 1: 100.000, mais preferivelmente de 1: 5.000 - 1: A 20,000 por peso, mais preferido é o numa proporção de 1: 10.000 (w / w). Numa forma de realização mais preferida, a clivagem ocorre em 8-23 horas à temperatura ambiente, o mais preferido 18 horas. Sob as condições utilizadas neste invento, mutante proNGF é clivado completamente e quase nenhum subprodutos são formados. Não foi observada agregação.

[0092] Tal como claramente descrito nos Exemplos, os presentes inventores descobriram que as modificações de aminoácidos introduzidos no mutante proNGF do invento não apenas evitar a clivagem da proteína de locais de clivagem indesejados mas também inesperadamente resulta num grande aumento da eficiência da clivagem de tripsina em comparação com a do proNGF tipo selvagem, o que permite levar a cabo a clivagem sob condições muito selectivos para obtenção de um produto muito puro.

[0093] Em detalhe, os dados experimentais mostram claramente que a já uma proporção muito baixa de tripsina / proteína, tais como 1: 100.000, o mutante proNGF do invento (SEQ ID NO: 5) resulta em elevada pureza recombinante humana beta-NGF com um elevado rendimento de clivagem (cerca de 85%). Além disso, o proNGF tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) na mesma proporção de tripsina / proteina mostra um rendimento de clivagem baixa (cerca de 5%). Um rendimento satisfatório é obtido apenas a razões de tripsina / proteína muito mais elevadas (1/250), mas isso é acompanhado por uma baixa selectividade e uma degradação do produto devido à alta overdigestion.

Etapa e: A purificação adicional de beta-NGF

[0094] O beta-NGF produzido a partir de um mutante proNGF da invenção é ainda purificado, por exemplo, através de vários métodos cromatográficos. Outras etapas de purificação são obrigados a separar tripsina e impurezas relacionadas com produtos da digestão tríptica de beta-NGF. Etapas de purificação deve reduzir os profissionais de saúde, endotoxinas, e ADN. Quaisquer métodos conhecidos na arte para a purificação de proteínas podem ser usados. Os mais preferidos são as purificações cromatográficas, por exemplo, com colunas de Sepharose (por exemplo, SP Sepharose HP, Q-Sepharose FF).

[0095] O produto final de beta-NGF produzido a partir de um proNGF foi analisado quanto à sua pureza por SDS-PAGE, RP-HPLC, SE- HPLC, e IEX-HPLC. Análise HPLC revelou uma pureza de betaNGF de pelo menos 97%.

[0096] Numa forma de realização preferida da invenção, o método para a produção de um pró-NGF muteina adequada para a obtenção de beta-NGF inclui as seguintes etapas: a) expressão de um mutante pro-NGF recombinante com local de clivagem de protease substituído em células procariotas b) isolamento dos pró-NGF muteína contendo corpos de inclusão, c) mistura dos corpos de inclusão com um tampão adequado de desnaturação, compreendendo pelo menos (i) uma substância caotrópico, (ii) um agente quelante, (iii) um tampão, e (iv) um agente de redução d) em uma solução de redobragem redobragem compreendendo pelo menos um acompanhante, um quelante de metal, e um sistema redox de baralhar, e) purificação do mutante de pró-NGF redobrado, f) clivagem para a forma ativa da beta-NGF com proteases tais como a tripsina g) o isolamento e purificação da beta-NGF.

Utilização de proNGF para a produção de beta-NGF

[0097] Num terceiro aspecto, a invenção é dirigida à utilização do mutante proNGF da presente invenção para a produção de beta- NGF humano.

Composição farmacêutica de betaNGF obtida a partir de mutantes proNGF da invenção

[0098] Num outro aspecto, o invento é dirigido a uma composição farmacêutica compreendendo betaNGF obtido a partir de um mutante proNGF-substituído no local de clivagem da protease nativa R1SK3R4 nas posições 101 e 103 (K 3 e R 1), da sequência proNGF tipo selvagem humana (SEQ ID NO: 1) como descrito acima e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização da invenção, farmaceuticamente beta-NGF ativo é administrado ao doente através de métodos de genes-terapêutico. Em terapia genética, existem dois métodos básicos disponíveis, adequados para a introdução de um gene, no presente caso, um gene codificador de uma beta-NGF, para o paciente.

[0099] Na aplicação in vivo ex, o gene que codifica farmaceuticamente beta-NGF ativo é introduzido numa célula do corpo por um vetor, em que a célula do corpo, de preferência é uma célula da glia, e a célula tratada desta maneira é então re-introduzida no paciente, por exemplo, microou nanopartículas. Particularmente preferido é o de uma integração específica do gene da beta-NGF no genoma celular.

[0100] Na terapia em vivogene, o gene da beta-NGF é transportado para as células alvo no corpo por vetores, por exemplo, por meio de vírus, o que por um lado pode infectar a célula-alvo und, assim, irá ser capaz de introduzir o farmaceuticamente gene da beta-NGF ativo, mas, por outro lado, não é capaz de reproduzir-se na célula-alvo. Nesta abordagem, as micropartículas de nano-ou, por exemplo, lipossomas, os quais podem fundir- se com a membrana da célula, podem ser utilizados vetores de um bem.

[0101] Como um vetor para o gene da beta-NGF, um vírus ou um anticorpo pode ser usado como um exemplo, capaz de infectar especificamente a célula hospedeira ou que imunorreage com um antigénio na célula-alvo. Como um veículo virai, retrovírus pode ser utilizado como um exemplo. Além disso, é possível a utilização de adenovírus ou vetores baseados, por exemplo, vaccinia, vírus de vaccinia modificado Ankara (MVA).

[0102] O perito na arte será capaz de selecionar uma formulação adequada com base em considerações de rotina e escolheu uma forma adequada para a administração da composição farmacêutica a um paciente presente. Por exemplo, a composição farmacêutica pode compreender um ou mais ingredientes farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, portadores ou diluentes. Entre estas classes de substâncias, pode-se citar de enchimento, sais, tampões, estabilisatores, potenciadores da penetração e outros materiais bem conhecidos. As técnicas para a formulação de composições farmacêuticas da presente invenção podem ser encontradas em livros de texto conhecidos convencionais, tais como "Remington Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edição. A dosagem do betaNGF obtido pelo método de produção como descrito na presente invenção pode estar numa gama de 0,1 ug / kg a 500 ug / kg de peso corporal, se administrada por infusão, e a partir de 2 ug / kg a 2 mg / kg de peso corporal, se administrada por injeção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0103] A Figura 1 mostra a sequência de pro-NGF e dos mutantes de pro-NGF da invenção.

[0104] Mostrado em negrito é a seqüência da proforma de beta-NGF humano. Mostrados em negrito e sublinhados é a protease local (tripsina) de clivagem (aminoácidos 101-104 da SEQ ID NO: 1; locais de clivagem de tripsina estão entre os aminoácidos 101-102 (R 1 ), 103-104 (K 3 ) e 104 -105 (R 4 )). X na sequência pode ser qualquer aminoácido.

[0105] A Figura 1a mostra uma sequência de proNGF humana (SEQ ID NO: 1) com o local de clivagem de protease RSKR (SEQ ID NO: 9).

[0106] A Figura 1b mostra uma sequência de um mutante proNGF do invento (SEQ ID NO: 2), com o local de clivagem de protease VSXR (SEQ ID NO: 10).

[0107] A Figura 1c mostra uma sequência de um mutante proNGF do invento (SEQ ID NO: 3) com o local de clivagem de protease mutada para XSXR (SEQ ID NO: 11).

[0108] A Figura 1d mostra uma sequência de um mutante proNGF do invento (SEQ ID NO: 4) com o local de clivagem de protease mutada para XSAR (SEQ ID NO: 12).

[0109] Figura 1e mostra uma sequência de um mutante proNGF do invento (SEQ ID NO: 5) com o local de clivagem de protease mutada para Vsar (SEQ ID NO: 13).

[0110] A Figura 1f mostra uma sequência de um mutante proNGF do invento (SEQ ID NO: 7), com o local de clivagem de protease mutada para XXXR (SEQ ID NO: 14).

[0111] A Figura 1g mostra uma sequência de um mutante proNGF do invento (SEQ ID NO: 8) com o local de clivagem de protease mutada para VXAR (SEQ ID NO: 15).

[0112] A Figura 1h mostra sequências de locais de clivagem de protease (SEQ ID NOs: 6, 9-15).

[0113] Figura 2 - Processamento de proNGF ou pro mutantes NGF a beta-NGF.

[0114] A Figura 2a mostra seis beta NGF produtos de clivagem, após a clivagem com tripsina utilizando o proNGF tipo selvagem possuindo um local de clivagem de furina RSKR nativa. O desenho mostra claramente que a clivagem do proNGF tipo selvagem para betaNGF resulta numa mistura heterogênea de diversos produtos de clivagem diferentes.

[0115] A Figura 2b mostra os produtos de clivagem beta NGF nativos depois de clivagem com tripsina usando uma mutante proNGF SP174-101 (SEQ ID NO: 5) com deleção do local de clivagem de furina nativa. O local de clivagem da protease RSKR (SEQ ID NO: 9) foi substituído por dois aminoácidos para resultar um local Vsar (SEQ ID NO: 12). Este local só pode ser clivada por uma protease após o aminoácido arginina na posição 104; Tripsina só pode unir em um local de clivagem (em vez de três). O desenho mostra claramente que a clivagem do mutante proNGF SP174-101 (SEQ ID NO: 5) com os resultados de beta-NGF em apenas um produto de clivagem homogénea (beta-NGF).

[0116] A Figura 3 mostra o redobramento da mutante proNGF SP174-101 (SEQ ID NO: 5) comparada com o proNGF tipo selvagem. A Figura compara o rendimento de redobramento do proNGF tipo selvagem (linha contínua) e o mutante proNGF (linha a tracejado) com o local de clivagem de protease mutada para Vsar. Pode ser claramente visto a partir da Figura que a eficiência de redobragem de tipo selvagem e mutante proNGF é idêntico.

[0117] A Figura 4 mostra a purificação de um mutante proNGF SP174-101, com o local de clivagem de protease mutada para Vsar (SEQ ID NO: 5) por uma coluna MEP HyperCel. A Figura mostra um perfil de eluição de MEP HyperCel a purificação de um mutante proNGF redobrada e filtrada.

[0118] A Figura 5 mostra a clivagem de um mutante proNGF SP174-101, com o local de clivagem de protease mutada para Vsar (SEQ ID NO: 5) por tripsina. A Figura mostra um gel corado com Coomassie de SDS-PAGE de fracções de clivagem tríptica. O produto de clivagem tríptica da mutante proNGF pode ser visto nas pistas 4-7. As Figuras mostram claramente que os mutantes purificados proNGF resulta em apenas um produto de clivagem (beta-NGF).

[0119] A Figura 6 mostra a purificação da beta-NGF. A Figura mostra um perfil de uma coluna de SP Sepharose HP, após a clivagem tríptica. A reação de digestão tríptica foi carregado numa coluna de SP Sepharose HP. A eluição foi feito em três etapas (a. 25% de fosfato de sódio 25 mM, NaCl 1 M, pH 6,5 (tampão B), b. Em um gradiente linear de 25-50% de tampão B, e c. De 100% de tampão B (taxa de 60 cm / h) de fluxo).

EXEMPLOS

[0120] Os exemplos seguintes são postos adiante de modo a proporcionar aos peritos na especialidade com uma divulgação completa e uma descrição de como fazer e usar os métodos e composições da invenção, e não se destinam a limitar o âmbito daquilo que os inventores consideram como a sua invenção. Foram feitos esforços para garantir a exactidão em relação aos números utilizados, mas alguns erros experimentais e desvios devem ser considerados. A menos que indicado de outra forma, o peso molecular é o peso molecular médio, a temperatura é em graus centígrados, e pressão é ou está próxima da atmosférica.

Exemplo 1. Substituição de tipo selvagem pró NGF no local de clivagem da protease nas posições 101 a 104 (R1SK3R4)

[0121] Substituição de Arginina R Lisina K 1 e 3 correspondentes às posições 101 e 103 de humano pro-NGF (SEQ ID NO: 1) foi realizado no nível do ADN utilizando um gene sintetizado por métodos como é conhecido para alguém perito na arte. Serina na posição 102 permaneceram inalteradas ou qualquer substituição da posição 102 de humano pro-NGF (SEQ ID NO: 1) foi também realizada ao nível do ADN, utilizando um gene sintetizado por métodos como é conhecido para alguém perito na arte. Lisina K 4 correspondendo à posição 104 não foi substituído. As sequências são apresentadas na Figura 1.

Exemplo 2. Expressão de recombinante de mutante proNGF SP174-101. (SEQ ID NO: 5) em células procariotas

[0122] O hospedeiro bacteriano E. coli JM108 utilizado para a expressão do r / i-proNGF (DSMZ 5585; F thi A (lac-pwAB) terminar Al gyrA96 relaxar PHX hsdRXl supE44 recA) é prolina-auxotróficas, que foi neutralizada pela utilização do plasmídeo com o pSCILlOl designação. O pSCILlOl plasmídeo baseia-se no plasmídeo pSCIL008 (ver WO05061716).A tensão não pode synthezise tiamina (Vieira &Messing, 1982 Gene. outubro; 19 (3) :259-68). O mutante de pró-NGF mostrado na SEQ ID NO: 5 é expresso sob o controlo do promotor tac localizado em pSCILlOl. O pSCILlOl vetor utilizado aqui é um plasmídeo de elevado número de cópias, com uma resistência à canamicina. A expressão é realizada em meio de sal mineral definido e é induzido pela adição de IPTG. O mutante de pró-NGF é depositado no citosol na forma de corpos de inclusão (IBS).

[0123] Linha de célula: ■ tensão hospedeiro, por exemplo, E. coli HMS174 (K12) ou JM108 (K12) ■ mutante proNGF SP174-101 (SEQ ID NO: 5) ■ promotor Tac (indução IPTG) ■ ColEl replicon ■ resistência Kanamycin ■ seleção Proba ■ sistema vetor Proprietary pSCIL 101 (por exemplo, ver WO05/061716)

Exemplo 3. Fermentação

[0124] O objetivo desta fermentação foi a obtenção de produto e da biomassa para as etapas subsequentes do processo.Para monitorizar a sobre-expressão da proteína alvo durante o processo de fermentação, as amostras foram analisadas por meio de SDS-PAGE antes e após a indução. ■ meio de sal mineral sem antibióticos ■ fase batch p ~ 0,25 h-1 (ODfinal = 18) ■ fase batch fed I alimentação exponencial com uset = 0,18 h-1 ■ fase batch fed II: taxa de alimentação constante ■ ponto de indução ODind = 60 ±5 ■ 1,0 mM IPTG ■ tempo de indução 5 h ■ final OD = 82 +4 ■ tempo de processamento de 28,5 h ±1,25 ■ estabilidade plasmídea 100% ■ rendimento: 40 mg / g proNGF; 1,2 g / L ± 0,2 g / L proNGF

Exemplo 4. Recuperação primária de corpos de inclusão contendo SP174-101

[0125] Em células bacterianas, a proteína recombinante está presente na forma de agregados. A expressão do pro-NGF levou muteína lugar sob a forma de IBS. A desagregação das células e a preparação IB foram realizadas de acordo com protocolos padrão e pode ser realizado em escala laboratorial até se um trabalho de aprox. 200 g de biomassa. A preparação desses "corpos de inclusão", que contêm a muteína proNGF foi realizada de acordo com Rudolph, R., et al. (1987); Folding proteínas. In: Creighton, TE (ed.): a função da proteína: Uma abordagem prática. Oxford University Press, pp 57-99, e de acordo com EP0994188B 1. Para ruptura da célula, os sedimentos celulares foram ressuspensos num tampão adequado e, subsequentemente, as células foram rebentadas através de homogeneização de alta pressão em 50 mM Natriumphosphat pH 7,0, EDTA 1 mM.

Exemplo 5. Dissolver o mutante proNGF SP174-101 numa solução desnaturante (solubilização de corpos de inclusão)

[0126] Os corpos de inclusão foram solubilizados numa solução de desnaturação, que compreendia uma solução de (i) um agente caotrópico, (ii) um agente quelante, (iii) um tampão, e (iv) um agente de redução. Para a solubilização, guanidínio HC1 (GuaHCl) foi testado numa gama de concentração de 4,0-6,0 M. O tampão de solubilização foram misturados em diferentes proporções, com uma suspensão de corpo de inclusão (IB lama). Todas as experiências tinham uma concentração final de cisteína a 5 mM e foram realizadas à temperatura ambiente. Os resultados foram analisados por SDS-PAGE (dados não mostrados). As experiências revelaram que uma concentração de 4 M GuaHCL era suficiente para a solubilização completa de corpos de inclusão. O rácio de pasta de corpos de inclusão, a tampão é de 1 + 1,25 (v / v) (pasta IB: tampão). As condições finais da solução de desnaturação para a solubilização dos corpos de inclusão foram: i. 4 M de guanidínio-HCl, ii. 0,1 M Tris, iii. 10 mM de EDTA iv. 5mM de Cisteína 5 v. pH 8,0

[0127] O solubilizado é clarificado por filtração de profundidade de acordo com os procedimentos padrão. A concentração de proteína foi então determinada utilizando o método de Bradford (Bradford, MM, Anal. Biochem. 72 (1976) 248). A concentração de proteína de proNGF muteína foi entre 10-20 mg / ml.

Exemplo 6. Transferir o mutante proNGF SP174-101 num tampão de redobragem onde o proNGF desnaturado assume uma conformação biologicamente ativa

[0128] Depois de solubilização, que é necessário para redobrar a proteína na sua conformação nativa e desse modo minimizar o enrolamento incorrecto e a agregação. Para preparar proNGF muteína biologicamente ativa de acordo com a invenção a partir de materiais solubilizados, estes foram diluídos numa solução de redobramento no qual proNGF assume uma conformação biologicamente ativa.

[0129] A solução final de redobramento para o solubilizado baseado em IB-lama composta i. 0,75 M arginina ii. 5 mM de EDTA iii. 1 mM de L-cistina e 5 mM de L-cisteína iv. pH 9,5

[0130] A obtenção do NGF na conformação ativa foi confirmado pelo presença de pontes de dissulfureto que ocorrem na maduro humano beta-NGF.

[0131] Para aumentar a concentração de proteína no processo de redobragem, uma renaturação pulso foi realizada. Um pulso foi dado a cada hora por 50 mg / ml proNGF proteína mutante. A concentração de guanidínio-HCl na solução não deve ser superior a 0,3 M. A fim de alcançar este objectivo, foram necessárias 15 pulsos. A fracção redobrada clarificado foi filtrado antes de carregar para outras colunas.

[0132] O desempenho da reação de redobragem foi analisada após cada pulso por meio de RP-HPLC. A área do pico resultante foi transferido com o número de pulsos. Para a RP-HPLC, uma coluna de fase reversa (por exemplo, 214MS54, 4,6 x 250 mm, 300 A, 5 pin, Vydac) com coluna de protecção (por exemplo, 214GK54, 300 A; Vydac) foi usado. Os tampões que funcionam eram H 2 0 com 0,05% de ácido trifluoroacético (TFA) e acetonitrilo com 0,05% de TFA. A taxa de fluxo foi de 1 mL / min. Os resultados são mostrados na Figura 3. Pode ser visto a partir da Figura 3 que a eficiência de redobragem de tipo selvagem e mutante proNGF é idêntica. Exemplo 7. Purificar o mutante proNGF SP174-101 a partir da solução de redobramento através de uma coluna de material de modo misturado

[0133] Uma coluna de afinidade com um ligando sintético, foi utilizada 4-mercapto-etil-piridina (MEP). A eluição foi feita deslocando o valor de pH. Além disso, a eluição foi realizada com uma concentração de sal baixa, o que é benéfico para um design de processo eficiente.

[0134] A coluna foi equilibrada com 0,75 M arginina, EDTA 5 mM, pH 9,5. A reação de redobragem clarificado foi carregado numa coluna de MEP HyperCel (Pall) com uma capacidade de carga máxima de 5 g por L mutante proNGF meios de coluna. Na etapa de lavagem, a maior parte de impurezas e de a proteína não ligada foram esgotados usando tampão de 2 M GuaHCl, Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0 e 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. A eluição foi realizada com um gradiente linear de 0-70% de acetato 50 mM, pH 4,0 (caudal de 120 centímetros / h). A Figura 4 mostra um perfil de eluição de MEP HyperCel purificação de um redobrada e filtrada mutante proNGF com o local de clivagem de protease mutada para Vsar (SEQ ID NO: 5) da invenção. Na etapa de lavagem GuaHCL "muitas impurezas foram removidas. No,, pooí", cerca de 60-70% do mutante proNGF foi recuperado.

Exemplo 8. Clivagem do mutante proNGF SP174-101 para obter beta-NGF ativo

[0135] Para a digestão tríptica de mutante proNGF de beta-NGF, tal Phosphatebuffer foi usado, que não inibem a atividade da protease. Tampão fosfato de sódio foi adicionado à MEP-eluato para uma concentração final de fosfato de sódio 25 mM. O valor de pH foi ajustado para pH 6,5. Para a proteólise, a tripsina (Roche, grau GMP) foi adicionada numa proporção de 1: 10.000 (w / w) (tripsina: proNGF). A proteólise foi realizada utilizando um tempo de incubação de 18 h à temperatura ambiente. Desempenho e no rendimento da digestão tríptica foram analisados por SDS-PAGE, RP-HPLC e UV/VIS280nm. A Figura 5 mostra uma SDS- PAGE de fracções de clivagem tríptica. Um 4-12% de Bis / Tris-gel, 1 mm MES lx como tampão de corrida (Invitrogen) foi utilizado. As pistas 5-7 mostram os produtos de clivagem trípticos em comparação com o mutante proNGF não clivada (rhproNGF *, ver pista 3) e para o NGF maduro beta-(NGF; ver pista 8). As Figuras mostram claramente que os mutantes purificados proNGF resulta em apenas um produto de clivagem (beta-NGF). A digestão completa de mutante proNGF de beta-NGF pode ser observada.

Exemplo 9. Purificação de NGF beta ativo

[0136] Após a digestão tríptica, beta-NGF foi carregado numa coluna de SP Sepharose HP para esgotar tripsina, subprodutos da clivagem e outras impurezas. A purificação de SP Sepharose HP é mostrado na Figura 6.

[0137] A coluna foi equilibrada com tampão de fosfato de Na 25 mM (pH 6,5). A reação de digestão tríptica foi carregado numa coluna de SP Sepharose HP '(2 g de beta-NGF / L meio), e a proteína não ligada foi lavada com o tampão de equilíbrio. A eluição foi feito em três etapas (3 CV de 25% de 25 mM de Na-fosfato pH 6,5 / NaCl 1 M (tampão B), em 10 CV de um gradiente linear de 25-50% de tampão B, e 3 cv 100% de tampão B (taxa de 60 cm / h) de fluxo).

[0138] A Figura 6 mostra a purificação da beta-NGF. A Figura mostra um perfil de uma coluna de SP Sepharose HP, após a clivagem tríptica. O rendimento de beta-NGF era 85-95% (pico "de eluição da amostra").

Exemplo 10. Eficiência de clivagem da tripsina em mutante SP174-101 e proNGF tipo selvagem

[0139] Este procedimento foi aplicado em paralelo, tanto para mutante proNGF SP174-101 (SEQ ID NO: 5) e humano de proNGF tipo selvagem (SEQ ID NO: 1; rhProNGF).

[0140] 5 mL de purificado rhProNGF foram dialisados contra 25 mM de tampão fosfato de pH 6,5. Após a diálise, a concentração de proteína de 0,08 mg / ml foi medida por HPLC-UV. Por exemplo a digestão, foram empregados 80 mg de proNGF. Após a proteólise, todas as amostras foram analisadas por HPLC-UV.

[0141] Proporção de massa 1/10.000 w / w de tripsina / rhMutante proNGF foi utilizado, enquanto diferentes razões de massa de tripsina / rhProNGF tipo selvagem foram usadas (ver Tabela 3). De acordo com uma solução de tripsina foram usados 1,0 mg / ml e 10 ug / ml. Após uma incubação de um dia para o outro (cerca de 17 horas) à temperatura ambiente, foram analisadas todas as amostras. Para botos controle rhMutante proNGF sem protease adicionada também foi incubada. TABELA 3

[0142] Performances e os rendimentos de todas as digestões tríptica foram analisados por HPLC-UV, utilizando uma coluna Vydac C4 214MS.

[0143] A Tabela 4 mostra os rendimentos de clivagem obtidos após digestão tríptica. Os dados experimentais mostram claramente que a clivagem do mutante proNGF SEQ ID NO: 5, com resultados de tripsina em apenas um produto (beta-NGF) em alto rendimento de corte (aproximadamente 85%) utilizando uma razão de tripsina / proteína muito baixas (1/10.000). Isto pode ser comparado com a clivagem do proNGF tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) que apresenta um rendimento baixo de clivagem (apenas cerca de 5%) em relação baixa de tripsina / proteína (1/10.000) e uma degradação elevada do produto (overdigested) a proporção de tripsina / proteína elevada (1/250). TABELA 4

Exemplo 11. Teste para a atividade biológica de proNGF através da estimulação da proliferação de células TF1

[0144] Células TF1 (ATCC, catálogo n. CRL2003) foram cultivadas de acordo com procedimentos padrão. Um meio de ensaio (meio de 90% de RPMI 1640, 10% FBS serume fetal bovino, 50 U / ml de penicilina und 50 ug / ml de estreptomicina) foi adicionado às células e centrifugadas. O sedimento foi ressuspenso a uma densidade de 1,5 • 105 células / ml em meio de ensaio a 37 ° C. A suspensão de células foi misturado com diferentes concentrações de proteína proNGF (10 ~ 10 M, 3-10 "10 M, 10 "9 M, 3-10 "9 M, de 10 ~ 8 M, 3 • 10 ~ 8 M, 10"7 M, 3 10 "7 M, 10 "6 M, 3 • 10 "6M, 10 "5 M und 3 • 10 "5 M) e analisados em 96 bem placas. Após incubação durante 48 h a 37 ° C, de reagente de proliferação celular (por exemplo, WST-1, Roche Applied Science, cat. 1.644.807) foi adicionado e as placas novamente incubadas durante 4 h a 37 ° C. A absorção foi medida a 450 nm e o valor de ECso determinada usando programas adequados (a. Bsp. Sigma-Plot, 2000).

Claims (14)

1. Mutante proNGF tendo uma sequência que consiste na sequência do proNGF de tipo selvagem humano (SEQ ID NO: 5), caracterizado pelo local de clivagem da protease R1SK3R4 ser substituído nas posições de R1 e K3 correspondentes às posições 101 e 103 sequência proNGF do tipo selvagem humana (SEQ ID NO: 5) por um aminoácido selecionado a partir de um aminoácido não-básico e histidina.

2. Mutante ProNGF, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo local de clivagem de protease ser substituído nas posições 101 e 103 por um aminoácido selecionado de Alanina, Glicina, Valina, Serina, Treonina, Metionina, Tirosina, Histidina, Asparagina, Ácido Aspártico, Glutamina, Ácido glutâmico, fenilalanina, isoleucina, leucina, triptofano, cisteína e prolina, preferencialmente selecionados de alanina, valina, glicina, serina, treonina, metionina, tirosina, histidina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutâmico, mais preferencialmente selecionado a partir de alanina e valina.

3. Mutante ProNGF, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo aminoácido na posição R4 corresponde à posição 104 sequência proNGF do tipo selvagem humana (SEQ ID NO: 5) ser selecionado a partir de arginina ou lisina.

4. Mutante ProNGF, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo aminoácido substituído na posição 102 da sequência proNGF do tipo selvagem humana (SEQ ID NO: 5) ser selecionada a partir de aminoácidos de serina, glicina, cisteína, asparagina, tirosina, treonina, ácido aspártico, glutamina, alanina, valina, ácido glutâmico, histidina, isoleucina, leucina, fenilalanina, prolina, triptofano, metionina.

5. Mutante ProNGF, de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo aminoácido na posição 101 da sequência proNGF do tipo selvagem humana (SEQ ID NO: 5) ser substituída por valina, na posição 102 por serina, na posição 103 por alanina, e em que o aminoácido na posição 104 é arginina.

6. Mutante ProNGF, de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo mutante ser obtido por expressão recombinante em células procarióticas, de preferência em E. coli.

7. Método de preparação de uma beta-NGF humana biologicamente ativa, caracterizado por compreender: (i) proporcionar um mutante proNGF conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e (ii) clivagem do mutante proNGF, a fim de obter uma beta- NGF humana ativa.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a. dissolver o o mutante proNGF de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13 por solubilização dos corpos de inclusão em uma solução desnaturante; b. transferir o mutante proNGF em uma solução de redobragem, onde o proNGF desnaturado assume uma conformação biologicamente ativa, c. purificar o mutante proNGF redobrado, d. clivar a pró-sequência do mutante proNGF para obter o beta-NGF ativo.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela solução desnaturante compreender uma solução contendo (i) uma substância caotrópica, (ii) um quelante, (iii) um tampão, e (iv) um agente de redução, de preferência, em que a solução desnaturante compreende: i. 1-8 M de guanidínio-HCl, de preferência 4-6 M, ii. 0,01 - 1 M Tris, iii. 1 - 50 mM de EDTA, iv. 1 - 100 mM selecionados de Glutione (GSH) ou cisteína, v. pH 7,0-10,0 e mais preferencialmente compreende: i. 4 M de guanidínio-HCl, ii. 0,1 M Tris, iii. 10 mM de EDTA iv. 5 mM GSH ou Cisteína v. pH 8,0 de preferência, em que a solução de redobragem compreende: i. 0,5-1,0 M de um chaperone, ii. 1 - 10 mM de um quelante de metal, iii. 0,1-10 mM de um sistema de embaralhamento redox, iv. pH 8,0 - pH 11,0. e mais preferencialmente compreende: i. 0,75 M arginina, ii. 5 mM de EDTA iii. 1 mM de L-cistina e 5 mM de L-cisteína, ou GSSG 1 mM (glutationa oxidada) e 5 mM GSH (glutationa reduzida), iv. pH 9,5.

10. Método, de acordo com as reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo redobramento ser realizado como um pulso de renaturação.

11. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo mutante proNGF ser purificado através de cromatografia de modo misturado.

12. Método, de acordo com as reivindicações 7 a 11, caracterizado pela pró-forma do mutante proNGF ser clivada por uma protease, preferencialmente uma protease da serina, mais preferencialmente tripsina.

13. Método, de acordo com as reivindicações 7 a 12, caracterizado por compreender ainda uma etapa adicional de purificação da beta-NGF por meio de cromatografia de coluna.

14. Utilização de um mutante proNGF conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser na produção de beta-NGF humana.

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